CN111979210A

CN111979210A - 辣椒疫霉纤维素合酶蛋白及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN111979210A
Application number: CN202010896372.2A
Authority: CN
Inventors: 刘西莉; 李腾蛟; 王为镇; 张灿; 薛昭霖; 沈婧欢; 张思聪; 黄中乔
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2020-08-31
Filing date: 2020-08-31
Publication date: 2020-11-24

Abstract

本发明公开了一种来自辣椒疫霉菌的纤维素合酶蛋白PcCesA2和PcCesA4及其编码基因与应用。本发明的纤维素合酶蛋白序列为如序列3或序列4。PcCesA2蛋白缺失后辣椒疫霉菌丝生长减慢、休止孢畸形膨大且萌发率降低、细胞壁结构变化、菌落形态改变、致病力降低等；PcCesA4蛋白缺失后辣椒疫霉菌丝生长减慢、游动孢子数量减少、致病力降低等；PcCesA2和PcCesA4蛋白同时缺失后辣椒疫霉菌丝生长减慢、游动孢子数量减少、休止孢畸形膨大且萌发率降低、细胞壁结构变化、菌落形态改变、致病力降低等。以上结论均为探究辣椒疫霉发育及致病分子机制提供了技术基础，为未来新型杀菌剂的研发提供了分子靶标。

Description

辣椒疫霉纤维素合酶蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及来自辣椒疫霉(Phytophthora capsici)的纤维素合酶蛋白PcCesA2和PcCesA4及其编码基因与应用。

背景技术

辣椒疫霉是一种世界性分布的重要植物病原卵菌，可以侵染茄科、豆科、葫芦科等多种植物，引起猝倒、萎蔫及根茎果实腐烂，造成严重经济损失。该病菌于1918年首次发现，已在美洲、欧洲、亚洲等世界各地造成了许多蔬菜上严重的病害流行。20世纪60年代，该病害在我国江苏省首次发现，目前已在中国南北方广泛发生，且有逐年加重的趋势。辣椒疫霉可在寄主的任何生长时期侵染，两到三天就可发生一代，是一种发病周期短流行速度迅猛的毁灭性病害，因其重要性被归为十大卵菌病害之一，受到国内外学者广泛关注和研究。

卵菌细胞壁作为细胞与外界接触的最外层结构，在其生长发育过程中发挥着重要作用，如提供机械强度保护内层细胞，维持渗透压平衡，信息交流等等。卵菌细胞壁生物合成抑制剂，能够通过抑制细胞壁的合成达到抑制卵菌生长发育和侵染寄主的效果，可以成为卵菌病害防治的有效措施。游动孢子作为卵菌再侵染的重要来源，当其附着于寄主可转变为休止孢，进一步萌发形成菌丝，直接侵入或通过伤口或自然孔口侵入寄主，这一过程伴随着卵菌细胞壁的形成和结构变化，对于卵菌成功侵染寄主至关重要。卵菌细胞壁的主要组成为β-1,4糖苷键连接的纤维素，β-1,3葡聚糖及β-1,6葡聚糖，其中纤维素可占整个细胞壁多糖的30％以上。因此，通过抑制辣椒疫霉细胞壁纤维素的合成，进而抑制其生长发育和侵染过程，可以达到控制辣椒疫病的目的。

发明内容

通过发明人的研究发现，辣椒疫霉中的纤维素合酶蛋白与辣椒疫霉细胞壁结构变化，菌丝的生长速率、游动孢子的产量、休止孢萌发以及菌落正常的结构形态密切相关，而植物病害正常的侵染循环与菌丝的细胞壁结构变化，菌丝的生长速率、游动孢子的产量、休止孢萌发以及存活时间呈正相关。因此可以通过调控纤维素合酶蛋白来破坏细胞壁的结构，减慢菌丝的生长、阻断正常的游动孢子产生，降低休止孢的萌发率，使辣椒疫霉生长发育和侵染寄主的能力减弱，从而控制辣椒疫病的发生发展。

因此，本发明的目的之一是提供一类辣椒疫霉纤维素合酶蛋白，命名为PcCesA2和PcCesA4，来源于辣椒疫霉菌株BYA5，是如下A1)或A2)或A3)或A4)：

A1)氨基酸序列是如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的蛋白质；

A2)在如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

A3)将如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的蛋白衍生的蛋白质；

A4)与如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列相似性在75％以上，优选在85％以上，更优选在95％以上且具有与如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列相同功能的氨基酸序列。

为了使A1)中的蛋白便于纯化，可在如序列表中SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上Poly-Arg(RRRRR)、Poly-His(HHHHHH)、FLAG(DYKDDDDK)、Strep-tag II(WSHPQFEK)、c-myc(EQKLISEEDL)等标签。

上述A1)-A4)中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述A2)-A4)中蛋白质的编码基因可通过将序列表中SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个核苷酸对的错义突变，和/或在其5’端和/或3’端连上述标签的编码序列得到。

其中，序列表中SEQ ID NO.3(PcCesA2)由1026个氨基酸残基组成，序列4(PcCesA4)由1019个氨基酸残基组成。

本发明目的之二是提供编码所述纤维素合酶蛋白的核酸分子。所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。

其中，上述纤维素合酶蛋白的编码基因为如下B1)或B2)或B3)：

B1)序列表中SEQ ID NO.序列1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.9所述的核苷酸序列所示的DNA分子；

B2)与B1)所示的核苷酸序列的具有75％以上或85％以上或95％以上同一性，且编码上述纤维素合酶蛋白的cDNA分子或DNA分子；

B3)在严格条件下与B1)或B2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述纤维素合酶蛋白的cDNA分子或DNA分子。

上述编码基因，序列表中SEQ ID NO.1由3081个核苷酸组成，自序列1的5’端第1-3081位核苷酸为编码序列，编码序列表中SEQ ID NO.3所示的蛋白质(PcCesA2)；序列表中SEQ ID NO.2由3129个核苷酸组成，自SEQ ID NO.2的5’端第1-1014位、第1084-3129位核苷酸为编码序列，编码序列表中SEQ ID NO.4所示的蛋白质(PcCesA4)。

所述的RNA分子，是所述的编码基因转录得到的RNA分子；

优选的，所述RNA分子的序列为如下C1)或C2)：

C1)如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的DNA序列转录的RNA序列的相似性在75％以上，进一步优选在85％以上，更优选在95％以上且具有与如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的DNA序列转录的RNA序列相同功能的RNA序列；

C2)如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的DNA序列转录的RNA序列。

如本发明的DNA序列在严格条件下与如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或SEQ IDNO.9所示DNA序列能够进行分子杂交且编码如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示纤维素合酶蛋白的DNA序列。上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

本发明目的之三是提供以上所述核酸分子相关的生物材料，包括重组载体、表达盒、重组微生物或转基因植物细胞系。所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体；所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌；所述转基因植物细胞系不包括繁殖材料。具体的可为如下为下述D1)至D10)中的任一种：

D1)含有权利要求2所述编码基因的表达盒；

D2)含有权利要求2所述编码基因的重组载体、或含有D1)所述表达盒的重组载体；

D3)含有权利要求2所述编码基因的重组微生物、或含有D1)所述表达盒的重组微生物、或含有D2)所述重组载体的重组微生物；

D4)含有权利要求2所述编码基因的转基因植物细胞系、或含有D1)所述表达盒的转基因植物细胞系；

D5)含有权利要求2所述编码基因的转基因植物组织、或含有D2)所述表达盒的转基因植物组织；

D6)含有权利要求2所述编码基因的转基因植物器官、或含有D2)所述表达盒的转基因植物器官；

D7)抑制权利要求2所述编码基因表达或使其缺失的核酸分子；

D8)含有D7)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系；

D9)抑制上述RNA分子翻译的核酸分子；

D10)产生D9)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。

所述D7)中，抑制所述编码基因表达或使其缺失的核酸分子包括用于敲除所述编码基因的核酸分子，如编码基因上下游片段，如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示的片段，也可以为编码表达靶向待敲除目的基因的sgRNA片段，如靶向于PcCesA2基因的sgRNA序列(编码序列)为GAGCTGGAAACATTATTGAG，靶向于PcCesA4基因的sgRNA序列(编码序列)为GCCAAGAACACGATGAGGTT。

