CN117447564A - 大豆疫霉14-3-3蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了1个来自疫霉菌(Phytophthora spp.)的14‑3‑3蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的14‑3‑3蛋白在大豆疫霉(Phytophthora sojae)中是序列为2,5,7,9所示的蛋白质；其编码基因如序列3,4,6,8所示。通过实验证明，本发明所提供的蛋白在大豆疫霉自身生长发育过程中发挥重要作用，具体表现为，该蛋白关键氨基酸功能位点31位突变后大豆疫霉的卵孢子数量下降，关键氨基酸功能位点172位突变后大豆疫霉的孢子囊数量及游动孢子数量下降，关键氨基酸功能位点223位突变后大豆疫霉的孢子囊数量及游动孢子数量下降。本发明的基因在控制疫霉菌引起的疫病发生和流行中具有很高的应用价值，为未来新型杀菌剂的研发提供了分子靶标。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及来自大豆疫霉(Phytophthorasojae)的14-3-3蛋白Ps14-3-3及其编码基因与应用。
背景技术
卵菌(Oomycete)分布广泛，可分为植物病原卵菌和动物病原卵菌，对植物界及动物界均能造成严重危害，给全世界的农业生产造成巨大的经济损失。其中疫霉属卵菌侵染的作物种类繁多，难以防治。由于卵菌与丝状真菌在系统发育上的差异性和日趋严重的抗药性问题，使基于新型靶标的卵菌杀菌剂的开发显得尤为重要和迫切，另外随着杀菌剂作用机制的不断深入解析，人们开始更加关注靶向蛋白关键结合位点的新型卵菌抑制剂的开发。
疫霉菌的生活史分为无性阶段和有性阶段。在无性阶段，疫霉可以产生孢子囊与游动孢子，随风、雨或灌溉水进行远距离的传播。在有性阶段，疫霉可以通过同宗配合形成卵孢子。卵孢子壁厚，内含物丰富，能够抵御极端环境，可在土壤中存活数年，在适宜条件下，可以直接萌发产生菌丝侵染寄主植物。大豆疫霉(Phytophthorasojae)作为能够引起大豆疫病的典型土传植物病原疫霉菌，可引起大豆根腐、茎腐等症状，被侵染的大豆植株通常表现为从根部腐烂，再由下向上沿着茎干逐渐扩散，在茎部形成褐色病斑，造成严重的经济损失。鉴于大豆根腐病发生广泛、病因复杂、监测防控难度大等特点，2023年2月13日农业农村部种植业管理司首次建议该病害增补为我国一类农作物病害，亟需引起重视。药物防治仍然是大豆疫霉等卵菌控制的关键策略，但由于卵菌面临着有效药剂种类少且抗药性日趋严重的实际问题，发掘全新卵菌抑制剂显得尤为重要。
14-3-3蛋白是一类在真核生物中广泛表达的酸性蛋白家族，通常作为“接头蛋白”在细胞核与细胞质间传递，可与多种蛋白质相互作用，进而影响下游蛋白的活性、定位、稳定性，参与神经元发育、细胞周期、凋亡、细胞信号转导和应激反应等多种生物学过程，是PPI小分子调节剂的主要研究对象。目前，哺乳动物中有关14-3-3蛋白的研究多集中在医学和动物学上，研究表明其在神经发育、细胞周期、疾病发生等生命过程中都发挥着重要作用。在植物中，14-3-3蛋白可与300多种靶蛋白互作进而在植物生长发育过程中参与赤霉素、脱落酸、油菜素类固醇化合物、乙烯等植物激素信号通路转导、营养代谢调控和光信号应答等过程。然而，14-3-3蛋白在植物病原卵菌中尚未见系统的功能报道。
综上所述，疫霉菌的游动孢子和卵孢子的形成是影响病害的发生发展的重要因素。如果能阻断疫霉菌游动孢子及卵孢子的形成，降低病原菌侵染寄主植物的能力，就可以控制疫霉菌引起的根腐病等危害。
发明内容
通过发明人的研究发现，大豆疫霉中的14-3-3蛋白关键位点的突变与大豆疫霉孢子囊和游动孢子的产量以及卵孢子的数量密切相关，而植物病害正常的侵染循环与孢子囊、游动孢子和卵孢子的产量以及存活时间呈正相关。因此可以通过调控14-3-3蛋白的关键氨基酸位点的功能来阻断正常的孢子囊，游动孢子以及卵孢子的产量，使大豆疫霉侵染寄主的能力减弱，从而控制大豆疫霉根腐病的发生发展。
因此，本发明的目的之一是提供一类大豆疫霉14-3-3及其三个关键氨基酸位点分别突变后的蛋白，命名为Ps14-3-3，Ps14-3-3N31A，Ps14-3-3N172A，Ps14-3-3N223A，来源于大豆疫霉菌株P6497，是如下A1)或A2)或A3)或A4)：
A1)氨基酸序列是如序列2,5,7,9所示的蛋白质；
A2)在如序列2、5、7或9所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
A3)将如序列2、5、7或9所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的如序列2,5,7,9所示的蛋白衍生的蛋白质；
A4)与如序列2、5、7或9所示的氨基酸序列相似性在85％以上，优选在90％以上，更优选在95％以上且具有与如序列2、5、7或9所示的氨基酸序列相同功能的氨基酸序列。
为了使A1)中的蛋白便于纯化，可在如序列表中序列2,5,7,9所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上Poly-Arg(RRRRR)、Poly-His(HHHHHH)、FLAG(DYKDDDDK)、Strep-tagII(WSHPQFEK)、c-myc(EQKLISEEDL)等标签。
