CN117660388A - 大豆疫霉m6A甲基转移酶亚基蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

大豆疫霉m6A甲基转移酶亚基蛋白及其编码基因与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了三种来自大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)的m6A甲基转移酶亚基蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的m6A甲基转移酶亚基蛋白如序列4‑6所示；其编码基因如序列1‑3所示。通过实验证明，本发明所提供的蛋白在大豆疫霉自身生长发育过程中发挥重要作用，具体表现为，该类蛋白缺失后大豆疫霉菌丝生长速率减慢、孢子囊产量降低、游动孢子数量减少、卵孢子产量下降以及致病力降低等。以上结论均为探究大豆疫霉发育及致病分子机制提供了技术基础，为未来新型杀菌剂的研发提供了潜在的分子靶标。

Description

大豆疫霉m6A甲基转移酶亚基蛋白及其编码基因与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及来自大豆疫霉(Phytophthora sojae)的m6A甲基转移酶亚基蛋白及其编码基因与应用。
背景技术
卵菌分布十分广泛，其寄主范围涵盖植物界和动物界，危害非常严重，其中植物病原卵菌侵染作物种类繁多，可给农业生产等造成巨大的经济损失。尽管卵菌在形态上与真菌相似，但在进化上与硅藻和褐藻更接近。其中，疫霉属具有破坏性的植物病原性卵菌，在全世界范围内造成严重的农业经济损失。由于卵菌与丝状真菌在系统发育上的差异性和日趋严重的抗药性问题，使基于新型靶标的卵菌杀菌剂的开发显得尤为重要和迫切.对于绿色农药分子靶标的开发和利用已经成为国家的重大需求，一个新的靶标不仅可以催生出几十甚至上百种农药品种，也能极大缓解已有农药品种的抗药性问题。
近年来，RNA修饰作为转录调控的关键部分一直是研究的焦点。其中，m6A甲基化修饰是真核mRNA、rRNA、tRNA、微RNA(miRNA)和长链非编码RNA中最丰富的RNA修饰之一，已被证明在RNA介导的多种分子和细胞过程的调控中发挥重要作用，包括基因表达、选择性剪接、RNA核输出、mRNA稳定性和翻译效率。METTL3是RNA m6A甲基转移酶复合物(MTC)的核心催化亚基蛋白。此外，METTL16是METTL3的同源蛋白，最近被发现可以动态调节U6小核RNA(snRNA)和部分转录本的m6A修饰，从而影响细胞内S-腺苷甲硫氨酸(SAM)水平。m6A在病毒、酵母、植物以及人类和其他哺乳动物中的重要作用已经被逐渐认识到，大多数研究都集中在m6A对发育、进化和生理的影响上。然而，目前m6A修饰在植物病原菌、特别是卵菌中的生物学功能还尚不清楚。
大豆疫霉(Phytophthora sojae)是典型的同宗配合的卵菌，被归为十大植物病原卵菌之一，已成为国际疫霉属卵菌研究的模式种。上世纪50年代在北美洲被首次发现并报道，其能够对大豆的生产造成严重的破坏，是典型的土传植物病原菌。在美国，每年由大豆疫霉引起的根腐和茎腐造成的经济损失达数十亿美元。大豆疫霉可以引起大豆种子腐烂、根腐、茎腐以及种苗枯萎。与绝大多数疫霉菌不同，其具有很强的寄主专化性，在田间可以侵染大豆和羽扁豆属的26个种，但仅能对大豆造成危害。
综上所述，大豆疫霉是一种非常重要的植物病原卵菌，对农业生产和经济具有严重的威胁。相较于真菌，用于卵菌病害防治的药物较少。此外，由于田间日趋严重的抗药性问题，开发具有全新靶标的卵菌杀菌剂变得尤为迫切。本发明对开展以m6A甲基转移酶PsMETTL3A、PsMETTL3B以及PsMETTL16为分子靶标的新型卵菌抑制剂的创制具有重要的指导意义。
发明内容
本发明开展以大豆疫霉中m6A甲基转移酶亚基蛋白METTL3A(methyltransferase-like 3A)蛋白PsMETTL3A、METTL3B(methyltransferase-like 3B)蛋白PsMETTL3B、METTL16(methyltransferase-like 16)蛋白PsMETTL16功能的相关研究工作，将为更深入的理解大豆疫霉的m6A甲基化修饰在调控疫霉生长发育及其与寄主互作过程中的作用，为新型防治卵菌靶标的设计提供参考和借鉴。
通过发明人的研究发现，大豆疫霉m6A甲基转移酶亚基蛋白(PsMETTL3A、PsMETTL3B和PsMETTL16)对于大豆疫霉的菌丝生长速率、孢子囊产生、游动孢子释放、卵孢子发育和致病力密切相关。这些结果表明，大豆疫霉m6A甲基转移酶亚基蛋白(PsMETTL3A、PsMETTL3B和PsMETTL16)对于病原菌的生理和致病过程都具有重要的调控作用。以该类基因开发作为病原卵菌大豆疫霉的分子药剂靶标，具有重要的应用前景。
因此，本发明的目的之一，提供大豆疫霉m6A甲基转移酶亚基METTL3A、METTL3B和METTL16蛋白，并分别将其命名为PsMETTL3A、PsMETTL3B、PsMETTL16，来源于大豆疫霉菌株P6497，是如下A1)或A2)A3)或A4)的蛋白质：
A1)氨基酸序列是如序列4-6中任意一项所示的蛋白质；
A2)在如序列4-6中任意一项所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
A3)将如序列4-6中任意一项所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的如序列4-6所示的蛋白衍生的蛋白质；
A4)与如序列4-6中任意一项所示的氨基酸序列相似性在75％以上，优选在85％以上，更优选在95％以上且具有与如序列4-6中任意一项所示的氨基酸序列相同功能的氨基酸序列。
