CN114164121A

CN114164121A - 球孢白僵菌uscm6和菌剂及其应用和防治害虫的方法

Info

Publication number: CN114164121A
Application number: CN202111400177.7A
Authority: CN
Inventors: 李维宏; 张向博; 杨宁
Original assignee: Shanxi Agricultural University
Current assignee: Shanxi Agricultural University
Priority date: 2021-11-19
Filing date: 2021-11-19
Publication date: 2022-03-11
Anticipated expiration: 2041-11-19
Also published as: CN114164121B

Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及球孢白僵菌USCM6和菌剂及其应用和防治害虫的方法。本发明提供了一株球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bb0901，所述的球孢白僵菌Bb0901的保藏编号为CGMCC No.23232。本发明所述菌株能够有效防治草地贪夜蛾，且具有环保、不易产生抗性的优势。

Description

球孢白僵菌USCM6和菌剂及其应用和防治害虫的方法

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及球孢白僵菌和菌剂及其应用和防治害虫的方法。

背景技术

草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)，属鳞翅目夜蛾科，又名为秋粘虫、草地夜蛾，Smith于1797年首次发现并命名(张润志.草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda(Smith)幼虫[J].应用昆虫学报,2020,57(06):1332.)。草地贪夜蛾起源于美洲热带和亚热带地区，广泛分布在美洲大陆，该虫于2016年通过国际贸易途径入侵非洲西南部的加纳和尼日利亚，2018年已蔓延至撒哈拉以南的44个非洲国家；同年5月，草地贪夜蛾入侵亚洲，首次在印度卡纳塔克邦的希莫加地区发现草地贪夜蛾；同年12月，先后在斯里兰卡、孟加拉国、泰国、缅甸等亚洲国家发现草地贪夜蛾入侵(杨普云,常雪艳.草地贪夜蛾在亚洲、非洲发生和影响及其防控策略[J].中国植保导刊,2019,39(06):88-90.)。2019年1月草地贪夜蛾自缅甸传入中国，在我国云南省普洱市江城县首次被发现，随后相继在广西、广东、贵州等地发现(姜玉英,刘杰,谢茂昌,李亚红,杨俊杰,张曼丽,邱坤.2019年我国草地贪夜蛾扩散为害规律观测[J].植物保护,2019,45(06):10-19.)。目前草地贪夜蛾已经在全球范围内蔓延，在南美洲、北美洲、中美洲、非洲、亚洲以及欧洲等近百国家和地区均有分布。

目前对于该虫的防治主要采用化学防治方法，由于农户大剂量使用农药，使得该虫对农药的抗性较强，造成农药残留，而且防治效果并不明显，对于人畜的安全隐患，因此目前化学农药防治受到一定制约(卢辉,唐继洪,吕宝乾,马子龙,何杏,陈琪,苏豪.草地贪夜蛾的生物防治及潜在入侵风险[J].热带作物学报,2019,40(06):1237-1244.)。

发明内容

本发明的目的在于提供球孢白僵菌USCM6和菌剂及其应用和防治害虫的方法。本发明所述菌株能够有效防治草地贪夜蛾，而且属于微生物防治，具有环保、不易产生抗性的优势。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一株球孢白僵菌(Beauveria bassiana)USCM6，所述的球孢白僵菌USCM6的保藏编号为CGMCC No.23224。

本发明提供了一种防治害虫的菌剂，所述菌剂的有效成分包括上述技术方案所述的球孢白僵菌USCM6。

优选的，所述菌剂中的球孢白僵菌USCM6的浓度为1×10⁷个/mL。

优选的，所述菌剂还包括表面活性剂。

优选的，所述表面活性剂包括吐温-80。

本发明提供了上述技术方案所述的球孢白僵菌USCM6或上述技术方案所述的菌剂在防治害虫中的应用。

优选的，所述害虫包括夜蛾科害虫。

优选的，所述夜蛾科害虫包括草地贪夜蛾。

本发明提供了一种防治害虫的方法，其所述方法包括以下步骤：

将上述技术方案所述的菌剂喷施于害虫虫体背部。

优选的，所述害虫包括害虫幼虫。

有益效果：

本发明提供了一株球孢白僵菌(Beauveria bassiana)USCM6，所述的球孢白僵菌USCM6由球孢白僵菌Bb0901诱变得到，其保藏编号为CGMCC No.23224。本发明所述菌株相较于球孢白僵菌Bb0901具有更优的防治效果，能够达到94.32％，同时具有环保、不易产生抗性的优势。因此，本发明所述菌株在草地贪夜蛾的防治等生产和研究中具有广泛的应用前景。

生物保藏信息

球孢白僵菌Bb0901，拉丁名为Beauveria bassiana，于2021年9月16日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.23232。

球孢白僵菌USCM6，拉丁名为Beauveria bassiana，于2021年09月06日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.23224。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为球孢白僵菌Bb0901的分生孢子梗、分生孢子结构和菌落结构，其中A为分生孢子梗结构，B为分生孢子结构，C为菌落结构；

图2为基于ITS基因序列构建的系统发育树；

图3为不同浓度球孢白僵菌Bb0901孢子悬浮液对草地贪夜蛾3龄幼虫矫正死亡率比较；

图4为紫外诱变不同时间球孢白僵菌Bb0901的致死率和正突变率比较；

图5为微波诱变不同时间球孢白僵菌Bb0901的致死率和正突变率比较；

图6为亚硝酸钠诱变的不同时间及同浓度菌Bb0901的致死率和正突变率比较，A为在浓度为0.01mol/L亚硝酸钠溶液条件下不同时间诱变情况，B为浓度为0.05mol/L亚硝酸钠溶液条件下不同时间诱变情况，C为浓度为0.1mol/L亚硝酸钠溶液条件下不同时间诱变情况，D为浓度为0.15mol/L亚硝酸钠溶液条件下在不同时间诱变情况；

