CN116425843A - 辣椒疫霉生长发育调控蛋白PcAGO1及其编码基因与应用 - Google Patents

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CN116425843A CN202310401033.6A CN202310401033A CN116425843A CN 116425843 A CN116425843 A CN 116425843A CN 202310401033 A CN202310401033 A CN 202310401033A CN 116425843 A CN116425843 A CN 116425843A
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Abstract

本发明公开了一种来自辣椒疫霉(Phytophthora capsici)病菌的含有ArgoN、PAZ、MID和Piwi结构域的生长发育调控蛋白PcAGO1及其编码基因与应用。该生长发育调控蛋白PcAGO1具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，其编码基因具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。本发明PcAGO1蛋白的主要作用是辣椒疫霉生长发育所必须的，PcAGO1蛋白缺失后辣椒疫霉菌丝生长速度降低、不产生孢子囊、游动孢子及卵孢子、丧失致病能力。本发明的基因在控制辣椒疫霉引起的疫病中具有很高的应用价值，以该蛋白为作用靶标开发的杀菌剂对控制辣椒疫霉引起的疫病的发生和流行具有重要的实践意义。

Description

辣椒疫霉生长发育调控蛋白PcAGO1及其编码基因与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及来自辣椒疫霉(Phytophthora capsici)的含有ArgoN、PAZ、MID和Piwi结构域的生长发育调控蛋白PcAGO1及其编码基因与应用。
背景技术
辣椒疫霉(Phytophthora capsici)是典型的腐霉科疫霉属植物病原卵菌，在世界范围分布广泛。作为一种重要的土传病原菌，其有着广泛的寄主范围，可侵染包括茄科中的辣椒、烟草以及豆科、葫芦科等26科70多种蔬菜作物。辣椒疫霉在苗期至果期均会引起植株的病害，并导致作物的根茎部、果实的腐烂，严重时导致植株萎蔫甚至猝倒，对作物产量和品质的影响极大，造成严重的经济损失。辣椒疫霉孢子囊产生的游动孢子是再次侵染的重要来源，可经雨水、土壤和气流等途径传播，游动孢子附着在寄主植物表面后会成为休止孢随后萌发产生菌丝以侵染寄主。在田间存在两种交配型时也会发生异宗配合产生卵孢子，卵孢子有抵御逆境的能力，在环境条件合适时其可萌发产生菌丝侵染寄主。
在生物体内普遍存在一种由双链RNA引发的基因沉默现象称为RNA干扰(RNAinterference，RNAi)，可分为转录水平和转录后水平。具有发卡结构或双链的RNA可以被酶剪切加工形成20-30bp的小RNA，小RNA通过与蛋白Argonaute(AGO)形成基因沉默复合体进而行使基因沉默功能。RNAi对生物的生长发育至关重要，因此形成基因沉默复合体的核心蛋白AGO发挥着非常重要的功能。此外，AGO蛋白还在植物、病原体的外泌体中被发现，揭示了该蛋白在植物免疫及病原菌致病中的关键生物学功能。如果能够破坏辣椒疫霉游动孢子和卵孢子的产生、降低菌丝生长速率，进一步抑制病原菌的致病能力就可以阻断辣椒疫霉正常的病害循环从而控制辣椒疫霉引起的植物疫病的流行。
发明内容
基于此，通过发明人的研究发现，辣椒疫霉中存在含有AGO蛋白保守结构域ArgoN、PAZ、MID和Piwi的生长发育调控蛋白PcAGO1。该生长发育调控蛋白与辣椒疫霉的菌丝生长速率、孢子囊产量及形态、游动孢子和卵孢子数量密切相关，并且还与辣椒疫霉的致病力相关。因此，可以通过控制生长发育调控蛋白PcAGO1来阻断辣椒疫霉的正常侵染，达到控制(抑制或阻断)辣椒疫霉病害大规模的传播和流行。
因此，本发明提供了一种辣椒疫霉病菌中含有ArgoN、PAZ、MID和Piwi结构域的生长发育调控蛋白，名称为PcAGO1，是如下A1)或A2)或A3)或A4)：
A1)氨基酸序列是如SEQ ID NO.2所示的蛋白质；
A2)在如SEQ ID NO.2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
A3)将如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的如SEQ ID NO.2所示的蛋白衍生的蛋白质；
A4)与如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列相似性在75％以上，优选在85％以上，更优选在95％以上且具有与如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列相同功能的氨基酸序列。