为了使A1)中的蛋白便于纯化，可在如序列表中序列4-6中任意一项所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上Poly-Arg(RRRRR)、Poly-His(HHHHHH)、FLAG(DYKDDDDK)、Strep-tag II(WSHPQFEK)、c-myc(EQKLISEEDL)等标签。
上述A1)-A4)中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述A2)-A4)中蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1-3中任意一项所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个核苷酸对的错义突变，和/或在其5’端和/或3’端连上述标签的编码序列得到。
其中，A1)中，序列表中序列4(PsMETTL3A)由372个氨基酸残基组成，序列5(PsMETTL3B)由229个氨基酸残基组成，序列6(PsMETTL16)由474个氨基酸残基组成。
本发明目的之二是提供编码所需的PsMETTL3A、PsMETTL3B、PsMETTL16蛋白的核酸分子。所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。
其中，上述大豆疫霉m6A甲基转移酶亚基蛋白(PsMETTL3A、PsMETTL3B、PsMETTL16蛋白)的编码基因为如下B1)或B2)或B3)：
B1)序列表中序列1-3中任意一项所述的核苷酸序列所示的DNA分子；
B2)与B1)所示的核苷酸序列的具有75％以上或85％以上或95％以上同一性，且编码上述大豆疫霉m6A甲基转移酶亚基蛋白的cDNA分子或DNA分子；
B3)在严格条件下与B1)或B2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述大豆疫霉m6A甲基转移酶亚基蛋白的cDNA分子或DNA分子。
上述编码基因，序列表中序列1由1199个核苷酸组成；自序列1的5’端第1-1061位和第1142-1199核苷酸为编码序列，编码序列表中序列4所示的蛋白质PsMETTL3A。序列2由815个核苷酸组成；自序列2的5’端第1-453位和第579-815核苷酸为编码序列，编码序列表中序列5所示的蛋白质PsMETTL3B。序列3由1789个核苷酸组成；自序列3的5’端第1-125位、第193-258位、第324-399位、第465-1157位、第1237-1319位和第1408-1789位核苷酸为编码序列，编码序列表中序列6所示的蛋白质PsMETTL16。
所述的RNA分子，是所述的编码基因转录得到的RNA分子；
优选的，所述RNA分子的序列为如下C1)或C2)：
C1)如序列1-3中任意一项所示的DNA序列转录的RNA序列的相似性在75％以上，进一步优选在85％以上，更优选在95％以上且具有与如序列1-3所示的DNA序列转录的RNA序列相同功能的RNA序列；
C2)如序列1-3中任意一项所示的DNA序列转录的RNA序列。
如本发明的DNA序列在严格条件下与如序列1-3中任意一项所示DNA序列能够进行分子杂交且编码如序列4-6中任意一项所示蛋白的DNA序列。上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
本发明目的之三是提供以上所述核酸分子相关的生物材料，包括重组载体、表达盒、重组微生物或转基因植物细胞系。所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体；所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌；所述转基因植物细胞系不包括繁殖材料。具体的可为如下为下述D1)至D10)中的任一种：
D1)含有所述编码基因的表达盒；
D2)含有所述编码基因的重组载体、或含有D1)所述表达盒的重组载体；
D3)含有所述编码基因的重组微生物、或含有D1)所述表达盒的重组微生物、或含有D2)所述重组载体的重组微生物；
D4)含有所述编码基因的转基因植物细胞系、或含有D1)所述表达盒的转基因植物细胞系；
D5)含有所述编码基因的转基因植物组织、或含有D2)所述表达盒的转基因植物组织；
D6)含有所述编码基因的转基因植物器官、或含有D2)所述表达盒的转基因植物器官；
D7)抑制所述编码基因表达的核酸分子；
D8)含有D7)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系；
D9)抑制上述RNA分子翻译的核酸分子；
D10)产生D9)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。
本发明目的之五是提供大豆疫霉PsMETTL3A、PsMETTL3B和/或PsMETTL16蛋白及编码PsMETTL3A、PsMETTL3B、PsMETTL16蛋白的核酸分子或含有编码PsMETTL3A、PsMETTL3B、PsMETTL16蛋白的核酸分子的生物材料的应用。
所述应用为下述1)-5)中任一种或几种：
1)在调控(提高或降低)大豆疫霉孢子囊数量、游动孢子产量和/或卵孢子的发育能力中的应用；
2)在调控(提高或降低)大豆疫霉菌丝生长速率中的应用；
3)在调控(提高或降低)大豆疫霉侵染寄主能力中的应用；
4)在调控(提高或降低)大豆疫霉对寄主的致病力中的应用；
5)在抑制和/或杀死大豆疫霉病菌中的应用。
优选的，其中，所述应用中，包括通过抑制序列1-3所述的编码基因中的转录或使其灭活，或抑制所述的RNA分子的翻译，或抑制和/或灭活序列4-6所述的PsMETTL3A、PsMETTL3B、PsMETTL16蛋白的活性来实现1)-5)所述的应用。
