CN115010795B

CN115010795B - 辣椒疫霉调控胞外囊泡分泌关键蛋白及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN115010795B
Application number: CN202210748255.0A
Authority: CN
Inventors: 刘西莉; 方媛; 王治文; 张思聪; 张博瑞; 张灿; 刘鹏飞
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2021-06-30
Filing date: 2022-06-29
Publication date: 2023-09-05
Anticipated expiration: 2042-06-29
Also published as: CN115010795A; CN113461792A

Abstract

本发明公开了一种来自辣椒疫霉菌的调控胞外囊泡分泌关键蛋白Pcsec4‑1和Pcsec4‑2及其编码基因与应用。本发明所提供的调控囊泡分泌关键蛋白序列为如序列2和序列4所示；其编码基因如序列1和序列3所示。通过实验证明，本发明所提供的蛋白在辣椒疫霉(Phytophthora capsici)自身生长发育过程中发挥重要作用，具体表现为，该类蛋白缺失后辣椒疫霉菌丝生长减慢、游动孢子数量减少、致病力降低、胞外囊泡分泌量下降等。以上结论均为探究辣椒疫霉发育及致病分子机制提供了技术基础，为未来新型杀菌剂的研发提供了潜在的分子靶标。

Description

辣椒疫霉调控胞外囊泡分泌关键蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及来自辣椒疫霉(Phytophthora capsici)的调控胞外囊泡分泌关键蛋白Sec4(Small GTPase Family Proteins)蛋白的同源蛋白Pcsec4-1和Pcsec4-2 及其编码基因与应用。

背景技术

辣椒疫霉是卵菌中一类重要的植物病原菌，该病原菌于1918年，首次从辣椒上分离获得的，1922年，由美国学者Leon H.Leonian将其命名为P.capsici Leonian(Hausbeckand Lamour, 2004)。在分类地位上，辣椒疫霉属于藻物界(Chromista)，卵菌门(Oomycetes)，霜霉目 (Peronosporales)，霜霉科(Peronosporaceae)，疫霉属(Phytophthora)。辣椒疫霉是一种世界范围分布的病原菌，寄主范围广，危害严重。可侵染茄科、葫芦科、豆科等在内的70多种植物 (Granke et al.,2012)。辣椒疫霉侵染辣椒后，严重影响了辣椒的产量和品质，对世界范围内的作物生产造成巨大的威胁，每年给全世界蔬菜产业造成的损失高达10亿美元(Erwin and Ribeiro,1996；Lamour et al.,2012)。目前，被归为十大病原卵菌之一，被国内外学者广泛关注和研究。

辣椒疫霉是典型的半活体营养型病原菌，在侵染前期辣椒疫霉为活体营养型，会释放大量的致病因子抑制植物免疫反应，汲取营养促进病原菌的生长；后期辣椒疫霉为死体营养型，在植物细胞内产生大量的孢子囊，杀死寄主细胞，释放孢子囊成为再侵染来源(Tyler, 2006)。在病原菌与植物互作方面研究表明，疫霉属的多种病原菌在侵染过程中会释放大量致病因子来促进病原菌的侵染。这些致病因子包括：1)细胞壁降解酶，2)次级代谢物合成酶，3)蛋白酶，4)脂酶，5)毒素蛋白，6)ABC运输体蛋白，以及7)效应蛋白(Tyler，2006)。

胞外囊泡(Extracellualr Vesicles,EVs)是一类其内包裹了细胞质基质及多种生物活性分子在内的具有磷脂双分子膜包被的亚细胞结构，它们由细胞释放到胞外环境中发挥作用(Latge et al.,2005；Nimrichter et al.,2005；Mitchell et al.,2006)。对胞外囊泡的内含物研究发现其可以对多种生物活性物质包括糖类、蛋白质、脂质、色素以及核酸(DNA,mRNA,sRNA)等进行运输(Marina Colombo et al.,2014)。对胞外囊泡的生物学功能研究发现，胞外囊泡可以对大量致病因子起到运输的作用，在病原菌的生理以及致病过程中都发挥了重要调控作用。最近的研究中还发现，胞外囊泡在植物和病原菌的互作过程中也发挥了重要的作用，并在跨界物质运输过程中扮演了重要的角色(Cai et al.,2018)。

辣椒疫霉在整个植株生长周期、多个部位均可侵染发病，主要为害根、茎、叶片和果实(Babadoost,2000)，造成植株猝倒、萎蔫和果实腐烂等症状。辣椒疫霉生长繁殖速度快、产孢量大、一旦在田间发病、防治难度高且不易根治。目前在辣椒上对辣椒疫霉抗性遗传的研究中，发现并定义了一些重要的数量性状基因座(Quesada-Ocampo,2010)。

然而，目前商业培育的作物中抗性品种种类有限且抗性稳定性不佳，化学防治仍然是生长上主要的防治方法。因此开放新型的防治卵菌有效分子靶标的药剂，对于防治卵菌病害的侵染，和保证农业作物的健康生长，都具有十分重要的意义。

发明内容

通过发明人的研究发现，辣椒疫霉中的Pcsec4-1对于辣椒疫霉的菌丝生长速率、游动孢子释放、休止孢的萌发等无性生长阶段的正常生长密切相关。破坏Pcsec4-1基因后导致了胞外囊泡的产量下降并干扰了辣椒疫霉在离体条件下的致病力。对另一个同源基因Pcsec4-2 功能研究发现，该基因敲除后致死。这些结果表明，辣椒疫霉中的Pcsec4-1和Pcsec4-2蛋白对于病原菌的生理和致病过程都具有重要的调控作用。以该基因开发作为病原卵菌辣椒疫霉的分子药剂靶标，具有重要的应用前景。

因此，本发明的目的之一，提供辣椒疫霉调控胞外囊泡分泌关键蛋白(Sec4蛋白)，并将其命名为Pcsec4-1和Pcsec4-2,来源于辣椒疫霉菌株LT1534，是如下A1)或A2)A3) 或A4)的蛋白质：

是如下A1)或A2)或A3)或A4)：

A1)氨基酸序列是如序列2或4所示的蛋白质；

A2)在如序列2或4所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

A3)将如序列2或4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和 /或添加得到的具有相同功能的如序列2或4所示的蛋白衍生的蛋白质；

A4)与如序列2或4所示的氨基酸序列相似性在75％以上，优选在85％以上，更优选在95％以上且具有与如序列2或4所示的氨基酸序列相同功能的氨基酸序列。

为了使A1)中的蛋白便于纯化，可在如序列表中序列2或4所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上Poly-Arg(RRRRR)、Poly-His(HHHHHH)、FLAG(DYKDDDDK)、Strep-tag II(WSHPQFEK)、c-myc(EQKLISEEDL)等标签。

上述A1)-A4)中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述A2)-A4)中蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1或3所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个核苷酸对的错义突变，和/或在其 5’端和/或3’端连上述标签的编码序列得到。

