CN116284284A - 含有fyve结构域的肌球蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents
含有fyve结构域的肌球蛋白及其编码基因与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种来自大豆疫霉病菌(Phytophthora sojae)的含有FYVE结构域的肌球蛋白及其编码基因与应用。本发明含有FYVE结构域的肌球蛋白PsMyosinF具有SEQ ID No.4所示的氨基酸序列，其编码基因具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。本发明PsMyosinF蛋白的主要作用是能够控制大豆疫霉菌丝的极性生长和孢子囊形成。本发明提供的基因在控制大豆疫霉根腐病中具有很高的应用价值，以该蛋白为作用靶标，开发的杀菌剂对控制大豆疫霉根腐病的发生和流行具有重要的实践意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种病原卵菌新型肌球蛋白及其编码基因与应用，特别涉及来自大豆疫霉中含有FYVE的肌球蛋白PsMyosinF其编码基因与应用。
背景技术
大豆疫霉(Phytophthora sojae)是重要的土传植物病原卵菌之一，于20世纪五十年代的北美洲首次被世人所知，其寄主范围非常窄，仅能侵染的作物为大豆。其侵染大豆从根部开始进而侵染茎部，在潮湿的条件下以及在密实或重度粘土土壤中都能生长，可引起大豆种子腐烂、幼苗倒伏以及根茎枯萎和腐烂等，在田间可导致严重的经济损失。
大豆疫霉是一种半寄生营养型卵菌，其营养体为发达的无隔菌丝体。大豆疫霉主要以侵染菌丝直接侵入寄主表皮细胞并通过菌丝的极性生长进行细胞间的扩散，在合适条件下，菌丝向寄主表皮外扩展生长，菌丝顶端膨大形成孢子囊，然后释放游动孢子，游动孢子通过趋向于寄主植物根部释放化合物的特性侵染寄主根部或者通过飞溅传播到上部植物，从而形成再侵染过程，导致病害大规模流行。
综上所述，病原菌菌丝的极性生长和孢子囊的形成是大豆疫霉侵染寄主所必需的过程。如果能够阻断菌丝的极性生长和孢子囊的形成，就可以控制大豆疫霉病害循环中的再侵染，控制病害大规模流行。
发明内容
通过发明人的研究发现，大豆疫霉病菌中含有FYVE的肌球蛋白与大豆疫霉病菌菌丝的极性生长和孢子囊的形成以及致病力有关，因此可以通过控制含有FYVE结构域的肌球蛋白来阻断菌丝的极性生长和孢子囊的形成，并降低大豆疫霉致病力，可以达到控制(抑制或阻断)大豆疫霉病害大规模的传播和流行。
因此，本发明提供了一种大豆疫霉病菌中含有FYVE的肌球蛋白，名称为PsMyosinF，其氨基酸序列为与如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列或者与SEQ IDNo.4所示的氨基酸序列相似性在93％以上，优选在95％以上，更优选在98％以上且具有与如SEQ IDNo.4所示的氨基酸序列相同功能的氨基酸序列。
一般来讲，在同一物种中都包括同源且功能相同或相似的氨基酸序列(或蛋白质序列)或核酸序列，特别是必要氨基酸序列(必要蛋白质序列)或必要核酸序列，它们的序列不一定100％相同，原因在于同一物种不同菌株受地理条件，外在环境如温度、湿度以及栽培品种等因素的影响，容易发生包括无义突变在内的各种突变，但因为其功能对该物种的存活或生长的重要性，上述突变不会或基本不会影响其功能的行驶。因此即使在同一物种中，允许与本发明的肌球蛋白的如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列在一定范围内存在差异。
其中，本发明的氨基酸序列可以是如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列。
为了方便纯化，也可以在如SEQ ID No.4所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；所述标签可以为Poly-Arg(RRRRR)、Poly-His(HHHHHH)、FLAG(DYKDDDDK)、Strep-tag II(WSHPQFEK)、c-myc(EQKLISEEDL)等标签。
本发明的肌球蛋白一般来源于自然界中大豆疫霉病菌中，即一般来讲，其为天然产物，也可以人工表达或者合成。
在本发明中，所述肌球蛋白的氨基酸序列可以具体地如SEQ ID No.4所示。SEQ IDNo.4所示的蛋白质由1410个氨基酸残基组成，其中，FYVE结构域的序列为自SEQ ID No.4的氨基端第1128-1181为氨基酸残基序列。