图7为诱变得到的不同球孢白僵菌的菌落形态，其中第一排从左到右依次为球孢白僵菌Bb0901、球孢白僵菌MSCM1、球孢白僵菌MSCM2、球孢白僵菌MSCM3和球孢白僵菌MSCM4，第二排从左到右依次为球孢白僵菌UMCM1、球孢白僵菌UMCM2、球孢白僵菌UMCM3、球孢白僵菌UMCM4、球孢白僵菌UMCM5和球孢白僵菌USCM1，第三排从左至右依次为球孢白僵菌USCM2、球孢白僵菌USCM3、球孢白僵菌USCM4、球孢白僵菌USCM5、球孢白僵菌USCM6和球孢白僵菌USCM7；

图8为不同复合诱变方式球孢白僵菌Bb0901的致死率和正突变率比较；

图9为复合诱变获得的正向突变的不同球孢白僵菌与球孢白僵菌Bb0901的产孢量比较，其中ck为孢白僵菌Bb0901；

图10为复合诱变获得的正向突变的不同球孢白僵菌与球孢白僵菌Bb0901的HE值比较，其中ck为孢白僵菌Bb0901；

图11为高几丁质酶活性的6株球孢白僵菌与球孢白僵菌Bb0901对草地贪夜蛾3龄幼虫矫正死亡率比较，其中ck为孢白僵菌Bb0901；

图12为球孢白僵菌USCM6与球孢白僵菌Bb0901对草地贪夜蛾不同虫龄幼虫矫正死亡率比较，其中ck为孢白僵菌Bb0901；

图13为球孢白僵菌USCM6侵染草地贪夜蛾幼虫过程，A为侵染时图片，B为侵染过程中草地贪夜蛾幼虫身体变红，C为侵染过程中草地贪夜蛾幼虫身体开始出现菌丝，D为草地贪夜蛾幼虫身体长满菌丝；

图14为球孢白僵菌USCM6的菌落形态。

具体实施方式

如无特殊要求，本发明所述试剂和组分均为本领域技术人员常规购买所得即可。

本发明提供了一株球孢白僵菌(Beauveria bassiana)USCM6，所述的球孢白僵菌USCM6由球孢白僵菌Bb0901诱变得到的；所述的球孢白僵菌USCM6的保藏编号为CGMCCNo.23224。在本发明中，所述球孢白僵菌USCM6的产孢量为2.711×10⁸个/mL，几丁质酶活性的HE值为2.04，致病力达到78.57％。

本发明所述球孢白僵菌USCM6的筛选方法优选包括：

将复壮的球孢白僵菌Bb0901进行紫外诱变和亚硝酸钠诱变，得复合诱变处理的白僵菌；

将所述的复合诱变处理的白僵菌接种于产孢培养基培养后进行复筛，得所述球孢白僵菌USCM6。

在本发明中，所述球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bb0901的保藏编号为CGMCCNo.23232。本发明所述球孢白僵菌Bb0901分离自山西省晋中市太谷区小白乡玉米田玉米上的草地贪夜蛾幼虫僵虫。在本发明中，所述球孢白僵菌Bb0901的ITS序列优选为SQE IDNo.1所示：TTAAGTTCAGCGGGTAGTCCTACCTGATTCGAGGTCAACGTTCAGAAGTTGGGTGTTTTACGGCGTGGCCGCGTCGGGGTCCCGGTGCGAGCTGTATTACTGCGCAGAGGTCGCCGCGGACGGGCCGCCACTCCATTTCAGGGCCGGCGGTGTGCTGCCGGTCCCCAACGCCGACCTCCCCAAGGGGAGGTCGAGGGTTGAAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCGCCAGAATGCTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGGATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCGTTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAGCCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTCATTTGTTTTGCCTTGCGGCGTATTCAGAAGATGCTGGAATACAAGAGTTTGAGGTCCCCGGCGGGCCGCTGGTCCAGTCCGCGTCCGGGCTGGGGCGAGTCCGCCGAAGCAACGATAGGTAGGTTCACAGAAGGGTTAGGGAGTTGAAAACTCGGTAATGATCCCTCC。该菌株与NCBI数据库中的Beauveria bassiana NR111594.1菌株的相似性为100％；系统发育树可知该菌株与数据库中其他球孢白僵菌株为一大支，说明该菌株与数据库中的球孢白僵菌菌株具有较高的相似性。

在本发明中，所述球孢白僵菌Bb0901的菌落形态为：该菌株平板正面菌落培养初期呈乳白色，后略变为淡沙黄色，孢子层厚且均匀，菌落边缘孢子较少，菌落生长速度快，在产孢培养基上26±1℃培养10d时，菌落直径达到45.9mm(图1中的C)；分生孢子梗着生于营养菌丝，分生孢子在菌丝或泡囊上簇生，着生在产孢细胞延伸而成的“之”字形结构上(图1中的A)；分生孢子透明、光滑，球形或近球形(图1中的B)。该菌株能够有效防治草地贪夜蛾；而且该菌株具有环保、不易产生抗性的优势。