其中，A1)中，序列表中序列2(Pcsec4-1)由207个氨基酸残基组成；序列表中序列4(Pcsec4-2)由202个氨基酸残基组成。

本发明目的之二是提供编码所需的Sec4蛋白的核酸分子。所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。

其中，上述Sec4蛋白的编码基因为如下B1)或B2)或B3)：

B1)序列表中序列1或3所述的核苷酸序列所示的DNA分子；

B2)与B1)所示的核苷酸序列的具有75％以上或85％以上或95％以上同一性，且编码上述Pcsec4-1或Pcsec4-2蛋白的cDNA分子或DNA分子；

B3)在严格条件下与B1)或B2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述Pcsec4-1或Pcsec4-2 蛋白的cDNA分子或DNA分子。

上述编码基因，序列表中序列1由624个核苷酸组成；自序列1的5’端第1-624位核苷酸为编码序列，编码序列表中序列2所示的蛋白质Pcsec4-1。序列表中序列3由609个核苷酸组成；自序列1的5’端第1-609位核苷酸为编码序列，编码序列表中序列4所示的蛋白质Pcsec4-2。

所述的RNA分子，是所述的编码基因转录得到的RNA分子；

优选的，所述RNA分子的序列为如下C1)或C2)：

C1)如序列1或序列3所示的DNA序列转录的RNA序列的相似性在75％以上，进一步优选在85％以上，更优选在95％以上且具有与如序列1或序列3所示的DNA序列转录的RNA序列相同功能的RNA序列；

C2)如序列1所示的DNA序列转录的RNA序列。

如本发明的DNA序列在严格条件下与如序列1或3所示DNA序列能够进行分子杂交且编码如序列2或4所示蛋白的DNA序列。上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

本发明目的之三是提供以上所述核酸分子相关的生物材料，包括重组载体、表达盒、重组微生物或转基因植物细胞系。所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体；所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌；所述转基因植物细胞系不包括繁殖材料。具体的可为如下为下述D1)至D10)中的任一种：

D1)含有所述编码基因的表达盒；

D2)含有所述编码基因的重组载体、或含有D1)所述表达盒的重组载体；

D3)含有所述编码基因的重组微生物、或含有D1)所述表达盒的重组微生物、或含有 D2)所述重组载体的重组微生物；

D4)含有所述编码基因的转基因植物细胞系、或含有D1)所述表达盒的转基因植物细胞系；

D5)含有所述编码基因的转基因植物组织、或含有D2)所述表达盒的转基因植物组织；

D6)含有所述编码基因的转基因植物器官、或含有D2)所述表达盒的转基因植物器官；

D7)抑制所述编码基因表达的核酸分子；

D8)含有D7)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系；

D9)抑制上述RNA分子翻译的核酸分子；

D10)产生D9)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。

本发明目的之五是提供辣椒疫霉Pcsec4-1或Pcsec4-2蛋白及编码Pcsec4-1或Pcsec4-2蛋白的核酸分子或含有编码Pcsec4-1或Pcsec4-2蛋白的核酸分子的生物材料的应用。

所述应用为下述1)-6)中任一种或几种：

1)在调控(如降低)辣椒疫霉游动孢子产量中的应用；

2)在调控(如降低)辣椒疫霉菌丝生长速率中的应用；

3)在调控(如降低)辣椒疫霉休止孢萌发和侵染寄主能力中的应用；

4)在调控(如降低)辣椒疫霉胞外囊泡产量中的应用；

5)在调控(如降低)辣椒疫霉对寄主的致病性中的应用；

6)在抑制和/或杀灭辣椒疫霉病菌中的应用；

优选的，其中，所述应用中，包括通过抑制序列1或3所述的编码基因中的转录或使其灭活，或抑制所述的RNA分子的翻译，或抑制和/或灭活序列2或4所述的Pcsec4-1或Pcsec4-2蛋白的活性来实现1)-6)所述的应用。

所述应用中，通过抑制如上述的编码基因的转录，或抑制上述的RNA序列的翻译，或抑制和/或失活上述Pcsec4-1或Pcsec4-2蛋白的活性来调控辣椒疫霉胞外囊泡产量、干扰菌丝的生长速率、影响游动孢子产量、休止孢的萌发和调控侵染寄主能力从而能够抑制和/或杀灭辣椒疫霉病菌的生长。

本发明目的之六是提供所述序列表中序列2或序列4所示的Pcsec4-1或Pcsec4-2蛋白、上述序列表中序列1或3所示的编码基因在作为抑菌或杀菌剂靶标筛选辣椒疫霉病菌抑菌或杀菌剂中的应用。

本发明目的之七是提供一种筛选或辅助筛选辣椒疫霉抑菌和/或杀菌剂的方法，所述方法包括将待检测物应用于所述辣椒疫霉病菌，当所述待检测物能够抑制如上DNA序列的转录，或抑制如上RNA序列的翻译，或抑制和/或失活如上所示的Pcsec4-1或Pcsec4-2蛋白，则所述待测物质为候选的所述植物辣椒疫霉抑菌和/或杀菌剂。

本发明目的之八是提供一种降低辣椒疫霉病菌的活性的方法，包括下述步骤：抑制如上述的编码基因的转录或使其缺失，或抑制所述的RNA分子的翻译，或抑制和/或失活如上所述的Pcsec4-1或Pcsec4-2蛋白的活性；

其中，所述降低辣椒疫霉病菌的活性为降低辣椒疫霉病菌对寄主的侵染能力和/或对寄主的致病性，和/或者降低辣椒疫霉病菌的菌体生长速度，和/或抑制辣椒疫霉游动孢子产量，和/或抑制辣椒疫霉休止孢的萌发，和/或抑制辣椒疫霉胞外囊泡的分泌。

上述方法中，通过所述抑制或降低待抑制活性或待灭活的蛋白的编码基因表达来实现蛋白的灭活，具体的，可通过基因敲除或通过基因沉默实现。

所述基因敲除是指通过同源重组使特定靶基因失活的现象。基因敲除是通过DNA序列的改变使特定靶基因失活。

所述基因沉默是指在不损伤原有DNA的前提下使基因不表达或低表达的现象。基因沉默可发生在两种水平上，一种是由于DNA甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平的基因沉默，另一种是转录后基因沉默，即在基因转录后的水平上通过对靶标RNA进行特异性抑制而使基因失活，包括反义RNA、共抑制(co-suppression)、基因压抑(quelling)、 RNA干扰(RNAi)和微小RNA(miRNA)介导的翻译抑制等。

优选的，通过使辣椒疫霉中序列表中序列1或3所示的基因进行基因敲除，以使所述序列表中序列2或4所示的蛋白质所示的蛋白质灭活；

在本发明的一个实施方式中，使上述基因进行基因敲除的方法是基于CRISPR/Cas9的基因敲除法。

具体的，基于CRISPR/Cas9的基因敲除法是将目的基因的Donor载体和sgRNA表达载体以及Cas9表达质粒转染辣椒疫霉筛选得到所述目的敲除蛋白灭活的重组菌。