本发明之二提供了上述肌球蛋白的编码基因PsMyosinF。所述编码基因，优选DNA序列为SEQ ID No.3所示的DNA序列或者与如SEQ ID No.3所示的DNA序列的相似性在75％以上，进一步优选在85％以上，更优选在95％以上且具有与如SEQ ID No.3所示的DNA序列相同功能的DNA序列，如cDNA或重组DNA。例如在本发明中，所述肌球蛋白的DNA序列包括存在于大豆疫霉病菌不同菌株(例如大豆疫霉病菌P6497菌株)中的肌球蛋白的DNA序列。
在本发明中，肌球蛋白的DNA序列(编码基因和cDNA)可以具体地如SEQ ID No.3所示。
本发明之三提供了如上任意一种DNA序列转录得到的RNA序列。如mRNA等。优选RNA序列为与如SEQ ID No.3所示的DNA序列转录的RNA序列的相似性在75％以上，进一步优选在85％以上，更优选在95％以上且具有与如SEQ ID No.3所示的DNA序列转录的RNA序列相同功能的RNA序列。最优选RNA序列为如SEQ ID No.3所示的DNA序列转录的RNA序列。
本发明之四提供与上述的肌球蛋白、编码基因或上述RNA分子相关的生物材料，为下述D1)至D10)中的任一种：
D1)含有所述编码基因的表达盒；
D2)含有所述编码基因的重组载体、或含有D1)所述表达盒的重组载体；
D3)含有所述编码基因的重组微生物、或含有D1)所述表达盒的重组微生物、或含有D2)所述重组载体的重组微生物；
D4)含有所述编码基因的转基因植物细胞系、或含有D1)所述表达盒的转基因植物细胞系；
D5)含有所述编码基因的转基因植物组织、或含有D2)所述表达盒的转基因植物组织；
D6)含有所述编码基因的转基因植物器官、或含有D2)所述表达盒的转基因植物器官；
D7)抑制所述编码基因表达的核酸分子；优选的，所述核酸分子为敲除所述编码基因的核酸分子，或者沉默所述编码基因的核酸分子；其中，所述敲除所述编码基因的核酸分子包括序列如CCGUGUUGGUGUAGAUCUUGCUG、CCGGGACUCUUGCCGGCCACGGA和/或
UGCUCUCCGUCACCUCUCCGUGG所示的RNA分子，或者序列表中SEQ IDNo.30、SEQ IDNo.31和SEQ ID No.32所示的编码所述RNA分子的DNA分子；
D8)含有或表达D7)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系；
D9)抑制所述RNA分子翻译的核酸分子；
D10)含有或表达D9)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。
本发明的目的之五是提供所述的肌球蛋白、及其编码基因或所述的RNA分子或所述的生物材料在控制(抑制或阻断)卵菌菌丝极性生长和/或孢子囊形成和/或降低卵菌致病力中的应用；
优选的，所述卵菌为大豆疫霉病菌(Phytophthora sojae)，最优选为大豆疫霉病菌(Phytophthora sojae)P6497。
所述的肌球蛋白或其编码基因在作为筛选控制卵菌菌丝极性生长和/或控制孢子囊产生和/或降低卵菌致病力的农药制剂的靶标中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明的目的之六为提供一种降低卵菌致病力的方法，所述方法包括通过基因敲除，或抑制RNA序列的翻译，或抑制和/或肌球蛋白的活性获得致病力降低的卵菌；所述含有FYVE结构域的肌球蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.4所示的氨基酸序列；所述DNA序列为能够编码所述的肌球蛋白的DNA序列；所述RNA为所述DNA序列转录得到的RNA序列；其中所述卵菌优选为大豆疫霉病菌(Phytophthora sojae)。
优选的，所述肌球蛋白的cDNA序列为如SEQ ID No.3所示的DNA序列。
本发明还提供一种控制(抑制或阻断)卵菌菌丝极性生长或孢子囊形成的方法，其包括通过抑制上述肌球蛋白的编码基因的表达或者将所述编码基因敲除，或抑制上述的RNA的翻译，或抑制和/或失活如所述的肌球蛋白的活性来控制(抑制或阻断)卵菌菌丝极性生长或孢子囊形成；所述卵菌为大豆疫霉病菌(Phytophthora sojae)。所述卵菌优选为大豆疫霉病菌P6497菌株。
本发明还提供降低卵菌侵染寄主能力的方法，是通过权利要求所述的控制菌丝极性生长或孢子囊形成来降低卵菌侵染寄主能力；所述寄主为大豆。
上述控制大豆疫霉病菌菌丝极性生长和孢子囊形成的方法，通过敲除如上任意一种DNA序列，控制所述大豆疫霉病菌菌丝极性生长和孢子囊形成的方法。所述大豆疫霉病菌包括大豆疫霉病菌P6497菌株。
本发明的一个实施方式中，其中上述基因敲除的方法采用基于CRISPR/Cas9的基因敲除法。
具体的，基于CRISPR/Cas9的基因敲除法是将目的基因的Donor载体和sgRNA及Cas9共表达质粒转染大豆疫霉筛选得到所述目的敲除蛋白灭活的重组菌。
其中，所述Donor载体为含有依次连接的待敲除目的基因上游800-1500bp的序列、筛选基因和待敲除目的基因的下游800-1500bp的序列的重组载体。