上述A1)-A4)中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述A2)-A4)中蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列3所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个核苷酸对的错义突变，和/或在其5’端和/或3’端连上述标签的编码序列得到。
其中，A1)中，序列表中序列2、5、7或9(Ps14-3-3，Ps14-3-3N31A，Ps14-3-3N172A，Ps14-3-3N223A)由249个氨基酸残基组成。
本发明目的之二是提供编码所述14-3-3及其三个关键氨基酸位点分别突变后蛋白的核酸分子。所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。
其中，上述14-3-3及其三个关键氨基酸位点分别突变后蛋白的编码基因为如下B1)或B2)或B3)：
B1)序列表中序列1、3、4、6或8所述的核苷酸序列所示的DNA分子；
B2)与B1)所示的核苷酸序列的具有85％以上或90％以上或95％以上同一性，且编码上述14-3-3及其三个关键氨基酸位点分别突变后蛋白的cDNA分子或DNA分子；
B3)在严格条件下与B1)或B2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述14-3-3及其三个关键氨基酸位点分别突变后蛋白的cDNA分子或DNA分子。
上述编码基因，序列表中序列3、4、6或8由都750个核苷酸组成；自序列3、4、6或8的5’端第1-750位核苷酸为编码序列，分别编码序列表中序列2，5,7,9所示的蛋白质(Ps14-3-3,Ps14-3-3N31A，Ps14-3-3N172A，Ps14-3-3N223A)。序列表中序列1由2007个核苷酸组成，自序列表中序列1的5’端第910-1661为外显子序列，即序列表中序列3，编码序列表中序列2所示的蛋白质。
所述的RNA分子，是所述的编码基因转录得到的RNA分子；
优选的，所述RNA分子的序列为如下C1)或C2)：
C1)如序列3、4、6或8所示的DNA序列转录的RNA序列的相似性在85％以上，进一步优选在90％以上，更优选在95％以上且具有与如序列3,4,6,8所示的DNA序列转录的RNA序列相同功能的RNA序列；
C2)如序列3、4、6或8所示的DNA序列转录的RNA序列。
如本发明的DNA序列在严格条件下与如序列3、4、6或8所示DNA序列能够进行分子杂交且编码如序列2、5、7或9所示14-3-3及其三个关键氨基酸位点分别突变后蛋白的DNA序列。上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
本发明目的之三是提供以上所述核酸分子相关的生物材料，包括重组载体、表达盒、重组微生物或转基因植物细胞系。所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体；所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌；所述转基因植物细胞系不包括繁殖材料。具体的可为如下为下述D1)至D10)中的任一种：
D1)含有所述编码基因的表达盒；
D2)含有所述编码基因的重组载体、或含有D1)所述表达盒的重组载体；
D3)含有所述编码基因的重组微生物、或含有D1)所述表达盒的重组微生物、或含有D2)所述重组载体的重组微生物；
D4)含有所述编码基因的转基因植物细胞系、或含有D1)所述表达盒的转基因植物细胞系；
D5)含有所述编码基因的转基因植物组织、或含有D2)所述表达盒的转基因植物组织；
D6)含有所述编码基因的转基因植物器官、或含有D2)所述表达盒的转基因植物器官；
D7)改变所述编码基因表达的核酸分子；
D8)含有D7)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系；
D9)改变上述RNA分子翻译的核酸分子；
D10)产生D9)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。
本发明目的之五是提供大豆疫霉14-3-3及其三个关键氨基酸位点分别突变后的蛋白及编码14-3-3及其三个关键氨基酸位点分别突变后蛋白的核酸分子或含有编码14-3-3及其三个关键氨基酸位点分别突变后蛋白的核酸分子的生物材料的应用。
所述应用为下述1)-3)中任一种或几种：
1)在调控疫霉菌孢子囊和/或游动孢子产量中的应用；
2)在调控疫霉菌卵孢子产量中的应用；
3)在抑制和/或杀灭疫霉菌病菌中的应用；
优选的，其中，所述应用中，包括通过改变序列3所述的编码基因的核苷酸分子，或改变所述的RNA分子，序列2所述的Ps14-3-3蛋白的功能来实现1)-3)所述的应用。
所述应用中，通过改变如上述的编码基因的DNA或RNA序列，或改变上述14-3-3蛋白的功能来调控疫霉菌孢子囊，游动孢子和卵孢子的产量，从而能够抑制和/或杀灭大豆疫霉病菌的生长。
本发明目的之六是提供所述序列表中序列2、5、7或9所示的14-3-3，Ps14-3-3N31A，Ps14-3-3N172A，Ps14-3-3N223A蛋白、上述序列表中序列3、4、6或8所示的编码基因在作为抑菌或杀菌剂靶标筛选疫霉菌抑菌或杀菌剂中的应用。
