CN108359688A

CN108359688A - 提高植物对赤霉素抑制剂敏感性的方法及其应用

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Publication number: CN108359688A
Application number: CN201710056193.6A
Authority: CN
Inventors: 李召虎; 张娟; 李芳军; 张明才; 杜明伟; 田晓莉; 段留生
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2017-01-25
Filing date: 2017-01-25
Publication date: 2018-08-03
Anticipated expiration: 2037-01-25
Also published as: CN108359688B

Abstract

本发明公开了提高植物对赤霉素抑制剂敏感性的方法及其应用。本发明所提供的提高植物对赤霉素抑制剂敏感性的方法，包括向受体植物中导入蛋白质的编码基因得到转基因植物的步骤；所述转基因植物与所述受体植物相比所述赤霉素抑制剂敏感性增加；所述蛋白质为如下a)或b)或c)的蛋白质：a)氨基酸序列是序列1的第1‑821位氨基酸的蛋白质；b)氨基酸序列是序列1的蛋白质；c)在a)或b)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。实验证明，本发明的提高植物赤霉素抑制剂敏感性的方法可以用来提高植物对赤霉素抑制剂的敏感性，并可用本发明的株高相关蛋白HRP调控植物的株高。

Description

提高植物对赤霉素抑制剂敏感性的方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中提高植物对赤霉素抑制剂敏感性的方法及其应用。

背景技术

缩节安(N,N-dimethylpiperidinium chloride,DPC)，其化学名称为1,1-二甲基哌啶翁氯化物,是一种抑制型的植物生长调节剂，对植物营养生长有延缓作用，可抑制细胞伸长，减弱植株顶芽长势，控制其纵横生长。棉花应用DPC后，叶片加厚，叶色变深，叶绿素含量加大，叶片光合速率提高(何钟佩等,1991；李丕明等,1991；田晓莉等,2004)，因而有利于田间透光，增强棉株下部的光照，并可抑制棉株主茎的生长,使棉株节间缩短，株型紧凑，从而防止了棉株旺长，推迟其封行期。DPC还可提高棉株根系活力(田晓莉等,2006)，同时DPC还能提高细胞膜的稳定性,增加棉株抗逆性(邵莉相等,2004)。

DPC在全国棉花上的应用占种植面积的80％以上，可在田间生长环境条件下对棉花进行调控，可通过缩短节间和减少节间数目，抑制棉花主茎的生长，降低株高，使其株型紧凑，有效控制棉花的旺长，塑造理想的株型从而优化其经济性状(何钟佩等,1991；Reddyet al.,1992)。在番茄栽培过程中，使用DPC能够抑制番茄植株徒长，增加幼苗叶绿素和可溶性糖的含量，降低相对电导率，显著提高大果番茄的产量(毛秀杰等,1999；王梅等,2012)。但DPC对禾本科作物如玉米调控效应不显著，应用1000mg/L DPC处理玉米郑单958，株高和茎粗与对照都没有显著的差异(陈吟，2012)。部分植物对DPC不敏感，局限了DPC在作物生产中的应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何提高植物的赤霉素抑制剂敏感性。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了提高植物对赤霉素抑制剂敏感性的方法。

本发明所提供的提高植物对赤霉素抑制剂敏感性的方法，包括A1)或A2)：

A1)增加受体植物中蛋白质的含量或增强所述受体植物中所述蛋白质的活性得到转基因植物；

A2)向所述受体植物中导入蛋白质的编码基因得到转基因植物；

所述转基因植物与所述受体植物相比所述赤霉素抑制剂敏感性增加；

所述蛋白质的名称为株高相关蛋白(HRP)，为如下a)或b)或c)的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列1的第1-821位氨基酸的蛋白质；

b)氨基酸序列是序列1的蛋白质；

c)在a)或b)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

其中，序列1的第1-821位氨基酸为株高相关蛋白HRP的氨基酸序列，由序列2的第1-2463位核苷酸所示的株高相关蛋白HRP基因编码；序列1的第824-996位氨基酸为GFP的氨基酸序列，由序列2的第2470-2720位核苷酸所示的DNA分子编码。

为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列1所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1、标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述b)中的HRP可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述b)中的HRP的编码基因可通过将序列表中序列2的第1-2463位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述d)中的HRP可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述d)中的HRP的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

所述方法还包括将所述受体植物中的CPS基因敲除。所述CPS基因可为序列表中序列4所示的DNA分子。所述敲除具体可为将所述CPS基因的AGCTGAAGCGGATCCCAAG突变为AGCTGAAGCGGATCTCCAAG。

上述方法中，所述HRP的编码基因为如下1)或2)或3)或4)或5)或6)所示的基因：

1)核苷酸序列是序列表中序列2的第1-2463位核苷酸的cDNA分子或DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述HRP的cDNA分子或基因组DNA分子；

3)在严格条件下与1)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述HRP的cDNA分子或基因组DNA分子；