D8)中所述的重组载体可以包括基于CRISPR/Cas9的基因敲除法是将目的基因的Donor载体和sgRNA及Cas9蛋白表达质粒；所述Donor载体为含有依次连接的待敲除目的基因上游800-1500bp的序列、Dodor DNA序列(可以为NPTII或GFP或RFP等基因序列)和待敲除目的基因的下游800-1500bp的序列的重组载体。

sgRNA及Cas9蛋白共表达质粒为编码表达靶向待敲除目的基因的sgRNA片段和表达Cas9蛋白的DNA序列的载体，其中，所述待敲除目的基因为PcCesA2和或PcCesA4基因，靶向于PcCesA2基因的sgRNA序列(编码序列)为GAGCTGGAAACATTATTGAG，靶向于PcCesA4基因的sgRNA序列(编码序列)为GCCAAGAACACGATGAGGTT。

优选的，所述sgRNA及Cas9共表达质粒是以pYF515载体为出发载体，将PcCesA2和PcCesA4基因的sgRNA退火得到的双链sgRNA编码序列，插入pYF515载体的Nhe I和Bsa I酶识别位点之间，得到sgRNA及Cas9共表达质粒。

本发明目的之四是提供一组成套使用的辣椒疫霉病菌纤维素合酶蛋白组合或者DNA组合，是下述E1)或E2)：

E1)由序列表中SEQ ID NO.3所示的蛋白质、序列表中SEQ ID NO.4所示的蛋白质的组合；

E2)由序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA分子、序列表中SEQ ID NO.2所示的DNA分子的组合。

本发明目的之五是提供辣椒疫霉纤维素合酶蛋白及编码纤维素合酶蛋白的核酸分子或含有编码纤维素合酶蛋白的核酸分子的生物材料的应用。

所述应用为下述1)-6)中任一种或几种：

1)在调控(提高或降低)辣椒疫霉游动孢子产量和/或休止孢萌发率、和/或维持或破坏休止孢野生型形态(使休止孢形态改变，如膨大)中的应用；

2)在维持或破坏辣椒疫霉细胞壁正常形态结构和菌落形态中应用；

3)在调控(提高或降低)辣椒疫霉菌丝生长速率中的应用；

4)在调控(提高或降低)辣椒疫霉侵染寄主能力中的应用；

5)在调控(提高或降低)辣椒疫霉对寄主的致病性中的应用；

6)在抑制和/或杀灭辣椒疫霉病菌中的应用；

优选的，其中，所述应用中，包括通过抑制SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2所述的编码基因中的一种或两种组合的转录或使其灭活，或抑制所述的RNA分子一种或两种组合的翻译，或抑制和/或灭活序列表中SEQ ID NO.3和/或SEQ ID NO.4所述的纤维素合酶蛋白中的一种或两种组合的活性来实现1)-6)所述的应用。

所述应用中，通过抑制如上述的编码基因的转录，或抑制上述的RNA序列的翻译，或抑制和/或失活上述纤维素合酶蛋白的活性来调控(降低)辣椒疫霉病菌游动孢子产量，和/或抑制休止孢萌发，和/或降低菌丝生长速率，和/或破坏细胞壁结构及菌落形态，和/或降低对寄主的侵染能力和/或对寄主的致病性(致病力)，从而能够抑制或杀灭辣椒疫霉病菌。

优选的，所述应用为将辣椒疫霉SEQ ID NO.3所示的PcCesA2蛋白缺失后使辣椒疫霉菌落形态改变、和/或菌丝生长减慢、和/或使休止孢畸形膨大且萌发率降低、和/或细胞壁结构变化、和/或致病力降低等；将辣椒疫霉SEQ ID NO.4所示的PcCesA4蛋白缺失后使辣椒疫霉菌丝生长减慢、和/或游动孢子数量减少、和/或致病力降低等；PcCesA2蛋白和PcCesA4蛋白同时缺失后是辣椒疫霉菌落形态改变、和/或菌丝生长减慢、和/或游动孢子数量减少、和/或使休止孢畸形膨大且萌发率降低、和/或细胞壁结构变化、和/或致病力降低等。

本发明目的之六是提供所述序列表中SEQ ID NO.3和/或SEQ ID NO.4所示的纤维素合酶蛋白、所述序列表中SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2所示的编码基因或上述RNA分子或上述生物材料或如权利要求5所述的蛋白组合或者DNA组合在作为抑菌或杀菌剂靶标筛选辣椒疫霉病菌抑菌和/或杀菌剂中的应用；所述抑菌或杀菌剂可通过抑制或者灭活辣椒疫霉SEQ ID NO.3所示的PcCesA2蛋白使辣椒疫霉菌落形态改变、和/或菌丝生长减慢、和/或使休止孢畸形膨大且萌发率降低、和/或细胞壁结构变化、和/或致病力降低、和/或对羧酸酰胺类杀卵菌剂更为敏感等；或者通过抑制或者灭活辣椒疫霉SEQ ID NO.4所示的PcCesA4蛋白使辣椒疫霉菌丝生长减慢、和/或游动孢子数量减少、和/或致病力降低等；PcCesA2蛋白和PcCesA4蛋白同时缺失后是辣椒疫霉菌落形态改变、和/或菌丝生长减慢、和/或游动孢子数量减少、和/或使休止孢畸形膨大且萌发率降低、和/或细胞壁结构变化、和/或致病力降低等。

本发明目的之七是提供一种筛选或辅助筛选辣椒疫霉抑菌和/或杀菌剂的方法，所述方法包括将待检测物应用于所述辣椒疫霉病菌，当所述待检测物能够抑制如上任意一种DNA序列或两种DNA序列任意组合的转录，或抑制如上任意一种RNA序列或两种RNA序列任意组合的翻译，或抑制和/或失活如上所示的任意一种纤维素合酶蛋白或两种蛋白任意组合的活性，则所述待测物质为候选的植物辣椒疫霉抑菌和/或杀菌剂。

本发明目的之八是提供一种降低辣椒疫霉病菌的活性的方法，包括下述步骤：抑制如上述的编码基因中的一种或两种组合的转录，或抑制所述的RNA分子中的一种或两种组合的翻译，或抑制和/或失活如上所述的纤维素合酶蛋白中一种或两种组合的活性；

其中，所述降低辣椒疫霉病菌的活性为降低辣椒疫霉病菌对寄主的侵染能力和/或对寄主的致病性(致病力)，和/或抑制(降低)辣椒疫霉病菌的游动孢子产量，和/或抑制休止孢萌发和/或使休止孢变异(如膨大)，和/或者降低辣椒疫霉病菌的菌丝生长速度，和/或使辣椒疫霉细胞壁结构及菌落形态畸形。

