CN111808178B

CN111808178B - 大豆疫霉ncr蛋白及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN111808178B
Application number: CN202010731235.3A
Authority: CN
Inventors: 刘西莉; 薛昭霖; 张博瑞; 王为镇; 方媛; 苗建强; 黄中乔
Original assignee: China Agricultural University; Northwest A&F University
Current assignee: China Agricultural University; Northwest A&F University
Priority date: 2020-07-27
Filing date: 2020-07-27
Publication date: 2021-12-03
Anticipated expiration: 2040-07-27
Also published as: CN111808178A

Abstract

本发明公开了一种来自大豆疫霉菌的NCR(Niemann Pick type C‑related)蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的NCR蛋白为如SEQ ID NO.2所示的蛋白质；其编码基因如SEQ ID NO.1所示。通过实验证明，本发明所提供的蛋白在大豆疫霉(Phytophthora sojae)自身生长发育过程中发挥重要作用，具体表现为，该类蛋白缺失后大豆疫霉菌丝生长减慢、孢子囊和游动孢子数量减少、致病力降低、卵孢子形态畸形等。以上结论均为探究大豆疫霉发育及致病分子机制提供了技术基础，为未来新型杀菌剂的研发提供了分子靶标。

Description

大豆疫霉NCR蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及来自大豆疫霉(Phytophthora sojae)的NCR(Niemann Pick type C-related)蛋白PsNCR1及其编码基因与应用。

背景技术

大豆疫霉是一种非常重要的植物病原卵菌，主要引起大豆疫霉根腐病。该病害于上世纪50年代，在北美洲被首次发现并报道；目前，在亚洲、非洲、欧洲、南北美洲和大洋洲的二十多个国家的大豆主产区均有发生。20世纪80年代，该病害在中国东北地区被首次发现，现在中国大豆的主产区黑龙江省和安徽省、内蒙古自治区、山东省等地均有发生。大豆疫霉在大豆的整个生育期均可侵染，对大豆能造成毁灭性灾害，每年可造成超过10亿美元的经济损失。目前，其被归为十大重要致病卵菌之一，被国内外学者广泛关注和研究。

大豆疫霉的生活史分为无性阶段和有性阶段。在无性繁殖阶段，大豆疫霉以无隔多核菌丝进行营养生长。大豆疫霉也可以产生孢子囊与游动孢子，随风、雨或灌溉水进行远距离的传播。孢子囊多呈梨形，通常在植株发病部位表面形成；其可以直接萌发形成菌丝，也可以分化形成单核，无细胞壁，双鞭毛的游动孢子，间接进行病害的侵染循环。游动孢子易受到外界环境的刺激转变为休止孢，再萌发形成菌丝，直接侵入或通过伤口或自然孔口侵入植物根部。游动孢子的游动具有自主性和趋向性，可以使其侵染寄主成功的概率提高；其作为病害循环中主要的再侵染源，在病害大规模流行中起着重要的作用。在有性繁殖阶段，大豆疫霉可以通过同宗配合形成卵孢子。卵孢子壁厚，内含物丰富，能够抵御极端环境，可在土壤中存活数年，在适宜条件下，可以直接萌发产生菌丝侵染寄主植物。

综上所述，大豆疫霉菌丝的生长速度、游动孢子和卵孢子的形成是影响病害的发生发展的重要因素。如果能减慢大豆疫霉菌丝的生长速率、阻断大豆疫霉游动孢子及卵孢子的形成，降低病原菌侵染寄主植物的能力，就可以控制大豆疫霉根腐病的危害。

发明内容

通过发明人的研究发现，大豆疫霉中的NCR蛋白与大豆疫霉菌丝的生长速率、孢子囊和游动孢子的产量以及卵孢子正常的结构形态密切相关，而植物病害正常的侵染循环与菌丝的生长速率、孢子囊、游动孢子和卵孢子的产量以及存活时间呈正相关。因此可以通过调控NCR蛋白来减慢菌丝的生长、阻断正常的孢子囊和/或游动孢子产生以及破坏卵孢子的结构，使大豆疫霉侵染寄主的能力减弱，从而控制大豆疫霉根腐病的发生发展。

因此，本发明的目的之一是提供一类大豆疫霉NCR蛋白，命名为PsNCR1，来源于大豆疫霉菌株P6497，是如下A1)或A2)或A3)或A4)：

A1)氨基酸序列是如SEQ ID NO.2所示的蛋白质；

A2)在如SEQ ID NO.2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

A3)将如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的如SEQ ID NO.2所示的蛋白衍生的蛋白质；

A4)与如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列相似性在75％以上，优选在85％以上，更优选在95％以上且具有与如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列相同功能的氨基酸序列。

为了使A1)中的蛋白便于纯化，可在如序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上Poly-Arg(RRRRR)、Poly-His(HHHHHH)、FLAG(DYKDDDDK)、Strep-tag II(WSHPQFEK)、c-myc(EQKLISEEDL)等标签。

上述A1)-A4)中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述A2)-A4)中蛋白质的编码基因可通过将序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个核苷酸对的错义突变，和/或在其5’端和/或3’端连上述标签的编码序列得到。

其中，A1)中，序列表中SEQ ID NO.2(PsNCR1)由1597个氨基酸残基组成。

本发明目的之二是提供编码所述NCR蛋白的核酸分子。所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。

其中，上述NCR蛋白的编码基因为如下B1)或B2)或B3)：

B1)序列表中SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列所示的DNA分子；

B2)与B1)所示的核苷酸序列的具有75％以上或85％以上或95％以上同一性，且编码上述NCR蛋白的cDNA分子或DNA分子；

B3)在严格条件下与B1)或B2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述NCR蛋白的cDNA分子或DNA分子。

上述编码基因，序列表中SEQ ID NO.1由4917个核苷酸组成；自SEQ ID NO.1的5’端第1-186位、第265-432位、第478-4917位核苷酸为编码序列，编码序列表中SEQ ID NO.2所示的蛋白质(PsNCR1)。

所述的RNA分子，是所述的编码基因转录得到的RNA分子；

优选的，所述RNA分子的序列为如下C1)或C2)：

C1)如SEQ ID NO.1所示的DNA序列转录的RNA序列的相似性在75％以上，进一步优选在85％以上，更优选在95％以上且具有与如SEQ ID NO.1所示的DNA序列转录的RNA序列相同功能的RNA序列；

C2)如SEQ ID NO.1所示的DNA序列转录的RNA序列。

如本发明的DNA序列在严格条件下与如SEQ ID NO.1所示DNA序列能够进行分子杂交且编码如SEQ ID NO.2所示NCR蛋白的DNA序列。上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

本发明目的之三是提供以上所述核酸分子相关的生物材料，包括重组载体、表达盒、重组微生物或转基因植物细胞系。所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体；所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌；所述转基因植物细胞系不包括繁殖材料。具体的可为如下为下述D1)至D10)中的任一种：