所述应用中，通过抑制如上述的编码基因的转录，或抑制上述的RNA序列的翻译，或抑制和/或失活上述PsMETTL3A、PsMETTL3B和/或PsMETTL16蛋白的活性来干扰菌丝的生长速率、影响游动孢子产量和调控侵染寄主能力从而能够抑制和/或杀死大豆疫霉病菌的生长。
本发明目的之六是提供所述序列表中序列4-6所示的PsMETTL3A、PsMETTL3B、和/或PsMETTL16蛋白、上述序列表中序列1-3所示的编码基因在作为抑菌或杀菌剂靶标筛选大豆疫霉病菌抑菌或杀菌剂中的应用。
本发明目的之七是提供一种筛选或辅助筛选大豆疫霉抑菌和/或杀菌剂的方法，所述方法包括将待检测物应用于所述大豆疫霉病菌，当所述待检测物能够抑制如上DNA序列的转录，或抑制如上RNA序列的翻译，或抑制和/或失活如上所示的PsMETTL3A、PsMETTL3B、PsMETTL16蛋白，则所述待测物质为候选的所述植物大豆疫霉抑菌和/或杀菌剂。
本发明目的之八是提供一种降低大豆疫霉病菌的活性的方法，包括下述步骤：抑制如上述的编码基因的转录或使其缺失，或抑制所述的RNA分子的翻译，或抑制和/或失活如上所述的PsMETTL3A、PsMETTL3B和/或PsMETTL16蛋白的活性；
其中，所述降低大豆疫霉病菌的活性为降低大豆疫霉病菌对寄主的侵染能力和/或对寄主的致病性，和/或者降低大豆疫霉病菌的菌体生长速度，和/或抑制大豆疫霉游动孢子产量。
上述方法中，通过所述抑制或降低待抑制活性或待灭活的蛋白的编码基因表达来实现蛋白的灭活，具体的，可通过基因敲除或通过基因沉默实现。
所述基因敲除是指通过同源重组使特定靶基因失活的现象。基因敲除是通过DNA序列的改变使特定靶基因失活。
所述基因沉默是指在不损伤原有DNA的前提下使基因不表达或低表达的现象。基因沉默可发生在两种水平上，一种是由于DNA甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平的基因沉默，另一种是转录后基因沉默，即在基因转录后的水平上通过对靶标RNA进行特异性抑制而使基因失活，包括反义RNA、共抑制(co-suppression)、基因压抑(quelling)、RNA干扰(RNAi)和微小RNA(miRNA)介导的翻译抑制等。
优选的，通过使大豆疫霉中序列表中序列1-3所示的基因进行基因敲除，以使所述序列表中序列4-6所示的蛋白质所示的蛋白质灭活。
在本发明的一个实施方式中，使上述基因进行基因敲除的方法是基于CRISPR/Cas9的基因敲除法。
具体的，基于CRISPR/Cas9的基因敲除法是将目的基因的Donor载体和sgRNA表达载体以及Cas9表达质粒转染大豆疫霉筛选得到所述目的敲除蛋白灭活的重组菌。
所述Donor载体(如pBS-PsMETTL3A-NPTII、pBS-PsMETTL3B-NPTII、pBS-PsMETTL16-NPTII)为含有依次连接的待敲除目的基因上游800-1500bp的序列、Donor DNA序列(可以为NPTII或GFP或RFP等基因序列)和待敲除目的基因的下游800-1500bp的序列的重组载体。sgRNA表达载体(如pYF2.3G-PsMETTL3A、pYF2.3G-PsMETTL3B、pYF2.3G-PsMETTL16)为表达靶向待敲除目的基因的sgRNA片段载体，其中，所述待敲除目的基因为自序列表中序列1-3，靶向于PsMETTL3A、PsMETTL3B、PsMETTL16基因的sgRNA序列分别为sgPsMETTL3A：CTTCGAGTCTCTGCTGTGAG(靶向于PsMETTL3A基因的SEQ ID No.1的第965-984位)；sgPsMETTL16：CTCGGACGAGTGCATCCTAG(靶向于PsMETTL3B基因的SEQ ID No.2的第656-675位)；sgPsMETTL16：GGAGGAGAGGTGGCGTTTAT(靶向于PsMETTL16基因的SEQ ID No.3的第927-946位)。优选的，所述sgRNA表达质粒是以pYF2.3G-Ribo-sgRNA载体为出发载体，分别将PsMETTL3A、PsMETTL3B、PsMETTL16基因的sgRNA退火得到的双链sgRNA编码序列，插入pYF2.3G-Ribo-sgRNA载体的Nhe I和Bsa I酶识别位点之间，得到sgRNA表达质粒。Donor载体分别pBS-PsMETTL3A-NPTII、pBS-PsMETTL3B-NPTII、pBS-PsMETTL16-NPTII、sgRNA表达载体分别pYF2.3G-PsMETTL3A、pYF2.3G-PsMETTL3B、pYF2.3G-PsMETTL16和Cas9表达质粒pYF2-Cas9分别对PsMETTL3A、PsMETTL3B、PsMETTL16基因的全长序列进行敲除。
抑制PsMETTL3A、PsMETTL3B、PsMETTL16蛋白质表达和/或活性的物质在制备植物大豆疫霉病菌杀菌剂中的应用也属于本发明的保护范围。
上述应用中，所述抑制PsMETTL3A、PsMETTL3B、PsMETTL16蛋白质表达和/或活性的物质为抑制PsMETTL3A、PsMETTL3B、PsMETTL16蛋白质表达和/或抑制PsMETTL3A、PsMETTL3B、PsMETTL16蛋白质的编码基因的转录和/或抑制PsMETTL3A、PsMETTL3B、PsMETTL16蛋白质的编码基因转录得到的RNA分子的翻译的物质。