本发明目的之七是提供一种筛选或辅助筛选疫霉菌抑菌和/或杀菌剂的方法，所述方法包括将待检测物应用于所述疫霉菌，当所述待检测物能够改变如上DNA序列，或改变如上RNA序列，或改变如上所示的14-3-3蛋白的功能，则所述待测物质为候选的所述植物疫霉菌抑菌和/或杀菌剂。
本发明目的之八是提供一种降低疫霉菌的活性的方法，包括下述步骤：改变如上述的编码基因的核苷酸分子序列，或抑改变如所述的RNA分子序列，或改变如上所述的14-3-3蛋白的功能；
其中，所述降低疫霉菌的活性为降低疫霉菌的孢子囊，游动孢子和卵孢子产量；
上述方法中，通过所述改变编码基因的核苷酸分子序列来实现蛋白功能的改变，具体的，可通过基因定点突变来实现。
所述基因定点突变是指通过同源重组使关键功能域中的关键氨基酸位点发生突变的现象。基因定点突变是通过将关键氨基酸位点发生改变从而使特定靶基因的功能发生变化。
优选的，通过对疫霉菌中14-3-3蛋白进行点突变以改变14-3-3蛋白的功能；
优选的，将14-3-3蛋白自氨基端第31位由N突变为A,和/或自氨基端第172位由N突变为A，和/或自氨基端第223位由N突变为A；
其中，所述14-3-3蛋白的序列优选如序列表中序列2所示。
具体表现为，该14-3-3蛋白关键氨基酸功能位点氨基端第31位由N突变为A,突变后大豆疫霉的卵孢子数量下降；关键氨基酸功能位点自氨基端第172位由N突变为A,突变后大豆疫霉的孢子囊数量及游动孢子数量下降；关键氨基酸功能位点自氨基端第223位由N突变为A,突变后大豆疫霉的孢子囊数量及游动孢子数量下降。
具体的，可通过使疫霉菌中序列表中序列3所示的基因进行基因定点突变，以使所述序列表中序列2所示的蛋白质功能发生改变。
上述疫霉菌优选为大豆疫霉。
在本发明的一个实施方式中，使上述基因进行基因定点突变的方法是基于CRISPR/Cas9的基因定点突变法。
具体的，基于CRISPR/Cas9的基因定点突变法是将目的基因的Donor载体和sgRNA及Cas9共表达质粒转染大豆疫霉筛选得到所述目的关键氨基酸位点突变后的重组菌。
所述Donor载体为含有依次连接目的基因待突变氨基酸位点上游800-1500bp的序列、目的基因突变后氨基酸序列(通常突变为丙氨酸)和目的基因待突变氨基酸位点下游800-1500bp的序列的重组载体。sgRNA及Cas9共表达质粒为共同表达靶向待突变目的基因的sgRNA片段和Cas9的编码的载体，其中，所述待突变目的基因为Ps14-3-3基因，靶向于Ps14-3-3基因的sgRNA序列为CCAGAAGATCGAGGGCGAAC。
优选的，所述sgRNA及Cas9共表达质粒是以PYF515载体为出发载体，将Ps14-3-3基因的sgRNA退火得到的双链sgRNA编码序列，插入PYF515载体的Nhe I和Bsa I酶识别位点之间，得到sgRNA及Cas9共表达质粒。
改变14-3-3蛋白质功能的物质在制备植物大豆疫霉病菌杀菌剂中的应用也属于本发明的保护范围。
上述应用中，所述改变14-3-3蛋白质功能的物质为改变14-3-3蛋白质编码基因的序列和/或改变14-3-3蛋白质的编码基因转录得到的RNA分子的翻译的物质。
试验证明，本发明所提供的14-3-3蛋白在大豆疫霉自身生长发育过程中起作用。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得的定点突变转化子，其生长发育较野生型亲本菌株而言有明显变化，主要包括：Ps14-3-3关键功能域中第31位氨基酸单点突变的转化子的卵孢子产量降低，Ps14-3-3关键功能域中第172位氨基酸单点突变的转化子的孢子囊数量及游动孢子数量降低，Ps14-3-3关键功能域中第223位氨基酸单点突变的转化子的孢子囊数量及游动孢子数量降低；因此，大豆疫霉病菌中14-3-3蛋白在大豆疫霉的无性生殖及有性生殖过程中均可发挥重要作用。本发明为的分子机制研究提供了技术支持，并为未来新型疫霉菌杀菌剂的研发提供了有潜力的分子靶标。
通过对植物病原卵菌中14-3-3蛋白与人，小鼠，果蝇，拟南芥和酵母中的14-3-3蛋白进行序列分析发现，大多数卵菌中仅含有一个的14-3-3蛋白，且大豆疫霉与其它卵菌中的14-3-3蛋白同源性较高，达到85％以上，而人，小鼠，果蝇，拟南芥和酵母中分别含有7个，8个，2个，12个和2个14-3-3蛋白，大豆疫霉中的14-3-3蛋白与它们的同源性较低(图1)。上述哺乳动物，植物和真菌中都包含有多个14-3-3蛋白的亚基，这些亚基共有三个保守的氨基酸功能位点，而大多数卵菌在进化过程中仅保留了一个14-3-3蛋白，因此这一个蛋白上就包含有上述三个保守的氨基酸功能位点(以大豆疫霉为例，107,172和223位点)，此外还进化出另一个关键氨基酸功能位点(以大豆疫霉为例，31位点)，这是与其他物种相比不同的地方。
附图说明
图1为植物病原菌14-3-3蛋白的聚类分析。
图2为大豆疫霉菌株P6497(WT)，空载体对照转化子CK，Ps14-3-3第31位氨基酸单点突变的转化子的卵孢子数量图(在V8固体培养基上培养7d)。
图3为大豆疫霉菌株P6497(WT)空载体对照转化子CK，Ps14-3-3第172位氨基酸单点突变的转化子的孢子囊及游动孢子数量图。
图4为大豆疫霉菌株P6497(WT)，空载体对照转化子CK，Ps14-3-3第223位氨基酸单点突变的转化子的孢子囊及游动孢子数量图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
大豆疫霉菌株P6497：为美国俄勒冈州立大学BrettM.Tyler教授馈赠的标准菌株，存放于中国农业大学植物保护学院种子病理与杀菌剂药理实验室，公众可从中国农业大学获得。