D1)含有权利要求2所述编码基因的表达盒；

D2)含有权利要求2所述编码基因的重组载体、或含有D1)所述表达盒的重组载体；

D3)含有权利要求2所述编码基因的重组微生物、或含有D1)所述表达盒的重组微生物、或含有D2)所述重组载体的重组微生物；

D4)含有权利要求2所述编码基因的转基因植物细胞系、或含有D1)所述表达盒的转基因植物细胞系；

D5)含有权利要求2所述编码基因的转基因植物组织、或含有D2)所述表达盒的转基因植物组织；

D6)含有权利要求2所述编码基因的转基因植物器官、或含有D2)所述表达盒的转基因植物器官；

D7)抑制权利要求2所述编码基因表达的核酸分子；

D8)含有D7)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系；

D9)抑制上述RNA分子翻译的核酸分子；

D10)产生D9)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。

本发明目的之五是提供大豆疫霉NCR蛋白及编码NCR蛋白的核酸分子或含有编码NCR蛋白的核酸分子的生物材料的应用。

所述应用为下述1)-6)中任一种或几种：

1)在调控大豆疫霉孢子囊和/或游动孢子产量中的应用；

2)在调控大豆疫霉菌丝生长速率中的应用；

3)在调控大豆疫霉侵染寄主能力中的应用；

4)在维持大豆疫霉卵孢子正常形态结构中应用；

5)在调控大豆疫霉对寄主的致病性中的应用；

6)在抑制和/或杀灭大豆疫霉病菌中的应用；

优选的，其中，所述应用中，包括通过抑制SEQ ID NO.1所述的编码基因中的转录或使其灭活，或抑制所述的RNA分子的翻译，或抑制和/或灭活SEQ ID NO.2所述的NCR蛋白的活性来实现1)-6)所述的应用。

所述应用中，通过抑制如上述的编码基因的转录，或抑制上述的RNA序列的翻译，或抑制和/或失活上述NCR蛋白的活性来调控大豆疫霉游动孢子产量和形态、菌丝生长速率、侵染寄主能力以及卵孢子正常形态结构，从而能够抑制和/或杀灭大豆疫霉病菌的生长。

本发明目的之六是提供所述序列表中SEQ ID NO.2所示的NCR蛋白、上述序列表中SEQ ID NO.1所示的编码基因在作为抑菌或杀菌剂靶标筛选大豆疫霉病菌抑菌或杀菌剂中的应用。

本发明目的之七是提供一种筛选或辅助筛选大豆疫霉抑菌和/或杀菌剂的方法，所述方法包括将待检测物应用于所述大豆疫霉病菌，当所述待检测物能够抑制如上DNA序列的转录，或抑制如上RNA序列的翻译，或抑制和/或失活如上所示的NCR蛋白，则所述待测物质为候选的所述植物大豆疫霉抑菌和/或杀菌剂。

本发明目的之八是提供一种降低大豆疫霉病菌的活性的方法，包括下述步骤：抑制如上述的编码基因的转录或使其缺失，或抑制所述的RNA分子的翻译，或抑制和/或失活如上所述的NCR蛋白的活性；

其中，所述降低大豆疫霉病菌的活性为降低大豆疫霉病菌对寄主的侵染能力和/或对寄主的致病性，和/或者降低大豆疫霉病菌的菌体生长速度，和/或抑制大豆疫霉病菌的孢子囊和游动孢子产量，和/或使大豆疫霉卵孢子结构畸形；

上述方法中，通过所述抑制或降低待抑制活性或待灭活的蛋白的编码基因表达来实现蛋白的灭活，具体的，可通过基因敲除或通过基因沉默实现。

所述基因敲除是指通过同源重组使特定靶基因失活的现象。基因敲除是通过DNA序列的改变使特定靶基因失活。

所述基因沉默是指在不损伤原有DNA的前提下使基因不表达或低表达的现象。基因沉默可发生在两种水平上，一种是由于DNA甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平的基因沉默，另一种是转录后基因沉默，即在基因转录后的水平上通过对靶标RNA进行特异性抑制而使基因失活，包括反义RNA、共抑制(co-suppression)、基因压抑(quelling)、RNA干扰(RNAi)和微小RNA(miRNA)介导的翻译抑制等。

优选的，通过使大豆疫霉中序列表中SEQ ID NO.1所示的基因进行基因敲除，以使所述序列表中SEQ ID NO.2所示的蛋白质所示的蛋白质灭活；

在本发明的一个实施方式中，使上述基因进行基因敲除的方法是基于CRISPR/Cas9的基因敲除法。

具体的，基于CRISPR/Cas9的基因敲除法是将目的基因的Donor载体和sgRNA及Cas9共表达质粒转染大豆疫霉筛选得到所述目的敲除蛋白灭活的重组菌。

所述Donor载体为含有依次连接的待敲除目的基因上游800-1500bp的序列、DodorDNA序列(可以为NPTII或GFP或RFP等基因序列)和待敲除目的基因的下游800-1500bp的序列的重组载体。

sgRNA及Cas9共表达质粒为共同表达靶向待敲除目的基因的sgRNA片段和Cas9的编码的载体，其中，所述待敲除目的基因为PsNCR1基因，靶向于PsNCR1基因的sgRNA序列为GAAGCAAGAAGAGTTGAAGA。

优选的，所述sgRNA及Cas9共表达质粒是以PYF515载体为出发载体，将PsNCR1基因的sgRNA退火得到的双链sgRNA编码序列，插入PYF515载体的Nhe I和Bsa I酶识别位点之间，得到sgRNA及Cas9共表达质粒。

抑制NCR蛋白质表达和/或活性的物质在制备植物大豆疫霉病菌杀菌剂中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述抑制NCR蛋白质表达和/或活性的物质为抑制NCR蛋白质表达和/或抑制NCR蛋白质的编码基因的转录和/或抑制NCR蛋白质的编码基因转录得到的RNA分子的翻译的物质。

试验证明，本发明所提供的NCR蛋白在大豆疫霉自身生长发育过程中起作用。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得的敲除突变体，其生长发育较野生型亲本菌株而言有明显变化，主要包括：PsNCR1单敲除突变体的菌丝生长速率减慢、孢子囊和游动孢子产量降低，以及侵染寄主植物的能力变弱，部分卵孢子形态也有一定程度的畸形；因此，大豆疫霉病菌中NCR蛋白在大豆疫霉营养生长、无性生殖、有性生殖及侵染寄主的各个过程均可发挥重要作用。本发明为大豆疫霉病菌病菌的致病机制研究提供了技术支持，并为未来新型杀菌剂的研发提供了有潜力的分子靶标。

附图说明

图1为大豆疫霉菌株P6497(WT)，空载体对照转化子CK(ΔN1-CK)，PsNCR1单敲除转化子ΔN1系列菌株的菌落直径柱状图(在V8固体培养基上培养5d)；

图2为大豆疫霉菌株P6497(WT)和PsNCR1单敲除转化子的卵孢子畸形率柱状图；

图3为大豆疫霉菌株P6497(WT)，空载体对照转化子CK(ΔN1-CK)，PsNCR1单敲除转化子ΔN1系列菌株的致病力柱状图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

大豆疫霉菌株P6497：为美国俄勒冈州立大学Brett M.Tyler教授馈赠的标准菌株，存放于中国农业大学植物保护学院种子病理与杀菌剂药理实验室，公众可从中国农业大学获得。

培养基或试剂配方：

10％V8固体培养基：100ml V8蔬菜汁，1.4g CaCO₃，搅拌混匀，用去离子水稀释10倍，即加入900ml去离子水，添加15g琼脂，121℃高压湿热灭菌20min。

10％V8液体培养基：100ml V8蔬菜汁，1.4g CaCO₃，搅拌混匀，12000rpm离心5min，取上清，用去离子水稀释10倍，121℃高压湿热灭菌20min。