优选的，所述Donor载体为含有依次连接的待敲除目的基因上游1000bp的序列、筛选基因和待敲除目的基因的下游1000bp的序列的重组载体。所述筛选基因为GFP基因，所述目的基因上游1000bp的序列具有SEQ ID No.33的DNA序列,所述目的基因下游1000bp的序列具有SEQ ID No.34所示的DNA序列。
sgRNA及Cas9共表达质粒表达的sgRNA序列分别为CCGUGUUGGUGUAGAUCUUGCUG、CCGGGACUCUUGCCGGCCACGGA和UGCUCUCCGUCACCUCUCCGUGG。
优选的，sgRNA及Cas9共表达质粒为含有表达靶向待敲除目的基因的sgRNA的编码DNA片段的CRISPR-Cas9系统表达载体，其中，靶向于PsMyosinF基因sgRNA的编码DNA为序列表中SEQ ID No.30、SEQ ID No.31或SEQ IDNo.32所示的DNA。
优选的，所述sgRNA及Cas9共表达质粒是出发载体是将以PYF515为出发载体，将SEQ ID No.30、SEQ ID No.31或SEQ ID No.32所示的DNA片段分别插入PYF515的BsaI和NneI酶识别位点之间，得到表达sgRNA及Cas9的重组表达载体。
本发明之七提供了一种检测大豆疫霉病菌中含有FYVE结构域的肌球蛋白转达水平的方法，其包括选取如上任意一种DNA序列中的任意一段80-300bp，特别是150-200bp长的靶标序列来进行反转录荧光定量PCR检测；优选还包括内参序列。所述大豆疫霉病菌包括大豆疫霉病菌P6497菌株。
本发明之八提供了一种用于扩增大豆疫霉病菌中含有FYVE结构域的肌球蛋白表达水平的引物序列，即用于扩增靶标序列的引物序列，优选所述引物序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示；更优选所述内参序列的引物序列如SEQ ID No.13-14所示。所述大豆疫霉病菌包括大豆疫霉病菌P6497菌株。
扩增编码如上肌球蛋白的DNA序列全长或其上的任意一段DNA序列的一条引物和/或引物对也属于本发明的保护范围。
实验证明，本发明所提供的肌球蛋白在大豆疫霉病菌自身生长发育过程中起作用，利用PEG-CaCl2介导的原生质体转化技术获得的敲除转化子菌丝生长缓慢膨大且不产生孢子囊(大豆疫霉P6497与敲除突变体ΔPsMyosinF的菌丝生长和孢子囊形成情况如图4所示)，回补全长转化子缺失表型恢复(回补转化子菌丝生长和孢子囊形成情况如图4所示)。因此，大豆疫霉病菌中含有FYVE结构域的肌球蛋白PsMyosinF可以调控菌丝的极性生长和孢子囊的形成，抑制该蛋白的功能就可以控制大豆疫霉病害循环中的再侵染，控制病害大规模流行。本发明为进一步研制大豆疫霉病菌发育过程和分子检测技术，以及大豆疫霉病菌所导致的植物病害的防治与研究提供了技术基础。
附图说明
图1为大豆疫霉PsMyosinF基因在大豆疫霉不同发育阶段(横坐标从左向右依次为：菌丝(My)、孢子囊(Sp)、游动孢子(Zo)、休止孢(Cy)、休止孢萌发(Cg)、侵染大豆叶片1.5h、3h、6h、12h、24h、48h)的表达模式分析图。
图2为敲除载体示意图，左侧为同源臂替换载体示意图，右侧为sgRNA载体示意图。
图3为大豆疫霉PsMyosinF敲除突变体验证的PCR鉴定结果(左侧)和全长及截短回补转化子验证的基因表达分析(右侧)。PCR电泳结果从左到右依次为野生型大豆疫霉菌株(P6497)、敲除突变体(ΔPsMyosinF-1、ΔPsMyosinF-2和ΔPsMyosinF-3)、水和对照菌株(CK)。
图4为野生型大豆疫霉菌株P6497、PsMyosinF基因敲除突变体ΔPsMyosinF和回补转化子的菌丝生长、菌落形态和孢子囊形态图。
图5为菌饼接种大豆叶片侵染48h图和敲除突变体在大豆叶片致病性测定图。从左往右依次为野生型大豆疫霉菌株P6497、PsMyosinF敲除转化子(ΔPsMyosinF-1、ΔPsMyosinF-2和ΔPsMyosinF-3)和回补转化子的菌饼接种大豆叶片侵染48h图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
大豆疫霉野生型菌株P6497为美国Brett M.Tyler教授馈赠的大豆疫霉标准菌株。以上菌株仅为本发明在实施例所使用的材料，事实上，在应用本发明所述筛选标记时，可使用任何商购途径获得疫霉菌菌株。
上述菌株均已经过现有的形态学和分子生物学方法鉴定。
实施例1、大豆疫霉中含有FYVE结构域的肌球蛋白PsMyosinF基因的克隆
1.1大豆疫霉总RNA提取
大豆疫霉菌株P6497在10％V8固体培养基上在25℃下黑暗培养4d后，从菌落边缘打取直径为5mm的菌饼接种在10％V8液体培养基中，25℃黑暗培养4d后收取菌丝，取30mg左右的菌丝，至于2mL无霉无菌的离心管中，并加入两颗直径5mm的钢珠，液氮冷冻后使用球磨仪研磨至粉末状。采用Promega公司的SV Total RNA提取试剂盒(Z3100)提取大豆疫霉RNA，具体方法步骤参考试剂盒中植物组织RNA提取的说明。