所述Donor载体为含有依次连接的待敲除目的基因上游800-1500bp的序列、DodorDNA 序列(可以为NPTII或GFP或RFP等基因序列)和待敲除目的基因的下游800-1500bp的序列的重组载体。

sgRNA表达质粒为表达靶向待敲除目的基因的sgRNA片段载体，其中，所述待敲除目的基因为Pcsec4-1和Pcsec4-2基因，靶向于Pcsec4-1基因的sgRNA序列为sgSec4-1：CTCCTGCTGATCGGAGACAG；靶向于Pcsec4-2基因的sgRNA序列序列sgSec4-2：GAAGGTGAAGCTGCAGATCT。

优选的，所述sgRNA表达质粒是以pYF2.3G-Ribo-sgRNA载体为出发载体，将Pcsec4-1 或Pcsec4-2基因的sgRNA退火得到的双链sgRNA编码序列，插入pYF2.3G-Ribo-sgRNA载体的Nhe I和Bsa I酶识别位点之间，得到sgRNA表达质粒。

抑制Pcsec4-1或Pcsec4-2蛋白质表达和/或活性的物质在制备植物辣椒疫霉病菌杀菌剂中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述抑制Pcsec4-1或Pcsec4-2蛋白质表达和/或活性的物质为抑制Pcsec4-1 或Pcsec4-2蛋白质表达和/或抑制Pcsec4-1或Pcsec4-2蛋白质的编码基因的转录和/或抑制 Pcsec4-1或Pcsec4-2蛋白质的编码基因转录得到的RNA分子的翻译的物质。

试验证明，本发明所提供的Pcsec4-1或Pcsec4-2蛋白在辣椒疫霉自身生长发育过程中起作用。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得的敲除突变体，其生长发育较野生型亲本菌株而言有明显变化，主要包括：Pcsec4-2基因单敲除突变体菌株致死；Pcsec4-1基因单敲除导致菌丝生长速率减慢、游动孢子产量降低、胞外囊泡分泌量下降，以及侵染寄主植物的能力变弱。因此，辣椒疫霉病菌中Pcsec4-1或Pcsec4-2蛋白在辣椒疫霉营养生长、无性生殖及侵染寄主等多个过程均可发挥重要作用。本发明为辣椒疫霉病菌的致病机制研究提供了技术支持，并为未来新型杀菌剂的研发提供了潜在的分子作用靶标。

附图说明

图1为辣椒疫霉菌株BYA5(WT)，敲除空载体对照转化子(CK)，Pcsec4-1单敲除转化子KD-1、KD-2菌株的菌落直径柱状图(在V8固体培养基上培养3天)；图1中A为柱状图，B为菌落照片。WT代表亲本菌株；CK代表敲除空载体菌株；KD-1,KD-2代表2 株纯合敲除转化子。

图2为辣椒疫霉菌株BYA5(WT)、空载体对照菌株以及Pcsec4-1单敲除转化子的孢子囊产量、游动孢子产量、休止孢萌发和致病力生物学性状测定结果的柱状图。图中，A 为孢子囊产量；B为游动孢子释放量；C为休止孢萌发量；D为离体烟草叶片致病力。 WT代表亲本菌株；CK代表敲除空载体；KD-1、KD-2代表2株纯合敲除转化子。Turkey 法用于计算野生型菌株和转化子之间的显著性差异(*P<0.01)。

图3为辣椒疫霉菌株BYA5(WT)，敲除空载体对照转化子CK，Pcsec4-1单敲除转化子KD-1、KD-2菌株游动孢子的致病力发病图片。WT代表亲本菌株；CK代表敲除空载体； KD-1,KD-2代表2株纯合敲除转化子。

图4为辣椒疫霉菌株BYA5(WT)，敲除空载体对照转化子(CK)，Pcsec4-1单敲除转化子KD-1、KD-2菌株胞外囊泡产量的柱状图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

辣椒疫霉菌株LT1534：为美国俄勒冈州立大学Brett M.Tyler教授馈赠的标准菌株，存放于中国农业大学植物保护学院种子病理与杀菌剂药理实验室，公众可从中国农业大学获得。

培养基或试剂配方：

试验所用培养配制方法：

10％V8固体培养基：100ml V8原汁，加入1.4g碳酸钙，15g琼脂糖，去离子水定容至1l，121℃，灭菌20min。

LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，去离子水定容至1l，121℃，灭菌20min。

LB固体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，加入15g琼脂糖，去离子水定容至1l，121℃，灭菌20min。

豌豆甘露醇培养基(Pea Mannitol，PM)：青豌豆125g，1l去离子水，121℃，灭菌20min，然后用两层纱布过滤，向过滤后的豌豆培养中，加入甘露醇91.1g，碳酸钙2g，氯化钙1g，用去离子水定容至1l，5,000rpm离心10min后取上清，121℃，灭菌20min。固体培养基(PMA)添加15g琼脂粉，湿热灭菌20min。

营养豌豆培养基(Nutrient pea broth，NPB)：青豌豆125g，1l离子水，121℃，灭菌20min，然后用2层纱布过滤，向过滤后的豌豆培养中，加入D-甘露醇5g，D-山梨醇5g，葡萄糖5g，硝酸钾3g，碳酸钙2g，酵母提取物2g，磷酸二氢钾1g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.5 g，氯化钙0.1g，5,000rpm离心10min后取上清,用去离子水定容至1l，固体培养基(NPBA)，添加15g琼脂粉121℃，灭菌20min。使用前在无菌操作台,向培养基中加入维生素储存液和微量元素储液，每1l培养基加入已过滤灭菌的2ml维生素储存液和2ml微量元素储液。

试验所用试剂配制方法：

氨苄青霉素(Ampicillin,Amp)：称量0.5g氨苄青霉素加入到10ml的ddH₂O中，配制成 5×10⁴μg/ml的母液，用无菌滤膜(0.22μm)过滤后分装在2ml的离心管中，置于-20℃保存备用。

遗传霉素(Geneticin,G418)：称量0.5g遗传霉素加入到10ml的ddH₂O中，配制成5× 10⁴μg/ml的母液，用无菌滤膜(0.22μm)过滤后分装在2ml的离心管中，置于-20℃保存备用。

菌丝酶解液(20ml)：10ml 0.8M甘露醇，0.8ml 0.5M KCl，0.8ml 0.5M 4-吗啉乙磺酸， 0.4ml 0.5M CaCl₂，0.12g纤维素酶(Calbiochem,cat.No.219466)，0.12g裂解酶(Sigma， cat.No.L1412)，无菌超纯水定容至20ml，轻柔混匀溶解，0.22μm滤膜过滤灭菌，现用现配。

MMG溶液(250ml)：18.22g甘露醇，0.76g MgCl₂·6H₂O，2.0ml 0.5M 4-吗啉乙磺酸(pH＝5.7)，超纯水定容至250ml，0.22μm滤膜过滤灭菌。