试验证明，本发明所提供的PsMETTL3A、PsMETTL3B、PsMETTL16蛋白在大豆疫霉自身生长发育过程中均起重要作用作用。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术分别获得PsMETTL3A、PsMETTL3B、PsMETTL16基因敲除纯合转化子。较野生型亲本菌株而言有明显变化，主要包括：PsMETTL3A基因纯合转化子孢子囊数量减少、游动孢子产量降低、卵孢子产量下降以及侵染寄主植物的能力变弱；PsMETTL3B基因纯合转化子菌丝生长速率降低、孢子囊数量减少、游动孢子产量降低以及侵染寄主植物的能力变弱；PsMETTL16基因纯合转化子孢子囊数量减少和游动孢子产量降低。因此，大豆疫霉PsMETTL3A、PsMETTL3B、PsMETTL16蛋白在大豆疫霉营养生长、无性生殖、有性生殖及侵染寄主等多个过程均可发挥重要作用。本发明为大豆疫霉病菌的致病机制研究提供了技术支持，并为未来新型杀菌剂的研发提供了潜在的分子作用靶标。
附图说明
图1为大豆疫霉菌株P6497(WT)，对照转化子EV-A、EV-B、EV-16，PsMETTL3A、PsMETTL3B、PsMETTL16基因敲除纯合转化子(Δ-PsMETTL3A、Δ-PsMETTL3B、Δ-PsMETTL16)的菌落直径柱状图(在V8固体培养基上培养3d)。
图2为大豆疫霉菌株P6497(WT)，对照转化子EV-A、EV-B、EV-16，PsMETTL3A、PsMETTL3B、PsMETTL16基因敲除纯合转化子(Δ-PsMETTL3A、Δ-PsMETTL3B、Δ-PsMETTL16)的卵孢子产量统计柱状图。
图3为大豆疫霉菌株P6497(WT)，对照转化子EV-A、EV-B、EV-16，PsMETTL3A、PsMETTL3B、PsMETTL16基因敲除纯合转化子(Δ-PsMETTL3A、Δ-PsMETTL3B、Δ-PsMETTL16)游动孢子在大豆黄化苗下胚轴的致病力。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
大豆疫霉菌株P6497：为美国俄勒冈州立大学Brett M.Tyler教授馈赠的标准菌株，存放于中国农业大学植物保护学院种子病理与杀菌剂药理实验室，公众可从中国农业大学获得。
培养基或试剂配方：
10％ V8固体培养基：100mL V8蔬菜汁，1.4g CaCO3，搅拌混匀，用去离子水稀释10倍，即加入900mL去离子水，添加15g Agar，121℃高压湿热灭菌20min。
10％ V8液体培养基：100mL V8蔬菜汁，1.4g CaCO3，搅拌混匀，12000rpm离心5min，取上清，用去离子水稀释10倍，121℃高压湿热灭菌20min。
营养豌豆培养基(Nutrient pea broth，NPB)：125g豌豆加入1L去离子水，121℃高压湿热灭菌20min，纱布过滤获得豌豆营养液；2.0g酵母提取物、5.0g葡萄糖、5.0g甘露醇、5.0g山梨醇、2.0g CaCO3、0.1g CaCl2、0.5gMgSO4、3.0g KNO3、1.0gK2HPO4、1.0g KH2PO4，搅拌混匀，3000rpm离心10min或静置30min，取上清，用豌豆营养液定容至1L，固体培养基(NPBA)添加15g琼脂粉，湿热灭菌20min。使用前，在无菌操作台中，添加2mL维生素储液(Biotin6.7×10-7g/mL；Folic acid 6.7×10-7g/mL；L-inositol 4.0×10-5g/mL；Nicotinic acid4.0×10-5g/mL；Pyridoxine-HCl 6.0×10-4g/mL；Riboflavin 5.0×10-5g/mL；Thiamine-HCl 1.3×10-3g/mL)以及2ml微量元素储液(FeC6H5O7·3H2O 5.4×10-4g/mL；ZnSO4·7H2O3.8×10-4g/mL；CuSO4·5H2O 7.5×10-4g/mL；MgSO4·H2O 3.8×10-5g/mL；H3BO32.5×10-5g/mL；Na2MoO4·H2O 3.0×10-5g/mL)。
豌豆甘露醇培养基(Pea Mannitol，PM)：91.1g甘露醇，1g CaCl2，2g CaCO3，加入大约900mL豌豆营养液，搅拌混匀约30min，3000rpm离心10min或静置30min，取上清，用豌豆营养液定容至1L，固体培养基(PMA)添加15g琼脂粉，湿热灭菌20min。
菌丝酶解液(20mL)：10mL 0.8M甘露醇，0.8mL 0.5M KCl，0.8mL 0.5M 4-吗啉乙磺酸，0.4mL 0.5M CaCl2，0.12g纤维素酶(Calbiochem,cat.No.219466)，0.12g裂解酶(Sigma，cat.No.L1412)，无菌超纯水定容至20mL，混匀溶解，0.22μm滤膜过滤灭菌，现用现配。
MMG溶液(250mL)：18.22g甘露醇，0.76g MgCl2·6H2O，2.0mL 0.5M 4-吗啉乙磺酸(pH＝5.7)，超纯水定容至250mL，0.22μm滤膜过滤灭菌。
W5溶液：0.1g KCl，4.6g CaCl2·2H2O，2.25g NaCl，7.8g葡萄糖，超纯水溶解定容至250mL，0.22μm滤膜过滤灭菌。
PEG-CaCl2溶液(40％w/v)：12g PEG 4000，3.75mL 0.5M CaCl2，3mL无菌超纯水，0.22μm滤膜过滤灭菌。
本实施例中使用的pBluescript II SK+同源臂载体质粒(Donor载体)，sgRNA表达载体pYF2.3G-Ribo-sgRNA和Cas9表达质粒pYF2-Cas9均由美国俄勒冈州立大学BrettM.Tyler教授馈赠。
实施例1、大豆疫霉PsMETTL3A、PsMETTL3B、PsMETTL16蛋白及其编码基因的获得