1.2大豆疫霉反转录第一链cDNA的合成
第一链cDNA合成采用Takara公司的
RT reagent Kit with gDNAEraser(Perfect Real Time)试剂盒(RR047A)进行。具体步骤如下：
(1)去除基因组DNA(10μL反应体系)：5×gDNA Eraser Buffer 2μL；gDNA Eraser1μL；总RNA 2μL；无RNase的超纯水5μL。
(2)反转录反应(10μL反应体系)：步骤(1)的反应液10μL；5×
Buffer 4μL；/>
Enzyme Mix I lμL；RT Primer Mix lμL；无RNase的超纯水4μL。
反应条件：37℃15min；85℃5s；4℃保存。将获得的cDNA稀释4倍用于Real timePCR反应。
1.3 PsMyosinF基因克隆
设计克隆大豆疫霉中含有FYVE结构域的肌球蛋白基因的引物，PsMyosinF-F：ATGGACGTGGGCGCCGAG(SEQ ID No.1)；PsMyosinF-R：TCATAGAAATTCGCTATCGCTATC(SEQ IDNo.2)。以步骤1.2获得大豆疫霉cDNA和基因组为模板，用上述引物进行PCR扩增，将扩增产物回收后分别与T1-simple Vector(北京全式金生物技术有限公司，北京)连接，并转化大肠杆菌T1感受态细胞，通过筛选出阳性克隆，提取阳性克隆的质粒进行测序，测序结果表明PsMyosinF基因cDNA具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，发明人通过对基因组扩增和测序表明，其编码基因与cDNA序列一致。SEQ ID No.3由4233个核苷酸组成，编码1410个氨基酸组成的蛋白质(序列见SEQ ID No.4)，将该蛋白质命名为PsMyosinF。其中，FYVE结构域的序列为自SEQ ID No.4的氨基端第1128-1181为氨基酸残基序列。
SEQ ID No.3：
SEQ ID No.3：
实施例2、PsMyosinF基因在大豆疫霉不同发育阶段的表达模式分析
选用试剂盒：TakaraTBGreenTM Premix Ex TaqTM II(Tli RNaseH Plus)(Code：RR820A)。用菌丝阶段cDNA样品分别稀释0、4、42、43、44、45、46倍，以PsActin(引物序列见SEQID No.13、SEQ ID No.14)为内参基因和PsMyosinF为检测基因，建立实时荧光定量PCR标准曲线。基因引物扩增效率需在90％以上，选取合适的稀释样品浓度进行下一步试验。
以不同发育阶段和侵染阶段样品稀释4倍作为模板，PsActin为内参基因，利用检测引物PsMyosinF-qPCR-F/PsMyosinF-qPCR-R(序列见SEQ ID No.5、SEQ ID No.6)，进行实时荧光定量PCR检测。qPCR反应体系为20μL：10μL TB Green Premix Ex Taq II、1.6μL模板、各0.8μL F/R引物、6.8μL ddH2O。反应程序为两步法：95℃ 30s；95℃ 5s，60℃ 30s，40个循环。通过2-ΔΔCt计算PsMyosinF基因在大豆疫霉不同发育阶段的相对表达量。
结果如图1所述，以大豆疫霉P6497菌丝阶段(my)进行归一化，PsMyosinF在大豆疫霉游动孢子阶段(zo)和休止孢萌发阶段(cg)显著高表达。
实施例3、大豆疫霉PsMyosinF基因的敲除转化子的获得
3.1大豆疫霉PsMyosinF基因的敲除载体的构建
(1)获得候选sgRNA
通过EuPaGDT(http://grna.ctegd.uga.edu/)进行PsMyosinF的sgRNA的设计，在网站中输入基因组全长进行搜索。
(2)二级结构筛选
利用网站工具(http://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/Servers/Predict1/Predict1.html)对候选sgRNA的二级结构进行分析，选取形成发夹互补桥梁的个数小于等于3个为候选sgRNA。
(3)脱靶分析
通过FungiDB(www.fungidb.org)对sgRNA进行脱靶分析，输入包括PAM区域的共23个碱基进行比对，包含9～23(含NGG)完全匹配的情况，认为脱靶的风险较高。
(4)选取理想的sgRNA进行合成(表达sgRNA的DNA分子序列见SEQ IDNo.30、SEQ IDNo.31和SEQ ID No.32，sgRNA序列分别为CCGUGUUGGUGUAGAUCUUGCUG、CCGGGACUCUUGCCGGCCACGGA、UGCUCUCCGUCACCUCUCCGUGG。分别靶向SEQ ID No.3的5’端第291-313位核酸酸序列、SEQ ID No.3的5’端第622-644位核酸酸序列、SEQ ID No.3的5’端第948-970位核酸酸序列。