在本发明中，所述紫外诱变的时间优选为40min；所述紫外诱变时，紫外灯功率优选为15W，照射距离优选为28cm；所述紫外诱变时紫外线的波长优选为254nm。在本发明中，所述亚硝酸钠诱变的时间优选为10min；所述亚硝酸钠诱变时，采用的亚硝酸钠溶液的浓度优选为0.1mol/L。

得到复合诱变处理的白僵菌后，本发明将所述的复合诱变处理的白僵菌接种于产孢培养基培养后进行复筛，得所述球孢白僵菌USCM6。

在本发明中，所述产孢培养基优选包括以下浓度的组分：蔗糖15g/L、酵母粉5g/L、蛋白胨2g/L、蚕蛹粉3g/L、米粉2.5g/L、玉米粉2.5g/L、乳糖3g/L、棉仁粉1g/L、硼酸0.1g/L、硫酸镁1g/L、硫酸铜0.05g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸锌0.05g/L、硫酸亚铁0.05g/L、硫酸锰0.02g/L和琼脂12g。在本发明中，所述培养包括初培养和纯化培养；所述初培养时的接种量优选为0.1ml/皿或0.1ml/平板；所述初培养时，每个皿中培养基的用量优选为15ml，每个平板中的培养基的用量优选为15ml；纯化培养时的接种量优选为0.1ml/皿或0.1ml/平板；所述初培养时，每个皿中培养基的用量优选为15ml，每个平板中的培养基的用量优选为15ml；所述初培养和纯化培养的培养温度均优选为26±1℃，均优选为暗培养；相对湿度优选为75±5wt.％；所述初培养的培养时间优选为5d；所述纯化培养的培养时间优选为10d。

在本发明中，所述球孢白僵菌USCM6的菌落形态如图14所示：菌落形态为菌株正面为乳白色，之后变为浅黄色，菌落呈现出平绒状，菌落厚且生长均匀，菌落生长速度较快，在纯化培养10d后，菌落直径达到了45.9mm。通过显微镜观察菌株，可以看到分生孢子梗着生于营养菌丝，分生孢子在分生孢子梗上簇生，形成“之”字形结构，分生孢子为球形或近球形。该菌株能够有效防治草地贪夜蛾，而且其防治效果显著高于原始菌株的防效，同时该菌株具有环保、不易产生抗性的优势。

本发明提供了一种防治害虫的菌剂，所述菌剂的有效成分包括上述技术方案所述的球孢白僵菌USCM6。在本发明中，所述球孢白僵菌USCM6的浓度优选为1×10⁷个/mL。在本发明中，所述菌剂优选还包括表面活性剂，更优选为吐温-80；所述菌剂中吐温-80的体积百分含量优选为1％。

本发明所述球孢白僵菌USCM6能够有效防治草地贪夜蛾；而且上述菌株均属于微生物，因此具有安全、不易产生抗性的优势。因此，本发明所述球孢白僵菌USCM6或含有所述球孢白僵菌USCM6的菌剂能够用于防治害虫。

本发明提供了上述技术方案所述的球孢白僵菌USCM6或上述技术方案所述的菌剂在防治害虫中的应用。在本发明中，所述害虫优选包括夜蛾科害虫，更优选包括草地贪夜蛾。采用发明所述菌株或菌剂的防效能够达到68.97％～94.32％。

本发明提供了一种防治害虫的方法，所述方法包括以下步骤：

将上述技术方案所述的菌剂喷施于害虫虫体表面。

本发明所述害虫体表优选为害虫背部；所述菌剂的喷适量优选以害虫背部可见小水滴即可。在本发明中，所述害虫为害虫幼虫，进一步优选为1～5龄幼虫，更优选为1～3龄幼虫，最优选为1～2龄幼虫。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的球孢白僵菌USCM6和菌剂及其应用和防治害虫的方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

球孢白僵菌Bb0901的分离鉴定

供试草地贪夜蛾幼虫僵虫及草地贪夜蛾虫源：2020年9月7日在山西省晋中市太谷区小白乡玉米田玉米上发现本实验草地贪夜蛾幼虫僵虫。草地贪夜蛾幼虫采集于山西省晋中市太谷区小白乡玉米田玉米上，在实验室用玉米叶饲养至化蛹，待其羽化产卵后建立实验室种群作为供试虫源，培养草地贪夜蛾的温度为26℃±1℃，相对湿度为60wt.％～70wt.％，光周期16L:8D(光照时间为16h，黑暗时间为8h)，得草地贪夜蛾幼虫僵虫。

培养基为产孢培养基和几丁质培养基配方，其中产孢培养基的配方为：蔗糖15g，酵母粉5g，蛋白胨2g，蚕蛹粉3g，米粉2.5g，玉米粉2.5g，乳糖3g，棉仁粉1g，硼酸0.1g，硫酸镁1g，硫酸铜0.05g，磷酸二氢钾2g，硫酸锌0.05g，硫酸亚铁0.05g，硫酸锰0.02g，琼脂12g，加水至1000mL(邓春生,张燕荣,张曼曼,耿兵,吴伟,付文君,张冬梅.球孢白僵菌可湿性粉剂对马铃薯甲虫的防治效果[J].中国生物防治学报,2012,28(01):62-66.)；几丁质培养基的配方为：0.5g KH₂PO₄，0.5g MgSO₄，0.5g KCl，FeSO₄0.01g，几丁质10g，琼脂15g，加水定容至1000mL(卢振起,黄秋娴,李雯,王婧,李会平.桑天牛生物防治专用高毒力球孢白僵菌菌株的紫外线诱变选育[J].蚕业科学,2013,39(06):1198-1201.)。