W5溶液：0.1g KCl，4.6g CaCl₂·2H₂O，2.25g NaCl，7.8g葡萄糖，超纯水溶解定容至 250ml，0.22μm滤膜过滤灭菌。

PEG-CaCl₂溶液(40％w/v)：12g PEG 4000，3.75ml 0.5M CaCl₂，3ml无菌超纯水，0.22μm滤膜过滤灭菌。

0.8M Mannitol溶液(1l)：145.76g甘露醇，超纯水溶解定容至1l，0.22μm滤膜过滤灭菌。

0.5M MES-KOH溶液(40ml)：4.88g 4-吗啉乙磺酸(MES)，9.76g的NaOH，超纯水定容至40ml，0.22μm滤膜过滤灭菌。

维生素储存液(Vitamin Stock)：Biotin 6.7×10^-7g/ml；Folic acid 6.7×10^- ⁷g/ml；L-inositol 4.0×10^-5g/ml；Nicotinic acid 4.0×10^-5g/ml；Pyridoxine-HCl 6.0×10^-4g/ml；Riboflavin 5.0× 10^-5g/ml；Thiamine-HCl 1.3×10^-3g/ml。

微量元素储液(Trace Elements)：FeC₆H₅O₇·3H₂O 5.4×10^-4g/ml；ZnSO₄·7H₂O3.8 ×10^-4g/ml；CuSO₄·5H₂O 7.5×10^-4g/ml；MgSO₄·H₂O 3.8×10^-5g/ml；H₃BO₃ 2.5×10^- ⁵g/ml；Na₂MoO₄·H₂O 3.0×10^-5g/ml。

本实施例中使用的pBluescript II SK+同源臂载体质粒(Donor载体)，sgRNA表达载体pYF2.3G-Ribo-sgRNA及Cas9表达质粒pYF2-PsNLS-hSpCas9均由美国俄勒冈州立大学Brett M.Tyler教授馈赠。

实施例1、辣椒疫霉Pcsec4-1、Pcsec4-2蛋白及其编码基因的获得

本实施例中辣椒疫霉Sec4蛋白Pcsec4-1、Pcsec4-2及其编码基因(或cDNA)可以以辣椒疫霉标准菌株LT1534的DNA(或cDNA)为模板，通过表1所列引物扩增获得。其中， DNA或RNA提取的材料可以为辣椒疫霉标准菌株LT1534的菌丝体。其中，Pcsec4-1的编码基因Pcsec4-1如序列表中序列1所示，序列表中序列1由624个核苷酸组成；自序列1的 5’端第1-624位核苷酸为编码序列，编码序列表中序列2所示的蛋白质Pcsec4-1。上述蛋白或基因也可以人工合成。Pcsec4-2的编码基因Pcsec4-2如序列表中序列3所示，序列表中序列3由609个核苷酸组成；自序列1的5’端第1-609位核苷酸为编码序列，编码序列表中序列3所示的蛋白质Pcsec4-2。上述蛋白或基因也可以人工合成。

表1.Pcsec4全长编码基因扩增引物

实施例2、辣椒疫霉Pcsec4-1和Pcsec4-2基因敲除载体的构建

本实施例中基于CRISPR/Cas9的基因敲除载体构建方法以及相关载体的序列以及NPT II基因序列在文献“Fang,Y.,and Tyler,B.M.(2016).Efficient disruption andreplacement of an effector gene in the oomycete Phytophthora sojae usingCRISPR/Cas9.Molecular plant pathology,17(1),127-139.”以及“Fang,Y.,Cui,L.,Gu,B.,Arredondo,F.,and Tyler,B.M.(2017).Efficient genome editing in the oomycetePhytophthora sojae using CRISPR/Cas9.Curr.Protoc.Microbiol.44,21A.1.1-21A.1.26.”中公开过。本实施例中使用的pBluescript II SK+同源臂载体质粒(Donor 载体)，sgRNA表达载体pYF2.3G-Ribo-sgRNA以及Cas9表达载体pYF2-PsNLS-hSpCas9均由美国俄勒冈州立大学Brett M.Tyler教授馈赠。

本实施方式中所用的Donor载体pBS-NPTII-Pcsec4-1、pBS-NPTII-Pcsec4-2；sgRNA表达质粒pYF2.3G-Pcsec4-1和pYF2.3G-Pcsec4-2；具体构建方法如下所述：

1)pBS-NPTII-Pcsec4-1的同源臂载体构建：以辣椒疫霉菌株LT1534的DNA为模板，利用TaKaRa-In-Fusion_Tools在线网站 (http://www.clontech.com/US/Products/Cloning_and_Competent_Cells/Cloning_Resources/On line_In-Fusion_Tools)设计引物扩增目的基因Pcsec4-1上游1000bp序列(序列表中序列5 所示，经如表2所示Pbs-NPTII-Sec4-1-F1和Pbs-NPTII-Sec4-1-R1所示引物扩增获得)、NPTII 基因序列(NPTII基因是以pYF2-PsNLS-hSpCas9骨架质粒为模板用引物序列如表2所示 Pbs-NPTII-Sec4-1-F2和Pbs-NPTII-Sec4-1-R2扩增获得的片段)、Pcsec4-1下游1000bp序列 (序列表中序列6所示，经引物序列如表2所示Pbs-NPTII-Sec4-1-F3和Pbs-NPTII-Sec4-1-R3的引物扩增获得)，利用HD Cloning Kit将三个扩增片段依次融合连接入克隆载体pBluescript II SK+(EcoR V酶切)，连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，37℃过夜培养后，使用通用引物M13F(序列：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’)/M13R(序列：5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’)扩增、测序验证克隆，将验证正确的含有依次连接的Pcsec4-1上游1000bp序列、NPTII基因序列和Pcsec4-1下游1000bp序列的重组表达载体命名为pBS-NPTII-Pcsec4-1。

2)pBS-NPTII-Pcsec4-2的同源臂载体构建如上述所述：以辣椒疫霉菌株LT1534的DNA 为模板，利用设计引物扩增目的基因Pcsec4-2上游1000bp序列(序列表中序列7所示，经如表2所示Pbs-NPTII-Sec4-2-F1和Pbs-NPTII-Sec4-2-R1所示引物扩增获得)、NPTII基因序列(NPTII基因是以pYF2-PsNLS-hSpCas9骨架质粒为模板用引物序列如表2所示 Pbs-NPTII-Sec4-2-F2和Pbs-NPTII-Sec4-2-R2扩增获得的片段)、Pcsec4-2下游1000bp序列(序列表中序列8所示，经引物序列如表2所示Pbs-NPTII-Sec4-2-F3和Pbs-NPTII-Sec4-2-R3的引物扩增获得)，利用HD Cloning Kit将三个扩增片段依次融合连接入克隆载体pBluescript II SK+(EcoR V酶切)，连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，37℃过夜培养后，使用通用引物M13F(序列：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’)/M13R(序列：5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’)扩增、测序验证克隆，将验证正确的含有依次连接的Pcsec4-2上游1000bp序列、NPTII基因序列和Pcsec4-2下游1000bp序列的重组表达载体命名为pBS-NPTII-Pcsec4-2。

