CN117660387A - 辣椒疫霉PcSTT3A蛋白编码基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种来自辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)的寡糖基转移酶STT3A(staurosporine and temperature‑sensitive A)亚基及其编码基因与应用。本发明所提供的寡糖基转移酶STT3A亚基为如序列2所示；其编码基因如序列1所示。通过实验证明，本发明所提供的蛋白在辣椒疫霉自身生长发育过程中发挥重要作用，具体表现为，该类蛋白缺失后辣椒疫霉菌丝生长速率减慢、游动孢子数量减少以及致病力降低等。以上结论均为探究辣椒疫霉发育及致病分子机制提供了技术基础，为未来新型杀菌剂的研发提供了潜在的分子靶标。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及来自辣椒疫霉(Phytophthora capsici)的STT3A(staurosporine and temperature-sensitive)蛋白PcSTT3A及其编码基因与应用。
背景技术
卵菌分布广泛，对植物界及动物界均能造成严重危害，其中疫霉属卵菌侵染的作物种类繁多，难以防治，亟需开发全新的防治药剂。随着杀菌剂作用机制的不断深入解析，人们开始更加关注靶向蛋白关键结合位点的新型卵菌抑制剂的开发。N-糖基化是真核生物中最普遍的糖基化修饰，在内质网将低聚糖转移至蛋白质特定基序Asn-X-Ser/Thr的天冬酰胺残基上，并在高尔基体进一步加工形成成熟的糖蛋白的过程。N-糖基化影响蛋白质的折叠、稳定性和定位，从而调控细胞生长发育和细胞间通讯等多个生物学过程。N-糖基化由寡糖基转移酶(oligosaccharyltransferase)催化，寡糖基转移酶是动物、植物和真菌中的一种异低聚膜蛋白复合物，催化低聚糖转移到受体多肽的Asn残基。其中STT3亚基是真核寡糖基转移酶中分子量最大的蛋白质，高度保守，且具有催化活性。由于寡糖基转移酶在N-糖基化过程中发挥着重要的催化作用，其催化机制在各个物种中均被关注和研究。
近年来，研究表明N-糖基化在病原菌的生长发育过程，侵染植物和逃避寄主植物免疫过程中发挥着重要的作用。烟曲霉(Aspergilus fumigatus)AfSTT3敲除破坏烟曲霉细胞壁完整性和抑制菌丝生长。大丽轮枝菌(Verticilium dahliae)侵染时分泌大量毒蛋白，其中大部分为N-糖蛋白。并且VdSTT3敲除抑制菌丝生长，孢子形成，糖蛋白分泌量显著减少以及致病性显著降低。
辣椒疫霉(Phytophthora capsici)是典型的腐霉科疫霉属植物病原菌，在世界范围内广泛分布。辣椒疫霉作为重要的土传病原菌，寄主范围非常广泛，可以侵染茄科、豆科、葫芦科等多种寄主植物，引起猝倒、萎蔫和根、茎、果实腐烂，给农业生产造成严重的经济损失。在适宜环境条件下，辣椒疫霉可在侵染寄主表面产生大量的孢子囊，释放游动孢子，不断地侵染寄主。孢子囊和游动孢子在辣椒疫霉一个生长季的多次侵染循环中起着重要作用。
综上所述，辣椒疫霉是一种重要的植物病原菌，对农业生产和经济具有严重的威胁，由于卵菌病害防治的杀菌剂种类较少，以及田间出现抗药性问题，亟需开发全新的防治药剂。本发明对开展以寡糖基转移酶STT3亚基为分子靶标的新型卵菌抑制剂的创制具有重要的指导意义。
发明内容
本发明开展以辣椒疫霉中STT3蛋白的同源蛋白PcSTT3A功能的相关研究工作，将为更深入的理解辣椒疫霉的N-糖基化在调控疫霉生长发育及其与寄主互作过程中的作用，为新型防治卵菌靶标的设计提供参考和借鉴。
通过发明人的研究发现，辣椒疫霉中的PcSTT3A对于辣椒疫霉的菌丝生长速率、游动孢子释放和致病力密切相关。这些结果表明，辣椒疫霉中的PcSTT3A蛋白对于病原菌的生理和致病过程都具有重要的调控作用。以该基因开发作为病原卵菌辣椒疫霉的分子药剂靶标，具有重要的应用前景。
因此，本发明的目的之一，提供辣椒疫霉STT3A蛋白，并将其命名为PcSTT3A，来源于辣椒疫霉菌株BYA5，是如下A1)或A2)A3)或A4)的蛋白质：
A1)氨基酸序列是如序列2所示的蛋白质；
A2)在如序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
A3)将如序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的如序列2所示的蛋白衍生的蛋白质；
A4)与如序列2所示的氨基酸序列相似性在75％以上，优选在85％以上，更优选在95％以上且具有与如序列2所示的氨基酸序列相同功能的氨基酸序列。
为了使A1)中的蛋白便于纯化，可在如序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上Poly-Arg(RRRRR)、Poly-His(HHHHHH)、FLAG(DYKDDDDK)、Strep-tagII(WSHPQFEK)、c-myc(EQKLISEEDL)等标签。