上述方法中，通过所述抑制或降低待抑制活性或待灭活的蛋白的编码基因表达来实现蛋白的灭活，具体的，可通过基因敲除或通过基因沉默实现。

所述基因敲除是指通过同源重组使特定靶基因失活的现象。基因敲除是通过DNA序列的改变使特定靶基因失活。

所述基因沉默是指在不损伤原有DNA的前提下使基因不表达或低表达的现象。基因沉默可发生在两种水平上，一种是由于DNA甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平的基因沉默，另一种是转录后基因沉默，即在基因转录后的水平上通过对靶标RNA进行特异性抑制而使基因失活，包括反义RNA、共抑制(co-suppression)、基因压抑(quelling)、RNA干扰(RNAi)和微小RNA(miRNA)介导的翻译抑制等。

优选的，通过使辣椒疫霉中序列表中SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2所示的基因进行基因敲除，以使所述序列表中SEQ ID NO.3和/或SEQ ID NO.4所示的蛋白质所示的蛋白质灭活；

在本发明的一个实施方式中，使上述基因进行基因敲除的方法是基于CRISPR/Cas9的基因敲除法。

具体的，基于CRISPR/Cas9的基因敲除法是将目的基因的Donor载体和sgRNA及Cas9蛋白表达质粒转染辣椒疫霉筛选得到所述目的敲除蛋白灭活的重组菌。

所述Donor载体为含有依次连接的待敲除目的基因上游800-1500bp的序列、DodorDNA序列(可以为NPTII或GFP或RFP等基因序列)和待敲除目的基因的下游800-1500bp的序列的重组载体。

sgRNA及Cas9蛋白共表达质粒为编码表达靶向待敲除目的基因的sgRNA片段和表达Cas9蛋白的DNA序列的载体，其中，所述待敲除目的基因为PcCesA2或PcCesA4基因，靶向于PcCesA2基因的sgRNA序列(编码序列)为GAGCTGGAAACATTATTGAG，靶向于PcCesA4基因的sgRNA序列(编码序列)为GCCAAGAACACGATGAGGTT。

抑制纤维素合酶蛋白质表达和/或活性的物质在制备植物辣椒疫霉病菌抑菌或杀菌剂中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述抑制纤维素合酶蛋白质表达和/或活性的物质为抑制纤维素合酶蛋白质表达和/或抑制纤维素合酶蛋白质的编码基因的转录和/或抑制纤维素合酶蛋白质的编码基因转录得到的RNA分子的翻译的物质。

试验证明，本发明所提供的纤维素合酶蛋白在辣椒疫霉自身生长发育过程中起作用。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得的敲除突变体，其生长发育较野生型亲本菌株而言有明显变化，主要包括：PcCesA2蛋白缺失后辣椒疫霉菌落形态改变、菌丝生长减慢、休止孢畸形膨大且萌发率降低、细胞壁结构变化、致病力降低等；PcCesA4蛋白缺失后辣椒疫霉菌丝生长减慢、游动孢子数量减少、致病力降低等；PcCesA2和PcCesA4蛋白同时缺失后辣椒疫霉菌丝生长减慢、游动孢子数量减少、休止孢畸形膨大且萌发率降低、细胞壁结构变化、菌落形态改变、致病力降低等；因此，辣椒疫霉病菌中纤维素合酶蛋白在辣椒疫霉营养生长、无性生殖及侵染寄主等过程均可发挥重要作用。本发明为辣椒疫霉病菌的致病机制研究提供了技术支持，并为未来新型杀菌剂的研发提供了有潜力的分子靶标。

附图说明

图1为辣椒疫霉菌株BYA5(WT)，PcCesA2敲除转化子菌株(ΔC2-1、ΔC2-2、ΔC2-3、ΔC2-4、ΔC2-5)的菌丝生长速率(图1A)、游动孢子萌发率(图1B)、致病力(图1C)和休止孢直径(图1D)测定结果柱状图。

图2为辣椒疫霉菌株BYA5(WT)，PcCesA2敲除转化子菌株的致病力图片。

图3为辣椒疫霉菌株BYA5(WT，图3A)，PcCesA2敲除转化子菌株(图3B)萌发的休止孢。

图4为辣椒疫霉菌株BYA5(WT，图4A)，PcCesA2敲除转化子菌株(图4B)细胞壁透射电镜观察。辣椒疫霉菌株BYA5(WT，图4C)，PcCesA2敲除转化子菌株(图4D)菌落形态观察。

图5为辣椒疫霉菌株BYA5(WT)，PcCesA4敲除转化子菌株菌丝生长速率(图5A)、游动孢子产量(图5B)和致病力(图5C)测定结果柱状图。

图6为辣椒疫霉菌株BYA5(WT)，PcCesA4敲除转化子菌株的致病力图片。

图7为辣椒疫霉菌株BYA5(WT)，PcCesA2PcCesA4双敲除转化子菌株(ΔC2ΔC4-12、ΔC2ΔC4-25、ΔC2ΔC4-26、ΔC2ΔC4-64)的菌丝生长速率(图7A)、游动孢子数量(图7B)、致病力(图7C)和游动孢子的萌发率(图7D)测定结果柱状图。

图8为辣椒疫霉菌株BYA5(WT，图8A)，PcCesA2PcCesA4双敲除转化子菌株(图8B)萌发的休止孢，及其休止孢直径(图8C)测定结果柱状图。

图9为辣椒疫霉菌株BYA5(WT)，PcCesA2PcCesA4双敲除转化子菌株的致病力图片。

图10为辣椒疫霉菌株BYA5(WT，图10A)，PcCesA2PcCesA4双敲除转化子菌株(图10B)细胞壁透射电镜观察。辣椒疫霉菌株BYA5(WT，图10C)，PcCesA2PcCesA4双敲除转化子菌株(图10D)菌落形态观察。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

辣椒疫霉菌株BYA5：中国农业大学植物保护学院种子病理与杀菌剂药理实验室保存，在文献“Wang,W.,et al.,PcMuORP1,an Oxathiapiprolin-Resistance Gene,Functions as a Novel Selection Marker for Phytophthora Transformation andCRISPR/Cas9 Mediated Genome Editing.Frontiers in Microbiology,2019.10.”中公开过，公众可从中国农业大学获得。

培养基或试剂配方：

10％V8固体培养基：100ml V8蔬菜汁，1.4g CaCO₃，搅拌混匀，用去离子水稀释10倍，即加入去离子水定容至1L，添加15g琼脂，121℃高压湿热灭菌20min。

10％V8液体培养基：100ml V8蔬菜汁，1.4g CaCO₃，搅拌混匀，12000rpm离心5min，取上清，用去离子水稀释10倍，121℃高压湿热灭菌20min。

营养豌豆培养基(Nutrient pea broth，NPB)：125g豌豆加入1L去离子水，121℃高压湿热灭菌20min，纱布过滤获得豌豆营养液；称量2.0g酵母提取物、5.0g葡萄糖、5.0g甘露醇、5.0g山梨醇、2.0g CaCO₃、0.1g CaCl₂、0.5g MgSO₄、3.0g KNO₃、1.0g K₂HPO₄、1.0gKH₂PO₄，搅拌混匀，3000rpm离心10min或静置30min，取上清，用豌豆营养液定容至1L，固体培养基(NPBA)添加15g琼脂粉，湿热灭菌20min。使用前，在无菌操作台中，添加2ml维生素储液(Biotin 6.7×10^-7g/ml；Folic acid 6.7×10^-7g/ml；L-inositol 4.0×10^-5g/ml；Nicotinic acid 4.0×10^-5g/ml；Pyridoxine-HCl 6.0×10^-4g/ml；Riboflavin 5.0×10^- ⁵g/ml；Thiamine-HCl 1.3×10^-3g/ml)以及2ml微量元素储液(FeC₆H₅O₇·3H₂O 5.4×10^-4g/ml；ZnSO₄·7H₂O 3.8×10^-4g/ml；CuSO₄·5H₂O 7.5×10^-4g/ml；MgSO₄·H₂O 3.8×10^-5g/ml；H₃BO₃ 2.5×10^-5g/ml；Na₂MoO₄·H₂O 3.0×10^-5g/ml)。