为了使A1)中的蛋白方便纯化，也可以在如SEQ ID No.2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；所述标签可以为Poly-Arg(RRRRR)、Poly-His(HHHHHH)、FLAG(DYKDDDDK)、Strep-tag II(WSHPQFEK)、c-myc(EQKLISEEDL)等标签。
上述A1)-A4)中的生长发育调控蛋白一般来源于自然界中辣椒疫霉病菌中，即一般来讲，其为天然产物，也可以人工表达或者合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述A2)-A4)中蛋白质的编码基因可通过将序列表中SEQ ID NO.2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个核苷酸对的错义突变，和/或在其5’端和/或3’端连上述标签的编码序列得到。其中，序列表中SEQ ID NO.2(PcAGO1)由933个氨基酸残基组成。
本发明目的之二是提供编码所述含有ArgoN、PAZ、MID和Piwi结构域的PcAGO1蛋白的核酸分子。所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。
其中，上述PcAGO1蛋白的编码基因为如下B1)或B2)或B3)：
B1)序列表中SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列所示的DNA分子；
B2)与B1)所示的核苷酸序列的具有75％以上或85％以上或95％以上同一性，且编码上述PcAGO1蛋白的cDNA分子或DNA分子；
B3)在严格条件下与B1)或B2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述PcAGO1蛋白的cDNA分子或DNA分子。例如在本发明中，所述生长发育调控蛋白的DNA序列包括存在于辣椒疫霉病菌不同菌株(例如辣椒疫霉病菌LT1534菌株)中的生长发育调控蛋白的DNA序列。
在本发明中，致病调控蛋白的DNA序列(编码基因和cDNA)可以具体地如SEQ IDNo.2所示，序列表中SEQ ID NO.1由2799个核苷酸组成，自序列1的5’端第1-2799位核苷酸为编码序列，编码序列表中SEQ ID NO.2所示的蛋白质(PcAGO1)。
本发明之三提供了如上任意一种DNA序列转录得到的RNA序列，优选的，所述RNA分子的序列为如下C1)或C2)：
C1)如SEQ ID NO.1所示的DNA序列转录的RNA序列的相似性在75％以上，进一步优选在85％以上，更优选在95％以上且具有与如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.1所示的DNA序列转录的RNA序列相同功能的RNA序列；
C2)最优选RNA序列为如SEQ ID NO.1所示的DNA序列转录的RNA序列。
本发明之四提供与上述的生长发育调控蛋白、编码基因或上述RNA分子相关的生物材料，为下述D1)至D10)中的任一种：
D1)含有权利要求2所述编码基因的表达盒；
D2)含有权利要求2所述编码基因的重组载体、或含有D1)所述表达盒的重组载体；
D3)含有权利要求2所述编码基因的重组微生物、或含有D1)所述表达盒的重组微生物、或含有D2)所述重组载体的重组微生物；
D4)含有权利要求2所述编码基因的转基因植物细胞系、或含有D1)所述表达盒的转基因植物细胞系；
D5)含有权利要求2所述编码基因的转基因植物组织、或含有D2)所述表达盒的转基因植物组织；
D6)含有权利要求2所述编码基因的转基因植物器官、或含有D2)所述表达盒的转基因植物器官；
D7)抑制权利要求2所述编码基因表达的核酸分子；优选的，所述核酸分子为敲除权利要求2所述编码基因的核酸分子，或者沉默权利要求2所述编码基因的核酸分子，也可以为编码表达靶向待敲除目的基因的sgRNA片段，如靶向于PcAGO1基因的sgRNA序列(编码序列)GAATTTGAAGGACATGGTGG；
D8)含有或表达D7)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系，重组载体可以包括基于CRISPR/Cas9的基因敲除法是将目的基因的Donor载体和sgRNA及Cas9蛋白表达质粒；所述Donor载体为含有依次连接的待敲除目的基因上游800-1500bp的序列、Dodor DNA序列(可以为NPTII或GFP或RFP等基因序列)和待敲除目的基因的下游800-1500bp的序列的重组载体。sgRNA及Cas9蛋白共表达质粒为编码表达靶向待敲除目的基因的sgRNA片段和表达Cas9蛋白的DNA序列的载体，其中，所述待敲除目的基因为PcAGO1基因，靶向于PcAGO1基因的sgRNA序列(编码序列)为GAATTTGAAGGACATGGTGG。优选的，所述sgRNA及Cas9共表达质粒是以pYF515载体为出发载体，将PcAGO1基因的sgRNA退火得到的双链sgRNA编码序列，插入pYF515载体的Nhe I和Bsa I酶识别位点之间，得到sgRNA及Cas9共表达质粒；