上述A1)-A4)中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述A2)-A4)中蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个核苷酸对的错义突变，和/或在其5’端和/或3’端连上述标签的编码序列得到。
其中，A1)中，序列表中序列2(PcSTT3A)由886个氨基酸残基组成。
本发明目的之二是提供编码所需的STT3A蛋白的核酸分子。所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。
其中，上述STT3A蛋白的编码基因为如下B1)或B2)或B3)：
B1)序列表中序列1所述的核苷酸序列所示的DNA分子；
B2)与B1)所示的核苷酸序列的具有75％以上或85％以上或95％以上同一性，且编码上述PcSTT3A蛋白的cDNA分子或DNA分子；
B3)在严格条件下与B1)或B2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述PcSTT3A蛋白的cDNA分子或DNA分子。
上述编码基因，序列表中序列1由2731个核苷酸组成；自序列1的5’端第1-266位和第337-2731核苷酸为编码序列，编码序列表中序列2所示的蛋白质PcSTT3A。
所述的RNA分子，是所述的编码基因转录得到的RNA分子；
优选的，所述RNA分子的序列为如下C1)或C2)：
C1)如序列1或序列3所示的DNA序列转录的RNA序列的相似性在75％以上，进一步优选在85％以上，更优选在95％以上且具有与如序列1或序列3所示的DNA序列转录的RNA序列相同功能的RNA序列；
C2)如序列1所示的DNA序列转录的RNA序列。
如本发明的DNA序列在严格条件下与如序列1所示DNA序列能够进行分子杂交且编码如序列2所示蛋白的DNA序列。上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
本发明目的之三是提供以上所述核酸分子相关的生物材料，包括重组载体、表达盒、重组微生物或转基因植物细胞系。所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体；所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌；所述转基因植物细胞系不包括繁殖材料。具体的可为如下为下述D1)至D10)中的任一种：
D1)含有权利要求2所述编码基因的表达盒；
D2)含有权利要求2所述编码基因的重组载体、或含有D1)所述表达盒的重组载体；
D3)含有权利要求2所述编码基因的重组微生物、或含有D1)所述表达盒的重组微生物、或含有D2)所述重组载体的重组微生物；
D4)含有权利要求2所述编码基因的转基因植物细胞系、或含有D1)所述表达盒的转基因植物细胞系；
D5)含有权利要求2所述编码基因的转基因植物组织、或含有D2)所述表达盒的转基因植物组织；
D6)含有权利要求2所述编码基因的转基因植物器官、或含有D2)所述表达盒的转基因植物器官；
D7)抑制权利要求2所述编码基因表达的核酸分子；
D8)含有D7)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系；
D9)抑制上述RNA分子翻译的核酸分子；
D10)产生D9)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。
本发明目的之五是提供辣椒疫霉PcSTT3A蛋白及编码PcSTT3A蛋白的核酸分子或含有编码PcSTT3A蛋白的核酸分子的生物材料的应用。
所述应用为下述1)-5)中任一种或几种：
1)在调控(提高或降低)辣椒疫霉游动孢子产量中的应用；
2)在调控(提高或降低)辣椒疫霉菌丝生长速率中的应用；
3)在调控(提高或降低)辣椒疫霉休止孢萌发和侵染寄主能力中的应用；
4)在调控(提高或降低)辣椒疫霉对寄主的致病性中的应用；
5)在抑制和/或杀灭辣椒疫霉病菌中的应用。
优选的，其中，所述应用中，包括通过抑制序列1所述的编码基因中的转录或使其灭活，或抑制所述的RNA分子的翻译，或抑制和/或灭活序列2所述的PcSTT3A蛋白的活性来实现1)-5)所述的应用。
所述应用中，通过抑制如上述的编码基因的转录，或抑制上述的RNA序列的翻译，或抑制和/或失活上述PcSTT3A蛋白的活性来干扰菌丝的生长速率、影响游动孢子产量和调控侵染寄主能力从而能够抑制和/或杀灭辣椒疫霉病菌的生长。
本发明目的之六是提供所述序列表中序列2所示的PcSTT3A蛋白、上述序列表中序列1所示的编码基因在作为抑菌或杀菌剂靶标筛选辣椒疫霉病菌抑菌或杀菌剂中的应用。