豌豆甘露醇培养基(Pea Mannitol，PM)：准确称量91.1g甘露醇，1g CaCl₂，2gCaCO₃，加入大约900ml豌豆营养液，搅拌混匀约30min，3000rpm离心10min或静置30min，取上清，用豌豆营养液定容至1L，固体培养基(PMA)添加15g琼脂粉，湿热灭菌20min。

菌丝酶解液(20ml)：10ml 0.8M甘露醇，0.8ml 0.5M KCl，0.8ml 0.5M 4-吗啉乙磺酸，0.4ml 0.5M CaCl₂，0.12g纤维素酶(Calbiochem,cat.No.219466)，0.12g裂解酶(Sigma，cat.No.L1412)，无菌超纯水定容至20ml，轻柔混匀溶解，0.22μm滤膜过滤灭菌，现用现配。

MMG溶液(250ml)：18.22g甘露醇，0.76g MgCl₂·6H₂O，2.0ml 0.5M 4-吗啉乙磺酸(pH＝5.7)，超纯水定容至250ml，0.22μm滤膜过滤灭菌。

W5溶液：0.1g KCl，4.6g CaCl₂·2H₂O，2.25g NaCl，7.8g葡萄糖，超纯水溶解定容至250ml，0.22μm滤膜过滤灭菌。

PEG-CaCl₂溶液(40％w/v)：12g PEG 4000，3.75ml 0.5M CaCl₂，3ml无菌超纯水，0.22μm滤膜过滤灭菌。

实施例1、辣椒疫霉纤维素合酶蛋白PcCesA2和PcCesA4及其编码基因的获得

本实施例中辣椒疫霉纤维素合酶蛋白PcCesA2和PcCesA4及其编码基因(或cDNA)可以辣椒疫霉菌株BYA5的DNA(或cDNA)为模板，通过表1所列引物扩增获得。其中，DNA或RNA提取的材料可以为辣椒疫霉菌株BYA5的菌丝体。其中，以辣椒疫霉菌株BYA5的DNA为模板用PcCesA2-F1和PcCesA2-R1扩增得到PcCesA2的编码基因PcCesA2，如序列表中SEQ ID NO.1所示，SEQ ID NO.1由3081个核苷酸组成，自SEQ ID NO.1的5’端第1-3081位核苷酸为编码序列，编码序列表中SEQ ID NO.3所示的蛋白质(PcCesA2)，以辣椒疫霉菌株BYA5的cDNA为模板用PcCesA2-F1和PcCesA2-R1扩增得到PcCesA2的cDNA，其序列与编码基因序列相同，如SEQ ID NO.1所示；以辣椒疫霉菌株BYA5的DNA为模板用PcCesA4-F1和PcCesA4-R1扩增得到PcCesA4的编码基因PcCesA4，如序列表中SEQ ID NO.2所示，序列表中SEQ ID NO.2由3129个核苷酸组成，自SEQ ID NO.2的5’端第1-1014位、第1084-3129位核苷酸为编码序列，编码序列表中SEQ ID NO.4所示的蛋白质(PcCesA4)，以辣椒疫霉菌株BYA5的cDNA为模板用PcCesA4-F1和PcCesA4-R1扩增得到PcCesA2的cDNA，其序列如序列表中SEQ ID NO.9所示。上述蛋白或基因也可以人工合成。

表1.PcCesA2和PcCesA4全长编码基因扩增引物

实施例2、辣椒疫霉PcCesA2和PcCesA4基因敲除载体的构建

本实施例中基于CRISPR/Cas9的基因敲除载体构建方法以及相关载体的序列以及NPT II基因序列在文献“Fang,Y.,and Tyler,B.M.(2016).Efficient disruption andreplacement of an effector gene in the oomycete Phytophthora sojae usingCRISPR/Cas9.Molecular plant pathology,17(1),127-139.”以及“Fang,Y.,Cui,L.,Gu,B.,Arredondo,F.,and Tyler,B.M.(2017).Efficient genome editing in the oomycetePhytophthora sojae using CRISPR/Cas9.Curr.Protoc.Microbiol.44,21A.1.1-21A.1.26.”中公开过。本实施例中使用的pBluescript II SK+同源臂载体质粒(Donor载体)，sgRNA及Cas9共表达质粒PYF515均由美国俄勒冈州立大学Brett M.Tyler教授馈赠。

本实例中使用的插入片段PcMuORP1的基因序列在文献“Wang,W.,Xue,Z.,Miao,J.,Cai,M.,Zhang,C.,Li,T.,Zhang,B.,Tyler,B.M.and Liu,X.(2019)PcMuORP1,anOxathiapiprolin-Resistance Gene,Functions as a Novel Selection Marker forPhytophthora Transformation and CRISPR/Cas9 Mediated GenomeEditing.Front.Microbiol.10,2402.”中公开过。

本实施方式中所用的Donor载体pBS-NPTII-CesA2和pBS-NPTII-CesA4；sgRNA及Cas9共表达质粒pYF515-CesA2和pYF515-CesA4；以及带有氟噻唑吡乙酮筛选标记的共表达质粒pYF515-PcMuORP1-CesA4具体构建方法如下所述：

1)pBS-NPTII-CesA2的构建：以辣椒疫霉菌株BYA5的DNA为模板，利用TaKaRa-In-Fusion_Tools在线网站(http://www.clontech.com/US/Products/Cloning_and_Competent_Cells/Cloning_Resources/Onli ne_In-Fusion_Tools)设计引物扩增目的基因PcCesA2上游1000bp序列(序列表中序列5所示，经如表2所示pBS-NPTII-CesA2-F1和pBS-NPTII-CesA2-R1所示引物扩增获得)、NPTII基因序列(NPTII基因是以pYF515骨架质粒为模板用引物序列如表2所示pBS-NPTII-CesA2-F2和pBS-NPTII-CesA2-R2扩增获得的片段)、PcCesA2下游1000bp序列(序列表中序列6所示，经引物序列如表2所示pBS-NPTII-CesA2-F3和pBS-NPTII-CesA2-R3的引物扩增获得)，利用

HD Cloning Kit将三个扩增片段依次融合连接入克隆载体pBluescript II SK+(EcoR V酶切)，连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，37℃过夜培养后，挑取单克隆，使用通用引物M13F(序列：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’)/M13R(序列：5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’)扩增、测序验证克隆，将验证正确的含有依次连接的PcCesA2上游1000bp序列、NPTII基因序列和PcCesA2下游1000bp序列的重组表达载体命名为pBS-NPTII-CesA2。

2)pBS-NPTII-CesA4的构建：如1)中所描述的步骤，将目的基因PcCesA4上游1000bp序列(序列表中序列7所示，经序列如表2所示的引物pBS-NPTII-CesA4-F1和pBS-NPTII-CesA4-R1扩增获得)、NPTII基因序列(NPTII基因是以PYF515骨架质粒为模板用引物序列如表2所示pBS-NPTII-CesA4-F2和pBS-NPTII-CesA4-R2扩增获得的片段)、PcCesA4下游1000bp序列(序列表中序列8所示，经序列如表2所示引物pBS-NPTII-CesA4-F3和pBS-NPTII-CesA4-R3扩增获得)依次融合连接入骨架载体pBluescript II SK+(EcoR V酶切)中，并测序验证阳性克隆，将验证正确的含有依次连接的PcCesA4上游1000bp序列、NPTII基因序列和PcCesA4下游1000bp序列的重组表达载体命名为pBS-NPTII-CesA4。