D9)抑制权利要求3所述RNA分子翻译的核酸分子；
D10)含有或表达D9)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。
本发明的目的之五是提供所述的生长发育调控蛋白、及其编码基因或权利要求3所述的RNA分子或权利要求4所述的生物材料在控制卵菌完全致病力中的应用；优选的，所述卵菌为辣椒疫霉病菌(Phytophthora capsici)，最优选为辣椒疫霉病菌(Phytophthoracapsici)LT1534。
所述应用为下述E1)-E6)中任一种或几种：
E1)在调控(降低)辣椒疫霉菌丝生长速率中的应用；
E2)在调控(抑制)辣椒疫霉孢子囊产生；
E3)在调控(抑制)游动孢子产生中的应用；
E4)在调控(降低)辣椒疫霉对寄主的致病性中的应用；
E5)在调控(降低)辣椒疫霉侵染寄主能力中的应用；
E6)在抑制和/或杀灭辣椒疫霉病菌中的应用。
优选的，其中，所述应用中，包括通过抑制SEQ ID NO.1所述的编码基因的转录或使其灭活，或抑制所述的RNA分子的翻译，或抑制和/或灭活序列表中SEQ ID NO.2的PcAGO1生长发育调控蛋白中的活性来实现E1)-E6)所述的应用。
所述应用中，通过抑制如上述的编码基因的转录，或抑制上述的RNA序列的翻译，或抑制和/或失活上述PcAGO1生长发育调控蛋白的活性来调控(降低)辣椒疫霉病菌孢子囊和游动孢子产生，和/或降低菌丝生长速率，和/或降低对寄主的侵染能力和/或对寄主的致病性(致病力)，从而能够抑制或杀灭辣椒疫霉病菌。
优选的，所述应用为将辣椒疫霉SEQ ID NO.2所示的PcAGO1蛋白缺失后使辣椒疫霉菌落形态改变、和/或菌丝生长减慢、和/或不能产生孢子囊和游动孢子、和/或致病力降低等；
本发明的目的之六为提供所述序列表中SEQ ID NO.2所示的PcAGO1生长发育调控蛋白、所述序列表中SEQ ID NO.1所示的编码基因或上述RNA分子或上述生物材料或如权利要求5所述的蛋白或者DNA在作为抑菌或杀菌剂靶标筛选辣椒疫霉病菌抑菌和/或杀菌剂中的应用；所述抑菌或杀菌剂可通过抑制或者灭活辣椒疫霉SEQ ID NO.2所示的PcAGO1生长发育调控蛋白使辣椒疫霉菌落形态改变、和/或菌丝生长减慢、抑制辣椒疫霉病菌孢子囊产生、抑制游动孢子产生，和/或降低菌丝生长速率，和/或降低对寄主的侵染能力和/或对寄主的致病性(致病力)，从而能够抑制或杀灭辣椒疫霉病菌。优选的，所述致病调控蛋白的cDNA序列为如SEQ ID No.1所示的DNA序列。优选的，所述方法用于抑制和/或杀灭辣椒疫霉引起的生产上的卵菌病害。
本发明目的之七是提供一种筛选或辅助筛选辣椒疫霉抑菌和/或杀菌剂的方法，所述方法包括将待检测物应用于所述辣椒疫霉病菌，当所述待检测物能够抑制如上DNA序列的转录，或抑制如上RNA序列的翻译，或抑制和/或失活如上所示PcAGO1生长发育调控蛋白的活性，则所述待测物质为候选的植物辣椒疫霉抑菌和/或杀菌剂。
本发明目的之八是提供一种控制(抑制或阻断)卵菌完全致病力的方法，包括下述步骤：抑制如上述的编码基因的转录，或抑制所述的RNA分子的翻译，或抑制和/或失活如上所述的PcAGO1生长发育调控蛋白的活性；
其中，所述控制(抑制或阻断)卵菌完全致病力为和/或抑制(降低)辣椒疫霉病菌的游动孢子产生，和/或者降低辣椒疫霉病菌的菌丝生长速度，和/或使辣椒疫霉菌丝生长速率降低，降低辣椒疫霉病菌对寄主的侵染能力和/或对寄主的致病性(致病力)。
本发明还提供降低卵菌侵染寄主能力的方法，是通过权利要求所述的控制完全致病力来降低卵菌侵染寄主能力。
上述控制辣椒疫霉病菌完全致病力的方法，通过敲除如上任意一种DNA序列，控制所述辣椒疫霉病菌形成完全致病力的方法。所述辣椒疫霉病菌包括辣椒疫霉病菌LT1534菌株。
本发明的一个实施方式中，其中上述基因敲除的方法采用基于CRISPR/Cas9的基因敲除法。
具体的，基于CRISPR/Cas9的基因敲除法是将目的基因的Donor载体和sgRNA及Cas9共表达质粒转染辣椒疫霉筛选得到所述目的敲除蛋白灭活的重组菌。
所述Donor载体为含有依次连接的待敲除目的基因上游800-1500bp的序列、DodorDNA序列(可以为NPTII或GFP或RFP等基因序列)和待敲除目的基因的下游800-1500bp的序列的重组载体。
sgRNA及Cas9蛋白共表达质粒为编码表达靶向待敲除目的基因的sgRNA片段和表达Cas9蛋白的DNA序列的载体，其中，所述待敲除目的基因为PcAGO1基因，靶向于PcAGO1基因的sgRNA序列(编码序列)为GAATTTGAAGGACATGGTGG。