本发明目的之七是提供一种筛选或辅助筛选辣椒疫霉抑菌和/或杀菌剂的方法，所述方法包括将待检测物应用于所述辣椒疫霉病菌，当所述待检测物能够抑制如上DNA序列的转录，或抑制如上RNA序列的翻译，或抑制和/或失活如上所示的PcSTT3A蛋白，则所述待测物质为候选的所述植物辣椒疫霉抑菌和/或杀菌剂。
本发明目的之八是提供一种降低辣椒疫霉病菌的活性的方法，包括下述步骤：抑制如上述的编码基因的转录或使其缺失，或抑制所述的RNA分子的翻译，或抑制和/或失活如上所述的PcSTT3A蛋白的活性；
其中，所述降低辣椒疫霉病菌的活性为降低辣椒疫霉病菌对寄主的侵染能力和/或对寄主的致病性，和/或者降低辣椒疫霉病菌的菌体生长速度，和/或抑制辣椒疫霉游动孢子产量。
上述方法中，通过所述抑制或降低待抑制活性或待灭活的蛋白的编码基因表达来实现蛋白的灭活，具体的，可通过基因敲除或通过基因沉默实现。
所述基因敲除是指通过同源重组使特定靶基因失活的现象。基因敲除是通过DNA序列的改变使特定靶基因失活。
所述基因沉默是指在不损伤原有DNA的前提下使基因不表达或低表达的现象。基因沉默可发生在两种水平上，一种是由于DNA甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平的基因沉默，另一种是转录后基因沉默，即在基因转录后的水平上通过对靶标RNA进行特异性抑制而使基因失活，包括反义RNA、共抑制(co-suppression)、基因压抑(quelling)、RNA干扰(RNAi)和微小RNA(miRNA)介导的翻译抑制等。
优选的，通过使辣椒疫霉中序列表中序列1所示的基因进行基因敲除，以使所述序列表中序列2所示的蛋白质所示的蛋白质灭活；或对自序列表中序列1的5’端第4-189位核苷酸进行基因敲除，抑制所述序列表中序列2所示的蛋白质的活性。
在本发明的一个实施方式中，使上述基因进行基因敲除的方法是基于CRISPR/Cas9的基因敲除法。
具体的，基于CRISPR/Cas9的基因敲除法是将目的基因的Donor载体和sgRNA表达载体以及Cas9表达质粒转染辣椒疫霉筛选得到所述目的敲除蛋白灭活的重组菌。
所述Donor载体pBS-PcSTT3A-NPTII为含有依次连接的待敲除目的基因上游800-1500bp的序列、Dodor DNA序列(可以为NPTII或GFP或RFP等基因序列)和待敲除目的基因的下游800-1500bp的序列的重组载体。sgRNA表达载体pYF2.3G-PcSTT3A为表达靶向待敲除目的基因的sgRNA片段载体，其中，所述待敲除目的基因为自序列表中序列1，靶向于PcSTT3A基因的sgRNA序列为sgPcSTT3A：GGTCTGATAGGCTGCAGTCG(靶向于PcSTT3A基因的SEQ IDNo.1的第80-99位)。优选的，所述sgRNA表达质粒是以pYF2.3G-Ribo-sgRNA载体为出发载体，将PcSTT3A基因的sgRNA退火得到的双链sgRNA编码序列，插入pYF2.3G-Ribo-sgRNA载体的Nhe I和Bsa I酶识别位点之间，得到sgRNA表达质粒。Donor载体pBS-PcSTT3A-NPTII、sgRNA表达载体pYF2.3G-PcSTT3A和Cas9表达质粒pYF2-Cas9对PcSTT3A基因的全长序列进行敲除。
或者，所述Donor载体pBS-PcSTT3A为含有依次连接的待敲除目的基因PcSTT3A4-189bp的上游800-1500bp的序列和待敲除目的基因PcSTT3A 4-189bp的下游800-1500bp的序列的重组载体。利用Donor载体pBS-PcSTT3A、sgRNA表达载体pYF2.3G-PcSTT3A和Cas9表达质粒pYF2-Cas9对PcSTT3A基因的4-189bp序列进行敲除。
抑制PcSTT3A蛋白质表达和/或活性的物质在制备植物辣椒疫霉病菌杀菌剂中的应用也属于本发明的保护范围。
上述应用中，所述抑制PcSTT3A蛋白质表达和/或活性的物质为抑制PcSTT3A蛋白质表达和/或抑制PcSTT3A蛋白质的编码基因的转录和/或抑制PcSTT3A蛋白质的编码基因转录得到的RNA分子的翻译的物质。
试验证明，本发明所提供的PcSTT3A蛋白在辣椒疫霉自身生长发育过程中起作用。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术无法获得PcSTT3A基因敲除纯合转化子，PcSTT3A基因敲除会导致辣椒疫霉致死。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对PcSTT3A基因的4-189bp,190-1657bp和1658-2728bp序列进行敲除，只获得PcSTT3A基因的4-189bp序列的敲除转化子，较野生型亲本菌株而言有明显变化，主要包括：菌丝生长速率减慢、游动孢子产量降低以及侵染寄主植物的能力变弱。因此，辣椒疫霉PcSTT3A蛋白在辣椒疫霉营养生长、无性生殖及侵染寄主等多个过程均可发挥重要作用。本发明为辣椒疫霉病菌的致病机制研究提供了技术支持，并为未来新型杀菌剂的研发提供了潜在的分子作用靶标。
附图说明