营养豌豆培养基(Nutrient pea broth，NPB)：125g豌豆加入1l去离子水，121℃高压湿热灭菌20min，纱布过滤获得豌豆营养液；称量2.0g酵母提取物、5.0g葡萄糖、5.0g甘露醇、5.0g山梨醇、2.0g CaCO₃、0.1g CaCl₂、0.5g MgSO₄、3.0g KNO₃、1.0g K₂HPO₄、1.0gKH₂PO₄，搅拌混匀，3000rpm离心10min或静置30min，取上清，用豌豆营养液定容至1l，固体培养基(NPBA)添加15g琼脂粉，湿热灭菌20min。使用前，在无菌操作台中，添加2ml维生素储液(Biotin 6.7×10^-7g/ml；Folic acid 6.7×10^-7g/ml；L-inositol 4.0×10^-5g/ml；Nicotinic acid 4.0×10^-5g/ml；Pyridoxine-HCl 6.0×10^-4g/ml；Riboflavin 5.0×10^- ⁵g/ml；Thiamine-HCl 1.3×10^-3g/ml)以及2ml微量元素储液(FeC₆H₅O₇·3H₂O 5.4×10^-4g/ml；ZnSO₄·7H₂O 3.8×10^-4g/ml；CuSO₄·5H₂O 7.5×10^-4g/ml；MgSO₄·H₂O 3.8×10^-5g/ml；H₃BO₃ 2.5×10^-5g/ml；Na₂MoO₄·H₂O 3.0×10^-5g/ml)。

豌豆甘露醇培养基(Pea Mannitol，PM)：准确称量91.1g甘露醇，1g CaCl₂，2gCaCO₃，加入大约900ml豌豆营养液，搅拌混匀约30min，3000rpm离心10min或静置30min，取上清，用豌豆营养液定容至1l，固体培养基(PMA)添加15g琼脂粉，湿热灭菌20min。

菌丝酶解液(20ml)：10ml 0.8M甘露醇，0.8ml 0.5M KCl，0.8ml 0.5M 4-吗啉乙磺酸，0.4ml 0.5M CaCl₂，0.12g纤维素酶(Calbiochem,cat.No.219466)，0.12g裂解酶(Sigma，cat.No.L1412)，无菌超纯水定容至20ml，轻柔混匀溶解，0.22μm滤膜过滤灭菌，现用现配。

MMG溶液(250ml)：18.22g甘露醇，0.76g MgCl₂·6H₂O，2.0ml0.5M 4-吗啉乙磺酸(pH＝5.7)，超纯水定容至250ml，0.22μm滤膜过滤灭菌。

W5溶液：0.1g KCl，4.6g CaCl₂·2H₂O，2.25g NaCl，7.8g葡萄糖，超纯水溶解定容至250ml，0.22μm滤膜过滤灭菌。

PEG-CaCl₂溶液(40％w/v)：12gPEG 4000，3.75ml 0.5M CaCl₂，3ml无菌超纯水，0.22μm滤膜过滤灭菌。

实施例1、大豆疫霉NCR蛋白PsNCR1及其编码基因的获得

本实施例中大豆疫霉NCR蛋白PsNCR1及其编码基因(或cDNA)可以大豆疫霉标准菌株P6497的DNA(或cDNA)为模板，通过表1所列引物扩增获得。其中，DNA或RNA提取的材料可以为大豆疫霉标准菌株P6497的菌丝体。其中，PsNCR1的编码基因PsNCR1如序列表中SEQ IDNO.1所示，序列表中SEQ ID NO.1由4917个核苷酸组成；自SEQ ID NO.1的5’端第1-186位、第265-432位、第478-4917位核苷酸为编码序列，编码序列表中SEQ ID NO.2所示的蛋白质PsNCR1。上述蛋白或基因也可以人工合成。

表1.PsNCR1全长编码基因扩增引物

实施例2、大豆疫霉PsNCR1基因敲除载体的构建

本实施例中基于CRISPR/Cas9的基因敲除载体构建方法以及相关载体的序列以及NPT II基因序列在文献“Fang,Y.,and Tyler,B.M.(2016).Efficient disruption andreplacement of an effector gene inthe oomycete Phytophthora sojae usingCRISPR/Cas9.Molecular plant pathology,17(1),127-139.”以及“Fang,Y.,Cui,L.,Gu,B.,Arredondo,F.,and Tyler,B.M.(2017).Efficient genome editing in the oomycetePhytophthora sojae using CRISPR/Cas9.Curr.Protoc.Microbiol.44,21A.1.1-21A.1.26.”中公开过。本实施例中使用的pBluescript II SK+同源臂载体质粒(Donor载体)，sgRNA及Cas9共表达质粒PYF515均由美国俄勒冈州立大学Brett M.Tyler教授馈赠。

本实施方式中所用的Donor载体pBS-NPTII-NCR1；sgRNA及Cas9共表达质粒PYF515-NCR1；具体构建方法如下所述：

1)pBS-NPTII-NCR1的构建：以大豆疫霉菌株P6497的DNA为模板，利用TaKaRa-In-Fusion_Tools在线网站(http://www.clontech.com/US/Products/Cloning_and_Competent_Cells/Cloning_Resources/On line_In-Fusion_Tools)设计引物扩增目的基因PsNCR1上游1000bp序列(序列表中SEQ ID NO.3所示，经如表2所示Pbs-NPTII-NCR1-F1和Pbs-NPTII-NCR1-R1所示引物扩增获得)、NPTII基因序列(NPTII基因是以PYF515骨架质粒为模板用引物序列如表2所示Pbs-NPTII-NCR1-F2和Pbs-NPTII-NCR1-R2扩增获得的片段)、PsNCR1下游1000bp序列(序列表中SEQ ID NO.4所示，经引物序列如表2所示Pbs-NPTII-NCR1-F3和Pbs-NPTII-NCR1-R3的引物扩增获得)，利用

HD Cloning Kit将三个扩增片段依次融合连接入克隆载体pBluescript II SK+(EcoR V酶切)，连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，37℃过夜培养后，使用通用引物M13F(序列：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’)/M13R(序列：5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’)扩增、测序验证克隆，将验证正确的含有依次连接的PsNCR1上游1000bp序列、NPTII基因序列和PsNCR1下游1000bp序列的重组表达载体命名为pBS-NPTII-NCR1。

2)PYF515-NCR1的构建：利用sgRNA设计网站EuPaGDT(http://grna.ctegd.uga.edu/)以及RNA结构在线分析工具(http://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/Servers/Predict1/Predict1.html)，选择特异性靶向PsNCR1基因且二级结构较弱的sgRNA序列(sgNCR1：GAAGCAAGAAGAGTTGAAGA，靶向于PsNCR1基因的SEQ IDNo.1的第2895-2914位)，送至公司合成带有NheI和BsaI酶切位点以及HH ribozyme的正反向sgRNA序列引物。用无菌水溶解成100μM溶液。退火反应合成双链sgRNA序列，反应体系：3μl正向链溶液，3μl反向链溶液，3μl 10×T4 DNA Ligase Buffer(NEB)，4μl 0.5M NaCl，21μl超纯无菌水，吸打混匀，100℃反应2min，放至室温自然冷却4h，之后将反应液稀释500倍。再取2μl 10×T4 DNA Ligase Buffer(NEB)，50ng PYF515载体(Nhe I/Bsa I双酶切)，4μl稀释后的双链sgRNA溶液，1μl T4 DNA Ligase，无菌超纯水补齐至20μl，室温反应30min，使用5μl连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，37℃过夜培养后，使用引物对RPL41_Pseq_F(序列：5’-CAAGCCTCACTTTCTGCTGAC TG-3’)/M13F(序列：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’)进行菌落PCR验证，并测序验证阳性克隆，将验证正确可表达上述sgRNA的重组载体命名为PYF515-NCR1。