培养基或试剂配方：
10％V8固体培养基：100mlV8蔬菜汁，1.4gCaCO3，搅拌混匀，用去离子水稀释10倍，即加入900ml去离子水，添加15g琼脂，121℃高压湿热灭菌20min。
10％V8液体培养基：100mlV8蔬菜汁，1.4gCaCO3，搅拌混匀，12000rpm离心5min，取上清，用去离子水稀释10倍，121℃高压湿热灭菌20min。
营养豌豆培养基(Nutrientpeabroth，NPB)：125g豌豆加入1l去离子水，121℃高压湿热灭菌20min，纱布过滤获得豌豆营养液；称量2.0g酵母提取物、5.0g葡萄糖、5.0g甘露醇、5.0g山梨醇、2.0gCaCO3、0.1gCaCl2、0.5gMgSO4、3.0gKNO3、1.0gK2HPO4、1.0gKH2PO4，搅拌混匀，3000rpm离心10min或静置30min，取上清，用豌豆营养液定容至1l，固体培养基(NPBA)添加15g琼脂粉，湿热灭菌20min。使用前，在无菌操作台中，添加2ml维生素储液(Biotin6.7×10-7g/ml；Folic acid 6.7×10-7g/ml；L-inositol 4.0×10-5g/ml；Nicotinic acid4.0×10-5g/ml；Pyridoxine-HCl 6.0×10-4g/ml；Riboflavin 5.0×10-5g/ml；Thiamine-HCl 1.3×10-3g/ml)以及2ml微量元素储液(FeC6H5O7·3H2O 5.4×10-4g/ml；ZnSO4·7H2O3.8×10-4g/ml；CuSO4·5H2O 7.5×10-4g/ml；MgSO4·H2O 3.8×10-5g/ml；H3BO32.5×10-5g/ml；Na2MoO4·H2O 3.0×10-5g/ml)。
豌豆甘露醇培养基(PeaMannitol，PM)：准确称量91.1g甘露醇，1gCaCl2，2gCaCO3，加入大约900ml豌豆营养液，搅拌混匀约30min，3000rpm离心10min或静置30min，取上清，用豌豆营养液定容至1l，固体培养基(PMA)添加15g琼脂粉，湿热灭菌20min。
菌丝酶解液(20ml)：10ml 0.8M甘露醇，0.8ml 0.5M KCl，0.8ml 0.5M 4-吗啉乙磺酸，0.4ml 0.5M CaCl2，0.12g纤维素酶(Calbiochem,cat.No.219466)，0.12g裂解酶(Sigma，cat.No.L1412)，无菌超纯水定容至20ml，轻柔混匀溶解，0.22μm滤膜过滤灭菌，现用现配。
MMG溶液(250ml)：18.22g甘露醇，0.76gMgCl2·6H2O，2.0ml 0.5M 4-吗啉乙磺酸(pH＝5.7)，超纯水定容至250ml，0.22μm滤膜过滤灭菌。
W5溶液：0.1g KCl，4.6gCaCl2·2H2O，2.25gNaCl，7.8g葡萄糖，超纯水溶解定容至250ml，0.22μm滤膜过滤灭菌。
PEG-CaCl2溶液(40％w/v)：12gPEG 4000，3.75ml 0.5M CaCl2，3ml无菌超纯水，0.22μm滤膜过滤灭菌。
实施例1、大豆疫霉14-3-3蛋白Ps14-3-3M0编码基因的获得
本实施例中大豆疫霉14-3-3蛋白Ps14-3-3M0编码基因可以大豆疫霉标准菌株P6497的DNA为模板，利用TaKaRa-In-Fusion_Tools在线网站(http://www.clontech.com/US/Products/Cloning_and_Competent_Cells/Cloni ng_Resources/Online_In-Fusion_Tools)设计引物扩增目的基因Ps14-3-3M0序列(序列表中序列1由2007个核苷酸组成，经如表3所示Ps14-3-3-F和Ps-14-3-3-R引物扩增获得，自序列表中序列1的5’端第910-1661为外显子序列，不含内含子序列。)，其中，DNA或RNA提取的材料可以为大豆疫霉标准菌株P6497的菌丝体。
利用HD Cloning Kit将扩增片段依次融合连接入克隆载体pBluescript II SK+(EcoRV酶切)，连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，37℃过夜培养后，使用通用引物M13F(序列：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’)/M13R(序列：5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’)扩增、测序验证克隆，将验证正确的连接好Ps14-3-3上游1000bp序列和Ps14-3-3下游1000bp序列的重组表达载体命名为pBS-14-3-3M0。序列表中序列1编码序列表中序列2所示的蛋白质Ps14-3-3。
通过对植物病原卵菌中14-3-3蛋白与人，小鼠，果蝇，拟南芥和酵母中的14-3-3蛋白进行序列分析发现，大多数卵菌中仅含有一个14-3-3蛋白，且大豆疫霉与其它卵菌中的14-3-3蛋白同源性较高，达到85％以上(表1)，而人，小鼠，果蝇，拟南芥和酵母中分别含有7个，8个，2个，12个和2个14-3-3蛋白，大豆疫霉中的14-3-3蛋白与它们的同源性较低(表2)。因此对14-3-3进行系统发育树分析发现，卵菌中14-3-3蛋白大多聚为一支，而与人，小鼠，果蝇及拟南芥中14-3-3蛋白相聚较远(图1)。上述哺乳动物，植物和真菌中都包含有多个14-3-3蛋白的亚基，这些亚基共有三个保守的氨基酸功能位点，而大多数卵菌在进化过程中仅保留了一个14-3-3蛋白，因此这一个蛋白上就包含有上述三个保守的氨基酸功能位点(以大豆疫霉为例，107,172和223位点)，此外还进化出另一个关键氨基酸功能位点(以大豆疫霉为例，31位点)，这是与其他物种相比不同的地方。