菌株的分离纯化：

在超净工作台将上述草地贪夜蛾幼虫僵虫用无菌钵杵在无菌研钵中研磨，充分研磨后，得到粉碎虫体；在粉碎虫体中加入1mL无菌水(该无菌水中含有体积百分含量为1％的吐温-80)继续充分研磨，使用移液枪将虫体浸泡液吸入10mL具塞刻度试管中，之后再在粉碎虫体加入1mL无菌水(该无菌水中含有体积百分含量为1％的吐温-80)继续充分研磨，使用移液枪将虫体浸泡液吸入10mL具塞刻度试管中，反复10次，得到10mL虫体浸泡液；将10mL虫体浸泡液充分摇匀后虫体浸泡液吸出1mL放入9mL无菌水(该无菌水中含有体积百分含量为1％的吐温-80)充分摇匀，得到稀释后的虫体浸泡液，之后将稀释后的虫体浸泡液吸出1mL放入9mL无菌水(该无菌水中含有体积百分含量为1％的吐温-80)充分摇匀，重复7次，后进行稀释。

将稀释10⁵、10⁶、10⁷、10⁸倍虫体浸泡液稀释液分别接种于含有15ml产孢培养基的平板上，虫体浸泡液稀释液的接种量为0.1ml，于26±1℃，全黑暗，相对湿度75±5wt.％的恒温培养箱中培养。培养5d后，挑取稀释10⁸倍(在该稀释浓度下，每个平板菌落数目少(10个左右)，而且菌落连接的几率小，更容易获得单菌落)虫体浸泡液中少量孢子(挑选标准为平板没有其他杂菌落，菌落未相连，为单孢子菌落)至新的含有产孢培养基的平板上，26±1℃纯化培养15d，平板上长出的菌落形态特征一致，将该菌编号为菌株Ⅰ，即分离纯化的菌株Ⅰ。

菌株培养形态观察：

将分离纯化的菌株Ⅰ接种在产孢培养基平板于温度为26±1℃、全黑暗、相对湿度为75±5wt.％的恒温培养箱中培养；5d后挑取菌丝在光学显微镜下观察菌株的菌丝和分生孢子梗形态；10d后挑取成熟分生孢子观察分生孢子的形态与大小，观察结果图1所示：该菌株在产孢培养基平板正面菌落培养初期呈乳白色，后略变为淡沙黄色，孢子层厚且均匀，菌落边缘孢子较少，菌落生长速度快，在产孢培养基上26±1℃培养10d时，菌落直径达到45.9mm(图1中的C)；分生孢子梗着生于营养菌丝，分生孢子在菌丝或泡囊上簇生，着生在产孢细胞延伸而成的“之”字形结构上(图1中的A)；分生孢子透明、光滑，球形或近球形(图1中的B)。

菌株分子生物学鉴定：

提取分离纯纯化的菌株Ⅰ的DNA，提取方法为：取20mg干燥的分离纯纯化的Bb0901菌株的菌体用液氮研磨成粉末，加入1.5mL离心管中，之后加入200μL Buffer Digestion和2μLβ-疏基乙醇，再加入20μL Proteinase K溶液，震荡混匀；56℃水浴1h至细胞完全裂解；之后加入100μL Buffer PF，充分颠倒混匀，-20℃冰箱放置5min；然后室温10,000rpm离心5min，将所得上清转移到新的1.5mL离心管中，加入200μL Buffer BD，充分颠倒混匀后，加入200μL的无水乙醇，充分颠倒混匀，得到混合液。

将吸附柱放入收集管中，用移液器将上述所得混合液全部加入吸附柱中，静置2min，再10,000rpm室温离心1min，倒掉收集管中的废液。将吸附柱放回收集管，加入500μLPw Solution，10,000rpm离心30s倒掉收集管中的废液，然后将吸附柱放回收集管，加入500μL Wash Solution，10,000rpm离心30s倒掉收集管中的废液。之后将吸附柱重新放回收集管中，于12,000rpm室温离心2min，离去残留的Wash Solution后，取出吸附柱，放入一个新的1.5mL离心管中，加入50μL TE Buffer静置3min，12,000rpm室温离心2min，收集DNA溶液。提取的DNA可立即进行下一步实验或-20℃保存。

25μL反应体系包括：1μL模板DNA，7μL Taq Plus DNA Polymerase(5U/μL)，0.5μL50mM MgSO₄，2.5μL 10×PCR Buffer，2.5μL dNTP(each 10mM)，引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，SQE ID No.2)/ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，SQE IDNo.3)各1μL(20μmol/L)，ddH₂O 9.5μL。

反应条件：95℃变性5min；94℃变性30s，57℃复性30s，72℃延伸90s；进行30个循环，72℃修复延伸10min。

用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，使用SanPrep柱式DNAJ胶回收试剂盒纯化回收后，委托上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，

去除分离菌株rDNA-ITS序列两端质量不好的序列，该菌株的ITS序列为SQE IDNo.1所示。将其与NCBI数据库进行BLAST比较，结果发现该菌株与NCBI数据库中的Beauveria bassiana NR111594.1菌株的相似性为100％。

制作系统发育树，如图2所示，分析结果表明：该菌株与数据库中其他球孢白僵菌株聚为一大支，说明该菌株与数据库中的球孢白僵菌菌株具有较高的相似性。综合形态特征鉴定和ITS序列相似性分析，将该菌株命名为球孢白僵菌Bb0901。