表2.用于载体构建的引物序列

实施例3、大豆疫霉PsNCR1基因敲除转化子的获得

采用CaCl₂-PEG介导的原生质体转化方法制备PsNCR1基因敲除转化子，卵菌遗传转化的方法在文献“Fang,Y.,and Tyler,B.M.(2016).Efficient disruption andreplacement of an effector gene in the oomycete Phytophthora sojae usingCRISPR/Cas9.Molecular plant pathology,17(1),127-139.”中公开过。

敲除转化子的获得具体为将实施例1中获得的敲除基因PsNCR1的Donor载体、sgRNA及Cas9共表达质粒(pBS-NPTII-NCR1和PYF515-NCR1)共同转入大豆疫霉P6497的原生质体中，将生长出的转化子经G418抗性V8固体培养基平板25℃培养筛选，收集疑似转化子的菌丝体，提取DNA进行PCR测序验证，将阳性转化子再提取RNA进行Q-PCR验证。获得PsNCR1单敲除转化子ΔN1系列菌株。同时，将转入相同载体质粒、经过相同转化步骤但没有发生同源替换的转化子作为CK对照转化子，即ΔN1-CK。

实施例4、大豆疫霉PsNCR1-4基因敲除转化子的生物学形状分析

一、菌丝生长速率检测

将野生型大豆疫霉菌株P6497(WT)，CK对照转化子(ΔN1-CK、)，实施例3得到的敲除转化子：PsNCR1敲除转化子ΔN1系列菌株(ΔN1-69、ΔN1-106、ΔN1-30、ΔN1-15、ΔN1-49)，分别接种于加有15ml V8固体培养基的无菌培养皿(直径9cm)中央，25℃黑暗条件下培养5天，用十字交叉法测量各菌株的菌落直径，每个菌株3次重复。

结果显示，所有测定的PsNCR1单敲除转化子ΔN1系列菌株的菌丝生长速率与野生型大豆疫霉菌株P6497(WT)及对照转化子ΔN1-CK相比显著下降(图1)。实验结果说明所述NCR蛋白参与调控了大豆疫霉的菌丝生长。

二、孢子囊和游动孢子数量及形态检测

制备10％V8固体和液体培养基，将野生型大豆疫霉菌株P6497(WT)、空载体对照转化子CK、实施例3得到的敲除转化子：PsNCR1敲除转化子ΔN1系列菌株，分别接种于V8固体培养基上，25℃条件下黑暗培养5-7天，每株菌株用5mm打孔器打取菌饼10个，放入20ml V8汁液体培养基的无菌培养皿(直径9cm)中，25℃黑暗培养3天后，用20ml无菌去离子水冲洗，每隔30min冲洗1次，共冲洗5次，之后加10ml去离子水定容，置于25℃黑暗条件下4-6h后，通过显微镜观察菌饼上孢子囊产生的数量及形态；8-10h后，通过显微镜观察无菌水中游动孢子产生的数量及形态，3次重复。

结果显示，与野生型大豆疫霉菌株P6497(WT)和空载体对照转化子CK相比，实施例3得到的PsNCR1敲除转化子ΔN1系列菌株孢子囊数量和释放的游动孢子数量明显下降，d但孢子囊和游动孢子形态正常，这说明PsNCR1蛋白主要影响了大豆疫霉孢子囊和游动孢子的数量(表3)。

表3.大豆疫霉菌株P6497中PsNCR1单基因敲除突变体的产孢量

三、卵孢子数量、形态检测及畸形率统计

将野生型大豆疫霉菌株P6497(WT)、对照转化子CK(ΔN1-CK)、实施例3得到的敲除转化子接种于加有15ml V8固体培养基的无菌培养皿(直径9cm)中央，25℃黑暗条件下培养7-14天，通过显微镜观察卵孢子产生的数量和形态，并且统计畸形率，3次重复。

结果显示，实施例3得到的各种类型的敲除转化子的卵孢子数量与野生型菌株P6497(WT)和对照转化子CK相比均无显著变化。但通过普通光学显微镜(40倍物镜)发现PsNCR1敲除转化子ΔN1-15部分卵孢子壁内外层分界不明显，卵质体和脂肪体区不能充满，皱缩。通过对畸形率进行统计分析发现，PsNCR1敲除转化子ΔN1-15具有不到5％的卵孢子畸形率(图2)。说明NCR蛋白可能在一定程度上参与调控了大豆疫霉卵孢子的形态结构。

四、致病力检测

供试大豆植株品种为日本青，种植于育苗盘中(540mm×280mm，每穴80株)，培养基质为2：1配比的泥炭土和蛭石，加入适量的去离子水，在温室中(27±2℃；24h黑暗处理)培养7d备用。

参照上述方法制备游动孢子悬浮液(2×10⁴游动孢子/ml)或在培养5-7d的大豆疫霉V8固体培养基上打5mm菌饼。在大豆黄花苗下胚轴约1cm处接种10μl游动孢子悬浮液或一个菌饼，每株菌接种10-20株黄花苗，25℃黑暗保湿培养3d后，调查大豆疫霉侵染黄花苗下胚轴的病斑长度(mm)。

结果显示，与野生型大豆疫霉菌株P6497(WT)和空载体对照转化子CK相比，实施例3得到的敲除转化子PsNCR1敲除转化子ΔN1系列菌株的致病力均显著下降(图3)。这说明NCR蛋白具有参与调控大豆疫霉侵染寄主植物的能力。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业大学；西北农林科技大学

<120> 大豆疫霉NCR蛋白及其编码基因与应用

<130> MP2019629Z

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4917

<212> DNA

<213> 大豆疫霉(Phytophthora sojae)