优选的，所述sgRNA及Cas9共表达质粒是以pYF515载体为出发载体，将PcAGO1基因的sgRNA退火得到的双链sgRNA编码序列，插入pYF515载体的Nhe I和Bsa I酶识别位点之间，得到sgRNA及Cas9共表达质粒。
抑制PcAGO1生长发育调控蛋白质表达和/或活性的物质在制备植物辣椒疫霉病菌抑菌或杀菌剂中的应用也属于本发明的保护范围。
上述应用中，所述PcAGO1生长发育调控蛋白质表达和/或活性的物质为抑制PcAGO1生长发育调控蛋白质表达和/或抑制纤维素合酶蛋白质的编码基因的转录和/或抑制PcAGO1生长发育调控蛋白质的编码基因转录得到的RNA分子的翻译的物质。
本发明还提供了一种用于扩增辣椒疫霉病菌中PcAGO1生长发育调控蛋白的引物序列，即用于扩增靶标序列的引物序列，优选所述引物序列如SEQ ID No.1所示。所述辣椒疫霉病菌包括辣椒疫霉病菌LT1534菌株。
扩增编码如上生长发育调控蛋白的DNA序列全长或其上的任意一段DNA序列的一条引物和/或引物对也属于本发明的保护范围。
试验证明，本发明所提供的PcAGO1生长发育调控蛋白在辣椒疫霉自身生长发育过程中起作用。利用PEG-CaCl2介导的原生质体转化技术并结合CRISPR/Cas9基因编辑技术获得的敲除突变体，其生长发育较野生型亲本菌株而言有明显变化，主要包括：PcAGO1蛋白缺失后辣椒疫霉菌落形态改变、菌丝生长减慢、不产生孢子囊、游动孢子和卵孢子、不能对烟草叶片致病；因此，辣椒疫霉病菌中PcAGO1生长发育调控蛋白在辣椒疫霉无性繁殖、有性生殖及侵染等过程均可发挥重要作用。本发明为进一步探究辣椒疫霉病菌的生长发育过程及致病机制提供了技术支持，并未辣椒疫霉引起的植物疫病防治及新型杀菌剂的研发提供了技术基础。
附图说明
图1为辣椒疫霉PcAGO1结构域示意图，包含ArgoN、PAZ、MID和Piwi结构域。
图2为野生型辣椒疫霉菌株LT1534、PcAGO1基因敲除突变体ΔPcAGO1菌落形态图。
图3为野生型辣椒疫霉菌株LT1534、PcAGO1基因敲除突变体ΔPcAGO1菌饼接种烟草叶片致病力图(接种后4d拍摄)。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
辣椒疫霉野生型菌株LT1534由美国Tennessee State University的KurtLammour教授馈赠，LT1534菌株信息在文献“Jason E.S.,Andrea L.V.,Howard S.J.,Gregory M.V.,Michael A.G.,Maryn O.C.,Nicholas D.,Jennifer J.,Joann M.,KurtH.L.,and Christine D.S.(2021).High-Quality Reference Genome Sequence for theOomycete Vegetable Pathogen Phytophthora capsici Strain LT1534.PlantMicrobiol.10,21.”中公开过。以上菌株仅为本发明在实施例所使用的材料，事实上，在应用本发明所述筛选标记时，可使用任何商购途径获得疫霉菌菌株。
上述菌株均已经过现有的形态学和分子生物学方法鉴定。
本研究所用培养基及试剂配方：
常用V8培养基：340mL V8，4.76g CaCO3，去离子水定容至3.4L，再加入51g琼脂制备成固体培养基，121℃高压湿热灭菌20min。
PM培养基(Pea Mannitol)：1L去离子水中加入125g豌豆以121℃灭菌20min后用纱布滤得豌豆汤，向其中加入Mannitol 91.1g，CaCO3 2g，CaCl2 1g，蒸馏水定容至1L，固体培养基则再加入15g琼脂粉，121℃灭菌20min。
敲除转化试验所用培养基如下：
NPB培养基(Nutrient pea broth)：1L去离子水中加入125g豌豆以121℃灭菌20min后用纱布滤得豌豆汤，向其中加入Yeast Extract 2.0g、Glucose 5.0g、Mannitol5.0g、Sorbitol 5.0g、CaCO3 2.0g、CaCl2 0.1g、MgSO4 0.5g、MgSO4 0.5g、KNO3 3.0g、K2HPO41.0g、KH2PO4 1.0g，用去离子水定容至1L。若配制固体培养基则再加入琼脂粉15g，121℃灭菌20min。灭菌后加入0.22μM过滤器过滤后的Vitamin stock 2mL(Folic acid 6.7×10-7g/mL；Pyridoxine-HCl 6.0×10-4g/mL；Biotin 6.7×10-7g/mL；Thiamine-HCl 1.3×10-3g/mL；L-inositol 4.0×10-5g/mL；Nicotinic acid 4.0×10-5g/mL；Riboflavin 5.0×10-5g/mL)和Vitamin stock2mL(FeC6H5O7·3H2O 5.4×10-4g/mL；Na2MoO4·H2O 3.0×10-5g/mL；ZnSO4·7H2O 3.8×10-4g/mL；MgSO4·H2O 3.8×10-5g/mL；H3BO3 2.5×10-5g/mL；CuSO4·5H2O7.5×10-4g/mL)