表1.Ps14-3-3在卵菌中同源性比对
表2.Ps14-3-3在其他物种中同源性比对
Ps14-3-3蛋白的编码基因(cDNA)Ps14-3-3如序列表中序列3所示，序列表中序列3由750个核苷酸组成，编码序列表中序列2所示的蛋白质Ps14-3-3。序列3的获得可以大豆疫霉标准菌株P6497的DNA为模板，利用TaKaRa-In-Fusion_Tools在线网站(http://www.clontech.com/US/Products/Cloning_and_Competent_Cells/Cloni ng_Resources/Online_In-Fusion_Tools)设计引物扩增Ps14-3-3-Ptor序列(Ps14-3-3-Ptor-F：5’-CCTTGAGGTTGCTAGCATGGACCGTGACTCCCTTG-3’,Ps14-3-3-Ptor-R：5’-AGAAGTAGGCACCCCGCGGTTACTCCACGTCCTGCAC-3’),其中，DNA提取的材料可以为大豆疫霉标准菌株P6497的菌丝体。
利用HD Cloning Kit将扩增片段依次融合连接入克隆载体Ptor-3XFLAG(SacII和NheI酶切)中，连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，37℃过夜培养后，使用通用引物Ptor-F(序列：5’-CCAAGTCCCAACCGACTCTT-3’)/Ptor-R(序列：5’-GTTCTACAAACGGCCTTCTT-3’)扩增、测序验证克隆，将验证正确的连接好Ps14-3-3序列的重组表达载体命名为Ps14-3-3-Ptor。
序列表中序列4由750个核苷酸组成，编码序列表中序列5所示的蛋白质Ps14-3-3N31A。序列表中序列6由750个核苷酸组成，编码序列表中序列7所示的蛋白质Ps14-3-3N172A。序列表中序列8由750个核苷酸组成，编码序列表中序列9所示的蛋白质Ps14-3-3N223A。上述蛋白或基因也可以人工合成。
表3.Ps14-3-3M0编码基因扩增引物
实施例2、大豆疫霉Ps14-3-3基因三个单点点突变载体的构建
本发明将Ps14-3-3蛋白进行点突变，具体为：
1)将序列表中序列2所述的氨基酸序列的第31位氨基酸由N突变为A，即序列表中序列5所示的蛋白质Ps14-3-3N31A；其编码基因由序列表中序列3的5’端第91至93位核苷酸由AAC突变为GCC，即序列表中序列4。
序列表中序列4由750个核苷酸组成，编码序列表中序列5所示的蛋白质Ps14-3-3N31A。
2)将序列表中序列2所述的氨基酸序列的第172位氨基酸由N突变为A，即序列表中序列7所示的蛋白质Ps14-3-3N172A；其编码基因由序列表中序列3的5’端第514至516位核苷酸由AAC突变为GCC，即序列表中序列6。
序列表中序列6由750个核苷酸组成，编码序列表中序列7所示的蛋白质Ps14-3-3N172A。
3)将序列表中序列2所述的氨基酸序列的第223位氨基酸由N突变为A，即序列表中序列9所示的蛋白质Ps14-3-3N223A；其编码基因由序列表中序列3的5’端第667至669位核苷酸由AAC突变为GCC，即序列表中序列8。
序列表中序列8由750个核苷酸组成，编码序列表中序列9所示的蛋白质Ps14-3-3N223A。
上述蛋白或基因可以人工合成。
下述通过基于CRISPR/Cas9的方法进行上述点突变。
本实施例中基于CRISPR/Cas9的基因点突变载体构建方法以及相关载体的序列在文献“Fang,Y.,and Tyler,B.M.(2016).Efficient disruption and replacement of aneffector gene in the oomycete Phytophthora sojae using CRISPR/Cas9.Molecularplant pathology,17(1),127-139.”以及“Fang,Y.,Cui,L.,Gu,B.,Arredondo,F.,andTyler,B.M.(2017).Efficient genome editing in the oomycete Phytophthora sojaeusing CRISPR/Cas9.Curr.Protoc.Microbiol.44,21A.1.1-21A.1.26.”中公开过。本实施例中使用的pBluescriptII SK+同源臂载体质粒(Donor载体)，sgRNA及Cas9共表达质粒PYF515均由美国俄勒冈州立大学BrettM.Tyler教授馈赠。
本实施方式中所用的点突变后的Donor载体pBS-14-3-3N31A，pBS-14-3-3N172A，pBS-14-3-3N223A，sgRNA及Cas9共表达质粒PYF515-14-3-3；具体构建方法如下所述：