(5)以PYF515(已发表载体，Fang Y,Cui L,Gu B,et al.2017.Efficient genomeediting in the oomycete Phytophthora sojae using CRISPR/Cas9.CurrentProtocols in Microbiology,44:21A.1.1-21A.1.26.)为骨架载体，按照文献已发表方法(记载于Fang Y,Cui L,Gu B,et al.2017.Efficient genome editing in the oomycetePhytophthora sojae using CRISPR/Cas9.Current Protocols in Microbiology,44:21A.1.1-21A.1.26.)构建sgRNA表达载体(结构如图2中sgRNA载体)。sgRNA编码DNA退火处理(30μL体系)：3μL正义链，3μL反义链，3μL 10×T4 DNA Ligase Buffer(NEB)，2μL T4Polynudeotide和19μLddH2O，37℃，30min；加入4μL 0.5M的NaCl，100℃，2min；于室温缓慢冷却约3～4h；稀释1μL，加入499μL ddH2O；选用酶切位点BsaI和NneI酶切PYF515质粒，使质粒线性化；连接质粒：3μL稀释后退火处理的sgRNA片段编码DNA(序列见SEQ ID No.30、SEQID No.31或SEQ ID No.32)，2μL 10×T4 DNA Ligase Buffer(NEB)，1μL T4
DNA Polynudeotide，50ng PYF515线性质粒，ddH2O补至20μL，25℃，30min。将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，冰浴30min、热激42℃，35s，冰浴2min，加入无抗性LB摇培60min，将菌液涂于带有Amp抗性的LB平板上，37℃过夜培养后，使用通用引物M13F(序列：TGTAAAACGACGGCCAGT)/RPL41-F(序列：CAAGCCTCACTTTCTGCTGACTG)扩增、测序验证克隆。将验证正确的含有SEQ ID No.30所示片段的重组载体命名为PYF515-sgRNA1，该载体表达靶向SEQ ID No.3的5’端第291-313位核酸序列；将验证正确的含有SEQ ID No.31所示片段的重组载体命名为PYF515-sgRNA2，该载体表达靶向SEQ ID No.3的5’端第622-644位核酸序列；将验证正确的含有SEQ ID No.32所示片段的重组载体命名为PYF515-sgRNA3，该载体表达靶向SEQ ID No.3的5’端第948-970位核酸序列。
(6)以大豆疫霉P6497基因组DNA为模板，利用引物对(基因上游1000bp片段引物对序列见SEQ ID No.7和SEQ ID No.8、基因下游1000bp片段引物对序列见SEQ ID No.11和SEQ ID No.12)分别扩增目的基因上游1000bp片段(序列见SEQ ID No.33)和下游1000bp片段(序列见SEQ ID No.34)；以PYF515为模板，利用引物对(序列见SEQ ID No.9和SEQ IDNo.10)扩增GFP片段。以pBluescript II SK+为骨架载体，选择酶切位点EcoRI和BamHI(酶购自NEB公司)酶切pBluescript II SK+质粒，通过In-fusion试剂盒(Takara CodeNo.639650)构建同源臂替换载体(结构如图2中Donor载体)。利用
HD CloningKit将三个扩增片段融合连接于克隆载体pBluescript II SK+(EcoRI和BamHI酶切)，50℃，15min后将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，冰浴30min、热激42℃，35s，冰浴2min，加入无抗性LB摇培60min，将菌液涂于带有Amp抗性的LB平板上，37℃过夜培养后，使用通用引物M13F(序列：TGTAAAACGACGGCCAGT)/M13R(序列：CAGGAAACAGCTATGACC)扩增、测序验证克隆，将验证正确的含有依次连接的PsMyosinF上游1000bp序列、GFP基因序列和PsMyosinF下游1000bp序列的重组表达载体命名为pBS-GFP-PsMyosinF。
3.2大豆疫霉PsMyosinF基因的敲除转化子的获得