实施例2

球孢白僵菌Bb0901侵染最佳浓度确定

将球孢白僵菌Bb0901用体积百分含量为1％吐温-80分别配成1×10⁴个·mL^-1、、1×10⁵个·mL^-1、1×10⁶个·mL^-1、1×10⁷个·mL^-1、1×10⁸个·mL^-1孢子悬浮液，采用超低量喷雾喷壶将上述不同浓度的孢子悬浮液分别喷至个体长度和活性相似的草地贪夜蛾3龄幼虫背部，将喷施孢子悬浮液的草地贪夜蛾3龄幼虫单只放入垫有滤纸的9mm无菌培养皿中，置于26±1℃，湿度为90wt.％的培养实验室培养，每天喂食一次，饲喂玉米叶，喂食量为每天每只约30平方厘米的玉米叶。每个浓度处理30头幼虫，每个浓度重复3次，持续观察6d，每天记录幼虫死亡数，对死亡幼虫进行保湿观察，确定是否为感菌致死。根据致死时间和致死率确定侵染的最佳浓度。

接种后不同浓度球孢白僵菌Bb0901的孢子悬浮液对草地贪夜蛾3龄幼虫的致病力见表1和图3。

表1不同浓度球孢白僵菌Bb0901的孢子悬浮液对草地贪夜蛾3龄幼虫的致病力

菌株浓度(个·mL<sup>-1</sup>)	1×10<sup>4</sup>	1×10<sup>5</sup>	1×10<sup>6</sup>	1×10<sup>7</sup>	1×10<sup>8</sup>
						矫正死亡率(％)	19.54	28.74	41.38	63.22	68.97

由表1和图3记载的可知，不同浓度球孢白僵菌Bb0901的孢子悬浮液对草地贪夜蛾3龄幼虫的致病力有所不同，草地贪夜蛾致死率随着孢子浓度的增大而增大。对3龄幼虫有较好致病作用的孢子浓度为1×10⁷个/mL～1×10⁸个/mL，1×10⁷个/mL有较高的经济效益，因此，选用1×10⁷/mL作为侵染浓度。

将表1中的数据应用Probit模型，计算球孢白僵菌处理的草地贪夜蛾3龄幼虫的LC₅₀值(致死中浓度)为3.03×10⁶个/mL。

实施例3

球孢白僵菌复合诱变突变株的筛选及诱变效应的测定实验

培养基为产孢培养基和几丁质培养基；培养基的组分与实施例1相同。

将由实施例1中分离纯化的球孢白僵菌Bb0901扩繁(用含体积百分含量为1％吐温-80的无菌水把球孢白僵菌Bb0901配成1×10⁷mL^-1孢子悬液，取制备好的悬液1mL于产孢培养基内，用涂布棒涂均匀，培养温度为于26±1℃，全黑暗，相对湿度75±5wt.％的恒温培养箱中培养，培养10d)，得扩繁菌液；取三份扩繁菌液，均配成浓度为1×10⁷个mL^-1孢子悬浮液分别进行紫外诱变、微波诱变和亚硝酸钠诱变来确定最佳诱变时间。

紫外诱变最佳时间确定：

取制备好的浓度为1×10⁷个mL^-1孢子悬浮液5mL于无菌培养皿内，并加入无菌的磁力搅拌子进行紫外照射(紫外灯功率为15W，照射距离为28cm，波长为254nm)不同时间(5min、10min、20min、30min、40min、50min、60min、70min、80min)，将经过紫外线诱变处理的白僵菌孢子悬浮液进行稀释500000倍后接种于15mL产孢培养基上，使每皿大约有20个孢子，将培养皿在26±1℃恒温培养箱内培养10d，扩繁菌液稀释后未诱变前的稀释菌液为对照组。通过致死率及正突变率筛选出紫外诱变的最优时间，检测结果见表2和图4。

表2紫外诱变的致死率及正突变率

照射时间(min)	5	10	20	30	40	50	60	70	80
										致死率(％)	30.1	41.75	68.93	76.7	88.35	94.17	95.15	97.09	98.06
正突变率(％)	0	1.67	9.38	8.33	16.67	0	0	0	0

由表2和图4记载的可知，球孢白僵菌Bb0901致死率随紫外照射时间增加而上升，紫外线照射时间与正突变率呈先上升后下降；其中正突变率最高的时间为紫外照射40min，正突变率为16.67％。

微波诱变最佳时间确定：

取制备好的浓度为1×10⁷个·mL^-1孢子悬浮液10mL于培养皿内，放入家用微波炉(功率为800W，微波频率2450MHz)辐射10s后冰上快速冷却10s再辐射，辐射时间累计分别10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130和140s，将经过紫外线诱变处理的白僵菌孢子悬浮液进行稀释500000倍后接种于15mL产孢培养基上，使每皿大约有20个孢子，然后将培养皿经黑布包裹后在26±1℃恒温培养箱内培养10d，将没有进行微波诱变处理的孢子悬浮液作为对照。通过致死率及正突变率筛选出微波诱变的最优时间，检测结果见表3和图5。

表3微波外诱变的致死率及正突变率

微波时间(s)	致死率(％)	正突变率(％)	微波时间(s)	致死率(％)	正突变率(％)
						10	6.83	0	80	83.56	18.07
20	13.76	0	90	90.99	13.35
						30	33.56	2.98	100	94.46	14.15
40	53.37	4.25	110	97.92	11.25
						50	64.26	2.77	120	94.82	8.67
60	69.21	9.65	130	98.51	0
						70	74.16	18.65	140	98.91	0