1)Ps14-3-3N31A的点突变载体pBS-14-3-3N31A的构建：手动设计4条M1突变引物。F1和R1中间共享一段包含突变位点在内的10bp左右的序列(如表4中所示)，其中定点突变位点一般选择突变为丙氨酸。FM和RM中间共享一段包含有同义突变位点在内的10bp左右的序列(如表4中所示)，其中同义突变位点选取4个左右，具体突变方式根据疫霉点突变时密码子的偏好性选择(Sucheta Tripathy,and Brett M.Tyler,2006)，上述4条引物长度均在30bp左右(其中F1即为表4中的Pbs-14-3-3N31A-F1，R1即为表4中的Pbs-14-3-3N31A-R1，FM即为表4中的Pbs-14-3-3N31A-FM，RM即为表4中的Pbs-14-3-3N31A-RM)。以pBS14-3-3M0同源重组载体为模板，用正向引物F1和反向引物RM进行扩增获得pBS-14-3-3N31A短片段，用反向引物R1和正向引物FM进行扩增获得pBS-14-3-3N31A长片段。然后通过PCR产物纯化回收，并利用Infusion连接酶进行连接转化，之后进行菌落PCR(引物为通用引物M13-F/R)并送至公司进行测序，确保靶标位点已经发生突变。将验证正确表达序列4的点突变后的重组表达载体分别命名为pBS-14-3-3N31A。
2)Ps14-3-3N172A的点突变载体pBS-14-3-3N172A的构建：手动设计4条M1突变引物。F1和R1中间共享一段包含突变位点在内的10bp左右的序列(如表4中所示)，其中定点突变位点一般选择突变为丙氨酸。FM和RM中间共享一段包含有同义突变位点在内的10bp左右的序列(如表4中所示)，其中同义突变位点选取4个左右，具体突变方式根据疫霉点突变时密码子的偏好性选择(Sucheta Tripathy,and Brett M.Tyler,2006)，上述4条引物长度均在30bp左右(其中F1即为表4中的Pbs-14-3-3N172A-F1，R1即为表4中的Pbs-14-3-3N172A-R1，FM即为表4中的Pbs-14-3-3N172A-FM，RM即为表4中的Pbs-14-3-3N172A-RM)。以pBS14-3-3M0同源重组载体为模板，用正向引物F1和反向引物RM进行扩增获得pBS-14-3-3N172A长片段，用反向引物R1和正向引物FM进行扩增获得pBS-14-3-3N172A短片段。然后通过PCR产物纯化回收，并利用Infusion连接酶进行连接转化，之后进行菌落PCR(引物为通用引物M13-F/R)并送至公司进行测序，确保靶标位点已经发生突变。将验证正确含有序列6的点突变后的重组表达载体分别命名为pBS-14-3-3N172A。
3)Ps14-3-3N223A的点突变载体pBS-14-3-3N223A的构建：手动设计4条M1突变引物。F1和R1中间共享一段包含突变位点在内的10bp左右的序列(如表4中所示)，其中定点突变位点一般选择突变为丙氨酸。FM和RM中间共享一段包含有同义突变位点在内的10bp左右的序列(如表4中所示)，其中同义突变位点选取4个左右，具体突变方式根据疫霉点突变时密码子的偏好性选择(Sucheta Tripathy,and Brett M.Tyler,2006)，上述4条引物长度均在30bp左右(其中F1即为表4中的Pbs-14-3-3N223A-F1，R1即为表4中的Pbs-14-3-3N223A-R1，FM即为表4中的Pbs-14-3-3N223A-FM，RM即为表4中的Pbs-14-3-3N223A-RM)。以pBS14-3-3M0同源重组载体为模板，用正向引物F1和反向引物RM进行扩增获得pBS-14-3-3N223A长片段，用反向引物R1和正向引物FM进行扩增获得pBS-14-3-3N223A短片段。然后通过PCR产物纯化回收，并利用Infusion连接酶进行连接转化，之后进行菌落PCR(引物为通用引物M13-F/R)并送至公司进行测序，确保靶标位点已经发生突变。将验证正确含有序列8的点突变后的重组表达载体分别命名为pBS-14-3-3N223A。
4)PYF515-14-3-31的构建：利用sgRNA设计网站EuPaGDT(http://grna.ctegd.uga.edu/)以及RNA结构在线分析工具(http://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/Servers/Predict1/Predict1.html)，选择特异性靶向Ps14-3-31基因且二级结构较弱的sgRNA序列(sg14-3-31：GTTCGCCCTCGATCTTCTGG，靶向于Ps14-3-31基因的SEQ ID No.1的第265-284位)，送至公司合成带有NheI和BsaI酶切位点以及HH ribozyme的正反向sgRNA序列引物。用无菌水溶解成100μM溶液。退火反应合成双链sgRNA序列，反应体系：3μl正向链溶液，3μl反向链溶液，3μl 10×T4 DNA Ligase Buffer(NEB)，4μl 0.5MNaCl，21μl超纯无菌水，吸打混匀，100℃反应2min，放至室温自然冷却4h，之后将反应液稀释500倍。再取2μl 10×T4 DNA Ligase Buffer(NEB)，50ngPYF515载体(Nhe I/Bsa I双酶切)，4μl稀释后的双链sgRNA溶液，1μl T4 DNA Ligase，无菌超纯水补齐至20μl，室温反应30min，使用5μl连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，37℃过夜培养后，使用引物对RPL41_Pseq_F(序列：5’-CAAGCCTCACTTTCTGCTGAC TG-3’)/M13F(序列：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’)进行菌落PCR验证，并测序验证阳性克隆，将验证正确可表达上述sgRNA的重组载体命名为PYF515-14-3-3。