表2.CRISPR/Cas9介导的Pcsec4-1/2基因敲除同源臂载体构建扩增引物

2)sgRNA及Cas9共表达质粒的构建：利用sgRNA设计网站EuPaGDT (http://grna.ctegd.uga.edu/)以及RNA结构在线分析工具(http://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/Servers/Predict1/Predict1.html)，选择特异性靶向Pcsec4-1基因且二级结构较弱的sgRNA序列(sgSec4-1：CTCCTGCTGATCGGAGACAG，靶向于Pcsec4-1基因的SEQID No.1的第37-56位)；选择特异性靶向Pcsec4-2基因且二级结构较弱的sgRNA序列(sgSec4-2： GAAGGTGAAGCTGCAGATCT，靶向于Pcsec4-2基因的SEQ ID No.3的第174-193位)送至公司合成带有NheI和BsaI酶切位点以及HH ribozyme的正反向sgRNA序列引物。用无菌水溶解成100μM溶液。退火反应合成双链sgRNA序列，反应体系：3μl正向链溶液，3 μl反向链溶液，3μl 10×T4 DNA Ligase Buffer(NEB)，4μl 0.5M NaCl，21μl超纯无菌水，吸打混匀，100℃反应2min，放至室温自然冷却4h，之后将反应液稀释500倍。再取 2μl 10×T4 DNALigase Buffer(NEB)，50ng pYF2.3G-Ribo-sgRNA载体(Nhe I/Bsa I双酶切)，4μl稀释后的双链sgRNA溶液，1μl T4 DNA Ligase，无菌超纯水补齐至20μl，室温反应30min，使用5μl连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，37℃过夜培养后，使用引物对RPL41_Pseq_F(序列：5’-CAAGCCTCACTTTCTGCTGACTG-3’)/M13F(序列： 5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’)进行菌落PCR验证，验证引物如表3所示，并测序验证阳性克隆，将验证正确可表达上述靶向Pcsec4-1基因的sgRNA的重组载体命名为pYF2.3G-Pcsec4-1；将验证正确可表达上述靶向Pcsec4-2基因的sgRNA的重组载体命名为 pYF2.3G-Pcsec4-2。

表3.合成Pcsec4-1/2基因敲除的sgRNA核苷酸序列

实施例3、辣椒疫霉Pcsec4-1基因和Pcsec4-2基因敲除转化子的获得

采用CaCl₂-PEG介导的原生质体转化方法制备Pcsec4-1和Pcsec4-2基因敲除转化子，卵菌遗传转化的方法在文献“Fang,Y.,and Tyler,B.M.(2016).Efficient disruptionand replacement of an effector gene in the oomycete Phytophthora sojae usingCRISPR/Cas9.Molecular plant pathology,17(1),127-139.”中公开过。

敲除转化子的获得具体为将实施例1中获得的敲除基因Pcsec4-1Donor载体 pBS-NPTII-Pcsec4-1和自身的sgRNA重组载体pYF2.3G-Pcsec4-1以及Cas9表达载体pYF2-PsNLS-hSpCas9；Pcsec4-2的Donor载体pBS-NPTII-Pcsec4-1和自身的sgRNA重组载体pYF2.3G-Pcsec4-2以及Cas9表达载体pYF2-PsNLS-hSpCas9(将各自的同源臂和sgRNA载体和Cas9表达载体混合后)转入辣椒疫霉LT1534的原生质体中，将生长出的转化子经G418 抗性V8固体培养基平板25℃培养筛选，收集疑似转化子的菌丝体，提取DNA进行PCR测序验证，将阳性转化子再提取RNA进行Q-PCR验证。在多次敲除转化试验中未获得Pcsec4-2 纯合敲除转化子，表明该基因敲除后致死。获得的Pcsec4-1单敲除转化子KD系列菌株。也未获得Pcsec4-2和Pcsec4-1双敲除转化子。同时，将转入相同载体质粒、经过相同转化步骤但没有发生靶基因敲除的转化子作为CK对照转化子，即CK。

实施例4、辣椒疫霉Pcsec4-1基因敲除转化子的生物学形状分析

一、菌丝生长速率检测

将野生型辣椒疫霉菌株BYA5(WT)，敲除空载体对照转化子(CK)，实施例3得到的敲除转化子：Pcsec4-1敲除转化子KD系列菌株(KD-1、KD-2)，分别接种于加有15ml V8固体培养基的无菌培养皿(直径9cm)中央，25℃黑暗条件下培养3天，用十字交叉法测量各菌株的菌落直径，每个菌株3次重复。

结果显示，所有测定的Pcsec4-1单敲除转化子KD系列菌株的菌丝生长速率与野生型辣椒疫霉菌株BYA5(WT)及对照转化子CK相比显著下降(图1)。实验结果说明所述Pcsec4-1 蛋白参与调控了辣椒疫霉的菌丝生长。

二、孢子囊、游动孢子数量、休止孢萌发及离体致病力检测

制备10％V8固体培养基，将野生型辣椒疫霉菌株BYA5(WT)、空载体对照转化子CK、实施例3得到的敲除转化子：Pcsec4-1基因敲除转化子KD系列菌株KD-1、KD-2菌株，分别接种于V8固体培养基上(直径9cm)，25℃条件下黑暗培养3天，然后将培养皿正面朝上置于25℃(RH＝60％-80％)光照培养箱继续培养5天。向培养好的皿中加入10ml 无菌水，于4℃冰箱放置30min，随后再将培养皿取出置于室温(25℃)放置30min，收集释放的游动孢子悬浮液，在涡旋仪上震荡1min，吸取20μl释放的游动孢子悬浮液滴加到血球计数板上，通过显微镜观察并统计游动孢子产生的数量；通过20倍物镜视野内观察培养基上孢子囊产生的数量及形态，每个菌株设置3个重复。

结果显示，与野生型辣椒疫霉菌株BYA5(WT)和空载体对照转化子CK相比，实施例3得到的Pcsec4-1基因敲除转化子KD系列菌株(KD-1、KD-2菌株)孢子囊数量没有发生明显的变化，而释放的游动孢子数量显著下降，但孢子囊和游动孢子形态正常，这说明 Pcsec4-1蛋白主要影响了辣椒疫霉游动孢子的数量(表4，图2-A,B)。

三、休止孢形态检测及萌发率统计

采用上述方法获得野生型辣椒疫霉菌株BYA5(WT)和实施例3得到敲除转化子的游动孢子悬浮液，将各菌株游动孢子悬浮液在涡旋振荡器上振荡处理1min，获得休止孢悬浮液。用移液枪吸取100μL辣椒疫霉休止孢悬浮液滴加至凹玻片上，并将凹玻片置于25℃黑暗培养4h，于光学显微镜下观察各处理休止孢的形态，并随机检测每100个休止孢中萌发的休止孢个数，每个菌株设置3个重复。