本实施例中大豆疫霉METTL3A、METTL3B、METTL16蛋白PsMETTL3A、PsMETTL3B、PsMETTL16及其编码基因(或cDNA)可以以大豆疫霉菌株P6497的DNA(或cDNA)为模板，通过表1所列引物扩增获得。其中，DNA或RNA提取的材料为大豆疫霉菌株BYA5的菌丝体。其中，PsMETTL3A、PsMETTL3B、PsMETTL16的编码基因如序列表中序列1-3所示，序列表中序列1由1199个核苷酸组成；自序列1的5’端第1-1061位和第1142-1199核苷酸为编码序列，编码序列表中序列4所示的蛋白质PsMETTL3A。序列2由815个核苷酸组成；自序列2的5’端第1-453位和第579-815核苷酸为编码序列，编码序列表中序列5所示的蛋白质PsMETTL3B。序列3由1789个核苷酸组成；自序列3的5’端第1-125位、第193-258位、第324-399位、第465-1157位、第1237-1319位和第1408-1789位核苷酸为编码序列，编码序列表中序列6所示的蛋白质PsMETTL16。上述蛋白或基因也可以人工合成。
表1.PsMETTL3A、PsMETTL3B、PsMETTL16全长编码基因扩增引物
序列表中序列1如下所示：
序列表中序列2如下所示：
序列表中序列3如下所示：
序列表中序列4如下所示：
序列表中序列5如下所示：
序列表中序列6如下所示：
实施例2、大豆疫霉PsMETTL3A、PsMETTL3B、PsMETTL16基因敲除载体的构建
本实施例中基于CRISPR/Cas9的基因敲除载体构建方法以及相关载体的序列在文献“Fang,Y.,and Tyler,B.M.(2016).Efficient disruption and replacement of aneffector gene in the oomycete Phytophthora sojae using CRISPR/Cas9.Molecularplant pathology,17(1),127-139.”以及“Fang,Y.,Cui,L.,Gu,B.,Arredondo,F.,andTyler,B.M.(2017).Efficient genome editing in the oomycete Phytophthora sojaeusing CRISPR/Cas9.Curr.Protoc.Microbiol.44,21A.1.1-21A.1.26.”中公开过。本实施例中使用的pBluescript II SK+同源臂载体质粒(Donor载体)，sgRNA表达载体pYF2.3G-Ribo-sgRNA以及Cas9表达质粒pYF2-Cas9均由美国俄勒冈州立大学Brett M.Tyler教授馈赠。
试验证明，本发明所提供的PsMETTL3A、PsMETTL3B、PsMETTL16蛋白在大豆疫霉自身生长发育过程中起作用。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术分别获得PsMETTL3A、PsMETTL3B、PsMETTL16基因敲除纯合转化子。较野生型亲本菌株而言有明显变化，主要包括：PsMETTL3A基因纯合转化子孢子囊数量减少、游动孢子产量降低、卵孢子产量下降以及侵染寄主植物的能力变弱；PsMETTL3B基因纯合转化子菌丝生长速率降低、孢子囊数量减少、游动孢子产量降低以及侵染寄主植物的能力变弱；PsMETTL16基因纯合转化子孢子囊数量减少和游动孢子产量降低。因此，大豆疫霉PsMETTL3A、PsMETTL3B、PsMETTL16蛋白在大豆疫霉营养生长、无性生殖、有性生殖及侵染寄主等多个过程均可发挥重要作用。
其中，Donor载体pBS-PsMETTL3A-NPTII、sgRNA表达质粒pYF2.3G-PsMETTL3A和Cas9表达质粒pYF2-Cas9对PsMETTL3A基因的全长序列进行敲除；利用Donor载体pBS-PsMETTL3B-NPTII、sgRNA表达质粒pYF2.3G-PsMETTL3B和Cas9表达质粒pYF2-Cas9对PsMETTL3B基因的全长序列进行敲除；利用Donor载体pBS-PsMETTL16-NPTII、sgRNA表达质粒pYF2.3G-PsMETTL16和Cas9表达质粒pYF2-Cas9对PsMETTL16基因的全长序列进行敲除。上述敲除方法如下所述。
本实施方式中所用的Donor载体pBS-PsMETTL3A-NPTII、pBS-PsMETTL3B-NPTII、pBS-PsMETTL16-NPTII，sgRNA表达质粒pYF2.3G-PsMETTL3A、pYF2.3G-PsMETTL3B、pYF2.3G-PsMETTL16；具体构建方法如下所述：
1)pBS-PsMETTL3A-NPTII、pBS-PsMETTL3B-NPTII、pBS-PsMETTL16-NPTI的同源臂载体构建：以大豆疫霉菌株P6497的DNA为模板，利用TaKaRa-In-Fusion_Tools在线网站(http://www.clontech.com/US/Products/Cloning_and_Competent_Cells/Cloning_Resources/On line_In-Fusion_Tools)设计引物分别扩增目的基因PsMETTL3A、PsMETTL3B、PsMETTL16的上游1000bp(序列表中序列7-9所示，经如表2所示pBS-PsMETTL3A-NPTII-F1和pBS-PsMETTL3A-NPTII-R1、pBS-PsMETTL3B-NPTII-F1和pBS-PsMETTL3B-NPTII-R1、pBS-PsMETTL16-NPTII-F1和pBS-PsMETTL16-NPTII-R1所示引物扩增获得)、NPTII基因(NPTII基因是以pYF2-Cas9骨架质粒为模板，经如表2所示pBS-PsMETTL3A-NPTII-F2和pBS-PsMETTL3A-NPTII-R2、pBS-PsMETTL3B-NPTII-F2和pBS-PsMETTL3B-NPTII-R2、pBS-PsMETTL16-NPTII-F3和pBS-PsMETTL16-NPTII-R3所示引物扩增获得)和PsMETTL3A、PsMETTL3B、PsMETTL16基因的下游1000bp序列(序列表中序列10-12所示，经如表2所示pBS-PsMETTL3A-NPTII-F3和pBS-PsMETTL3A-NPTII-R3、pBS-PsMETTL3B-NPTII-F3和pBS-PsMETTL3B-NPTII-R3、pBS-PsMETTL16-NPTII-F3和pBS-PsMETTL16-NPTII-R3所示引物扩增获得)。