表4.用于定点突变载体构建的引物序列
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实施例3、大豆疫霉Ps14-3-3基因三个单点定点突变转化子的获得
采用CaCl2-PEG介导的原生质体转化方法制备Ps14-3-3基因定点突变转化子，卵菌遗传转化的方法在文献“Fang,Y.,and Tyler,B.M.(2016).Efficient disruption andreplacement of an effector gene in the oomycete Phytophthora sojae usingCRISPR/Cas9.Molecular plant pathology,17(1),127-139.”中公开过。
pBS-14-3-3N31A定点突变转化子的获得具体为将实施例2中获得的定点突变基因pBS-14-3-3N31A的Donor载体、sgRNA及Cas9共表达质粒(pBS-14-3-3N31A与PYF515-14-3-3)共同转入大豆疫霉P6497的原生质体中，将生长出的转化子经G418抗性V8固体培养基平板25℃培养筛选，收集疑似转化子的菌丝体，提取DNA进行PCR测序验证，获得Ps14-3-3N31A单点突变的转化子菌株，分别命名为Ps14-3-3N31A-37、Ps14-3-3N31A-68、Ps14-3-3N31A-52。同时，将转入相同载体质粒、经过相同转化步骤但没有发生同源替换的转化子作为CK对照转化子，即CK。
pBS-14-3-3N172A定点突变转化子的获得具体为将实施例2中获得的定点突变基因pBS-14-3-3N172A的Donor载体、sgRNA及Cas9共表达质粒(pBS-14-3-3N172A与PYF515-14-3-3)共同转入大豆疫霉P6497的原生质体中，将生长出的转化子经G418抗性V8固体培养基平板25℃培养筛选，收集疑似转化子的菌丝体，提取DNA进行PCR测序验证，获得Ps14-3-3N172A单点突变的转化子菌株，分别命名为Ps14-3-3N172A-121、Ps14-3-3N172A-127。同时，将转入相同载体质粒、经过相同转化步骤但没有发生同源替换的转化子作为CK对照转化子，即CK。
pBS-14-3-3N223A定点突变转化子的获得具体为将实施例2中获得的定点突变基因pBS-14-3-3N223A的Donor载体、sgRNA及Cas9共表达质粒(pBS-14-3-3N223A与PYF515-14-3-3)共同转入大豆疫霉P6497的原生质体中，将生长出的转化子经G418抗性V8固体培养基平板25℃培养筛选，收集疑似转化子的菌丝体，提取DNA进行PCR测序验证，获得Ps14-3-3N223A单点突变的转化子菌株，分别命名为Ps14-3-3N223A-22、Ps14-3-3N223A-18。同时，将转入相同载体质粒、经过相同转化步骤但没有发生同源替换的转化子作为CK对照转化子，即CK。
实施例4、大豆疫霉Ps14-3-3基因三个单点定点突变转化子的生物学形状分析
一、卵孢子数量检测
将野生型大豆疫霉菌株P6497(WT)、对照转化子CK(CK)、实施例3得到的Ps-14-3-3N31A基因单点突变转化子接种于加有15mlV8固体培养基的无菌培养皿(直径9cm)中央，25℃黑暗条件下培养7-14天，通过显微镜观察卵孢子产生的数量，3次重复。
结果显示，实施例3得到的Ps-14-3-3N31A基因单点突变转化子的卵孢子数量与野生型菌株P6497(WT)和对照转化子CK相比下降(表5，图2)。说明Ps14-3-3蛋白的第31位点可能在一定程度上参与调控了大豆疫霉卵孢子的数量。
表5.大豆疫霉菌株P6497中Ps-14-3-3N31A单点突变转化子的卵孢子产量
二、孢子囊和游动孢子数量检测
制备10％V8固体和液体培养基，将野生型大豆疫霉菌株P6497(WT)、空载体对照转化子CK、实施例3得到的定点突变转化子：pBS-14-3-3N172A和pBS-14-3-3N223A菌株，分别接种于V8固体培养基上，25℃条件下黑暗培养5-7天，每株菌株用5mm打孔器打取菌饼10个，放入20mlV8汁液体培养基的无菌培养皿(直径9cm)中，25℃黑暗培养3天后，用20ml无菌去离子水冲洗，每隔30min冲洗1次，共冲洗5次，之后加10ml去离子水定容，置于25℃黑暗条件下4-6h后，通过显微镜观察菌饼上孢子囊产生的数量及形态；8-10h后，通过显微镜观察无菌水中游动孢子产生的数量及形态，3次重复。
结果显示，与野生型大豆疫霉菌株P6497(WT)和空载体对照转化子CK相比，实施例3得到的Ps-14-3-3N172A及Ps-14-3-3N223A基因定点突变转化子的孢子囊和游动孢子数量数量明显下降，这说明Ps14-3-3蛋白第172位点(表6，图3)和第223位点(表7，图4)的突变主要影响了大豆疫霉的孢子囊和游动孢子数量数量。
表6.大豆疫霉菌株P6497中Ps-14-3-3N172A单点突变转化子的孢子囊及游动孢子产量