3)pYF515-CesA2的构建：利用sgRNA设计网站EuPaGDT(http://grna.ctegd.uga.edu/)以及RNA结构在线分析工具(http://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/Servers/Predict1/Predict1.html)，选择特异性靶向PcCesA2基因且形成二级结构较弱的sgRNA序列(sgCesA2：GAGCTGGAAACATTATTGAG，靶向于PcCesA2基因的SEQID No.1的第557-576位核苷酸序列)，送至公司合成带有Nhe I和Bsa I酶切位点以及HHribozyme的正反向sgRNA序列引物。用无菌水溶解成100μM溶液。退火反应合成双链sgRNA序列，反应体系：3μl正义链溶液，3μl反义链溶液，3μl 10×T4 DNA Ligase Buffer(NEB)，4μl0.5M NaCl，21μl超纯无菌水，吸打混匀，100℃反应2min，放至室温自然冷却4h，之后将反应液稀释500倍。再取2μl 10×T4 DNA Ligase Buffer(NEB)，50ng pYF515载体(Nhe I/Bsa I双酶切)，4μl稀释后的双链sgRNA溶液，1μl T4 DNA Ligase，无菌超纯水补齐至20μl，室温反应30min，使用5μl连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，37℃过夜培养后，使用引物对RPL41_Pseq_F(序列：5’-CAAGCCTCACTTTCTGCTGACTG-3’)/M13F(序列：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’)进行菌落PCR验证，并测序验证阳性克隆，将验证正确可表达上述sgRNA的重组载体命名为pYF515-CesA2。

4)pYF515-CesA4的构建：按照如3)中所描述的步骤，将设计的sgRNA序列(sgCesA4：GCCAAGAACACGATGAGGTT，靶向于PcCesA4基因的SEQ ID No.2第2752-2771位反向互补的反义链上的序列)连入pYF515载体(Nhe I/Bsa I双酶切)中，并测序验证阳性克隆，将验证正确的重组载体命名为pYF515-CesA4。

5)pYF515-PcMuORP1-CesA4的构建：利用TaKaRa-In-Fusion_Tools在线网站(网址同1)设计引物(如表2所示PcMuORP1-F1和PcMuORP1-R1)扩增PcMuORP1基因序列，利用

HD Cloning Kit将PcMuORP1连接入如7)中构建的载体pYF515-CesA4(Pac I/NotI双酶切)，连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，37℃过夜培养后，使用引物Resg-F(序列：5’-ACTCGCCCACGATCGGAAGG-3’)和Resg-R(序列：5’-CACAAAATCTGCAACTTCGC-3’)进行菌落PCR验证，并测序验证阳性克隆，将验证正确的重组载体命名为pYF515-PcMuORP1-CesA4。

表2.用于载体构建的引物序列

实施例3、辣椒疫霉PcCesA2和PcCesA4单基因敲除和双基因敲除转化子的获得

采用PEG-CaCl₂介导的原生质体转化方法制备PcCesA2、PcCesA4单基因敲除和双基因敲除转化子，卵菌遗传转化的方法在文献“Fang,Y.,and Tyler,B.M.(2016).Efficient disruption and replacement of an effector gene in the oomycetePhytophthora sojae using CRISPR/Cas9.Molecular plant pathology,17(1),127-139.”中公开过。

单基因敲除转化子的获得具体为将实施例1中获得的敲除基因PcCesA2或PcCesA4的Donor载体、sgRNA及Cas9共表达质粒(pBS-NPTII-CesA2和pYF515-CesA2、或者pBS-NPTII-CesA4和pYF515-CesA4)分别转入辣椒疫霉BYA5的原生质体中，将生长出的转化子经G418抗性V8固体培养基平板25℃培养筛选，收集疑似转化子的菌丝体，提取DNA进行PCR测序验证，将阳性转化子再提取RNA进行Q-PCR验证。获得PcCesA2敲除转化子(ΔC2-1、ΔC2-2、ΔC2-3、ΔC2-4、ΔC2-5)和PcCesA4敲除转化子系列菌株(ΔC4-1、ΔC4-2、ΔC4-3、ΔC4-4、ΔC4-5)。

双敲除转化子的获得具体为将实施例1中获得的PcCesA4基因的载体质粒(Donor载体pBS-NPTII-CesA4、sgRNA及Cas9共表达质粒pYF515-PcMuORP1-CesA4)转入辣椒疫霉PcCesA2单敲除转化子ΔC2-3的原生质体中，将生长出的转化子经氟噻唑吡乙酮抗性V8固体培养基平板25℃培养筛选，收集疑似转化子的菌丝体，提取DNA进行PCR测序验证；提取RNA进行Q-PCR验证。经过验证，获得了辣椒疫霉PcCesA2蛋白和PcCesA4蛋白缺失的双敲除转化子系列菌株(ΔC2ΔC4-12、ΔC2ΔC4-25、ΔC2ΔC4-26、ΔC2ΔC4-64)。

实施例4、辣椒疫霉PcCesA2敲除转化子和PcCesA4敲除转化子的生物学形状分析一、菌丝生长速率检测

将野生型辣椒疫霉菌株BYA5(WT)和实施例3得到的敲除转化子：PcCesA2敲除转化子(ΔC2-1、ΔC2-2、ΔC2-3、ΔC2-4、ΔC2-5)，PcCesA4敲除转化子系列菌株(ΔC4-1、ΔC4-2、ΔC4-3、ΔC4-4、ΔC4-5)和PcCesA2PcCesA4双敲除转化子系列菌株(ΔC2ΔC4-12、ΔC2ΔC4-25、ΔC2ΔC4-26、ΔC2ΔC4-64)分别接种于加有15ml V8固体培养基的无菌培养皿(直径9cm)中央，25℃黑暗条件下培养3天，用十字交叉法测量各菌株的菌落直径，每个菌株3次重复。同时取各菌株菌落边缘菌丝，进行菌丝细胞壁透射电镜观察。打取各菌株菌落边缘菌丝菌饼，直径5mm，接种于含300mL液体V8培养基的三角瓶中，25℃温度下，120rpm摇培3天，观察菌落形态。

结果显示，所有测定的PcCesA2敲除转化子菌株的菌丝生长速率(图1A)，PcCesA4敲除转化子菌株的菌丝生长速率(图5A)和PcCesA2PcCesA4双敲除转化子菌株(图7A)与野生型辣椒疫霉菌株BYA5(WT)相比显著下降。PcCesA2敲除转化子和PcCesA2PcCesA4双敲除转化子的细胞壁与BYA5相比，内层有所加厚(图4A、4B和图10A、10B)。PcCesA2敲除转化子的菌落形态与BYA5相比，出现畸形改变(图4C、4D和图10C、10D)。实验结果说明所述纤维素合酶蛋白PcCesA2和PcCesA4参与调控了辣椒疫霉的菌丝生长。纤维素合酶蛋白PcCesA2可能参与调控了辣椒疫霉细胞壁结构组成和菌落正常形态构成。

二、游动孢子数量检测

将野生型辣椒疫霉菌株BYA5(WT)和实施例3得到的敲除转化子：PcCesA2敲除转化子(ΔC2-1、ΔC2-2、ΔC2-3、ΔC2-4、ΔC2-5)，PcCesA4敲除转化子系列菌株(ΔC4-1、ΔC4-2、ΔC4-3、ΔC4-4、ΔC4-5)和PcCesA2PcCesA4双敲除转化子系列菌株(ΔC2ΔC4-12、ΔC2ΔC4-25、ΔC2ΔC4-26、ΔC2ΔC4-64)，分别接种于加有15ml V8固体培养基的无菌培养皿(直径9cm)中央，25℃黑暗条件下培养3天，转入25℃光照条件下培养5天诱导产孢，之后加入10ml去离子水置于4℃条件30min后转入25℃条件30min释放游动孢子，将游动孢子悬浮液涡旋震荡1min使其停止游动，使用血球计数板通过显微镜观察的计数游动孢子的数量，每个菌株设置3次重复。