由表3和图5记载的可知，球孢白僵菌致死率随微波时间增加而上升，正突变率呈先上升后下降，其中正突变率最高的时间为微波70s为18.65％。

亚硝酸钠诱变最佳时间确定：

取制备好的浓度为1×10⁷个mL^-1孢子悬浮液1mL、醋酸缓冲液(pH 4.5)2mL、不同浓度的亚硝酸钠溶液(0.01mol/L、0.05mol/L、0.1mol/L、0.15mol/L)1mL，将孢子悬浮液、醋酸缓冲液与不同浓度的醋酸缓冲液分别混合后于26℃下分别于1、5、10、15、20、25min后每个样中加入0.07mol/L磷酸氢二钠溶液(pH 8.6)20mL，以终止反应。

将经过亚硝酸钠诱变处理的白僵菌孢子悬浮液分别进行稀释500000倍后分别接种于15mL产孢培养基上，使每皿大约有20个孢子，然后将培养皿经黑布包裹后在26±1℃恒温培养箱内培养10d；将没有进行亚硝酸钠诱变处理的孢子悬浮液作为对照。通过致死率及正突变率筛选出亚硝酸钠诱变的最优时间，计算结果见表4和图6。

表4亚硝酸钠诱变的致死率及正突变率

0.01mol/L亚硝酸钠诱变时间(min)	5	10	15	20	25
						致死率(％)	3.72	7.98	9.04	12.23	16.49
正突变率(％)	0	0	0	0	0
						0.05mol/L亚硝酸钠诱变时间(min)	5	10	15	20	25
致死率(％)	11.17	36.7	51.6	62.23	70.74
						正突变率(％)	0	0	3.3	5.63	12.73
0.1mol/L亚硝酸钠诱变时间(min)	5	10	15	20	25
						致死率(％)	46.25	85.98	95.21	98.4	99.47
正突变率(％)	3.6	19.05	11.11	0	0
						0.15mol/L亚硝酸钠诱变时间(min)	5	10	15	20	25
致死率(％)	68.65	95.21	99.47	98.94	99.47
						正突变率(％)	5.22	11.11	0	0	0

由表4和图6记载的可知，在0.01mol/L的亚硝酸钠浓度下球孢白僵菌致死率随诱变时间增加而上升；在0.05mol/L的亚硝酸钠浓度下球孢白僵菌致死率随诱变时间增加而上升，正突变率随诱变时间增加而上升；在0.1mol/L的亚硝酸钠浓度下球孢白僵菌致死率随诱变时间增加而上升，正突变率呈先上升后下降；在0.15mol/L的亚硝酸钠浓度下球孢白僵菌致死率随诱变时间增加而上升，正突变率呈先上升后下降；其中正突变率最高的条件为浓度0.1mol/L的亚硝酸钠溶液中浸泡10min为19.05％。

复合诱变：

将由实施例1中分离纯化的球孢白僵菌Bb0901扩繁(用含体积百分含量为1％吐温-80的无菌水把球孢白僵菌Bb0901配成1×10⁷mL^-1孢子悬液，取制备好的孢子悬液1mL于产孢培养基内，用涂布棒涂均匀，培养温度为于26±1℃，全黑暗，相对湿度75±5wt.％的恒温培养箱中培养，培养10d)后取三份，均配成浓度为1×10⁷个mL^-1孢子悬浮液分别进行紫外微波复合诱变、微波亚硝酸钠复合诱变和紫外亚硝酸钠复合诱变。

紫外微波复合诱变的具体方法：取制备好的浓度为1×10⁷个·mL^-1孢子悬浮液10mL，以紫外诱变和微波诱变的最佳诱变时间对菌悬浮液进行紫外微波复合诱变，即紫外照射(紫外灯功率为15W，照射距离为28cm，波长为254nm)40min后，立即用家用微波炉(功率为800W，微波频率2450MHz)辐射10s后冰上快速冷却10s再辐射70s，得球孢白僵菌UMCM1、球孢白僵菌UMCM2、球孢白僵菌UMCM3、球孢白僵菌UMCM4和球孢白僵菌UMCM5；

紫外亚硝酸钠复合诱变的具体方法：取制备好的浓度为1×10⁷个·mL^-1孢子悬浮液10mL，以紫外诱变和亚硝酸钠诱变的最佳诱变时间对菌悬浮液进行紫外亚硝酸钠复合诱变，即紫外照射(紫外灯功率为15W，照射距离为28cm，波长为254nm)40min后，立即用浓度为0.1mol/L的亚硝酸钠溶液中浸泡10min，得球孢白僵菌USCM1、球孢白僵菌USCM2、球孢白僵菌USCM3、球孢白僵菌USCM4、球孢白僵菌USCM5、球孢白僵菌USCM6和球孢白僵菌USCM7；

微波亚硝酸钠复合诱变的具体方法：取制备好的浓度为1×10⁷个·mL^-1孢子悬浮液10mL，以微波诱变和亚硝酸钠诱变的最佳诱变时间对菌悬浮液进行微波亚硝酸钠复合诱变，即用家用微波炉(功率为800W，微波频率2450MHz)辐射10s后冰上快速冷却10s再辐射70s后，立即用浓度为0.1mol/L的亚硝酸钠溶液中浸泡10min，得球孢白僵菌MSCM1、球孢白僵菌MSCM2、球孢白僵菌MSCM3和球孢白僵菌MSCM4；