表7.大豆疫霉菌株P6497中Ps-14-3-3N223A单点突变转化子的孢子囊及游动孢子产量
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Claims (10)
1.一类大豆疫霉病菌(Phytophthorasojae)14-3-3蛋白，是如下A1)或A2)或A3)或A4)的蛋白质：
A1)氨基酸序列是如序列2、5、7或9所示的蛋白质；
A2)在如序列2、5、7或9所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
A3)将如序列2、5、7或9所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能由序列2所示的蛋白衍生的蛋白质；
A4)与如序列2、5、7或9所示的氨基酸序列相似性在85％以上，优选在90％以上，更优选在95％以上且具有与如序列2所示的氨基酸序列相同功能的氨基酸序列。
2.编码权利要求1所示的14-3-3蛋白的编码基因；优选的，所述编码基因为如下B1)或B2)或B3)：
B1)序列表中序列1、3、4、6或8所述的核苷酸序列所示的DNA分子；
B2)与B1)所示的核苷酸序列的具有85％以上或90％以上或95％以上同一性，且编码权利要求1中所述14-3-3蛋白的cDNA分子或DNA分子；
B3)在严格条件下与B1)或B2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述14-3-3蛋白的cDNA分子或DNA分子。
3.权利要求2所述的编码基因转录得到的RNA分子；优选的，所述RNA分子的序列为如下C1)或C2)：
C1)与如序列1所示的DNA序列转录的RNA序列的相似性在85％以上，进一步优选在90％以上，更优选在95％以上且具有与如序列1所示的DNA序列转录的RNA序列相同功能的RNA序列；
C2)如序列1所示的DNA序列转录的RNA序列。
4.含有与权利要求2所示的编码基因或权利要求3所述的RNA分子相关的核酸分子的生物材料，为下述D1)至D10)中的任一种：
D1)含有权利要求2所述编码基因的表达盒；
D2)含有权利要求2所述编码基因的重组载体、或含有D1)所述表达盒的重组载体；
D3)含有权利要求2所述编码基因的重组微生物、或含有D1)所述表达盒的重组微生物、或含有D2)所述重组载体的重组微生物；
D4)含有权利要求2所述编码基因的转基因植物细胞系、或含有D1)所述表达盒的转基因植物细胞系；
D5)含有权利要求2所述编码基因的转基因植物组织、或含有D2)所述表达盒的转基因植物组织；
D6)含有权利要求2所述编码基因的转基因植物器官、或含有D2)所述表达盒的转基因植物器官；
D7)抑制权利要求2所述编码基因表达的核酸分子；
D8)含有D7)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系；
D9)抑制权利要求3所述RNA分子翻译的核酸分子；
D10)产生D9)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。
5.权利要求1所述14-3-3蛋白、权利要求2所示的编码基因或权利要求3所述的RNA分子或权利要求4所述的生物材料的应用，其特征在于：所述应用为下述1)-3)中任一种或几种：
1)在调控疫霉菌孢子囊和/或游动孢子产量的应用；
2)在调控疫霉菌卵孢子产量中的应用；
3)在抑制和/或杀灭疫霉菌病菌中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其中，包括通过改变如权利要求2所述的编码基因中的序列，或改变如权利要求3所述的RNA分子的翻译，或改变和/或灭活如权利要求1所述的14-3-3蛋白的功能来实现1)-3)所述的应用。
7.权利要求1所述14-3-3蛋白、权利要求2所示的编码基因或权利要求3所述的RNA分子或权利要求4所述的生物材料或权利要求5所述的蛋白组合或者DNA组合在作为抑菌或杀菌剂靶标筛选疫霉菌抑菌或杀菌剂中的应用。
8.一种筛选或辅助筛选疫霉菌抑菌和/或杀菌剂的方法，所述方法包括将待检测物应用于所述大豆疫霉病菌，当所述待检测物能够改变如权利要求2所述的编码基因的序列，或改变如权利要求3所述的RNA分子的翻译，或改变如权利要求1所述的14-3-3蛋白的功能，则所述待检测物为所述疫霉菌的抑菌和/或杀菌剂。
9.一种降低疫霉菌的活性的方法，包括下述步骤：改变如权利要求2所述的编码基因的序列，或改变如权利要求3所述的RNA分子中的翻译，或改变如权利要求1所述的14-3-3蛋白的功能；
其中，所述降低疫霉菌的活性为降低疫霉菌病菌的孢子囊和/或游动孢子的产量，降低疫霉菌卵孢子数量；
优选的，通过对疫霉菌中14-3-3蛋白进行点突变以改变14-3-3蛋白的功能；
优选的，将14-3-3蛋白自氨基端第31位由N突变为A,和/或自氨基端第172位由N突变为A，和/或自氨基端第223位由N突变为A；
其中，所述14-3-3蛋白的序列优选如序列表中序列2所示。
10.改变权利要求1所述14-3-3蛋白质功能的物质在制备植物疫霉杀菌剂中的应用；优选的，所述改变14-3-3蛋白质功能的物质为改变14-3-3蛋白质功能和/或改变14-3-3蛋白质的编码基因的序列和/或改变14-3-3蛋白质的编码基因转录得到的RNA分子的翻译的物质。
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