采用CaCl2-PEG介导的原生质体转化方法获得PsMyosinF基因的敲除转化子(记载于Fang and Tyler,2016.Efficient disruption and replacement of an effectorgene in the oomycete Phytophthora sojae using CRISPR/Cas9)。具体为将3.1中构建的sgRNA表达载体(PYF515-sgRNA1、PYF515-sgRNA2和PYF515-sgRNA3分三组一起转入，第一组：PYF515-sgRNA1和PYF515-sgRNA2；第二组PYF515-sgRNA2和PYF515-sgRNA3；第三组PYF515-sgRNA1和PYF515-sgRNA3)分别和同源臂替换载体pBS-GFP-PsMyosinF同时进行原生质体转化，转入大豆疫霉P6497中，将生长出来的转化子经G418抗性V8平板上25℃培养筛选，从菌落边缘打取菌丝块接种在铺有玻璃纸的V8平板上，25℃黑暗培养6d后刮取菌丝，提取转化子样品的DNA。
利用三对引物进行敲除转化子的验证，引物对PsMyosinF-QCYZ-F1/R1(见序列表中序列15和序列16)和PsMyosinF-QCYZ-F2/R2(见序列表中序列19和序列20)用于基因是否发生替换验证，PsMyosinF-QCYZ-F3/R3(见序列表中序列17和序列18)用于基因内部的验证。若PsMyosinF-QCYZ-F1/R1和PsMyosinF-QCYZ-F2/R2对疑似转化子进行PCR扩增时有条带，且PsMyosinF-QCYZ-F3/R3对疑似转化子进行PCR扩增时无条带，则可以鉴定该疑似转化子为阳性纯合转化子；若三对引物均有条带，则可以鉴定该疑似转化子为阳性杂合转化子。如图3所示，共获得了3株纯合PsMyosinF敲除转化子，分别为：ΔPsMyosinF-1、ΔPsMyosinF-2和ΔPsMyosinF-3。
实施例4、大豆疫霉PsMyosinF基因的过量表达回补转化子的获得
以大豆疫霉P6497的cDNA为模板，采用引物(序列见SEQ ID No.21和SEQ IDNo.22)进行PCR扩增，将扩增的PsMyosinF基因cDNA片段产物回收后选用ApaI和SpeI(酶购自NEB公司)进行酶切，同时扩繁PYF3质粒(已发表载体，Fang Y,Cui L,Gu B,etal.2017.Efficient genome editing in the oomycete Phytophthora sojae usingCRISPR/Cas9.Current Protocols in Microbiology,44:21A.1.1-21A.1.26.)用于酶切。将酶切后的PsMyosinF基因连接至酶切后的PYF3质粒中，连接体系如下(T4连接酶购买自Takara公司)：体系共10μL(反应条件：25℃30min)，酶切后的PYF3质粒1μL；酶切后的PsMyosinF基因片段5μL；5×T4 DNA Ligase Buffer 2μL；T4 DNA Ligase 0.5μL；ddH2O1.5μL。测序获得PsMyosinF全长过表达载体。以全长过表达载体为模板，进行关键结构域截短体片段的扩增(序列SEQ ID No.21、SEQ ID No.22、SEQ ID No.23和SEQ ID No.24用于扩增构建关键结构域截短过表达载体的截短Motor结构域的片段，扩增产物共2070个核苷酸；序列SEQ ID No.21、SEQ ID No.22、SEQ ID No.25和SEQ IDNo.26用于扩增构建关键结构域截短过表达载体的截短FYVE结构域的片段，扩增产物共4071个核苷酸；序列SEQ ID No.21和SEQ ID No.27用于扩增构建关键结构域截短过表达载体的截短GAF结构域的片段，扩增产物共3723个核苷酸)，利用
HD CloningKit试剂盒(Takara Code No.639650)构建PsMyosinF关键结构域截短过表达载体，分别将各个截短体对应的扩增片段融合连接于克隆载体PYF3(SpeI和ApaI酶切)，50℃反应15min后将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，冰浴30min、热激42℃35s，冰浴2min，加入无抗性LB摇培60min，将菌液涂于带有Amp抗性的LB平板上，37℃过夜培养后，使用引物pTOR-F(序列：CCAAGTCCCAACCGACTCTT)/pTOR-R(序列：GTTCTACAAACGGCCTTCTT)扩增、测序验证克隆，将验证正确的重组表达载体分别命名为PYF3-PsMyosinF-ΔMotor、PYF3-PsMyosinF-ΔFYVE和PYF3-PsMyosinF-ΔGAF。