图1为辣椒疫霉菌株BYA5(WT)，对照转化子N-CK，PcSTT3A基因的4-189bp序列的敲除转化子(N27、N62、N250)的菌落直径柱状图(在V8固体培养基上培养3d)。
图2为辣椒疫霉菌株BYA5(WT)，对照转化子N-CK，PcSTT3A基因的4-189bp序列的敲除转化子(N27、N62、N250)游动孢子在辣椒叶片的致病力。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
辣椒疫霉菌株BYA5：为中国农业大学植物保护学院种子病理与杀菌剂药理实验于2011年分离、鉴定和保存，其分离于甘肃省的发病的辣椒样品，公众可从中国农业大学获得。
培养基或试剂配方：
10％V8固体培养基：100mL V8蔬菜汁，1.4g CaCO3，搅拌混匀，用去离子水稀释10倍，即加入900mL去离子水，添加15g Agar，121℃高压湿热灭菌20min。
10％V8液体培养基：100mL V8蔬菜汁，1.4gCaCO3，搅拌混匀，12000rpm离心5min，取上清，用去离子水稀释10倍，121℃高压湿热灭菌20min。
营养豌豆培养基(Nutrient pea broth，NPB)：125g豌豆加入1L去离子水，121℃高压湿热灭菌20min，纱布过滤获得豌豆营养液；2.0g酵母提取物、5.0g葡萄糖、5.0g甘露醇、5.0g山梨醇、2.0g CaCO3、0.1g CaCl2、0.5g MgSO4、3.0g KNO3、1.0g K2HPO4、1.0g KH2PO4，搅拌混匀，3000rpm离心10min或静置30min，取上清，用豌豆营养液定容至1L，固体培养基(NPBA)添加15g琼脂粉，湿热灭菌20min。使用前，在无菌操作台中，添加2mL维生素储液(Biotin 6.7×10-7g/mL；Folic acid 6.7×10-7g/mL；L-inositol 4.0×10-5g/mL；Nicotinic acid 4.0×10-5g/mL；Pyridoxine-HCl 6.0×10-4g/mL；Riboflavin 5.0×10- 5g/mL；Thiamine-HCl 1.3×10-3g/mL)以及2ml微量元素储液(FeC6H5O7·3H2O 5.4×10-4g/mL；ZnSO4·7H2O 3.8×10-4g/mL；CuSO4·5H2O 7.5×10-4g/mL；MgSO4·H2O 3.8×10-5g/mL；H3BO32.5×10-5g/mL；Na2MoO4·H2O 3.0×10-5g/mL)。
豌豆甘露醇培养基(Pea Mannitol，PM)：91.1g甘露醇，1g CaCl2，2g CaCO3，加入大约900mL豌豆营养液，搅拌混匀约30min，3000rpm离心10min或静置30min，取上清，用豌豆营养液定容至1L，固体培养基(PMA)添加15g琼脂粉，湿热灭菌20min。
菌丝酶解液(20mL)：10mL 0.8M甘露醇，0.8mL 0.5M KCl，0.8mL 0.5M 4-吗啉乙磺酸，0.4mL 0.5M CaCl2，0.12g纤维素酶(Calbiochem,cat.No.219466)，0.12g裂解酶(Sigma，cat.No.L1412)，无菌超纯水定容至20mL，混匀溶解，0.22μm滤膜过滤灭菌，现用现配。
MMG溶液(250mL)：18.22g甘露醇，0.76g MgCl2·6H2O，2.0mL 0.5M 4-吗啉乙磺酸(pH＝5.7)，超纯水定容至250mL，0.22μm滤膜过滤灭菌。
W5溶液：0.1gKCl，4.6gCaCl2·2H2O，2.25g NaCl，7.8g葡萄糖，超纯水溶解定容至250mL，0.22μm滤膜过滤灭菌。
PEG-CaCl2溶液(40％w/v)：12g PEG 4000，3.75mL 0.5M CaCl2，3mL无菌超纯水，0.22μm滤膜过滤灭菌。
本实施例中使用的pBluescript II SK+同源臂载体质粒(Donor载体)，sgRNA表达载体pYF2.3G-Ribo-sgRNA和Cas9表达质粒pYF2-Cas9均由美国俄勒冈州立大学BrettM.Tyler教授馈赠。
实施例1、辣椒疫霉PcSTT3A蛋白及其编码基因的获得
本实施例中辣椒疫霉STT3A蛋白PcSTT3A及其编码基因(或cDNA)可以以辣椒疫霉菌株BYA5的DNA(或cDNA)为模板，通过表1所列引物扩增获得。其中，DNA或RNA提取的材料为辣椒疫霉菌株BYA5的菌丝体。其中，PcSTT3A的编码基因如序列表中序列1所示，序列表中序列1由2731个核苷酸组成；自序列1的5’端第1-266位和第337-2731核苷酸为编码序列，编码序列表中序列2所示的蛋白质PcSTT3A。上述蛋白或基因也可以人工合成。
表1.PcSTT3A全长编码基因扩增引物
序列表中序列1如下所示：
序列表中序列2如下所示：
实施例2、辣椒疫霉PcSTT3A基因的4-189bp敲除载体的构建