结果显示，与野生型辣椒疫霉菌株BYA5(WT)相比，实施例3得到的PcCesA4敲除转化子系列菌株和PcCesA2PcCesA4双敲除转化子系列菌株释放的游动孢子数量明显下降，说明纤维素合酶蛋白PcCesA4蛋白影响了辣椒疫霉游动孢子的数量(图5B和图7B)。

三、休止孢形态检测及萌发率统计

采用上述方法获得野生型辣椒疫霉菌株BYA5(WT)和实施例3得到敲除转化子的游动孢子悬浮液，于涡旋振荡器上振荡处理各菌株游动孢子悬浮液1min，即可获得辣椒疫霉休止孢悬浮液。用涂布器将100μL辣椒疫霉休止孢悬浮液均匀涂布至0.8％水琼脂平板，并将培养皿置于25℃黑暗培养3h，于光学显微镜下观察休止孢的形态，并随机检测每100个休止孢中萌发的休止孢个数，每个菌株设置3个重复。

结果显示，实施例3得到的PcCesA2敲除转化子和PcCesA2PcCesA4双敲除转化子系列菌株的游动孢子萌发率与野生型菌株BYA5(WT)相比显著降低。通过对休止孢直径进行统计分析发现，PcCesA2敲除转化子的休止孢直径显著增大，表现出畸形膨大现象(图3和图8)。说明纤维素合酶蛋白PcCesA2参与调控了辣椒疫霉游动孢子的萌发过程。

四、致病力检测

供试辣椒植株品种为牛角椒，种植于育苗盘中，培养基质为2：1配比的泥炭土和蛭石，生长至5～6片真叶期备用。

将野生型辣椒疫霉菌株BYA5(WT)，PcCesA2敲除转化子和PcCesA4敲除转化子系列菌株，分别接种于加有15ml V8固体培养基的无菌培养皿(直径9cm)中央，25℃黑暗条件下培养3天，在菌落边缘上打5mm菌饼。采集相同叶位辣椒叶片，于叶片中央接种一个菌饼，每株菌接种5个叶片，25℃黑暗保湿培养3d后，调查辣椒疫霉侵染辣椒叶片的病斑直径(mm)。

结果显示，与野生型辣椒疫霉菌株BYA5(WT)相比，实施例3得到的PcCesA2敲除转化子系列菌株的致病力(图1C和图2)，PcCesA4敲除转化子系列菌株的致病力(图5C和图6)和PcCesA2PcCesA4双敲除转化子系列菌株的致病力(图7C和图9)均出现下降。这说明纤维素合酶蛋白PcCesA2和PcCesA4具有参与调控辣椒疫霉侵染寄主植物的能力。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 辣椒疫霉纤维素合酶蛋白及其编码基因与应用

<130> WHOI201052

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3081

<212> DNA

<213> 辣椒疫霉(Phytophthora capsici)