以3.2获得PsMyosinF敲除转化子ΔPsMyosinF-1为实验材料，利用CaCl2-PEG介导的原生质体转化，并利用引物对(序列见SEQ ID No.28-29)验证获得PsMyosinF全长及截短体的过表达回补转化子。将验证正确的PsMyosinF全长回补转化子命名为ΔPsMyosinF-C；将验证正确的截短Motor结构域的片段的回补转化子命名为ΔPsMyosinF-CΔMotor；将验证正确的截短FYVE结构域的回补转化子命名为ΔPsMyosinF-CΔFYVE；将验证正确的截短GAF结构域的回补转化子命名为ΔPsMyosinF-CΔGAF。
实施例5、大豆疫霉PsMyosinF基因的敲除转化子和回补转化子生物学性状分析
(1)菌丝生长速率检测
将供试菌株大豆疫霉PsMyosinF基因的敲除转化子ΔPsMyosinF、全长回补转化子ΔPsMyosinF-C和各个结构域截短回补转化子(ΔPsMyosinF-CΔMotor，ΔPsMyosinF-CΔFYVE和ΔPsMyosinF-CΔGAF)接于V8平板上，25℃黑暗培养6d后，用直径5mm的打孔器沿菌落边缘打取菌饼，接种于V8平板上，25℃培养箱中黑暗培养6d，采用十字交叉法测量菌落直径。试验进行3次生物学重复。大豆疫霉P6497为对照。
如图4所示，与野生型大豆疫霉菌株P6497相比，敲除突变体ΔPsMyosinF菌丝膨大，生长速率显著下降，全长回补转化子ΔPsMyosinF-C和GAF结构域截短回补转化子ΔPsMyosinF-CΔGAF的菌丝生长性状得到恢复，而Motor结构域截短回补转化子ΔPsMyosinF-CΔMotor和FYVE结构域截短回补转化子ΔPsMyosinF-CΔFYVE的菌丝生长性状没有恢复。
(2)孢子囊和游动孢子测定
将供试菌株大豆疫霉PsMyosinF基因的敲除转化子ΔPsMyosinF、全长回补转化子ΔPsMyosinF-C和各个结构域截短回补转化子(ΔPsMyosinF-CΔMotor，ΔPsMyosinF-CΔFYVE和ΔPsMyosinF-CΔGAF)接于V8平板上，25℃黑暗培养6d后，用直径5mm的打孔器沿菌落边缘打取菌饼，取10个菌饼于装有20mL 10％V8液体培养基的培养皿中，菌饼的菌丝面朝上，水面要没过菌饼，在25℃培养箱中黑暗培养2d后，倾去V8液体培养基，用20mL无菌水重悬冲洗菌丝丛5次，每次间隔30min。冲洗完毕后，加入20mL无菌水，25℃黑暗培养8-12h，诱导孢子囊产生后，在显微镜下镜检各菌株每个视野产生孢子囊的数目，试验进行3次生物学重复。大豆疫霉P6497为对照。
将镜检完毕的孢子囊在25℃黑暗培养1-3h诱导游动孢子的产生。收集游动孢子悬浮液，涡旋振荡30s后，用血球计数板进行显微镜镜检，计算游动孢子产量，试验进行3次生物学重复。
结果如图4所示，在产孢诱导处理条件下，野生型大豆疫霉菌株P6497能够正常形成孢子囊，敲除突变体ΔPsMyosinF不产生孢子囊，全长回补转化子ΔPsMyosinF-C和GAF结构域截短回补转化子ΔPsMyosinF-CΔGAF可以正常产生孢子囊，而Motor结构域截短回补转化子ΔPsMyosinF-CΔMotor和FYVE结构域截短回补转化子ΔPsMyosinF-CΔFYVE不能产生孢子囊。
(3)转化子的离体叶片致病力
菌饼离体叶片致病力：大豆疫霉PsMyosinF基因的敲除转化子(ΔPsMyosinF-1、ΔPsMyosinF-2和ΔPsMyosinF-3)和全长回补转化子ΔPsMyosinF-C在25℃黑暗培养6d后，用直径5mm的打孔器沿菌落边缘打取菌饼备用。取两层吸水纸铺在保鲜盒中，倒入适量去离子水后放入健壮、等位、同龄的大豆叶片(第二对真叶)十片。将打取的菌饼接种于大豆叶片，每片叶片接种1个，每组至少接种10片叶片。接种后的大豆叶片置于25℃(RH＝60％-80％)条件下，黑暗培养3d。测量记录病斑面积并拍照，试验进行3次生物学重复。大豆疫霉P6497为对照。
如图5所示，在菌饼接种大豆离体叶片，与野生型大豆疫霉菌株P6497相比，敲除突变体致病力显著下降，全长回补转化子的致病力得到恢复。
Claims (10)
1.一种含有FYVE结构域的肌球蛋白，是如下A1)或A2)或A3)或A4)的蛋白质：
A1)由SEQ ID No.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
A2)在如SEQ ID No.4所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
A3)由SEQ ID No.4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与大豆疫霉菌丝极性生长和/或孢子囊形成相关的由A1)衍生的蛋白质；
A4)与SEQ ID No.4所示的氨基酸序列相似性在93％以上，优选在95％以上，更优选在98％以上且具有与如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列相同功能的氨基酸序列。