利用In-HD Cloning Kit分别将上述三个基因各自的三个扩增片段依次融合连接入克隆载体pBluescript II SK+(EcoR V酶切)，连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，37℃过夜培养后，使用通用引物M13F(序列：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’)/M13R(序列：5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’)扩增、测序验证克隆，分别将验证正确的含有依次连接的PsMETTL3A、PsMETTL3B、PsMETTL16基因的上游1000bp、NPTII基因和PsMETTL3A、PsMETTL3B、PsMETTL16基因的下游1000bp的重组表达载体命名为pBS-PsMETTL3A-NPTII、pBS-PsMETTL3B-NPTII、pBS-PsMETTL16-NPTII。
表2.PsMETTL3A、PsMETTL3B、PsMETTL16基因的全长敲除Donor载体构建扩增引物
2)pYF2.3G-PsMETTL3A、pYF2.3G-PsMETTL3B、pYF2.3G-PsMETTL16的构建：利用sgRNA设计网站EuPaGDT(http://grna.ctegd.uga.edu/)以及RNA结构在线分析工具(http://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/Servers/Predict1/Predict1.html)，分别选择特异性靶向PsMETTL3A、PsMETTL3B、PsMETTL16基因序列且二级结构较弱的sgRNA序列(sgPsMETTL3A：CTTCGAGTCTCTGCTGTGAG，靶向于PsMETTL3A基因的SEQID No.1的第965-984位；sgPsMETTL16：CTCGGACGAGTGCATCCTAG，靶向于PsMETTL3B基因的SEQ ID No.2的第656-675位；sgPsMETTL16：GGAGGAGAGGTGGCGTTTAT，靶向于PsMETTL16基因的SEQ ID No.3的第927-946位)，送至公司合成带有NheI和BsaI酶切位点以及HH ribozyme的sgRNA序列引物(如表4所示)。用无菌水溶解成100μM溶液。退火反应合成双链sgRNA序列，反应体系：3μL正向链溶液，3μL反向链溶液，3μL 10×T4 DNA Ligase Buffer(NEB)，4μL0.5M NaCl，21μL超纯无菌水，吸打混匀，100℃反应2min，放至室温自然冷却4h，之后将反应液稀释500倍。再取2μL 10×T4 DNA Ligase Buffer(NEB)，50ng pYF2.3G-Ribo-sgRNA载体(Nhe I/Bsa I双酶切)，4μL稀释后的双链sgRNA溶液，1μL T4 DNA Ligase，无菌超纯水补齐至20μL，室温反应30min，使用5μL连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，37℃过夜培养后，使用引物对RPL41_Pseq_F(序列：5’-CAAGCCTCACTTTCTGCTGACTG-3’)/M13F(序列：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’)进行菌落PCR验证，并测序验证阳性克隆，将验证正确可表达上述sgRNA的重组载体分别命名为pYF2.3G-PsMETTL3A、pYF2.3G-PsMETTL3B、pYF2.3G-PsMETTL16。
表3.合成PsMETTL3A、PsMETTL3B、PsMETTL16基因的序列敲除的sgRNA核苷酸序列
实施例3、大豆疫霉PsMETTL3A、PsMETTL3B、PsMETTL16基因敲除转化子的获得
采用CaCl2-PEG介导的原生质体转化方法制备PsNCR1基因敲除转化子，卵菌遗传转化的方法在文献“Fang,Y.,and Tyler,B.M.(2016).Efficient disruption andreplacement of an effector gene in the oomycete Phytophthora sojae usingCRISPR/Cas9.Molecular plant pathology,17(1),127-139.”中公开过。
敲除转化子的获得具体为将实施例2中PsMETTL3A、PsMETTL3B、PsMETTL16基因全长的敲除系列载体(Donor载体pBS-PsMETTL3A-NPTII、pBS-PsMETTL3A-NPTII、pBS-PsMETTL3A-NPTII，sgRNA载体pYF2.3G-PsMETTL3A、pYF2.3G-PsMETTL3B、pYF2.3G-PsMETTL16及Cas9表达质粒pYF-Cas9)共同转入大豆疫霉P6497的原生质体中，将生长出的转化子经G418抗性V8固体培养基平板25℃培养筛选，收集疑似转化子的菌丝体，提取DNA进行PCR测序验证，将阳性转化子再提取RNA进行Q-PCR验证。分别获得PsMETTL3A单敲除转化子Δ-PsMETTL3A，PsMETTL3B单敲除转化子Δ-PsMETTL3B，PsMETTL16单敲除转化子Δ-PsMETTL16。同时，将转入相同载体质粒、经过相同转化步骤但没有发生同源替换的转化子作为CK对照转化子，即EV-A、EV-B、EV-16。