<400> 1

atgtacggca acgacaagca gtcgcttatg aagcacgagg actacgagct gcacggcacc 60

cccgccacgg gcgacaacga cggcggtgct ggcttctacg cgcaggaagg tcgccccatg 120

atgcagcagg gctatgtgga tccacgtgga ccggcgctac ctcctatgaa cgtctcggac 180

gccgtgggac ttggcagcca gcgtgacaac atcatctcag ttcacggcta catgcacaag 240

cagggcaagc gcacgatcaa gggaccgatc cacaagagct ggaagaggcg ctacttcgcc 300

ctggagaagg ccaagattta ctacttccac tctcatttgg agtgccggca gtacttcacc 360

actcgtaacg ctgacctggt tgtcggtgcc atcgaactga aagacgctct gcagttgcgt 420

ccttgtgcac gtttggatct gccccataag ggttttgaag tccacacgaa gcgccgtgtg 480

tgggtgctgt gtcctgagac ggacgacgag taccgcatgt ggttccaggg cgtcgaacgc 540

gccattgtgg ccaacggagc tggaaacatt attgagcgga aactgcccaa cgtccgcaag 600

tatctgatga agggcaacca gacgtaccga ttcttctact tcctgttcct cattgccggt 660

atagtggaac tgctggcgat cgtgttctgg ttcgtgatcg gcttggagcc ttgtgacgcg 720

tcgcgcctgg aagttgactg tgaaacaatt acgatcacat ctttggaaac tctgcgttgc 780

tcggcccaac cgttcagcgg ttggtttacc ccgcccaact ggtatctgaa gatcgctgat 840

gtcgagaacg tacaatgttt ccgcgaccca cctattccgc agtgggtctc gtacttcgcc 900

atgctgttcg ctgagattct tacgttcgct ctaggcgttc tgtactacct tggaatgtgg 960

aagcctgttc gtcgtggcgc ccattacttc gacgagtttg agcctcctgt acccgatgag 1020

ctgtggccca aggtagatgt tctgctgtgc cattactctg aaccagctga agagacaatc 1080

gacacgttga tggcctgcat gaacctgcag tacccgcctc atcttctgca gatctgggtc 1140

tgtgatgatg gttactgcaa agccaagtgg accaagggca acccagtgcc gacggtggaa 1200

ctgaacaaag gcattttgga aactgctggt gatcttcgtc aagaagtggc tcagttcatg 1260

tatgaccgcg tgtgcgaccc caacgaggat atggaggtgt atgcgtggcg taagctacac 1320

tcgtccgcca atttgccgtc tccgtctcgc gtcaaggttg tgaaccgtgc ggactgtgcc 1380

gttggctcgt tccgcgacga ctaccgttat cctggtctac cgcacgtgac ttttattggc 1440

cgtgtgaagc cggatgtcca ctactcaaag gctggcaaca tcaataactg cctgtacaac 1500

gagggtgcca acggccgcta cctgatcatt ctggatacgg atatgcagcc ccacccgaag 1560

tttattcttg ctactctccc gttcttcttt gatgacgagg accgtcagga caaggccaag 1620

tacatttgct gtggtattgg ctgtaacgca gtggcgaagc tctgctgtgc atcgtgccag 1680

attgctggtg tccccgagga gcagatcagc tactgctcaa aggactgctt tgagaacgcc 1740

atgcacgtcc agagtgcagt tcaccgccgt caggtgaatg gcactatgag tgaaacccgc 1800

cagagcaaga ttgacatgcg ctgcatgaac tgtgattcta agctgcccaa gaacggtgtg 1860

tgccgtaagt gtggcaacaa gggtgctgat ggtgaggatg tgtcatcgct tcacacttac 1920

tcggacgacg tcaaggataa cgctgtggct ttcgttcaga cgcctcagta cttccgtgac 1980

tgcattcagc tccagattgg cgatccgatg ggccaccgta atgctacgtt ctatgacgcc 2040

atccagacag gccaggatgg ctacgactgt gcctcatttg ctggaacgaa cgcaatgttc 2100

cgtcgcgaag cacttgactc gattggtggc attcagtacg gtagtttgac ggaagattgc 2160

tacactggtc aggttttgtg ctctatgggc tggaaagcgc agtacttccg caaggatttc 2220

gaaggagaac cttcggagcg catccgtctg gctgaaggac ttattcctga ctcggtggct 2280

ggctcgcttg cgcagcgtaa acgttgggcg aagggtaact tccagatcgc cttgatgaac 2340

aagaagacgc agtactttga cccggagtgg aagctgccgg aggcgcaagt tccgtcgtac 2400

cacaagtcga acaagttcat gcgtcgcgtg ttttacttca actcgacgct gtacccgctc 2460

ggctcgatta ctgccattct gttctactac attacgctct acttcctgta ctcgggctac 2520

gctccgatct acatggctgg tgctcgtctg gtgtacgctt tggtgccgaa gctctttgtg 2580

cagggcgtgc tgtcggcgct gagcaaccgt acagtggaga acagcgatgt tattcgttct 2640

caggaggttt ggttcgcgta cgcattcacg aattgcacag ctgtgttgga agctttctgg 2700

tggaagatca cgggtaagga gcccaagtgg ttcaacactg gaggtgcgag ccgtggttca 2760

actgcggaac tacccaacgt gatcattttc ttcgggaccg tggtaggtgt gctgtggtct 2820

gtggtgcgtt tcctggctgg atacaacagc atccagacat cgcacggtgc gtcactgctg 2880

ttcgccagtc ttatgatggg tctgttcatc gccgtgaagc tggcgccgag cgtgcgtatg 2940

agcatccagg agtactttgg ctggagctac gagagtctga cggaccaggg caacgtcgtt 3000

ggctcgatct cgatcgcatt cggacttgtc ttcatcacgc tgtgggtctg gatcgaggag 3060

cccacatcca accccttcta a 3081

<210> 2

<211> 3129

<212> DNA

<213> 辣椒疫霉(Phytophthora capsici)

<400> 2

atggccaatc ggcaacctcc cggcctcgga gcgctcccgg aagacgctca gtacagccag 60

acgcctctgt ctggcgttca ataccacgaa cagctctctt ccgcggcggc cccaggcaag 120

aagctgttat ctcagtccac gatggacgtg cagaacacca tcaatgagct cacgaaggcc 180

aaggagcacg aggagctggg caaaatcaca gtccacggat ggatgcacaa gcagggcagt 240

cgcaagttca aaggccccgt ggcgaaaagc tggcgcaagc gctatttcgc ccttgaaggc 300

gcgaaaatgt actatttcca cagtgacgtg gactgccgca agtactttaa ctcgcgtaac 360

ggcgaattag tggtcggcgc cgtggattta agggacgctt ttaagctcga gcagagtgaa 420

cgtctcgacc tgccggcgcg aggcatcgtg atccacacgc gtcatcgcgc gtggcttgtg 480

tgtcctgaga cggaccagga ctttacgatg tggttcgacg ccttggagtt caccgtcatg 540

tctgcgggtt cgggtaatgt ggtcaagcgc gacttaccca atgtgcgagt gtacgagatg 600

aaggggcgat tcagttaccg gttttggtat gtcatcttcg tcatcactgc gctgatcgag 660

ttggcaggta tcgtactgtg gttcccgttg ggtattgaac cgtgcgatgt caagtacaaa 720

acggactcgt gtgatgagat tcaactgctc tatgcggaca ctttacagtg tggtgacaag 780

cctttcaacg gggtgtggga ccctccgcaa tggtaccatt ggtcggctgg tattgagacg 840

gtgcagtgct ttaaagagcc acacattggt gactgggtct cgtacttctt gttctacctg 900

gcggagttca ttagtatctc gcttggtttc ctctactatt tggggatgtg gaaacctgtt 960

cgtcgtggtg ctcgctactt gagagatttc gagccgcatt tccctcccga gaaggtattt 1020

cactttgatt tggttagtat ttttttcttt tcttcttacg agattgtttg ataatgctat 1080

cagtggccga cagtggatat tcttctatgt cactacgctg aaccggctga agacaccatc 1140

gctacgctcg agaagatcat gaatttggac tacccgccgc acttgttcca cgtctggatc 1200

tgtgacgacg gctactgcaa atccaagtgg gaggctgggg ctcaagtgcc caaggtcagt 1260

gtcaacactg gcgtgatcga agaggctgga gacgtccgtc atgaagtggc tcagttcatg 1320

tacgaccgtg tgtgcgagtc gtacgaactg gaagtggacg agtggcgcaa ggagcacacg 1380

accgtcaaga tgcccaccaa cgccaacccg cgtatcgtga atcgctcgga ctgcgctgtc 1440

ggttctgtac gtgacgacta ccactaccac ggactgccca agttgacgtt cgtgggtcgt 1500

atcaagccgc cagtacacca ctccaaggcc ggtaacatca acaacgtcct gtacaatgaa 1560

ggcgcgatcg gacgctacgc tatcatcctg gataacgaca tgaagccgca cgagatgttc 1620

attcaggcca cgctgccgtt cttcttcgac gccccgcaga actccaagat cacgcgctgc 1680

tgtgcgcctg gatgcggtga catcggcaaa atctgttgtg ctctgtgcca ggccgcgggc 1740

gtcccggagg cccagatcat gtactgctcc aaggactgct acaacgcgtc gggccacacc 1800

aagtcgagtg tccaccgacg ccagacgcag aacaccatgt cggagcgtat gatgtgcgcg 1860

agctgtggca gcaaaatcaa ccagaagaag ggactgtgcc gcaagtgcaa ccgcgcggtg 1920

agtcagcgtg acagcaacca gttcgtgggt gtgtcagctg atgactactc agatcacgtg 1980

tcagtgaacc aggtcggtta cgtgcagact ccgcagtact tcgaggactg cctgcagctc 2040

cgtctgggcg acccgtgtgg tcaccgtaac tcgacgttct tcgattcggc gcagaccggt 2100

atggacggct acgactgtgc gtctttcgct ggtaccaacg ctatcttccg ccgtgaagct 2160

cttgactcgg tttgtggtat tcagtacggc tcgctcactg aggacgccta cacaggcaag 2220

atgatggtgg acaagggatg gaagggttac tacttccgta aggatctcga aggtgaggag 2280

gctgaccgta tccgtttggc tgaaggagct gtacctgagt cggtggctgc tgctttggct 2340

caacgtaagc gctgggccaa gggtaacttt cagatcttcc tacgcaacaa gaagagtctg 2400

gtggacccgg agtggactgc tccagtggtg gagttgcccc cgaagcgcaa gatcaacaag 2460

tttatgcgtt gggtattctt catgaacctg acggtgtacc cgatcggctc gttcccggcc 2520

attttcttct tctacatcac cggctacttc ctgtataccg gtcaggcgcc tatctacacg 2580

tctggactgc gtctgttgat ggctcttgtg cccaagatcg tcgcgcagag tattctatcg 2640

gctctgtcca accgtacggt cgacaacgac gatgtgctgc gtagtcagca gacgtggttc 2700

tcctacgcct tcgtgcacgt catggctgtg ttcgagacga tctactggaa gatcaccggt 2760

aaagaggcga cgtgggccaa cacgggcgct ctgggtggta acagccccat ggaactgccg 2820

aacctcatcg tgttcttggc tatgatcttc ggtatgatgt gggatacggt gcgctacttc 2880

gcgggttaca acaacgccgc aacgactcac ggcacgccgc tgtacttcgc gtccttgttc 2940

ctgggtggat tcctggctag tcagctgggg cccatggtgc gtatgagcct gcagacatat 3000

ttcggctgga gccacaagag tctgacggac cagggcaaca tcgtcggcag tttctcgctg 3060

gcttttgtgc tcattatcct gtgtatctgg gtgtacgtcg agacacccaa ccactccatc 3120

tttgggtaa 3129

<210> 3

<211> 1026

<212> PRT

<213> 辣椒疫霉(Phytophthora capsici)