敲除转化试验试剂配制如下：
酶解液：现用现配，裂解酶(Lysing Enzymes from Trichoderma harzianum,L1412,Sigam)0.12g,纤维素酶(yakult R10)0.12g，0.8M Mannitol 10mL，超纯水8mL，0.5MKCl 800μL，0.5M MES(pH 5.7)800μL，0.5M CaCl2 400μL，0.22μM滤膜过滤灭菌。
W5溶液：KCl 0.1g，CaCl2·2H2O 4.6g，NaCl 2.25g，Glucose 7.8g，超纯水溶解定容至250mL，0.22μm滤膜过滤灭菌。
PEG-CaCl2溶液(40％w/v)：现用现配，6g PEG4000，0.8M Mannitol 3.75mL，超纯水3mL，0.5M CaCl2 3mL，0.22μm滤膜过滤灭菌。
MMG溶液(250mL)：Mannitol 18.22g，0.5M MES(pH 5.7)2.0mL，MgCl2·6H2O0.76g，超纯水定容至250mL，0.22μm滤膜过滤灭菌。
实施例1、辣椒疫霉中生长发育调控蛋白PcAGO1及其编码基因的获得
本实施例中辣椒疫霉生长发育调控蛋白PcAGO1及其编码基因(或cDNA)可以辣椒疫霉菌株LT1534的DNA(或cDNA)为模板，通过表1所列引物扩增获得。其中，DNA或RNA提取的材料可以为辣椒疫霉菌株LT1534的菌丝体。其中，以辣椒疫霉菌株LT1534的DNA为模板用PcAGO1-F和PcAGO1-R扩增得到PcAGO1的编码基因PcAGO1，如序列表中SEQ ID NO.1所示，SEQ ID NO.1由2799个核苷酸组成，自SEQ ID NO.1的5’端第1-2799位核苷酸为编码序列，编码序列表中SEQ ID NO.2所示的蛋白质(PcAGO1)，其中，ArgoN结构域的序列为自SEQ IDNO.2的氨基端第109-248位氨基酸残基序列，PAZ结构域的序列为自SEQ ID No.2的氨基端第314-438位氨基酸残基序列，MID结构域的序列为自SEQ ID No.2的氨基端第499-582位氨基酸残基序列，Piwi结构域的序列为自SEQ ID No.2的氨基端第593-895位氨基酸残基序列。以辣椒疫霉菌株LT1534的cDNA为模板用PcAGO1-F和PcAGO1-R扩增得到PcAGO1的cDNA，其序列与编码基因序列相同，如SEQ ID NO.1所示。上述蛋白或基因也可以人工合成。
表1.PcAGO1全长编码基因扩增引物
Figure BDA0004179630020000091
SEQ ID NO.1如下所示：
Figure BDA0004179630020000092
Figure BDA0004179630020000101
SEQ ID No.2如下所示:
Figure BDA0004179630020000102
Figure BDA0004179630020000111
实施例2、辣椒疫霉PcAGO1基因敲除载体的构建
本实施例中基于CRISPR/Cas9的基因敲除载体构建方法以及相关载体的序列(包括pBluescript II SK+和PYF515)以及NPT II基因序列在文献“Fang,Y.,and Tyler,B.M.(2016).Efficient disruption and replacement of an effector gene in theoomycete Phytophthora sojae using CRISPR/Cas9.Molecular plant pathology,17(1),127-139.”以及“Fang,Y.,Cui,L.,Gu,B.,Arredondo,F.,and Tyler,B.M.(2017).Efficient genome editing in the oomycete Phytophthora sojae using CRISPR/Cas9.Curr.Protoc.Microbiol.44,21A.1.1-21A.1.26.”中公开过。本实施例中使用的pBluescript II SK+同源臂载体质粒(Donor载体)，sgRNA及Cas9共表达质粒PYF515均由美国俄勒冈州立大学Brett M.Tyler教授馈赠。
本实施方式中所用的Donor载体pBS-NPTII-AGO1；sgRNA及Cas9共表达质粒pYF515-AGO1具体构建方法如下所述：