实施例4、大豆疫霉PsMETTL3A、PsMETTL3B、PsMETTL16基因序列的敲除转化子的生物学性状分析
一、菌丝生长速率检测
将野生型大豆疫霉菌株P6497(WT)，对照转化子(EV-A、EV-B、EV-16)，实施例3得到的PsMETTL3A、PsMETTL3B、PsMETTL16基因全长的敲除转化子(Δ-PsMETTL3A，Δ-PsMETTL3B，Δ-PsMETTL16)，分别接种于加有15mL V8固体培养基的无菌培养皿(直径9cm)中央，25℃黑暗条件下培养3d，用十字交叉法测量各菌株的菌落直径，每个菌株3次重复。
结果显示，与野生型大豆疫霉菌株P6497(WT)及对照转化子(EV-A、EV-B、EV-16)相比，PsMETTL3B基因敲除转化子(Δ-PsMETTL3B)的菌丝生长速率显著下降，而PsMETTL3A和PsMETTL16基因敲除转化子(Δ-PsMETTL3A和Δ-PsMETTL16)的菌丝生长速率无明显变化(图1)。实验结果说明所述PsMETTL3B蛋白调控了大豆疫霉的菌丝生长。
二、孢子囊和游动孢子数量检测
制备10％V8固体培养基，将野生型大豆疫霉菌株P6497(WT)，对照转化子(EV-A、EV-B、EV-16)，实施例3得到的PsMETTL3A、PsMETTL3B、PsMETTL16基因全长的敲除转化子(Δ-PsMETTL3A，Δ-PsMETTL3B，Δ-PsMETTL16)分别接种于V8固体培养基上(直径9cm)，25℃条件下黑暗培养5-7天，每株菌株用5mm打孔器打取菌饼10个，放入20ml V8汁液体培养基的无菌培养皿(直径9cm)中，25℃黑暗培养3天后，用20ml无菌去离子水冲洗，每隔30min冲洗1次，共冲洗5次，之后加10ml去离子水定容，置于25℃黑暗条件下4-6h后，通过显微镜观察菌饼上孢子囊产生的数量及形态；8-10h后，通过显微镜观察无菌水中游动孢子产生的数量及形态，3次重复。
结果显示，与野生型大豆疫霉菌株P6497(WT)及对照转化子(EV-A、EV-B、EV-16)相比，实施例3得到的PsMETTL3A、PsMETTL3B、PsMETTL16基因全长的敲除转化子(Δ-PsMETTL3A，Δ-PsMETTL3B，Δ-PsMETTL16)孢子囊数量和释放的游动孢子产量均显著下降。此外，PsMETTL3B敲除转化子孢子囊形态部分畸形，这说明PsMETTL3A，PsMETTL3B，PsMETTL16均影响了大豆疫霉孢子囊发育和游动孢子释放(表4)。
三、休止孢形态检测及萌发率统计
采用上述方法获得野生型大豆疫霉菌株P6497(WT)、对照转化子(EV-A、EV-B、EV-16)和实施例3得到的PsMETTL3A、PsMETTL3B、PsMETTL16基因全长的敲除转化子(Δ-PsMETTL3A，Δ-PsMETTL3B，Δ-PsMETTL16)，将各菌株游动孢子悬浮液在涡旋振荡器上振荡处理1min，获得休止孢悬浮液，置于25℃黑暗培养8h，于光学显微镜下观察各处理休止孢的形态，并随机检测每100个休止孢中萌发的休止孢个数，每个菌株设置3个重复。
结果显示，野生型大豆疫霉菌株P6497(WT)及对照转化子(EV-A、EV-B、EV-16)相比，实施例3得到的PsMETTL3A、PsMETTL3B、PsMETTL16基因全长的敲除转化子(Δ-PsMETTL3A，Δ-PsMETTL3B，Δ-PsMETTL16)休止孢萌发率无显著性差异(表4)。
表4.PsMETTL3A、PsMETTL3B、PsMETTL16敲除转化子产孢量和休止孢萌发率
注：a P6497代表亲本菌株；EV-A、EV-B、EV-16代表对照转化子；Δ-PsMETTL3A，Δ-PsMETTL3B，Δ-PsMETTL16分别代表PsMETTL3A、PsMETTL3B、PsMETTL16基因敲除转化子。
b表中数值表示平均值±标准偏差。DPS软件中单因素ANOVA分析中F检验法用于计算野生型菌株和不同转化子之间的生物学性状差异，同一列中标注相同字母，表示不存在显著性差异(P<0.05)
四、卵孢子数量、形态检测及畸形率统计
将野生型大豆疫霉菌株P6497(WT)、对照转化子(EV-A、EV-B、EV-16)和实施例3得到的PsMETTL3A、PsMETTL3B、PsMETTL16基因全长的敲除转化子(Δ-PsMETTL3A，Δ-PsMETTL3B，Δ-PsMETTL16)接种于加有15ml V8固体培养基的无菌培养皿(直径9cm)中央，25℃黑暗条件下培养7-14天，通过显微镜观察卵孢子产生的数量和形态，并且统计畸形率，3次重复。
结果显示，与野生型大豆疫霉菌株P6497(WT)及对照转化子(EV-A、EV-B、EV-16)相比，实施例3得到的PsMETTL3A敲除转化子(Δ-PsMETTL3A)卵孢子数量显著下降，而PsMETTL3B、PsMETTL16基因敲除转化子(Δ-PsMETTL3B和Δ-PsMETTL16)卵孢子数量无明显变化(图2)。说明PsMETTL3A蛋白参与调控了大豆疫霉卵孢子的发育过程。
五、致病力的结果统计和观察
供试大豆植株品种为日本青，种植于育苗盘中(540mm×280mm，每穴80株)，培养基质为2：1配比的泥炭土和蛭石，加入适量的去离子水，在温室中(27±2℃；24h黑暗处理)培养7d备用。
参照上述方法制备游动孢子悬浮液(2×104游动孢子/ml)或在培养5-7d的大豆疫霉V8固体培养基上打5mm菌饼。在大豆黄花苗下胚轴约1cm处接种10μl游动孢子悬浮液或一个菌饼，每株菌接种10-20株黄花苗，25℃黑暗保湿培养3d后，调查大豆疫霉侵染黄花苗下胚轴的病斑长度(mm)。
结果显示，与野生型大豆疫霉菌株P6497(WT)及对照转化子(EV-A、EV-B、EV-16)相比，实施例3得到的PsMETTL3A和PsMETTL3B敲除转化子(Δ-PsMETTL3A和Δ-PsMETTL3B)菌株的致病力均显著下降，而PsMETTL16基因敲除转化子(Δ-PsMETTL16)致病力无明显变化(图3)。这说明PsMETTL3A和PsMETTL3B蛋白具有参与调控大豆疫霉侵染寄主植物的能力。