结果显示，与野生型辣椒疫霉菌株BYA5(WT)和空载体对照转化子CK相比，实施例3得到的Pcsec4-1基因敲除转化子中KD-1的休止孢萌发率放生了显著的下降，而敲除转化子KD-2的休止孢萌发率未发生显著的下降。该部分结果说明，Pcsec4-1蛋白对于调控辣椒疫霉休止孢的萌发存在着一定的影响，但是鉴于2株转化子表型存在着差异，是否是由于Pcsec4-2的功能互补所影响，还需要试验的进一步验证(图2-C)。

四、致病力的结果统计和观察

按照上述方法收集辣椒疫霉各个处理菌株的游动孢子，通过显微镜调节各个菌株的游动孢子浓度至10⁵个/ml。向采摘的等位、同龄、健壮的辣椒叶片上接种孢子悬浮液，每片辣椒叶片滴加5滴，每滴体积为10μl，每个处理接种6片叶片。将接种好的叶片放在玻璃架上并置于铺有3层吸水纸和适量清水的15cm的玻璃皿内，将接种后的辣椒叶片放置在 25℃(RH＝60％-80％)光照培养箱，12h光照，12h黑暗交替培养3天。记录病斑面积并拍照，整个试验重复3次。

结果显示，与野生型辣椒疫霉菌株BYA5(WT)和空载体对照转化子CK相比，实施例3得到的Pcsec4-1基因敲除转化子中KD-2的致病力相较于野生型菌株和敲除空载体菌株的致病力发生了显著下降，而敲除转化子KD-1的致病力相较于野生型菌株和敲除空载体菌株的致病力未发生明显变化。该结果表明，Pcsec4-1蛋白也参与调控了辣椒疫霉侵染寄主植物的过程(图2-D，图3)。

五、胞外囊泡的分泌量

制备10％V8固体培养基，将野生型辣椒疫霉菌株BYA5(WT)、空载体对照转化子CK、实施例3得到的敲除转化子：Pcsec4-1基因敲除转化子KD系列菌株，分别接种于V8 固体培养基上(直径9cm)，25℃条件下黑暗培养3天。每株菌株用5mm打孔器打取菌饼 15个，放入马铃薯葡萄糖液体培养基中，25℃120rpm条件下黑暗培养3天，培养完成后向马铃薯葡萄糖液体培养基中添加表面灭菌处理后的辣椒叶片(75％乙醇浸泡叶片1min, 用无菌水清洗3遍，2％戊二醛浸泡叶片5min，无菌水清洗3遍，将叶片平放于无菌培养皿中，在无菌操作台中紫外照射30min。)，放于25℃(RH＝60％-80％)光照培养箱继续培养4天，用于胞外囊泡的提取，并通过BCA蛋白检测试剂盒对各个菌种中获得的辣椒疫霉胞外囊泡浓度进行检测(图4)。

结果显示，与野生型辣椒疫霉菌株BYA5(WT)和空载体对照转化子CK相比，实施例3得到的Pcsec4-1基因敲除转化子KD系列菌株在胞外囊泡的产量方面发生了显著的下降，说明Pcsec4-1影响了辣椒疫霉胞外囊泡的分泌过程(图4)。

表4.辣椒疫霉菌株中Pcsec4-1单基因敲除突变体表型分析

注：^aWT代表亲本菌株；CK代表敲除空载体；KD-1、KD-2代表2株纯合敲除转化子。

^b表中数值表示平均值±标准偏差。DPS软件中单因素ANOVA分析中Turkey法用于计算野生型菌株和不同转化子之间的生物学性状差异,同一列中标注相同字母，表示不存在显著性差异(P<0.01)。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 辣椒疫霉调控胞外囊泡分泌关键蛋白及其编码基因与应用

<130> WHOI210034

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 624

<212> DNA

<213> 辣椒疫霉(Phytophthora capsici)

<400> 1

atggtgcata gcagcaagta cgatctgctc atcaagctcc tgctgatcgg agacagtggt 60

gttgggaaga gttgcgtgct cttgcgctac tcagacgatt cgttcacgac ctccttcatc 120

actaccatcg gcatcgactt taaggttaag accatcgacg tcgacggcaa gcgaataaag 180

ctgcagatat gggacactgc gggccaggaa cgtttccgga ctatcacaac agcttattat 240

cgcggtgcaa tgggaattct attggtatac gatgtgacgg atgaccactc cttccagaac 300

attcgcaatt ggatgactca aattcgacaa aacgcgtcgt ctaatgtgaa caaaatcctg 360

atcggcaaca agtgcgacgt ggacccgtcg gaaagagcag tgactacgaa acagggtcag 420

gatttggcgg acgagttcgg catcaagttc ttcgagacga gcgccaagag caatgaaaac 480

atcaacgagg ccttccgctc aatcgcagtg gacatccaga agcggctggc ggagagcgag 540

cacgatagat tagacgtggc caatggcagc aagttccgtg tggatgagtc tcaggagcag 600

acgaaagacg gttgctgctc gtga 624

<210> 2

<211> 207

<212> PRT

<213> 辣椒疫霉(Phytophthora capsici)

<400> 2

Met Val His Ser Ser Lys Tyr Asp Leu Leu Ile Lys Leu Leu Leu Ile

1 5 10 15

Gly Asp Ser Gly Val Gly Lys Ser Cys Val Leu Leu Arg Tyr Ser Asp

20 25 30

Asp Ser Phe Thr Thr Ser Phe Ile Thr Thr Ile Gly Ile Asp Phe Lys

35 40 45

Val Lys Thr Ile Asp Val Asp Gly Lys Arg Ile Lys Leu Gln Ile Trp

50 55 60

Asp Thr Ala Gly Gln Glu Arg Phe Arg Thr Ile Thr Thr Ala Tyr Tyr

65 70 75 80

Arg Gly Ala Met Gly Ile Leu Leu Val Tyr Asp Val Thr Asp Asp His

85 90 95

Ser Phe Gln Asn Ile Arg Asn Trp Met Thr Gln Ile Arg Gln Asn Ala

100 105 110

Ser Ser Asn Val Asn Lys Ile Leu Ile Gly Asn Lys Cys Asp Val Asp

115 120 125

Pro Ser Glu Arg Ala Val Thr Thr Lys Gln Gly Gln Asp Leu Ala Asp

130 135 140

Glu Phe Gly Ile Lys Phe Phe Glu Thr Ser Ala Lys Ser Asn Glu Asn

145 150 155 160

Ile Asn Glu Ala Phe Arg Ser Ile Ala Val Asp Ile Gln Lys Arg Leu

165 170 175

Ala Glu Ser Glu His Asp Arg Leu Asp Val Ala Asn Gly Ser Lys Phe

180 185 190

Arg Val Asp Glu Ser Gln Glu Gln Thr Lys Asp Gly Cys Cys Ser

195 200 205

<210> 3

<211> 609

<212> DNA

<213> 辣椒疫霉(Phytophthora capsici)