本实施例中基于CRISPR/Cas9的基因敲除载体构建方法以及相关载体的序列在文献“Fang,Y.,and Tyler,B.M.(2016).Efficient disruption and replacement of aneffector gene in the oomycete Phytophthora sojae using CRISPR/Cas9.Molecularplant pathology,17(1),127-139.”以及“Fang,Y.,Cui,L.,Gu,B.,Arredondo,F.,andTyler,B.M.(2017).Efficient genome editing in the oomycete Phytophthora sojaeusing CRISPR/Cas9.Curr.Protoc.Microbiol.44,21A.1.1-21A.1.26.”中公开过。本实施例中使用的pBluescript II SK+同源臂载体质粒(Donor载体)，sgRNA表达载体pYF2.3G-Ribo-sgRNA以及Cas9表达质粒pYF2-Cas9均由美国俄勒冈州立大学Brett M.Tyler教授馈赠。
试验证明，本发明所提供的PcSTT3A蛋白在辣椒疫霉自身生长发育过程中起作用。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术无法获得PcSTT3A基因敲除纯合转化子，PcSTT3A基因敲除导致辣椒疫霉致死。
利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对PcSTT3A基因的4-189bp、190-1657bp和1658-2728bp序列进行敲除，只获得PcSTT3A基因的4-189bp序列的敲除转化子，较野生型亲本菌株而言有明显变化，主要包括：菌丝生长速率减慢、游动孢子产量降低以及侵染寄主植物的能力变弱。因此，辣椒疫霉PcSTT3A蛋白在辣椒疫霉营养生长、无性生殖及侵染寄主等多个过程均可发挥重要作用。
其中，Donor载体pBS-PcSTT3A-NPTII、sgRNA表达质粒pYF2.3G-PcSTT3A和Cas9表达质粒pYF2-Cas9对PcSTT3A基因的全长序列进行敲除；利用Donor载体pBS-PcSTT3A、sgRNA表达质粒pYF2.3G-PcSTT3A和Cas9表达质粒pYF2-Cas9对PcSTT3A基因的4-189bp序列进行敲除。上述两种类型的敲除方法如下所述。
本实施方式中所用的Donor载体pBS-PcSTT3A、Donor载体pBS-PcSTT3A-NPTII，sgRNA表达质粒pYF2.3G-PcSTT3A；具体构建方法如下所述：
1)pBS-PcSTT3A的同源臂载体构建：以辣椒疫霉菌株BYA5的DNA为模板，利用TaKaRa-In-Fusion_Tools在线网站(http://www.clontech.com/US/Products/Cloning_and_Competent_Cells/Cloning_Resources/On line_In-Fusion_Tools)设计引物扩增目的基因PcSTT3A的4-189bp的上游1000bp(序列表中序列3所示，经如表2所示pBS-STT3A-F1和pBS-STT3A-R1所示引物扩增获得)和PcSTT3A基因的4-189bp的下游1000bp序列(序列表中序列4所示，经引物序列如表2所示pBS-STT3A-F2和pBS-STT3A-R2的引物扩增获得)，利用HD Cloning Kit将两个扩增片段依次融合连接入克隆载体pBluescript II SK+(EcoR V酶切)，连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，37℃过夜培养后，使用通用引物M13F(序列：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’)/M13R(序列：5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’)扩增、测序验证克隆，将验证正确的含有依次连接的PcSTT3A基因的4-189bp的上游1000bp和PcSTT3A基因的4-189bp的下游1000bp的重组表达载体命名为pBS-PcSTT3A。
表2.PcSTT3A基因的4-189bp序列敲除Donor载体载体构建扩增引物