<400> 1

atgtggctgt tcgcggccat cagcctcgcg atcgcgacgc cgtgcttccg cgcgtggctc 60

gaggcgctgt tcgccgagct gtccatcatc ttcttcacgt acctgcggct ggtgtcggcc 120

ggcctgagcc tcgtgctgct gctggcgctg gccttccacg gccgccgctt cctgcgcagt 180

cgtcgggtcg ccaaggcgcc gcgagcgggc ggcagcggca gccaagcggc ggatgaggga 240

tccaaggcgt cgctgtcggc caagacgggc ctggcgcgcg tccactggcg gcgcggcacc 300

aggcgccgcg cgctcatgct gcgcgtcaag agcacgacca gcgagatcgc gggcagcggc 360

ttctacccgc cgcagctctg gacctcgtcg ctcttcgcgc tggccatgct gcccattatc 420

aacagcgtcg tggtcggggg cggaggcggc tcgagtctgc gcggactcaa gagcgagacg 480

gcggccgccg cccaaacggc tttcgacgcc gacgcggcgg cactcgtgac gctgcagcag 540

cagctgacga cctgcaagta ctcgggaggc gacgactgtc ttgacgacgt gactgccatc 600

tctgtgctgg ggagctatca gcaggcgagt ggatactgcg tggcctttga cgcggcctat 660

gtgaatgtga cgacgggggc ggcactaccg gcccagtact tccccatcgg ggtggaggag 720

gcccacgccc agggctttgc caacaacttc tcggcgtggt ccgagaccaa ccaggagaag 780

ttcaagacgg actgccccct gctgttcaac gagacggtga gtggagacgg agaggggctg 840

ctgtgctgta ccgagacgca gtacgagatg ctgagcctgc aggtccggaa gctgcctgga 900

gagtgcacgt cctgcaagca gaacctgcgc aacctgtggt gccagttcac gtgccatccg 960

agcaacagcc tgttcgtgga cgtgacgcag gtgcggctta tggagggaga cgcggaccac 1020

gcggacgagg tcttccccgc catcgaggag gccacctact acgtgggcag tgacatggtg 1080

cgcgacctgc acgacttttg tgaggccgac tcgggcttca tgccgctgtt gtgcgggatg 1140

aatgccgatg gtaattgctc gacgacaggc tcggacatgt tggggtacct tggagcgtac 1200

agctttgacg gtgtgggatc gccctcgcag gtgatcttca ctacgatgga gcagctgtca 1260

gcggctgagc aggaggacaa gatctgtgcc tgtgacagca gcaacacgac tggctgcttt 1320

tcgccgatgg atacgcggct tgagtcgtgc gtggatacgt gtggctcgct ctgtgctgtg 1380

agtgatgatg acagccggca gtatcaggcg gcttgctaca gttccggcag tacgtcggca 1440

tccgacgatt tgagcactgt cactacagcc acgaccagca ccagcgctgc tgataagctt 1500

gagtctttac tgtcggattt gtcgtcccgt gcggagggtg gtagttttgc cgtgctaaac 1560

tatgtccttg ctgttctcgc attctttggc gccacagcgc ttgcgctcgg cttcgcgtac 1620

tcgacgcggt acggcaggaa gaagcgccag tctgtgctgg acgaccctgt taacggtttg 1680

ggatctggaa tgctgtcact cgtgaatttg gatcagttga agggaatcgg acgttgggat 1740

gaccggctga cgatgcactt gaaacgctgg ggagatttcg tggccatggg gaaccacccg 1800

ttgtacatta ttctactgtc gttgatggtt gtcgtttgct gctcgagtgg gttgatccgc 1860

atggaagtgg agacggactc catgaagctg tgggtttccg gtaggagctc tgtttttcag 1920

gagaggacgc gcttcggcga gatgcttggg ccagtggatc gtatggaacg actggtcctt 1980

gtcactaagg acggcggcgc agtgaccaga ccagcgtata tcaaggaggc gatccgcttg 2040

cagcaagtca ttggaagcga ggttgccgct gacagtatta cactgagtga gatctgcgtc 2100

aaagacgcct cgagctctcc atgccaggtg aattccgtaa cgcagtactt ccagaacagc 2160

atggatcact tcaacatgta cgatgcgtat gggctcgtag gcaagcactt gagcaactgc 2220

gctaatgctc cggaacgagc ggacggtaat gtgtgcagtg agctgcaagt gcaactcaat 2280

gcctcgggtg cttcgcttcc gacgagtatg agcggctgcc cttgtgcgtc gtcgtttggg 2340

gtgccgatgg ctgagctgga gaagtacctg ggcggattga gtactgacgg tggatcattg 2400

aatgccagtg cttatctgga gcaagcgaca actctctttt caactgccat ggtgactaac 2460

caccaggatg gtgctaagaa cgcagatgca atcgcttggg aacgcgcgta tatcgcgcgg 2520

atggagaaag aatcggatac caacacgatg tatgatatct attatgctgc agaggtgtct 2580

gctgacgacg agttcgtggc tgcttccaac ttggacatcg tcttcaaggc tggaattgca 2640

ggctttctct ttatgtttgt ttacgtggtc attggactga accactggaa gctggactac 2700

cgcttcttcc attcgtcaaa gatcggtgtg ggtttcatgg gcgttgcgtg catcctgatg 2760

gccgtgggcg ggaccttggg tatctttgcg tggactggag taaagcttca gatcgtgacg 2820

ctcgttgtga tgccggtggt tgtacttgcg atcggcactg gaaacatctt cctgatcctg 2880

catgccgtcg acctgaagca agaagagttg aagatggagc agcgctcact gtttgtgggt 2940

cttgaagaca acgatttcgg tattcatgag atcacgtgtg tgctgctgtg cgaggcaacg 3000

ggttatatcg gccccagcat gatcgcgacg tgcgtatgcg agtgctgtat cgttgctttt 3060

gcagcatatt cgaccatgcc agctgcacag tggctcgctg gatcgttggt gcttgggctc 3120

gcagccagtt ttgctttgca aatgaccttg ttcctcgcca tcgtagcgct ggacaagcgt 3180

cgtgagctca gcggcacgta cgatgtgatc tgctgtaagc gggcatcgtt cgctcgccgc 3240

cctcgcctct ccgaagacga gacgactgct gcgaccgaaa actcgtcgtt ccctggaagc 3300

actatttcac tgcccgactt gaacttgatg aaccgatgcg ttgctggata catccatgtg 3360

ctgctcaaga aggtgtcgaa ggtgttggtg ctcctcgtgt ttgccgcgtg tactctggcg 3420

gcgattgtct ccatcgaggc aatggatcgc ggtctttcac cgaactcgtt catcccgacg 3480

aactcgtatc tgcacgcata ctaccgtgca gtggacgaaa atgacttgtc gacgaaggag 3540

ttccctgcct atttcgttgt tgaagctggc tacggaagca accctaccgg attcaacgat 3600

ctcgccaacg atgcggaagc tcaatgcaaa ctgtgctcgt cgaaggagtt ctgcgacgac 3660

ttgtcgatcc cgaatattct cagtgcgttg gttgccgctg gggaaagcaa cgtcacgttt 3720

ttcaaggacg gcactgttgt tggatcatgg ttggacgact tctggagctt tgttgaccca 3780

gccagtgagt gctgccgcgt cgatgcggag aacgactact cgtattacgc tattctaccg 3840

gaagagagca gcgctgaata tgtgctcaag cgcgcgtcca acgcgccatc gtgtctcgct 3900

gactcaagtg cggtgctctc agtgcccgat gaatcgttca tgtcgttgtt cagcatgttc 3960

tcgactgcgg ctgctggacc cttgtgctcg tacgcagcag gcacgcgcta ccatggacag 4020

ctcagcgttg atagccaacc tattcctgcc atgagcagta gtgctgctgc gggcgtgact 4080

ctcaatggca ctggctacgg cagtgatgtg acggcgtttg tgtacaaggt tctgagcact 4140

acagtcggct cgtcaaagat ttcaggaagc caagaaggag caatcgcagc ctactcgcaa 4200

gctcagcaca ttgccaagtg gatcagcgag gaaactggca tcgatgtgtg ggcgtactcc 4260

cccgagtacg tttatctgga tcagttccac tcggttcgtc gtactgcgta cattgtggtg 4320

ggtgtcggac tcgcagtggt gttcgtgctg cagagtttgg ctctggggag ttactggtat 4380

ggatttgcgg tgacttgtgt cgctgcagcc acggttgtcc aagtcgctgg cctcatgatg 4440

ccgatggggg tcccaatcaa ctcgctttcg attgtgagcc tctcgatcgc cgtcaccttt 4500

tccgtcggat tctcggggca ttttgctcgt ctttttgcca aggctcgcac catcactgac 4560

gacttgggct actcacctgg cggcgatgcc tgcgttcgga aggtgttggc gcagcttctc 4620

gcgtcgtgga cgttgggcgt cgccgtctcc aagttcgttg ccatcgcagc gctcgcgctt 4680

gtcgccacgc ccgtcttcga acccgctggg aactgtttct tccggacgct gatggctgca 4740

gcggtgtgcg cgtggctgaa cagcgccgtg ctgcttcccg tcgggctcag catttgtgtg 4800

gatgccacgg aaggccgcgt gcgtgacgtg aagccgacga atgaagaggg cggggagtac 4860

tcgcgtgaga gcccttcgtc gtcataccac actgcgccgc cgactagcaa gtactga 4917

<210> 2

<211> 1597

<212> PRT

<213> 大豆疫霉(Phytophthora sojae)