2.编码权利要求1所示的PsMyosinF蛋白的编码基因；优选的，所述编码基因为如下B1)或B2)或B3)：
B1)SEQ ID No.3中所述的核苷酸序列所示的DNA分子；
B2)与a)所示的核苷酸序列的具有75％以上或85％以上或95％以上同一性，且编码权利要求1中所述蛋白质的cDNA分子或DNA分子；
B3)在严格条件下与B1)或B2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述蛋白质的cDNA分子或DNA分子。
3.权利要求2所述的编码基因转录得到的RNA分子；
优选的，所述RNA分子的序列为如下C1)或C2)：
C1)如SEQ ID No.3所示的DNA序列转录的RNA序列的相似性在75％以上，进一步优选在85％以上，更优选在95％以上且具有与如SEQ ID No.3所示的DNA序列转录的RNA序列相同功能的RNA序列；
C2)如SEQ ID No.3中所示的DNA序列转录的RNA序列。
4.与权利要求1所示的肌球蛋白、权利要求2所示的编码基因或权利要求3所述的RNA分子相关的生物材料，为下述D1)至D10)中的任一种：
D1)含有权利要求2所述编码基因的表达盒；
D2)含有权利要求2所述编码基因的重组载体、或含有D1)所述表达盒的重组载体；
D3)含有权利要求2所述编码基因的重组微生物、或含有D1)所述表达盒的重组微生物、或含有D2)所述重组载体的重组微生物；
D4)含有权利要求2所述编码基因的转基因植物细胞系、或含有D1)所述表达盒的转基因植物细胞系；
D5)含有权利要求2所述编码基因的转基因植物组织、或含有D2)所述表达盒的转基因植物组织；
D6)含有权利要求2所述编码基因的转基因植物器官、或含有D2)所述表达盒的转基因植物器官；
D7)抑制权利要求2所述编码基因表达的核酸分子；优选的，所述核酸分子为敲除权利要求2所述编码基因的核酸分子，或者沉默权利要求2所述编码基因的核酸分子；
D8)含有或表达D7)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系；
D9)抑制权利要求3所述RNA分子翻译的核酸分子；
D10)含有或表达D9)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。
5.权利要求1所述的肌球蛋白、权利要求2所示的编码基因或权利要求3所述的RNA分子或权利要求4所述的生物材料在控制卵菌菌丝极性生长和/或控制孢子囊产生和/或降低卵菌致病力中的应用；
优选的，所述卵菌为大豆疫霉病菌(Phytophthora sojae)，最优选为大豆疫霉病菌(Phytophthora sojae)P6497。
6.权利要求1所述的肌球蛋白或权利要求2所示的编码基因在作为筛选控制卵菌菌丝极性生长和/或控制孢子囊产生和/或降低卵菌致病力的农药制剂的靶标中的应用。
7.一种降低卵菌致病力的方法，包括通过抑制卵菌中含有FYVE结构域的肌球蛋白的编码基因的表达或使其失活，或抑制其RNA的翻译，或抑制含有FYVE结构域的肌球蛋白的活性或使其失活，获得致病力降低的卵菌；所述含有FYVE结构域的肌球蛋白的氨基酸序列为SEQID No.4所示的氨基酸序列；所述卵菌为大豆疫霉病菌(Phytophthora sojae)；
所述抑制卵菌中含有FYVE结构域的肌球蛋白的编码基因的表达或使其失活的方法优选为将所述的编码基因敲除。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述含有FYVE结构域的肌球蛋白的编码基因为如SEQ ID No.3所示的DNA。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述卵菌优选为大豆疫霉病菌(Phytophthora sojae)P6497。
10.一种抑制或阻断卵菌菌丝极性生长或孢子囊形成的方法，其包括通过抑制权利要求2所述的基因的表达或使其失活，或抑制如权利要求3中所述的RNA序列的翻译，或抑制如权利要求1所述的肌球蛋白的活性或使其失活，抑制或阻断所述卵菌菌丝极性生长或孢子囊形成；所述卵菌为大豆疫霉病菌(Phytophthora sojae)；
所述抑制权利要求2所述的基因的表达或使其失活的方法优选为将权利要求2所述的基因敲除。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116004588A (zh) * | 2022-01-10 | 2023-04-25 | 西北农林科技大学 | 含有fyve结构域的agc蛋白激酶及其编码基因与应用 |
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2023
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