<400> 3

atggctcgtc atgaaaaccc cttcgatatg cagatcaagc tgttgatgat cggcgacagc 60

ggtgtgggga agacctgttt gttgctgcgt tatgccaacg actcgttctc tccgactttt 120

atcacgacca tcgggattga cttcaaaatc aagaacatag agctggacaa caagaaggtg 180

aagctgcaga tctgggacac agctggtcag gagcgcttcc gcaccattac gacgtcgtac 240

ttccgcggtg ctcagggtat tttattggtc tacgatgtca cggatcgcgc atctttccaa 300

agtatccgca actgggtggg tcagatccag cagcacgccg acgtgcacgt caacaagatc 360

ctcatcggca acaagtgcga tatgacggac gacaaagttg taagcacgga ggaaggtcag 420

gcattagcgg acgagtatgg tgtcaagttc ttcgagacga gtgcgaagaa caatatcaac 480

gtggaaggag gcttcatcga gatcgcgcgt gaagtgaaga acagactcat ggaagagggc 540

ggaccgcaca agaaagacaa tgtcaacctc agcgcaaaac cagcacccgt gaagaagggt 600

tgttgctaa 609

<210> 4

<211> 202

<212> PRT

<213> 辣椒疫霉(Phytophthora capsici)

<400> 4

Met Ala Arg His Glu Asn Pro Phe Asp Met Gln Ile Lys Leu Leu Met

1 5 10 15

Ile Gly Asp Ser Gly Val Gly Lys Thr Cys Leu Leu Leu Arg Tyr Ala

20 25 30

Asn Asp Ser Phe Ser Pro Thr Phe Ile Thr Thr Ile Gly Ile Asp Phe

35 40 45

Lys Ile Lys Asn Ile Glu Leu Asp Asn Lys Lys Val Lys Leu Gln Ile

50 55 60

Trp Asp Thr Ala Gly Gln Glu Arg Phe Arg Thr Ile Thr Thr Ser Tyr

65 70 75 80

Phe Arg Gly Ala Gln Gly Ile Leu Leu Val Tyr Asp Val Thr Asp Arg

85 90 95

Ala Ser Phe Gln Ser Ile Arg Asn Trp Val Gly Gln Ile Gln Gln His

100 105 110

Ala Asp Val His Val Asn Lys Ile Leu Ile Gly Asn Lys Cys Asp Met

115 120 125

Thr Asp Asp Lys Val Val Ser Thr Glu Glu Gly Gln Ala Leu Ala Asp

130 135 140

Glu Tyr Gly Val Lys Phe Phe Glu Thr Ser Ala Lys Asn Asn Ile Asn

145 150 155 160

Val Glu Gly Gly Phe Ile Glu Ile Ala Arg Glu Val Lys Asn Arg Leu

165 170 175

Met Glu Glu Gly Gly Pro His Lys Lys Asp Asn Val Asn Leu Ser Ala

180 185 190

Lys Pro Ala Pro Val Lys Lys Gly Cys Cys

195 200

<210> 5

<211> 1000

<212> DNA

<213> 辣椒疫霉(Phytophthora capsici)

<400> 5

caccagctac atcggagact ctgattgctg tctccccttc ctctcttcgc tcggtttctt 60

cttcggcggt agacatgaga agtcccgtcc ggcttccccg tggtttctgg aagtgaaaag 120

cattgcgtgc gtcgatctct gtgtaacgtc tggctagatc aaattcgata gtataatgaa 180

gtaaaacgcc aaagtaaggt agtcatggtg aaagagacat catttcatta atgaaatcaa 240

gtcattcacc gcatgactgt ctattttgag acaaagacac acatctagct ggtgtttgcc 300

cgtcgagcat tgtgctgtga tatctacagc tacatcgaac actgaaatcc gggcagcagg 360

ctatagttca agcgttatgt agaccaattt agggtgagcg ccgttggctc ggattgtggg 420

gtggctggaa gcccctgccc ccgtctattg aagttagaac cgtaagaaat ggagccggac 480

tcgtaattta tcctgggatc cacctgtatc tgtctctgta catttgtgca ttacgtgaac 540

aactgatcga cggcttggcc aatgaaaaaa ctcaccgttg attttgttca cagacacaaa 600

aattttagcc aatgaagaaa atgctcgaaa atattgaagg tagtaccgtg gttttgtgaa 660

aggggtcaaa ttgccccact tgagtgacct atccctccca attaccatct gtgcagaaag 720

gcttcctcaa agcgagtacc gtaaaattat gaaaggggtc aaattgcccc cgttcacttg 780

ttatcgtgct aactttgtat actatagtag ccaaagtcat taagctctgt tcgcgatagg 840

gttaataatt tataaaataa ttttttcccc tattgagtct caaaatgtct tatgatgggt 900

ttatgtgaat tagcaaaacg catattttgt ggtgcccacc aaaaaatggg acacgtgctt 960

cttcggcaca caacattctg caggcatcct agtcgtcgcc 1000

<210> 6

<211> 1000

<212> DNA

<213> 辣椒疫霉(Phytophthora capsici)

<400> 6

ttccactgtc tttcgccttg ttcgtgcttg tcgttttgtg ccgaatggtt gccacgctct 60

agctgatagc ttagtaccct gcaactagcc ctcgaatgcg ataaactcat tatcatacat 120

agtacttctt gactcaggtt ccaaaatctc agatggctac atcatgacag tgtagccatc 180

tgacgcatcc gccaatcatt ttgattatct caacgtgcta ttggtggctg gtggttcatt 240

tgctgattga attgacgtaa ggaatggcgg agcgcgaaga catcgtggac ggcggcgaga 300

cgtgggacga ctgggtggac gacgggtcgt ccaccagcta cgactgcgtg ttctgcgccg 360

ataagttccc ggccgaggat ccgcttcatg cgcatctaca ggaggcgcac gacttttcac 420

tccgtagcga gatctcaagc cgcaagctgg acacatacgg catcattcaa ctgattaatt 480

tcttacgttg gcatacattg gatggagttt cagccgaaca ggtgaagcag acgctggcaa 540

cggaaggaaa cgctgccttc cagaaggacg agttcctcaa gcctgtggtg gtggacgacc 600

ctctgcttta ctgtctcgac tgcgatagtg acagtgatga tgacgaggac aatgccaacg 660

aggagcagaa aagtgcggaa gttgtggaga cccctgctac tgctggagat gacgctgctg 720

ctctgatcgc caggttgcag atggagaacc aagaacttaa gcagcagatg accaaatact 780

cgaaacttgt tcgcgacttt gtggtagatg gagagaacac cgcccctgtg gaggatgccg 840

ctgacaacga tacgtactac ttcgactcgt actcgcacgt gggtattcat cgtgagatga 900

tcacggacag gatccgtacc gatggctacc gcaatgccat cattaacaat ccccaggtat 960

ttgagggcaa ggtggtacta gatgttgggt gtggtactgg 1000

<210> 7

<211> 1000

<212> DNA

<213> 辣椒疫霉(Phytophthora capsici)