Claims (10)

1.大豆疫霉病菌m6A甲基转移酶亚基蛋白，是如下A1)或A2)或A3)或A4)的蛋白质：
A1)氨基酸序列是如序列4-6中任意一项所示的蛋白质；
A2)在如序列4-6中任意一项所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
A3)将如序列4-6中任意一项所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能由序列2所示的蛋白衍生的蛋白质；
A4)与如序列4-6中任意一项所示的氨基酸序列相似性在75％以上，优选在85％以上，更优选在95％以上且具有与如序列4-6中任意一项所示的氨基酸序列相同功能的氨基酸序列。
2.编码权利要求1所示的大豆疫霉病菌m6A甲基转移酶亚基蛋白的编码基因；优选的，所述编码基因为如下B1)或B2)或B3)：
B1)序列表中序列1-3中任意一项所述的核苷酸序列所示的DNA分子；
B2)与B1)所示的核苷酸序列的具有75％以上或85％以上或95％以上同一性，且编码权利要求1中所述蛋白质的cDNA分子或DNA分子；
B3)在严格条件下与B1)或B2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述蛋白质的cDNA分子或DNA分子。
3.权利要求2所述的编码基因转录得到的RNA分子；优选的，所述RNA分子的序列为如下C1)或C2)：
C1)与如序列1所示的DNA序列转录的RNA序列的相似性在75％以上，进一步优选在85％以上，更优选在95％以上且具有与如序列1所示的DNA序列转录的RNA序列相同功能的RNA序列；
C2)如序列1所示的DNA序列转录的RNA序列。
4.含有与权利要求2所示的编码基因或权利要求3所述的RNA分子相关的核酸分子的生物材料，为下述D1)至D10)中的任一种：
D1)含有权利要求2所述编码基因的表达盒；
D2)含有权利要求2所述编码基因的重组载体、或含有D1)所述表达盒的重组载体；
D3)含有权利要求2所述编码基因的重组微生物、或含有D1)所述表达盒的重组微生物、或含有D2)所述重组载体的重组微生物；
D4)含有权利要求2所述编码基因的转基因植物细胞系、或含有D1)所述表达盒的转基因植物细胞系；
D5)含有权利要求2所述编码基因的转基因植物组织、或含有D2)所述表达盒的转基因植物组织；
D6)含有权利要求2所述编码基因的转基因植物器官、或含有D2)所述表达盒的转基因植物器官；
D7)抑制权利要求2所述编码基因表达的核酸分子；
D8)含有D7)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系；
D9)抑制权利要求3所述RNA分子翻译的核酸分子；
D10)产生D9)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。
5.权利要求1所述大豆疫霉病菌m6A甲基转移酶亚基蛋白、权利要求2所示的编码基因或权利要求3所述的RNA分子或权利要求4所述的生物材料的应用，其特征在于：所述应用为下述1)-5)中任一种或几种：
1)在调控大豆疫霉孢子囊数量、卵孢子的发育能力和/或游动孢子产量中的应用；
2)在调控大豆疫霉菌丝生长速率中的应用；
3)在调控大豆疫霉侵染寄主能力中的应用；
4)在调控大豆疫霉对寄主的致病性中的应用；
5)在抑制和/或杀死大豆疫霉病菌中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其中，包括通过抑制如权利要求2所述的编码基因中的转录或使其灭活，或抑制如权利要求3所述的RNA分子的翻译，或抑制和/或灭活如权利要求1所述的大豆疫霉病菌m6A甲基转移酶亚基蛋白来实现1)-5)所述的应用。
7.权利要求1所述大豆疫霉病菌m6A甲基转移酶亚基蛋白、权利要求2所示的编码基因或权利要求3所述的RNA分子或权利要求4所述的生物材料或权利要求5所述的蛋白组合或者DNA组合在作为抑菌或杀菌剂靶标筛选大豆疫霉病菌抑菌或杀菌剂中的应用。
8.一种筛选或辅助筛选大豆疫霉病菌抑菌和/或杀菌剂的方法，所述方法包括将待检测物应用于所述大豆疫霉病菌，当所述待检测物能够抑制如权利要求2所述的编码基因的转录，或抑制如权利要求3所述的RNA分子的翻译，或抑制如权利要求1所述的大豆疫霉病菌m6A甲基转移酶亚基蛋白中的一种或者几种的活性或使其失活，则所述待检测物为所述大豆疫霉病菌的抑菌和/或杀菌剂。
9.一种降低大豆疫霉病菌的活性的方法，包括下述步骤：抑制如权利要求2所述的编码基因的转录或使其缺失，或抑制如权利要求3所述的RNA分子中的翻译，或抑制如权利要求1所述的大豆疫霉病菌m6A甲基转移酶亚基蛋白中的一种或者几种的活性或使其失活；
其中，所述降低大豆疫霉病菌的活性为降低大豆疫霉病菌对寄主的侵染能力和/或对寄主的致病性，和/或者降低大豆疫霉病菌的菌丝生长速度，和/或降低游动孢子的产量；
优选的，通过对大豆疫霉中序列表中序列1-3所示的基因进行基因敲除以使序列表中序列4-6所示的蛋白质失活。
10.抑制权利要求1所述大豆疫霉病菌m6A甲基转移酶亚基蛋白表达和/或活性的物质在制备植物大豆疫霉病菌杀菌剂中的应用；优选的，所述抑制所述大豆疫霉病菌m6A甲基转移酶亚基蛋白表达和/或活性的物质为所述大豆疫霉病菌m6A甲基转移酶亚基蛋白表达和/或抑制所述大豆疫霉病菌m6A甲基转移酶亚基蛋白的编码基因的转录和/或抑制所述大豆疫霉病菌m6A甲基转移酶亚基蛋白的编码基因转录得到的RNA分子的翻译的物质。
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