<400> 2

Met Trp Leu Phe Ala Ala Ile Ser Leu Ala Ile Ala Thr Pro Cys Phe

1 5 10 15

Arg Ala Trp Leu Glu Ala Leu Phe Ala Glu Leu Ser Ile Ile Phe Phe

20 25 30

Thr Tyr Leu Arg Leu Val Ser Ala Gly Leu Ser Leu Val Leu Leu Leu

35 40 45

Ala Leu Ala Phe His Gly Arg Arg Phe Leu Arg Ser Arg Arg Thr Gly

50 55 60

Leu Ala Arg Val His Trp Arg Arg Gly Thr Arg Arg Arg Ala Leu Met

65 70 75 80

Leu Arg Val Lys Ser Thr Thr Ser Glu Ile Ala Gly Ser Gly Phe Tyr

85 90 95

Pro Pro Gln Leu Trp Thr Ser Ser Leu Phe Ala Leu Ala Met Leu Pro

100 105 110

Ile Ile Asn Ser Val Val Thr Ala Ala Ala Ala Gln Thr Ala Phe Asp

115 120 125

Ala Asp Ala Ala Ala Leu Val Thr Leu Gln Gln Gln Leu Thr Thr Cys

130 135 140

Lys Tyr Ser Gly Gly Asp Asp Cys Leu Asp Asp Val Thr Ala Ile Ser

145 150 155 160

Val Leu Gly Ser Tyr Gln Gln Ala Ser Gly Tyr Cys Val Ala Phe Asp

165 170 175

Ala Ala Tyr Val Asn Val Thr Thr Gly Ala Ala Leu Pro Ala Gln Tyr

180 185 190

Phe Pro Ile Gly Val Glu Glu Ala His Ala Gln Gly Phe Ala Asn Asn

195 200 205

Phe Ser Ala Trp Ser Glu Thr Asn Gln Glu Lys Phe Lys Thr Asp Cys

210 215 220

Pro Leu Leu Phe Asn Glu Thr Val Ser Gly Asp Gly Glu Gly Leu Leu

225 230 235 240

Cys Cys Thr Glu Thr Gln Tyr Glu Met Leu Ser Leu Gln Val Arg Lys

245 250 255

Leu Pro Gly Glu Cys Thr Ser Cys Lys Gln Asn Leu Arg Asn Leu Trp

260 265 270

Cys Gln Phe Thr Cys His Pro Ser Asn Ser Leu Phe Val Asp Val Thr

275 280 285

Gln Val Arg Leu Met Glu Gly Asp Ala Asp His Ala Asp Glu Val Phe

290 295 300

Pro Ala Ile Glu Glu Ala Thr Tyr Tyr Val Gly Ser Asp Met Val Arg

305 310 315 320

Asp Leu His Asp Phe Cys Glu Ala Asp Ser Gly Phe Met Pro Leu Leu

325 330 335

Cys Gly Met Asn Ala Asp Gly Asn Cys Ser Thr Thr Gly Ser Asp Met

340 345 350

Leu Gly Tyr Leu Gly Ala Tyr Ser Phe Asp Gly Val Gly Ser Pro Ser

355 360 365

Gln Val Ile Phe Thr Thr Met Glu Gln Leu Ser Ala Ala Glu Gln Glu

370 375 380

Asp Lys Ile Cys Ala Cys Asp Ser Ser Asn Thr Thr Gly Cys Phe Ser

385 390 395 400

Pro Met Asp Thr Arg Leu Glu Ser Cys Val Asp Thr Cys Gly Ser Leu

405 410 415

Cys Ala Val Ser Asp Asp Asp Ser Arg Gln Tyr Gln Ala Ala Cys Tyr

420 425 430

Ser Ser Gly Ser Thr Ser Ala Ser Asp Asp Leu Ser Thr Val Thr Thr

435 440 445

Ala Thr Thr Ser Thr Ser Ala Ala Asp Lys Leu Glu Ser Leu Leu Ser

450 455 460

Asp Leu Ser Ser Arg Ala Glu Gly Gly Ser Phe Ala Val Leu Asn Tyr

465 470 475 480

Val Leu Ala Val Leu Ala Phe Phe Gly Ala Thr Ala Leu Ala Leu Gly

485 490 495

Phe Ala Tyr Ser Thr Arg Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Gln Ser Val Leu