<400> 7

tagtaactcc catcttgaac gcgaaggaat gtcaggtaag cactaccacc gctaaatggc 60

gtttctcctg tcagaagctg gtagacaatg caaccgaatg cccacatgtc gctagcataa 120

gtcggatctt tgttgtcgat cgtctccggt ggcatgtact ccggtgtgcc aacgaaattt 180

ggtccgttga gtttatcatc ggccatgttt ttagccgtgc caaagtcgat gagctttagg 240

tggttacctg catccttgca gacaaccatg ttctcaggct ttaagtcacg atgaatcacc 300

tggttcgcgt gcatgtactc gactgcgttc acaacgtcgg ccaagtaaaa ccgtgcaagt 360

tcctcatcca gtccaagctg gcggccttcg tgcagcaggt gggagagcag ttcacctccg 420

tccagtagtt ccagcaggaa atataagttg ttgtcgtctt ggaaggtctg atacagacgg 480

ataatgttgg ggtgcagcaa ccgattcagc acttccttct ccatgttgat ctcattgaag 540

atgttctggt gacgcaaccg cagccgcttg atgcgttgct tctcgatcac tttaagcgcg 600

aacttgtcac ccgtagcctt gtgtcgggcc tcaacgatgc gcgagaagtt gccttcgccc 660

agaggtttgc cctgcacgaa ctcgtcaata ctcggcttct ccgtcgcgtc cttcgctgta 720

acaacgcaac gacacaatcg tcagtgtcgt gaagtgaatt tacagtacaa tagacagcaa 780

tcactagact ggaaataaac aatgaagagc tctcaaggac gtacggctaa tggccatgat 840

ggaagtggtt ggtgcgtctt cgaatcgatt tttttcgttt tatgccgacg cttcaagtac 900

tcgtagggtt tcggtttttc gatttttcca gttttgatgt gtgccacatc gtgttcggtg 960

gctacgaata gaaccccttt tatatgcgtt acgtaggctg 1000

<210> 8

<211> 1000

<212> DNA

<213> 辣椒疫霉(Phytophthora capsici)

<400> 8

gtttgccaga cagcttgctt gggctcggtg gcgtcgcaat ttgatatgct cgctcgctac 60

tatttcgcag atgcatgctg ccttactata gctactactt ccactcaact acttttttca 120

tggtttttat gttgtacttt tgctagtgtt tcgatttcaa gaacactgaa gattttcatc 180

taaactcgat taatctgcct cgcgttccca gacgcgaact gagctatcaa ttgatgctga 240

tagcgcaagt ttgccatcat aactaaagct gcagtcaaat acttcggctt cgtgaccgca 300

tagtatttgc tgacactcgc cggtgaaagc gttccacact cgagcggttc catctgtacc 360

agcagtgaga acttggagcc cttgcatgct gaagcagacc ttattgattg ccttttggtg 420

gccagacaat atgcaccgcc ttgtacctgt aagtgtgtca tatatgaatg catttccgtc 480

cttaccacac gatactacga gcgcgccgga agcattgaat gcagcgtggg taacttcata 540

accgttgtga tcatcccagt cataaagaca ttttccggtg cgagcatccc acaacttgca 600

tgtcccgtcg gaagaagaag acagtaaagt gttgcctttg ttgtcgaacg acacgctgga 660

aatatcagcg tcgtgatgct cgatacaacg gaaacagcca ccatatcgag tgtcccagag 720

cctcacagtc gagtcacaag aacctgtagc gatgagtttg gtgtcgatcg agtcgaatgc 780

caaacatgat acttctgcgg aatgtcccga aagcgtcagc ctggatgttt ccgttgcgat 840

atcccaaacc actccggtgc catcgaccga atagctaccg aagcactcat tgctacttga 900

tcccaaagca aacacagccc ccaccacctc tcctacgtgg caccggtagg ttccgatagc 960

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Claims

1.一种降低辣椒疫霉游动孢子产量、辣椒疫霉菌丝生长、辣椒疫霉休止孢萌发率、辣椒疫霉胞外囊泡产量和/或辣椒疫霉对寄主的致病力的方法，其特征在于，所述方法通过抑制和/或灭活如序列表中序列2或序列4所示的辣椒疫霉病菌调控胞外囊泡分泌关键蛋白来实现。

2.一种抑制和/或杀灭辣椒疫霉病菌的方法，其特征在于，所述方法通过抑制和/或灭活如序列表中序列2或序列4所示的辣椒疫霉病菌调控胞外囊泡分泌关键蛋白来实现。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述辣椒疫霉病菌调控胞外囊泡分泌关键蛋白的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列1或序列3所示。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法通过抑制如权利要求3所述编码基因中一种或两种以上任意组合的转录或使其灭活，或抑制如权利要求3所述编码基因转录得到的RNA分子中的一种或两种以上任意组合的翻译来实现。

5.辣椒疫霉病菌调控胞外囊泡分泌关键蛋白或其编码基因在作为抑菌或杀菌剂靶标筛选辣椒疫霉病菌抑菌或杀菌剂中的应用，其特征在于，所述辣椒疫霉病菌调控胞外囊泡分泌关键蛋白的氨基酸序列为序列2或序列4所示。

6.一种筛选或辅助筛选辣椒疫霉病菌抑菌和/或杀菌剂的方法，其特征在于，所述方法包括将待检测物应用于所述辣椒疫霉病菌，当所述待检测物能够抑制辣椒疫霉病菌调控胞外囊泡分泌关键蛋白的编码基因的转录，或转录的RNA分子的翻译，或抑制辣椒疫霉病菌调控胞外囊泡分泌关键蛋白的活性或使其灭活，则所述待检测物为所述辣椒疫霉病菌的抑菌和/或杀菌剂；所述辣椒疫霉病菌调控胞外囊泡分泌关键蛋白的氨基酸序列为序列2或序列4所示。

7.一种降低辣椒疫霉病菌的活性或者杀灭辣椒疫霉病菌的方法，包括下述步骤：抑制辣椒疫霉病菌调控胞外囊泡分泌关键蛋白的编码基因的转录或使其缺失，或抑制辣椒疫霉病菌调控胞外囊泡分泌关键蛋白的编码基因转录的RNA分子的翻译，或抑制辣椒疫霉病菌调控胞外囊泡分泌关键蛋白的活性或使其灭活；

其中，所述降低辣椒疫霉病菌的活性为降低辣椒疫霉病菌对寄主的侵染能力和/或对寄主的致病性，和/或者降低辣椒疫霉病菌的菌丝生长速度，和/或抑制辣椒疫霉病菌的孢子囊和/或游动孢子的产量，和/或使辣椒疫霉胞外囊泡分泌；

所述辣椒疫霉病菌调控胞外囊泡分泌关键蛋白的氨基酸序列为序列2或序列4所示。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：通过对辣椒疫霉中序列表中序列1或序列3所示的基因进行基因敲除，以使序列表中序列2或序列4所示的蛋白质灭活。