2)pBS-PcSTT3A-NPTII的同源臂载体构建：以辣椒疫霉菌株BYA5的DNA为模板，利用TaKaRa-In-Fusion_Tools在线网站(http://www.clontech.com/US/Products/Cloning_and_Competent_Cells/Cloning_Resources/On ine_In-Fusion_Tools)设计引物扩增目的基因PcSTT3A的上游1000bp(序列表中序列5所示，经如表3所示pBS-STT3A-NPTII-F1和pBS-STT3A-NPTII-R1所示引物扩增获得)、NPTII基因(NPTII基因是以pYF2-Cas9骨架质粒为模板，经如表3所示pBS-STT3A-NPTII-F2和pBS-STT3A-NPTII-R2所示引物扩增获得)和PcSTT3A基因的下游1000bp序列(序列表中序列6所示，经引物序列如表3所示pBS-STT3A-NPTII-F3和pBS-STT3A-NPTII-R3的引物扩增获得)。利用HD Cloning Kit将三个扩增片段依次融合连接入克隆载体pBluescript II SK+(EcoR V酶切)，连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，37℃过夜培养后，使用通用引物M13F(序列：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’)/M13R(序列：5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’)扩增、测序验证克隆，将验证正确的含有依次连接的PcSTT3A基因的上游1000bp、NPTII基因和PcSTT3A基因的下游1000bp的重组表达载体命名为pBS-PcSTT3A-NPTII。
表3.PcSTT3A基因的全长敲除Donor载体构建扩增引物
3)pYF2.3G-Ribo-sgRNA的构建：利用sgRNA设计网站EuPaGDT(http://grna.ctegd.uga.edu/)以及RNA结构在线分析工具(http://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/Servers/Predict1/Predict1.html)，选择特异性靶向PcSTT3A基因的4-189bp序列且二级结构较弱的sgRNA序列(sgSTT3A：GGTCTGATAGGCTGCAGTCG，靶向于PcSTT3A基因的SEQ ID No.1的第80-99位)，送至公司合成带有NheI和BsaI酶切位点以及HHribozyme的sgRNA序列引物(如表4所示)。用无菌水溶解成100μM溶液。退火反应合成双链sgRNA序列，反应体系：3μL正向链溶液，3μL反向链溶液，3μL 10×T4 DNA Ligase Buffer(NEB)，4μL 0.5M NaCl，21μL超纯无菌水，吸打混匀，100℃反应2min，放至室温自然冷却4h，之后将反应液稀释500倍。再取2μL 10×T4 DNA Ligase Buffer(NEB)，50ng pYF2.3G-Ribo-sgRNA载体(Nhe I/Bsa I双酶切)，4μL稀释后的双链sgRNA溶液，1μL T4 DNA Ligase，无菌超纯水补齐至20μL，室温反应30min，使用5μL连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，37℃过夜培养后，使用引物对RPL41_Pseq_F(序列：5’-CAAGCCTCACTTTCTGCTGACTG-3’)/M13F(序列：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’)进行菌落PCR验证，并测序验证阳性克隆，将验证正确可表达上述sgRNA的重组载体命名为pYF2.3G-STT3A。
表4.合成PcSTT3A基因的4-189bp序列敲除的sgRNA核苷酸序列
实施例3、辣椒疫霉PcSTT3A基因的4-189bp序列的敲除转化子的获得
采用CaCl2-PEG介导的原生质体转化方法制备PcSTT3A基因的4-189bp序列的敲除转化子，卵菌遗传转化的方法在文献“Fang,Y.,and Tyler,B.M.(2016).Efficientdisruption and replacement of an effector gene in the oomycete Phytophthorasojae using CRISPR/Cas9.Molecular plant pathology,17(1),127-139.”中公开过。
将实施例2中获得的PcSTT3A基因全长的敲除系列载体(Donor载体pBS-PcSTT3A-NPTII、sgRNA载体pYF2.3G-STT3A及Cas9表达质粒pYF-Cas9)共同转入辣椒疫霉BYA5的原生质体中，将生长出的转化子经G418抗性V8固体培养基平板筛选，收集疑似转化子的菌丝体，提取DNA进行PCR测序验证，以及提取RNA进行Q-PCR验证。经过多次生物学重复，均无法获得PcSTT3A基因全长的敲除纯合转化子，说明PcSTT3A基因全长敲除导致辣椒疫霉致死。将实施例2中获得的PcSTT3A基因的4-189bp序列的敲除系列载体(Donor载体pBS-PcSTT3、sgRNA载体pYF2.3G-STT3A及Cas9表达质粒pYF-Cas9)共同转入辣椒疫霉BYA5的原生质体中，获得PcSTT3A基因的4-189bp序列的敲除转化子(N27、N62、N250)。同时，将转入相同载体质粒、经过相同转化步骤但没有发生同源替换的转化子作为对照转化子N-CK。