500 505 510

Asp Asp Pro Val Asn Gly Leu Gly Ser Gly Met Leu Ser Leu Val Asn

515 520 525

Leu Asp Gln Leu Lys Gly Ile Gly Arg Trp Asp Asp Arg Leu Thr Met

530 535 540

His Leu Lys Arg Trp Gly Asp Phe Val Ala Met Gly Asn His Pro Leu

545 550 555 560

Tyr Ile Ile Leu Leu Ser Leu Met Val Val Val Cys Cys Ser Ser Gly

565 570 575

Leu Ile Arg Met Glu Val Glu Thr Asp Ser Met Lys Leu Trp Val Ser

580 585 590

Gly Arg Ser Ser Val Phe Gln Glu Arg Thr Arg Phe Gly Glu Met Leu

595 600 605

Gly Pro Val Asp Arg Met Glu Arg Leu Val Leu Val Thr Lys Asp Gly

610 615 620

Gly Ala Val Thr Arg Pro Ala Tyr Ile Lys Glu Ala Ile Arg Leu Gln

625 630 635 640

Gln Val Ile Gly Ser Glu Val Ala Ala Asp Ser Ile Thr Leu Ser Glu

645 650 655

Ile Cys Val Lys Asp Ala Ser Ser Ser Pro Cys Gln Val Asn Ser Val

660 665 670

Thr Gln Tyr Phe Gln Asn Ser Met Asp His Phe Asn Met Tyr Asp Ala

675 680 685

Tyr Gly Leu Val Gly Lys His Leu Ser Asn Cys Ala Asn Ala Pro Glu

690 695 700

Arg Ala Asp Gly Asn Val Cys Ser Glu Leu Gln Val Gln Leu Asn Ala

705 710 715 720

Ser Gly Ala Ser Leu Pro Thr Ser Met Ser Gly Cys Pro Cys Ala Ser

725 730 735

Ser Phe Gly Val Pro Met Ala Glu Leu Glu Lys Tyr Leu Gly Gly Leu

740 745 750

Ser Thr Asp Gly Gly Ser Leu Asn Ala Ser Ala Tyr Leu Glu Gln Ala

755 760 765

Thr Thr Leu Phe Ser Thr Ala Met Val Thr Asn His Gln Asp Gly Ala

770 775 780

Lys Asn Ala Asp Ala Ile Ala Trp Glu Arg Ala Tyr Ile Ala Arg Met

785 790 795 800

Glu Lys Glu Ser Asp Thr Asn Thr Met Tyr Asp Ile Tyr Tyr Ala Ala

805 810 815

Glu Val Ser Ala Asp Asp Glu Phe Val Ala Ala Ser Asn Leu Asp Ile

820 825 830

Val Phe Lys Ala Gly Ile Ala Gly Phe Leu Phe Met Phe Val Tyr Val

835 840 845

Val Ile Gly Leu Asn His Trp Lys Leu Asp Tyr Arg Phe Phe His Ser

850 855 860

Ser Lys Ile Gly Val Gly Phe Met Gly Val Ala Cys Ile Leu Met Ala

865 870 875 880

Val Gly Gly Thr Leu Gly Ile Phe Ala Trp Thr Gly Val Lys Leu Gln

885 890 895

Ile Val Thr Leu Val Val Met Pro Val Val Val Leu Ala Ile Gly Thr

900 905 910

Gly Asn Ile Phe Leu Ile Leu His Ala Val Asp Leu Lys Gln Glu Glu

915 920 925

Leu Lys Met Glu Gln Arg Ser Leu Phe Val Gly Leu Glu Asp Asn Asp

930 935 940

Phe Gly Ile His Glu Ile Thr Cys Val Leu Leu Cys Glu Ala Thr Gly

945 950 955 960

Tyr Ile Gly Pro Ser Met Ile Ala Thr Cys Val Cys Glu Cys Cys Ile

965 970 975

Val Ala Phe Ala Ala Tyr Ser Thr Met Pro Ala Ala Gln Trp Leu Ala

980 985 990

Gly Ser Leu Val Leu Gly Leu Ala Ala Ser Phe Ala Leu Gln Met Thr

995 1000 1005

Leu Phe Leu Ala Ile Val Ala Leu Asp Lys Arg Arg Glu Leu Ser Gly

1010 1015 1020

Thr Tyr Asp Val Ile Cys Cys Lys Arg Ala Ser Phe Ala Arg Arg Pro

1025 1030 1035 1040

Arg Leu Ser Glu Asp Glu Thr Thr Ala Ala Thr Glu Asn Ser Ser Phe

1045 1050 1055

Pro Gly Ser Thr Ile Ser Leu Pro Asp Leu Asn Leu Met Asn Arg Cys

1060 1065 1070

Val Ala Gly Tyr Ile His Val Leu Leu Lys Lys Val Ser Lys Val Leu

1075 1080 1085

Val Leu Leu Val Phe Ala Ala Cys Thr Leu Ala Ala Ile Val Ser Ile

1090 1095 1100

Glu Ala Met Asp Arg Gly Leu Ser Pro Asn Ser Phe Ile Pro Thr Asn

1105 1110 1115 1120

Ser Tyr Leu His Ala Tyr Tyr Arg Ala Val Asp Glu Asn Asp Leu Ser

1125 1130 1135

Thr Lys Glu Phe Pro Ala Tyr Phe Val Val Glu Ala Gly Tyr Gly Ser

1140 1145 1150

Asn Pro Thr Gly Phe Asn Asp Leu Ala Asn Asp Ala Glu Ala Gln Cys

1155 1160 1165

Lys Leu Cys Ser Ser Lys Glu Phe Cys Asp Asp Leu Ser Ile Pro Asn

1170 1175 1180

Ile Leu Ser Ala Leu Val Ala Ala Gly Glu Ser Asn Val Thr Phe Phe

1185 1190 1195 1200

Lys Asp Gly Thr Val Val Gly Ser Trp Leu Asp Asp Phe Trp Ser Phe

1205 1210 1215

Val Asp Pro Ala Ser Glu Cys Cys Arg Val Asp Ala Glu Asn Asp Tyr

1220 1225 1230

Ser Tyr Tyr Ala Ile Leu Pro Glu Glu Ser Ser Ala Glu Tyr Val Leu

1235 1240 1245

Lys Arg Ala Ser Asn Ala Pro Ser Cys Leu Ala Asp Ser Ser Ala Val

1250 1255 1260

Leu Ser Val Pro Asp Glu Ser Phe Met Ser Leu Phe Ser Met Phe Ser

1265 1270 1275 1280

Thr Ala Ala Ala Gly Pro Leu Cys Ser Tyr Ala Ala Gly Thr Arg Tyr

1285 1290 1295

His Gly Gln Leu Ser Val Asp Ser Gln Pro Ile Pro Ala Met Ser Ser

1300 1305 1310

Ser Ala Ala Ala Gly Val Thr Leu Asn Gly Thr Gly Tyr Gly Ser Asp

1315 1320 1325

Val Thr Ala Phe Val Tyr Lys Val Leu Ser Thr Thr Val Gly Ser Ser

1330 1335 1340

Lys Ile Ser Gly Ser Gln Glu Gly Ala Ile Ala Ala Tyr Ser Gln Ala

1345 1350 1355 1360

Gln His Ile Ala Lys Trp Ile Ser Glu Glu Thr Gly Ile Asp Val Trp

1365 1370 1375

Ala Tyr Ser Pro Glu Tyr Val Tyr Leu Asp Gln Phe His Ser Val Arg

1380 1385 1390

Arg Thr Ala Tyr Ile Val Val Gly Val Gly Leu Ala Val Val Phe Val

1395 1400 1405

Leu Gln Ser Leu Ala Leu Gly Ser Tyr Trp Tyr Gly Phe Ala Val Thr

1410 1415 1420

Cys Val Ala Ala Ala Thr Val Val Gln Val Ala Gly Leu Met Met Pro

1425 1430 1435 1440

Met Gly Val Pro Ile Asn Ser Leu Ser Ile Val Ser Leu Ser Ile Ala

1445 1450 1455

Val Thr Phe Ser Val Gly Phe Ser Gly His Phe Ala Arg Leu Phe Ala

1460 1465 1470

Lys Ala Arg Thr Ile Thr Asp Asp Leu Gly Tyr Ser Pro Gly Gly Asp

1475 1480 1485

Ala Cys Val Arg Lys Val Leu Ala Gln Leu Leu Ala Ser Trp Thr Leu

1490 1495 1500

Gly Val Ala Val Ser Lys Phe Val Ala Ile Ala Ala Leu Ala Leu Val

1505 1510 1515 1520

Ala Thr Pro Val Phe Glu Pro Ala Gly Asn Cys Phe Phe Arg Thr Leu

1525 1530 1535

Met Ala Ala Ala Val Cys Ala Trp Leu Asn Ser Ala Val Leu Leu Pro

1540 1545 1550

Val Gly Leu Ser Ile Cys Val Asp Ala Thr Glu Gly Arg Val Arg Asp

1555 1560 1565

Val Lys Pro Thr Asn Glu Glu Gly Gly Glu Tyr Ser Arg Glu Ser Pro

1570 1575 1580

Ser Ser Ser Tyr His Thr Ala Pro Pro Thr Ser Lys Tyr

1585 1590 1595

<210> 3

<211> 1000

<212> DNA

<213> 大豆疫霉(Phytophthora sojae)