<400> 3

Met Tyr Gly Asn Asp Lys Gln Ser Leu Met Lys His Glu Asp Tyr Glu

1 5 10 15

Leu His Gly Thr Pro Ala Thr Gly Asp Asn Asp Gly Gly Ala Gly Phe

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Gly Ser Gln Arg Asp Asn Ile Ile Ser Val His Gly Tyr Met His Lys

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Gln Gly Lys Arg Thr Ile Lys Gly Pro Ile His Lys Ser Trp Lys Arg

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Arg Tyr Phe Ala Leu Glu Lys Ala Lys Ile Tyr Tyr Phe His Ser His

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Leu Glu Cys Arg Gln Tyr Phe Thr Thr Arg Asn Ala Asp Leu Val Val

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Gly Ala Ile Glu Leu Lys Asp Ala Leu Gln Leu Arg Pro Cys Ala Arg

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Leu Asp Leu Pro His Lys Gly Phe Glu Val His Thr Lys Arg Arg Val

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Gly Val Glu Arg Ala Ile Val Ala Asn Gly Ala Gly Asn Ile Ile Glu

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Leu Ala Ile Val Phe Trp Phe Val Ile Gly Leu Glu Pro Cys Asp Ala

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<212> DNA

<213> 辣椒疫霉(Phytophthora capsici)

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cgctgggcca agggtaactt tcagatcttc ctacgcaaca agaagagtct ggtggacccg 2340

gagtggactg ctccagtggt ggagttgccc ccgaagcgca agatcaacaa gtttatgcgt 2400

tgggtattct tcatgaacct gacggtgtac ccgatcggct cgttcccggc cattttcttc 2460

ttctacatca ccggctactt cctgtatacc ggtcaggcgc ctatctacac gtctggactg 2520

cgtctgttga tggctcttgt gcccaagatc gtcgcgcaga gtattctatc ggctctgtcc 2580

aaccgtacgg tcgacaacga cgatgtgctg cgtagtcagc agacgtggtt ctcctacgcc 2640

ttcgtgcacg tcatggctgt gttcgagacg atctactgga agatcaccgg taaagaggcg 2700

acgtgggcca acacgggcgc tctgggtggt aacagcccca tggaactgcc gaacctcatc 2760

gtgttcttgg ctatgatctt cggtatgatg tgggatacgg tgcgctactt cgcgggttac 2820

aacaacgccg caacgactca cggcacgccg ctgtacttcg cgtccttgtt cctgggtgga 2880

ttcctggcta gtcagctggg gcccatggtg cgtatgagcc tgcagacata tttcggctgg 2940

agccacaaga gtctgacgga ccagggcaac atcgtcggca gtttctcgct ggcttttgtg 3000

ctcattatcc tgtgtatctg ggtgtacgtc gagacaccca accactccat ctttgggtaa 3060

Claims

1.一类辣椒疫霉病菌(Phytophthora capsici)纤维素合酶蛋白，是如下A1)或A2)或A3)或A4)的蛋白质：

A1)氨基酸序列是如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的蛋白质；

A2)在如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

A3)将如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能由SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的蛋白衍生的蛋白质；

2.编码权利要求1所示的纤维素合酶蛋白的编码基因；优选的，所述编码基因为如下B1)或B2)或B3)：

B1)序列表中SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.9所述的核苷酸序列所示的DNA分子；

B2)与B1)所示的核苷酸序列的具有75％以上或85％以上或95％以上同一性，且编码权利要求1中所述纤维素合酶蛋白的cDNA分子或DNA分子；

B3)在严格条件下与B1)或B2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述纤维素合酶蛋白的cDNA分子或DNA分子。

3.权利要求2所述的编码基因转录得到的RNA分子；

优选的，所述RNA分子的序列为如下C1)或C2)：

C1)与如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的DNA序列转录的RNA序列的相似性在75％以上，进一步优选在85％以上，更优选在95％以上且具有与如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的DNA序列转录的RNA序列相同功能的RNA序列；

C2)如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的DNA序列转录的RNA序列。

4.含有与权利要求2所示的编码基因或权利要求3所述的RNA分子相关的核酸分子的生物材料，为下述D1)至D10)中的任一种：

D1)含有权利要求2所述编码基因的表达盒；

D7)抑制权利要求2所述编码基因表达或使其缺失的核酸分子；

D9)抑制权利要求3所述RNA分子翻译的核酸分子；

5.一组成套使用的辣椒疫霉病菌纤维素合酶蛋白组合或者DNA组合，是下述E1)或E2)：

6.权利要求1所述纤维素合酶蛋白、权利要求2所示的编码基因或权利要求3所述的RNA分子或权利要求4所述的生物材料或权利要求5所示的辣椒疫霉病菌纤维素合酶蛋白组合或者DNA组合的应用，其特征在于：所述应用为下述1)-6)中任一种或几种：

1)在调控辣椒疫霉游动孢子产量和/或休止孢萌发率、和/或维持或破坏休止孢野生型形态中的应用；

2)在维持或破坏辣椒疫霉细胞壁正常结构和菌落正常形态中的应用；

3)在调控辣椒疫霉菌丝生长速率中的应用；

4)在调控辣椒疫霉侵染寄主能力中的应用；

5)在调控辣椒疫霉对寄主的致病性中的应用；

6)在抑制和/或杀灭辣椒疫霉病菌中的应用。

优选的，包括通过抑制如权利要求2所述的编码基因中的转录或使其灭活，或抑制如权利要求3所述的RNA分子的翻译，或抑制和/或灭活如权利要求1所述的纤维素合酶蛋白来实现1)-6)所述的应用。

7.权利要求1所述纤维素合酶蛋白、权利要求2所示的编码基因或权利要求3所述的RNA分子或权利要求4所述的生物材料或权利要求5所述的蛋白组合或者DNA组合在作为抑菌或杀菌剂靶标筛选辣椒疫霉病菌抑菌或杀菌剂中的应用。

8.一种筛选或辅助筛选辣椒疫霉病菌抑菌和/或杀菌剂的方法，所述方法包括将待检测物应用于所述辣椒疫霉病菌，当所述待检测物能够抑制如权利要求2所述的编码基因的转录，或抑制如权利要求3所述的RNA分子的翻译，或抑制如权利要求1所述的纤维素合酶蛋白的活性或使其灭活，则所述待检测物为所述辣椒疫霉病菌的抑菌和/或杀菌剂。

9.一种降低辣椒疫霉病菌的活性的方法，包括下述步骤：抑制如权利要求2所述的编码基因的转录或使其缺失，或抑制如权利要求3所述的RNA分子中的翻译，或抑制如权利要求1所述的纤维素合酶蛋白的活性或使其灭活；

其中，所述降低辣椒疫霉病菌的活性为降低辣椒疫霉病菌对寄主的侵染能力和/或对寄主的致病性，和/或抑制辣椒疫霉病菌的游动孢子产量，和/或抑制休止孢萌发，和/或破坏休止孢野生型形态，和/或降低辣椒疫霉病菌的菌丝生长速度，和/或使辣椒疫霉细胞壁结构形态改变；和/或使辣椒疫霉菌落形态畸形；

优选的，通过对辣椒疫霉中序列表中SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的基因进行基因敲除，以使序列表中SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的蛋白质灭活。

10.抑制权利要求1所述纤维素合酶蛋白质表达和/或活性的物质在制备植物辣椒疫霉病菌杀菌剂中的应用；优选的，所述抑制纤维素合酶蛋白质表达和/或活性的物质为抑制纤维素合酶蛋白质表达，和/或抑制纤维素合酶蛋白质的编码基因的转录，和/或抑制纤维素合酶蛋白质的编码基因转录得到的RNA分子的翻译的物质。