实施例4、辣椒疫霉PcSTT3A基因的4-189bp序列的敲除转化子的生物学形状分析
一、菌丝生长速率检测
将野生型辣椒疫霉菌株BYA5(WT)，对照转化子N-CK，实施例3得到的PcSTT3A基因的4-189bp序列的敲除转化子系列菌株(N27、N62、N250)，分别接种于加有15mL V8固体培养基的无菌培养皿(直径9cm)中央，25℃黑暗条件下培养3d，用十字交叉法测量各菌株的菌落直径，每个菌株3次重复。
结果显示，与野生型辣椒疫霉菌株BYA5(WT)及对照转化子N-CK相比，PcSTT3A基因的4-189bp序列的敲除转化子(N27、N62、N250)的菌丝生长速率显著下降(图1)。实验结果说明所述PcSTT3A蛋白调控了辣椒疫霉的菌丝生长。
二、孢子囊和游动孢子数量检测
制备10％V8固体培养基，将野生型辣椒疫霉菌株BYA5(WT)、对照转化子N-CK、实施例3得到的PcSTT3A基因的4-189bp序列的敲除转化子(N27、N62、N250)分别接种于V8固体培养基上(直径9cm)，25℃条件下黑暗培养3d，然后将培养皿正面朝上置于25℃(RH＝60％-80％)光照培养箱继续培养5d。加入10mL无菌水，于4℃冰箱放置30min，随后再将培养皿取出置于室温(25℃)放置40min，收集释放的游动孢子悬浮液，在涡旋仪上震荡1min，吸取10μL释放的游动孢子悬浮液滴加到血球计数板上，通过显微镜观察并统计游动孢子产生的数量。通过20倍物镜视野内观察培养基上孢子囊产生的数量及形态，每个菌株设置3个重复。
结果显示，与野生型辣椒疫霉菌株BYA5(WT)和对照转化子N-CK相比，实施例3得到的PcSTT3A基因的4-189bp序列的敲除转化子(N27、N62、N250)孢子囊数量没有发生明显的变化，而释放的游动孢子数量显著下降，但孢子囊和游动孢子形态正常，这说明PcSTT3A蛋白主要影响了辣椒疫霉游动孢子的数量(表5)。
三、休止孢形态检测及萌发率统计
采用上述方法获得野生型辣椒疫霉菌株BYA5(WT)、对照转化子N-CK和实施例3得到的PcSTT3A基因的4-189bp序列的敲除转化子系列菌株(N27、N62、N250)，将各菌株游动孢子悬浮液在涡旋振荡器上振荡处理1min，获得休止孢悬浮液，置于25℃黑暗培养8h，于光学显微镜下观察各处理休止孢的形态，并随机检测每100个休止孢中萌发的休止孢个数，每个菌株设置3个重复。
结果显示，与野生型辣椒疫霉菌株BYA5(WT)和对照转化子N-CK相比，实施例3得到的PcSTT3A基因的4-189bp序列的敲除转化子(N27、N62、N250)休止孢萌发率无显著性差异(表5)。
四、致病力的结果统计和观察
按照上述方法收集辣椒疫霉各个处理菌株的游动孢子，通过显微镜调节各个菌株的游动孢子浓度至105个/mL。向采摘的等位、同龄、健壮的辣椒叶片上接种孢子悬浮液，每片辣椒叶片滴加10μL游动孢子悬浮液，每个处理接种6片叶片。将接种好的叶片放在玻璃架上并置于铺有3层吸水纸和适量清水的15cm的玻璃皿内，将接种后的辣椒叶片放置在25℃(RH＝60％-80％)光照培养箱，黑暗培养3d。十字交叉法测量病斑直径并拍照，整个试验重复3次。
结果显示，与野生型辣椒疫霉菌株BYA5(WT)和对照转化子N-CK相比，实施例3得到的PcSTT3A基因的4-189bp序列的敲除转化子(N27、N62、N250)的致病力显著下降(图2)。
表5.PcSTT3A基因的4-189bp序列的敲除转化子产孢量和休止孢萌发率
注：a BYA5代表亲本菌株；N-CK代表对照转化子；N27、N62、N250代表PcSTT3A基因的4-189bp序列的敲除转化子。
b表中数值表示平均值±标准偏差。DPS软件中单因素ANOVA分析中F检验法用于计算野生型菌株和不同转化子之间的生物学性状差异，同一列中标注相同字母，表示不存在显著性差异(P<0.05)。
Claims (10)
1.辣椒疫霉病菌寡糖基转移酶STT3A亚基蛋白，是如下A1)或A2)或A3)或A4)的蛋白质：
A1)氨基酸序列是如序列2所示的蛋白质；
A2)在如序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
A3)将如序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能由序列2所示的蛋白衍生的蛋白质；
A4)与如序列2所示的氨基酸序列相似性在75％以上，优选在85％以上，更优选在95％以上且具有与如序列2所示的氨基酸序列相同功能的氨基酸序列。
2.编码权利要求1所示的辣椒疫霉病菌寡糖基转移酶STT3A亚基蛋白的编码基因；优选的，所述编码基因为如下B1)或B2)或B3)：
B1)序列表中序列1所述的核苷酸序列所示的DNA分子；
B2)与B1)所示的核苷酸序列的具有75％以上或85％以上或95％以上同一性，且编码权利要求1中所述PcSTT3A蛋白的cDNA分子或DNA分子；