<400> 3

gtcgtcgcga ggatacatcg acgtagacgt ctctgccgat ggtggagccg ctgagctcct 60

tgagctcctt cgctcgaagc cggcaccact ggtggtgtgc tgctggccgg cccgccgtcc 120

tggcggtgca gcaacgatga ctcagcgccg ccgcgcgtca aagtgaacaa gtccagacaa 180

gttcagtcga gctgaaggcg tcgccacgtc gagcggcttc gctttcggtg tgcgacaagc 240

gatgcccctc tcttcaaggg acaatgctgt ccctacagca aggggccggc acgctgtgcc 300

cctggagcag acgccgcagt tgatcccttc gcggcaacag caacagcgac tcgaacaggc 360

agctcggcga gctctcgctg cccgcgtctg ctccggatgg gagtgccgca cccactttgc 420

aggcccacgc tcgaccaggt tgattcaagc ccgcgacagc aagcccgaga tttgaggcgg 480

gagggaacag tagaccatgc tgcagcccaa cgccatgctg ccgtccttgt cgtccaaggc 540

gacagagctc acagtcaagt tgtcgccagg cttacttgcg atgagaagac ctccagcgcg 600

cgagcgagcg gaggctccgt gcagccaaga aggcggcggc agcgagcgag cagattcact 660

cgagcacgtc gatgtgcgtc tgtcgaccga cagactcgga agaggtgtcg caacggaccg 720

catactgagc ccaggtcact ttatggaaaa aaccatatgg atacgcgcat ctggtttcag 780

aggtttttac acagcctctc attacctgaa cgccaatgtc gataccgtcg tgctatacag 840

gcaatgtgtt gtcgaaggtg atggcccctc tccgtcgccc cgtcgctgca gtgatgaagt 900

gccactctgt cactatcctc ccccgcttta cgctttcgcc ttgcggctgc tatgacatca 960

tttcgatatc ggcgcccaga ggatcacagg accaggcgcc 1000

<210> 4

<211> 1000

<212> DNA

<213> 大豆疫霉(Phytophthora sojae)

<400> 4

tgggctggct ggctatccga ccgctcacta gcactcggta tgcatgtata tgaaccacaa 60

gacgacaaaa cacgagaaaa aagcgacgaa gacgctggag atgatcccga atgaacaaga 120

agcccatgtg tacacttctg ctatgggcaa gcagcaaaag gacaaacaaa agccggagat 180

tgcaacagcg catgaatgta ttttatattt tcatttcctg agggcttgcc cccccgtccc 240

ctttgcgtcc actgcttcga gtcggggttt cctgccttgg tcgcgaatgg cgagtatttc 300

ggccccggaa gctacaggta agtcctctcc aaaatagttg tgccagcacc acttcaacgt 360

tgtccccatt taggctgaag gagctggcgc tgctgcggtt gagcggtcga acaacctgaa 420

ggtgtccagg cgacggcgtg cttcctctcg cgaccatgag caacgcgcct acggcggggg 480

gcgccatgtc caacatgttc agtcctcgca gtacgaatgg gaacaaccgg tatcacctgg 540

ccagcggtgg agctcgtacg ccgcgtgtgt ttccgccaga tgtgcagagt atcccgctga 600

gtccgtcgcg gctcgagagc ccgatgtttc gagagcgggt gacggcgctg atgcagcaag 660

gcgacacgta cgcgaagcgg ctggacagcg agcgtcgtcg gtcccatgac ctggatctag 720

cgctgcgcac cctgcgagtc gagcacttcc aagcgcgcaa ggcgctgtgt gacgccacga 780

acgcccagct ctgcgctgct acgacagagc tgaagccgat tcggacgctc gagaaccgcc 840

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Claims

1.大豆疫霉病菌（Phytophthora sojae）NCR蛋白、大豆疫霉病菌NCR蛋白的编码基因、大豆疫霉病菌NCR蛋白的编码基因转录得到的RNA分子、或者含有与大豆疫霉病菌NCR蛋白的编码基因或其转录的RNA分子相关的核酸分子的生物材料的应用，所述应用为下述1)-5)中任一种或几种：

1）在调控大豆疫霉孢子囊和/或游动孢子产量的应用；

2）在调控大豆疫霉菌丝生长速率中的应用；

3）在调控大豆疫霉侵染寄主能力中的应用；

4）在调控大豆疫霉卵孢子正常形态结构中应用；

5）在调控大豆疫霉对寄主的致病性中的应用；

所述大豆疫霉病菌NCR蛋白，是氨基酸序列如序列2所示的蛋白质；

所述大豆疫霉病菌NCR蛋白的编码基因为序列表中序列1所述的核苷酸序列所示的DNA分子；

所述大豆疫霉病菌NCR蛋白的编码基因转录得到的RNA分子的序列为序列1所示的DNA序列转录的RNA序列；

所述含有与大豆疫霉病菌NCR蛋白的编码基因或其转录的RNA分子相关的核酸分子的生物材料为下述D1）至D7）中的任一种：

D1）含有大豆疫霉病菌NCR蛋白的编码基因的表达盒；

D2）含有大豆疫霉病菌NCR蛋白的编码基因的重组载体、或含有D1）所述表达盒的重组载体；

D3）含有大豆疫霉病菌NCR蛋白的编码基因的重组微生物、或含有D1）所述表达盒的重组微生物、或含有D2）所述重组载体的重组微生物；

D4）抑制大豆疫霉病菌NCR蛋白的编码基因表达的核酸分子；

D5）含有D4）所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物；

D6）抑制所述大豆疫霉病菌NCR蛋白的编码基因转录得到的RNA分子翻译的核酸分子；

D7）产生D6）所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。

2.根据权利要求1所述的应用，其中，包括通过抑制所述的编码基因中的转录或使其灭活，或抑制所述的RNA分子的翻译，或抑制和/或灭活如所述的NCR蛋白来实现1）-5）所述的应用。

3.权利要求1中所述的大豆疫霉病菌NCR蛋白、大豆疫霉病菌NCR蛋白的编码基因、大豆疫霉病菌NCR蛋白的编码基因转录得到的RNA分子在作为抑菌或杀菌剂靶标筛选大豆疫霉病菌抑菌或杀菌剂中的应用。

4.一种筛选或辅助筛选大豆疫霉病菌抑菌和/或杀菌剂的方法，所述方法包括将待检测农药制剂应用于大豆疫霉病菌，当所述农药制剂能够抑制大豆疫霉病菌NCR蛋白的编码基因的转录，或抑制大豆疫霉病菌NCR蛋白的编码基因转录得到的RNA分子的翻译，或抑制大豆疫霉病菌NCR蛋白的活性或使其灭活，则所述农药制剂为所述大豆疫霉病菌的抑菌和/或杀菌剂；

所述大豆疫霉病菌NCR蛋白的编码基因转录得到的RNA分子的序列为序列1所示的DNA序列转录的RNA序列。

5.一种降低大豆疫霉病菌的活性的方法，包括下述步骤：抑制所述大豆疫霉病菌NCR蛋白的编码基因的转录或使其缺失，或抑制大豆疫霉病菌NCR蛋白的编码基因转录得到的RNA分子的翻译，或抑制大豆疫霉病菌NCR蛋白的活性或使其灭活；

其中，所述降低大豆疫霉病菌的活性为降低大豆疫霉病菌对寄主的侵染能力和/或对寄主的致病性，和/或者降低大豆疫霉病菌的菌丝生长速度，和/或抑制大豆疫霉病菌的孢子囊和/或游动孢子的产量，和/或使大豆疫霉卵孢子结构畸形；

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：通过对大豆疫霉中序列表中序列1所示的基因进行基因敲除，以使大豆疫霉病菌NCR蛋白灭活。

7.抑制如序列2所示的大豆疫霉病菌NCR蛋白表达和/或活性的农药制剂在制备植物大豆疫霉病菌杀菌剂中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述抑制大豆疫霉病菌NCR蛋白表达和/或活性的农药制剂为抑制NCR蛋白表达和/或抑制NCR蛋白的编码基因的转录和/或抑制NCR蛋白的编码基因转录得到的RNA分子的翻译的农药制剂。