上述不同的孢白僵菌可放于本试验室4℃保存，备用。

对上述孢白僵菌的菌落形态进行观察，外观用肉眼观察，孢子和分生孢子梗用显微镜的高倍镜观察，部分菌株的菌落形态如图7所示，对比差别不明显。

将上述经过复合诱变处理的白僵菌孢子悬浮液分别进行稀释500000倍后分别接种于15mL产孢培养基上，使每皿大约有20个孢子，然后将培养皿经黑布包裹后在26±1℃恒温培养箱内培养10d，将没有进行诱变处理的孢子悬浮液作为对照，比较诱变菌株在菌落大小、产孢量、几丁质酶活力和致病力等方面的变异性，以筛选获得在生长特性或对草地贪夜蛾致病能力有显著提高的突变体。

采用游标卡尺测量菌落直径的大小，测量结果如表5所示

表5菌落直径

供试菌株	菌落直径(mm)	供试菌株	菌落直径(mm)
				UMCM1	46.14	USCM1	44.31
UMCM2	46.68	USCM2	41.24
				UMCM3	44.24	USCM3	41.52
UMCM4	46.79	USCM4	42.81
				UMCM5	46.86	USCM5	44.96
MSCM1	48.16	USCM6	60.37
				MSCM2	40.57	USCM7	44.56
MSCM3	44.07	对照	46.01
				MSCM4	56.24

由表5记载的可知，UMCM1、UMCM2、UMCM4、UMCM5、MSCM1、MSCM4、USCM6菌株直径大于对照(未诱变之前)菌株直径。其中USCM6菌株直径达到60.37mm,该菌株在生长速度上有较大变异。

以诱变前菌株作为对照，以产孢量超过诱变前菌株1倍以上的突变菌株作为正向突变菌株，计算正突变得突变率，计算结果见表6和图8。

表6致死率和正突变得突变率

复合诱变方式	紫外微波复合诱变	紫外亚硝酸钠复合诱变	微波亚硝酸钠复合诱变
				致死率(％)	96.20	94.94	96.26
正突变率(％)	20.83	26.92	16.67

由表6和图8记载的可知，微波亚硝酸钠复合诱变致死率最高，致死率为96.26％，紫外亚硝酸钠复合诱变正突变率最高，正突变率为26.92％。

产孢量测定：用直径为6mm的打孔器切菌落3块于5mL含0.5‰吐温80的溶液(即该溶液为体积百分含量为含0.5‰吐温80)中，充分震荡后在显微镜下用血球计数板计数，以诱变前菌株(球孢白僵菌Bb0901)作为对照，计算产孢量，每个处理重复3次重复。检测结果见表7和图9。

表7不同处理的得到的球孢白僵菌菌株的产孢量(个·mL^-1)

供试菌株	产孢量	供试菌株	产孢量(×10<sup>7</sup>)
				UMCM1	21.43	USCM1	20.98
UMCM2	22.94	USCM2	23.73
				UMCM3	23.96	USCM3	24.68
UMCM4	25.92	USCM4	22.80
				UMCM5	24.65	USCM5	25.05
MSCM1	25.05	USCM6	27.11
				MSCM2	25.75	USCM7	20.98
MSCM3	23.70	对照	10.36
				MSCM4	21.16

由表7和图9记载的可知，经复合诱变后的菌株出现了不同趋向、不同幅度的变异。其中正向突变的菌株共有10株，产孢量最高的菌株为球孢白僵菌USCM6，产孢量为27.11×10⁷个/mL。

几丁质酶活力测定：

将筛选出的16个正突变株配制成浓度为1×10⁸个·mL^-1的孢子悬浮液，分别接种于几丁质培养基平板上，26±1℃条件下培养3d，测量透明圈的直径(D)和菌落直径(d)，以HE值的大小来表示几丁质酶活性的大小，以诱变前菌株(球孢白僵菌Bb0901)作为对照，测定结果见表8和图10。

表8不同处理的得到的球孢白僵菌的几丁质酶活力测定结果

供试菌株	HE值	供试菌株	HE值
				UMCM1	1.32	USCM1	1.09
UMCM2	1.57	USCM2	1.65
				UMCM3	1.82	USCM3	1.25
UMCM4	1.94	USCM4	1.38
				UMCM5	1.10	USCM5	1.68
MSCM1	1.73	USCM6	2.04
				MSCM2	1.55	USCM7	1.58
MSCM3	1.13	对照	1.64
				MSCM4	1.65

由表8和图10记载的可知，16个正向突变菌株的几丁质酶活性其中有6株高于原始菌株。其中HE值最高的菌株为球孢白僵菌USCM6，HE值为2.04。

实施例4

球孢白僵菌诱变复合株对草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)幼虫的致病力测定

草地贪夜蛾3龄幼虫为供试材料，选择健康、大小基本一致的幼虫用于生物测定试验。

将实施例4中几丁质酶活力高的6株球孢白僵菌(UMCM3、UMCM4、MSCM1、USCM2、USCM2和USCM6)孢子分别稀释至1×I0⁷个·mL^-1浓度的孢子悬浮液，以诱变之前菌株(球孢白僵菌Bb0901)对照。采用超低量喷雾喷壶喷至草地贪夜蛾3龄幼虫背部对草地贪夜蛾进行侵染，每个处理30头幼虫，每个处理重复3次，喷施量为只要背面可见小水滴即可；每天记录幼虫死亡数，共记录6d，对死亡幼虫进行保湿观察，确定是否为感菌致死。根据致死率筛选出高毒力菌株，结果见表9和图11。