B3)在严格条件下与B1)或B2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述PcSTT3A蛋白的cDNA分子或DNA分子。
3.权利要求2所述的编码基因转录得到的RNA分子；优选的，所述RNA分子的序列为如下C1)或C2)：
C1)与如序列1所示的DNA序列转录的RNA序列的相似性在75％以上，进一步优选在85％以上，更优选在95％以上且具有与如序列1所示的DNA序列转录的RNA序列相同功能的RNA序列；
C2)如序列1所示的DNA序列转录的RNA序列。
4.含有与权利要求2所示的编码基因或权利要求3所述的RNA分子相关的核酸分子的生物材料，为下述D1)至D10)中的任一种：
D1)含有权利要求2所述编码基因的表达盒；
D2)含有权利要求2所述编码基因的重组载体、或含有D1)所述表达盒的重组载体；
D3)含有权利要求2所述编码基因的重组微生物、或含有D1)所述表达盒的重组微生物、或含有D2)所述重组载体的重组微生物；
D4)含有权利要求2所述编码基因的转基因植物细胞系、或含有D1)所述表达盒的转基因植物细胞系；
D5)含有权利要求2所述编码基因的转基因植物组织、或含有D2)所述表达盒的转基因植物组织；
D6)含有权利要求2所述编码基因的转基因植物器官、或含有D2)所述表达盒的转基因植物器官；
D7)抑制权利要求2所述编码基因表达的核酸分子；
D8)含有D7)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系；
D9)抑制权利要求3所述RNA分子翻译的核酸分子；
D10)产生D9)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。
5.权利要求1所述PcSTT3A蛋白、权利要求2所示的编码基因或权利要求3所述的RNA分子或权利要求4所述的生物材料的应用，其特征在于：所述应用为下述1)-5)中任一种或几种：
1)在调辣椒疫霉游动孢子产量中的应用；
2)在调控辣椒疫霉菌丝生长速率中的应用；
3)在调控辣椒疫霉休止孢萌发和侵染寄主能力中的应用；
4)在调控辣椒疫霉对寄主的致病性中的应用；
5)在抑制和/或杀灭辣椒疫霉病菌中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其中，包括通过抑制如权利要求2所述的编码基因中的转录或使其灭活，或抑制如权利要求3所述的RNA分子的翻译，或抑制和/或灭活如权利要求1所述的PcSTT3A蛋白来实现1)-5)所述的应用。
7.权利要求1所述PcSTT3A蛋白、权利要求2所示的编码基因或权利要求3所述的RNA分子或权利要求4所述的生物材料或权利要求5所述的蛋白组合或者DNA组合在作为抑菌或杀菌剂靶标筛选辣椒疫霉病菌抑菌或杀菌剂中的应用。
8.一种筛选或辅助筛选辣椒疫霉病菌抑菌和/或杀菌剂的方法，所述方法包括将待检测物应用于所述辣椒疫霉病菌，当所述待检测物能够抑制如权利要求2所述的编码基因的转录，或抑制如权利要求3所述的RNA分子的翻译，或抑制如权利要求1所述的PcSTT3A蛋白的活性或使其灭活，则所述待检测物为所述辣椒疫霉病菌的抑菌和/或杀菌剂。
9.一种降低辣椒疫霉病菌的活性的方法，包括下述步骤：抑制如权利要求2所述的编码基因的转录或使其缺失，或抑制如权利要求3所述的RNA分子中的翻译，或抑制如权利要求1所述的PcSTT3A蛋白的活性或使其灭活；
其中，所述降低辣椒疫霉病菌的活性为降低辣椒疫霉病菌对寄主的侵染能力和/或对寄主的致病性，和/或者降低辣椒疫霉病菌的菌丝生长速度，和/或降低游动孢子的产量；
优选的，通过对辣椒疫霉中序列表中序列1所示的基因进行基因敲除以使序列表中序列2所示的蛋白质灭活、或对自序列表中序列1的5’端第4-189位核苷酸进行基因敲除，抑制所述序列表中序列2所示的蛋白质的活性。
10.抑制权利要求1所述PcSTT3A蛋白质表达和/或活性的物质在制备植物辣椒疫霉病菌杀菌剂中的应用；优选的，所述抑制PcSTT3A蛋白质表达和/或活性的物质为抑制PcSTT3A蛋白质表达和/或抑制PcSTT3A蛋白质的编码基因的转录和/或抑制PcSTT3A蛋白质的编码基因转录得到的RNA分子的翻译的物质。
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| CN202311656355.1A Pending CN117660387A (zh) | 2022-12-23 | 2023-12-05 | 辣椒疫霉PcSTT3A蛋白编码基因及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117660387A (zh) |
-
2023
- 2023-12-05 CN CN202311656355.1A patent/CN117660387A/zh active Pending
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