1)pBS-NPTII-AGO1的构建：以辣椒疫霉菌株LT1534的DNA为模板，利用TaKaRa-In-Fusion_Tools在线网站(http://www.clontech.com/US/Products/Cloning_and_Competent_Cells/Cloning_Resources/Online_In-Fusion_Tools)设计引物扩增目的基因PcAGO1上游1000bp序列(序列表中序列3所示，经如表2所示pBS-NPTII-AGO1-F1和pBS-NPTII-AGO1-R1所示引物扩增获得)、NPTII基因序列(NPTII基因是以pYF515骨架质粒为模板用引物序列如表2所示pBS-NPTII-AGO1-F2和pBS-NPTII-AGO1-R2扩增获得的片段)、PcAGO1下游1000bp序列(序列表中序列4所示，经引物序列如表2所示pBS-NPTII-AGO1-F3和pBS-NPTII-AGO1-R3的引物扩增获得)，利用
Figure BDA0004179630020000112
HD Cloning Kit将三个扩增片段依次融合连接入克隆载体pBluescript II SK+(EcoR V酶切)，连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，37℃过夜培养后，挑取单克隆，使用通用引物M13F(序列：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’)/M13R(序列：5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’)扩增、测序验证克隆，将验证正确的含有依次连接的PcAGO1上游1000bp序列、NPTII基因序列和PcAGO1下游1000bp序列的重组表达载体命名为pBS-NPTII-AGO1。
2)pYF515-AGO1的构建：利用sgRNA设计网站EuPaGDT(http://grna.ctegd.uga.edu/)以及RNA结构在线分析工具(http://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/Servers/Predict1/Predict1.htmL)，选择特异性靶向PcAGO1基因且形成二级结构较弱的sgRNA序列(sgAGO1：GAATTTGAAGGACATGGTGG，靶向于PcAGO1基因的SEQID No.1的第2154-2173位核苷酸序列)，送至公司合成带有Nhe I和Bsa I酶切位点以及HHribozyme的正反向sgRNA序列引物。用无菌水溶解成100μM溶液。退火反应合成双链sgRNA序列，反应体系：3μl正义链溶液，3μl反义链溶液，3μl 10×T4 DNA Ligase Buffer(NEB)，4μl0.5M NaCl，21μl超纯无菌水，吸打混匀，100℃反应2min，放至室温自然冷却4h，之后将反应液稀释500倍。再取2μl10×T4 DNA Ligase Buffer(NEB)，50ng pYF515载体(Nhe I/Bsa I双酶切)，4μl稀释后的双链sgRNA溶液，1μl T4 DNA Ligase，无菌超纯水补齐至20μl，室温反应30min，使用5μl连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，37℃过夜培养后，使用引物对RPL41_Pseq_F(序列：5’-CAAGCCTCACTTTCTGCTGACTG-3’)/M13F(序列：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’)进行菌落PCR验证，并测序验证阳性克隆，将验证正确可表达上述sgRNA的重组载体命名为pYF515-AGO1。
表2.用于载体构建的引物序列
Figure BDA0004179630020000121
Figure BDA0004179630020000131
实施例3、辣椒疫霉PcAGO1基因敲除转化子的获得
采用PEG-CaCl2介导的原生质体转化方法制备PcAGO1基因敲除转化子，卵菌遗传转化的方法在文献“Wang,Z.,Tyler,B.M.,Liu,X.Protocol of Phytophthora capsicitransformation using the CRISPR-Cas9 system.Plant Pathogenic Fungi andOomycetes.Humana Press,New York,NY,2018:265-274.”中公开过。
PcAGO1基因敲除转化子的获得具体为将实施例1中获得的敲除基因PcAGO1的Donor载体、sgRNA及Cas9共表达质粒(pBS-NPTII-AGO1和pYF515-AGO1)转入辣椒疫霉LT1534的原生质体中，将生长出的转化子经G418抗性的V8固体培养基平板25℃培养筛选，收集疑似转化子的菌丝体，提取DNA进行PCR测序验证，将阳性转化子再提取RNA进行qPCR验证。获得PcAGO1敲除转化子(ΔPcAGO1)。