表9不同球孢白僵菌对草地贪夜蛾幼虫的矫正死亡率

由表9记载的可知，接种后各球孢白僵菌诱变复合株对草地贪夜蛾3龄幼虫的致病力有所不同。而且在调查过程中发现，第3天幼虫开始死亡，球孢白僵菌USCM6突变体的致病力比原始菌株有显著提高，在致死速度上快于原始菌株，说明球孢白僵菌USCM6突变体对草地贪夜蛾幼虫具有较强的致病力。

实施例5

将高几丁质酶活性球孢白僵菌USCM6用体积百分含量为10％吐温-80配成1×10⁷mL^-1孢子悬浮液，采用超低量喷雾喷壶喷至个体大小一致的草地贪夜蛾不同虫龄(1～6龄)幼虫背部，每个培养皿(放入垫有滤纸的9mm无菌培养皿)放30只左右草地贪夜蛾1龄和2龄幼虫草，将草地贪夜蛾3龄及以上龄期幼虫单只放入垫有滤纸的9mm无菌培养皿中，每天喂食一次，喂食玉米叶，喂食量为每次放40平方厘米左右的玉米叶，待快吃完就再放。置于26±1℃，湿度为90wt.％的培养实验室。每个处理30头幼虫，每个处理重复3次，持续观察7d，以诱变之前菌株(球孢白僵菌Bb0901)为对照，每天记录幼虫死亡数。对死亡幼虫进行保湿观察，确定是否为感菌致死，结果见表10和图12。

表10球孢白僵菌USCM6突变体对不同龄期的草地贪夜蛾幼虫的矫正死亡率

龄期	USCM6矫正死亡率(％)	对照矫正死亡率(％)
			1龄	94.32	87.50
2龄	92.05	85.23
			3龄	77.27	61.36
4龄	47.73	44.32
			5龄	30.68	23.86
6龄	15.91	10.23

由表10和图12记载的可知，接种后球孢白僵菌USCM6对草地贪夜蛾不同虫龄幼虫的致病力有所不同，球孢白僵菌USCM6的致病力比原始菌株有显著提高，说明孢白僵菌USCM6对草地贪夜蛾补充虫龄幼虫致病力都有提升。

同时观察球孢白僵菌USCM6侵染草地贪夜蛾幼虫过程如图13所示，侵染草地贪夜蛾幼虫过程中草地贪夜蛾幼虫身体先变红(侵染的4天变红)，之后开始出现菌丝(侵染的5天长菌丝)，最后草地贪夜蛾幼虫身体长满菌丝(侵染的6天长满菌丝。可见本发明球孢白僵菌USCM6能够有效防治草地贪夜蛾。

由上述实施例记载的可知，本发明球孢白僵菌USCM6能够有效防治草地贪夜蛾，且具有环保、不易产生抗性的优势。而且本发明所述球孢白僵菌USCM6相较于球孢白僵菌Bb0901具有更优的防治效果，能够达到94.32％。因此，所述球孢白僵菌Bb0901和球孢白僵菌USCM6在草地贪夜蛾的防治等生产和研究中具有广泛的应用前景。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

序列表

<110> 山西农业大学

<120> 球孢白僵菌USCM6和菌剂及其应用和防治害虫的方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 532

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttaagttcag cgggtagtcc tacctgattc gaggtcaacg ttcagaagtt gggtgtttta 60

cggcgtggcc gcgtcggggt cccggtgcga gctgtattac tgcgcagagg tcgccgcgga 120

cgggccgcca ctccatttca gggccggcgg tgtgctgccg gtccccaacg ccgacctccc 180

caaggggagg tcgagggttg aaatgacgct cgaacaggca tgcccgccag aatgctggcg 240

ggcgcaatgt gcgttcaaag attcgatgat tcactggatt ctgcaattca cattacttat 300

cgcgtttcgc tgcgttcttc atcgatgcca gagccaagag atccgttgtt gaaagttttg 360

attcatttgt tttgccttgc ggcgtattca gaagatgctg gaatacaaga gtttgaggtc 420

cccggcgggc cgctggtcca gtccgcgtcc gggctggggc gagtccgccg aagcaacgat 480

aggtaggttc acagaagggt tagggagttg aaaactcggt aatgatccct cc 532

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcctccgctt attgatatgc 20

Claims

1.一株球孢白僵菌(Beauveria bassiana)USCM6，其特征在于，所述的球孢白僵菌USCM6的保藏编号为CGMCC No.23224。

2.一种防治害虫的菌剂，其特征在于，所述菌剂的有效成分包括权利要求1所述的球孢白僵菌USCM6。

3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂中的球孢白僵菌USCM6的浓度为1×10⁷个/mL。

4.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂还包括表面活性剂。

5.根据权利要求4所述的菌剂，其特征在于，所述表面活性剂包括吐温-80。

6.权利要求1所述的球孢白僵菌USCM6或权利要求2～5任一项所述的菌剂在防治害虫中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述害虫包括夜蛾科害虫。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述夜蛾科害虫包括草地贪夜蛾。

9.一种防治害虫的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

将权利要求2～5任一项所述的菌剂喷施于害虫虫体背部。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述害虫包括害虫幼虫。