实施例4、辣椒疫霉PcAGO1敲除转化子的生物学性状分析
一、菌丝生长速率检测
将野生型辣椒疫霉菌株LT1534和实施例3得到的敲除转化子PcAGO1敲除转化子(ΔPcAGO1)分别接于V8固体培养基(9cm培养皿中倒入15mL培养基)，25℃黑暗条件下培养4d，用十字交叉法测量各菌株的菌落直径，每株菌重复3次。
结果表明，所有测定的PcAGO1敲除转化子菌株的菌丝生长速率与野生型辣椒疫霉菌株LT1534相比显著下降(图2和表3)。实验结果说明所述辣椒疫霉生长发育调控蛋白PcAGO1参与调控了辣椒疫霉的菌丝生长及菌落正常形态的形成。
二、孢子囊数量检测
将野生型辣椒疫霉菌株LT1534和实施例3得到的敲除转化子ΔPcAGO1分别接于V8固体培养基(9cm培养皿中倒入15mL培养基)，25℃黑暗条件下培养4d，转入25℃光照条件下培养5d诱导产孢，通过显微镜观察培养皿上孢子囊的形态并统计数量，每株菌重复3次。
结果表明，与野生型辣椒疫霉菌株LT1534相比，实施例3得到的敲除转化子ΔPcAGO1不产生孢子囊，说明辣椒疫霉生长发育调控蛋白PcAGO1影响了辣椒疫霉孢子囊的产生(表3)。
三、卵孢子数量检测
将辣椒疫霉A2交配型标准菌株分别与野生型辣椒疫霉菌株LT1534和实施例3得到的敲除转化子ΔPcAGO1在V8固体培养基(9cm培养皿中倒入15mL培养基)上对峙培养，25℃黑暗条件下培养5d，随后在显微镜下观察两个菌落交接处，统计卵孢子的数量，每株菌重复3次。
结果表明，与野生型辣椒疫霉菌株LT1534相比，实施例3得到的敲除转化子ΔPcAGO1的产生的卵孢子数量显著下降，说明辣椒疫霉生长发育调控蛋白PcAGO1参与了辣椒疫霉有性生殖阶段，影响了辣椒疫霉卵孢子的产生(表3)。
四、转化子的离体叶片致病力检测
供试烟草植株品种为本氏烟，种植于育苗盘中，培养基质为草炭土，生长至4～6周备用。将野生型辣椒疫霉菌株LT1534和实施例3得到的敲除转化子ΔPcAGO1分别接于V8固体培养基(9cm培养皿中倒入15mL培养基)，25℃黑暗条件下培养4d，在菌落边缘用打孔器打取5mm的菌饼。采集相同叶位的烟草叶片，于叶片靠近叶脉的中央接种一个菌饼，每株菌接种5个叶片，25℃黑暗保湿(RH＝60％-80％)培养4d后，以十字交叉法测量辣椒疫霉侵染辣椒叶片的病斑直径(mm)。
结果表明，与野生型辣椒疫霉菌株LT1534相比，实施例3得到的敲除转化子ΔPcAGO1丧失对烟草叶片的致病力(图3和表3)。这说明辣椒疫霉生长发育调控蛋白PcAGO1参与了调控辣椒疫霉侵染寄主植物的生物学途径。
因此，辣椒疫霉生长发育调控蛋白PcAGO1可以调控辣椒疫霉的毒力，抑制该蛋白的功能就可以控制辣椒疫霉的侵染过程，控制病害大规模发生。
表3.辣椒疫霉PcAGO1基因敲除转化子生物学性状测定结果
菌株号 菌落直径 孢子囊 游动孢子 病斑直径 卵孢子
(mm) (个) (个) (mm) (个)
LT1534 69.7±1.0a 291±60a 292±52a 60.1±7.2a 203.17±52.77a
△PcAGO1 54.33±1.0b 0.00±0.00b 0.00±0.00b 0.00±0.00b 0.00±0.00b

Claims (9)

1.一种来自辣椒疫霉(Phytophthora capsici)的含有ArgoN、PAZ、MID和Piwi结构域的生长发育调控蛋白PcAGO1，是如下A1)或A2)或A3)或A4)的蛋白质：
A1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
A2)在如SEQ ID No.2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
A3)由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与辣椒疫霉生长发育相关的由A1)衍生的蛋白质；
A4)与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列相似性在93％以上，优选在95％以上，更优选在98％以上且具有与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列相同功能的氨基酸序列。
2.编码权利要求1所示的生长发育调控蛋白PcAGO1的编码基因；优选的，所述编码基因为如下B1)或B2)或B3)：
B1)SEQ ID No.1中所述的核苷酸序列所示的DNA分子；
B2)与B1)所示的核苷酸序列的具有75％以上或85％以上或95％以上同一性，且编码权利要求1中所述蛋白质的cDNA分子或DNA分子；
B3)在严格条件下与B1)或B2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述蛋白质的cDNA分子或DNA分子。
3.权利要求2所述的编码基因转录得到的RNA分子；
优选的，所述RNA分子的序列为如下C1)或C2)：
C1)如SEQ ID No.1所示的DNA序列转录的RNA序列的相似性在75％以上，进一步优选在85％以上，更优选在95％以上且具有与如SEQ ID No.1所示的DNA序列转录的RNA序列相同功能的RNA序列；
C2)如SEQ ID No.1中所示的DNA序列转录的RNA序列。
4.与权利要求1所示的生长发育调控蛋白PcAGO1、权利要求2所示的编码基因或权利要求3所述的RNA分子相关的生物材料，为下述D1)至D10)中的任一种：
D1)含有权利要求2所述编码基因的表达盒；
D2)含有权利要求2所述编码基因的重组载体、或含有D1)所述表达盒的重组载体；
D3)含有权利要求2所述编码基因的重组微生物、或含有D1)所述表达盒的重组微生物、或含有D2)所述重组载体的重组微生物；
D4)含有权利要求2所述编码基因的转基因植物细胞系、或含有D1)所述表达盒的转基因植物细胞系；
D5)含有权利要求2所述编码基因的转基因植物组织、或含有D2)所述表达盒的转基因植物组织；
D6)含有权利要求2所述编码基因的转基因植物器官、或含有D2)所述表达盒的转基因植物器官；
D7)抑制权利要求2所述编码基因表达的核酸分子；优选的，所述核酸分子为敲除权利要求2所述编码基因的核酸分子，或者沉默权利要求2所述编码基因的核酸分子；
D8)含有或表达D7)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系；
D9)干扰权利要求3所述RNA分子翻译的核酸分子；
D10)含有或表达D9)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。
5.权利要求1所述的生长发育调控蛋白PcAGO1、权利要求2所示的编码基因或权利要求3所述的RNA分子或权利要求4所述的生物材料在控制卵菌生长发育或调控卵菌致病力的应用；
优选的，所述卵菌为辣椒疫霉病菌(Phytophthora capsici)，最优选为辣椒疫霉病菌(Phytophthora capsici)LT1534。
6.权利要求1所述的生长发育调控蛋白PcAGO1、权利要求2所示的编码基因或权利要求3所述的RNA分子或权利要求4所述的生物材料在作为筛选抑制卵菌生长发育和/或对寄主致病力的农药制剂中的应用，其特征在于为下述E1)-E6)中任一种或几种：
E1)在调控辣椒疫霉菌丝生长速率中的应用；
E2)在调控辣椒疫霉孢子囊产量中的应用；
E3)在调控辣椒疫霉抑制游动孢子产生中的应用；
E4)在调控辣椒疫霉对寄主的致病性中的应用；
E5)在调控辣椒疫霉侵染寄主能力中的应用；
E6)在抑制和/或杀灭辣椒疫霉病菌中的应用。
优选的，包括通过抑制如权利要求2所述的编码基因中的转录或使其灭活，或抑制如权利要求3所述的RNA分子的翻译，或抑制和/或灭活如权利要求1所述的生长发育调控蛋白PcAGO1来实现E1)-E6)所述的应用。
7.一种抑制和/或杀灭卵菌生长的方法，包括通过抑制卵菌中含有ArgoN、PAZ、MID和Piwi结构域的生长发育调控蛋白PcAGO1的编码基因的表达或使其失活，或抑制其RNA的翻译，或抑制含有ArgoN、PAZ、MID和Piwi结构域的生长发育调控蛋白PcAGO1的活性或使其失活；所述含有ArgoN、PAZ、MID和Piwi结构域的生长发育调控蛋白PcAGO1的氨基酸序列为SEQID No.2所示的氨基酸序列，所述卵菌为辣椒疫霉病菌(Phytophthora capsici)；
所述抑制卵菌中含有ArgoN、PAZ、MID和Piwi结构域的致病调控蛋白PcAGO1的编码基因的表达或使其失活的方法优选为将所述的编码基因敲除，优选的，所述含有ArgoN、PAZ、MID和Piwi结构域的致病调控蛋白PcAGO1的编码基因为如SEQ ID No.1所示的DNA。
8.一种抑制或阻断卵菌完全致病力的方法，其包括通过抑制权利要求2所述的编码基因的表达或使其失活，或抑制如权利要求3中所述的RNA序列的翻译，或抑制如权利要求1所述的生长发育调控蛋白PcAGO1的活性或使其失活，抑制或阻断所述卵菌完全致病力；所述卵菌为辣椒疫霉病菌(Phytophthora capsici)；
其中，所述抑制或阻断辣椒疫霉病菌的活性为抑制辣椒疫霉病菌对寄主的侵染能力和/或对寄主的致病性，和/或抑制辣椒疫霉病菌的孢子囊产量，和/或抑制游动孢子产生，和/或降低辣椒疫霉病菌的菌丝生长速度；
所述抑制权利要求2所述的基因的表达或使其失活的方法优选为将权利要求2所述的编码基因敲除。
9.一种降低卵菌侵染寄主能力的方法，是通过权利要求8所述的方法抑制或阻断完全致病力，达到降低卵菌侵染寄主能力的目的；所述寄主为辣椒、烟草等。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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