4)核苷酸序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；

5)与4)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述HRP的cDNA分子或基因组DNA分子；

6)在严格条件下与4)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述HRP的cDNA分子或基因组DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

其中，序列2的核苷酸序列编码序列1所示的氨基酸序列。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码HRP的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的HRP的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码HRP且具有HRP功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列1或序列1的第1-821位氨基酸所示的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述方法中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

在本发明的实施例中，所述HRP的编码基因(即序列2的第1-821位核苷酸所示的DNA分子)通过含有HRP基因表达盒的HRP基因重组表达载体导入目的植物中。

上述方法中，其中所述HRP基因可先进行如下修饰，再导入受体种子植物中，以达到更好的表达效果：

1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述HRP基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；

2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；

3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；

4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；

5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV,MCMV和AMV)。

所述HRP基因重组表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒栽体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach,1998，Method for PlantMolecular Biology VIII,Academy Press,New York,pp.411-463；Geiserson and Corey,1998,Plant Molecular Biology(2nd Edition).)。

上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述HRP基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

为解决上述技术问题，本发明还提供了下述M1或M2的产品：

M1、所述蛋白质；

M2、与所述蛋白质相关的生物材料，为下述B1)至B20)中的任一种：

B1)编码所述蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；

B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；

B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；

B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；

B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；

B9)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

B10)含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B11)含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

B12)含有B4)所述重组载体的转基因植物细胞系；

B13)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织；

B14)含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；

B15)含有B3)所述重组载体的转基因植物组织；

B16)含有B4)所述重组载体的转基因植物组织；

B17)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官；

B18)含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；

B19)含有B3)所述重组载体的转基因植物器官；

B20)含有B4)所述重组载体的转基因植物器官。

上述产品中，B2)所述的含有编码HRP的核酸分子的表达盒(HRP基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达HRP的DNA，该DNA不但可包括启动HRP基因转录的启动子，还可包括终止HRP基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S：来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol 120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I⁹⁸⁵)Nature313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic AcidsRes.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。

可用现有的表达载体构建含有所述HRP基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

上述产品中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

上述产品中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。

上述产品中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。

在本发明的一个实施方式中，HRP的编码基因(即序列2的第1-2463位所示的DNA分子)通过含有HRP的编码基因的表达盒的重组载体导入根癌农杆菌GV3101中。所述重组载体为用序列2的第1-2463位所示的DNA分子替换载体pSuper1300的Xba I和Kpn I识别序列间的DNA片段得到的重组载体pSuper1300-HRP，所述pSuper1300-HRP与所述pSuper1300的差别仅在于将所述pSuper1300-HRP的Xba I和Kpn I识别序列间的DNA片段替换为序列2的第1-2463位核苷酸所示的DNA分子。所述重组载体pSuper1300-HRP表达序列1所示的蛋白质。

上述产品中，B1)所述核酸分子可为所述1)或所述2)或所述3)或所述4)或所述5)或所述6)所示的基因。

为解决上述技术问题，本发明还提供了下述N1-N4中任一应用：

N1、所述方法在调控植物株高中的应用；

N2、所述产品在调控植物株高中的应用；

N3、所述产品在培育对赤霉素抑制剂敏感性增加植物中的应用；

N4、所述产品在培育株高增加植物中的应用。

上述应用中，所述植物为转基因植物。

上述应用中，N4所述应用包括向受体植物中导入所述HRP的编码基因得到转基因植物的步骤；所述转基因植物与所述受体植物相比株高增加。

上述应用中，N1或N2所述应用包括S1)和S2)：

S1)向受体植物中导入所HRP的编码基因得到转基因植物；

S2)对所述转基因植物施用所述赤霉素抑制剂得到与所述转基因植物相比株高降低的植物。

上述应用中，所述HRP的编码基因的编码序列是序列表中序列2的DNA分子。

上述应用中，其中所述HRP基因可先进行如下修饰，再导入受体种子植物中，以达到更好的表达效果：

上述应用中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述HRP基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

本发明中，所述赤霉素抑制剂可为赤霉素合成抑制剂，如赤霉素生物合成抑制剂。所述赤霉素抑制剂具体可为缩节安DPC。所述缩节安具体可为江苏润泽农化有限公司公司产品，货号为HG/T2856-1997。

本发明中，所述植物可为双子叶植物或单子叶植物。所述双子叶植物可为十字花科植物，如拟南芥(Arabidopsis thaliana)。所述单子叶植物具体可为玉米。

本发明中，所述赤霉素抑制剂敏感性增加体现在在相同的赤霉素抑制剂浓度增加量下，转基因植物的株高降低率高于受体植物。如，30mg/L缩节胺处理的转HRP基因植物的株高相对于0mg/L缩节胺处理的转HRP基因植物的株高的株高降低率为33.92％，30mg/L缩节胺处理的受体植物的株高相对于0mg/L缩节胺处理的受体植物的株高的株高降低率为13.60％。

实验证明，本发明的提高植物赤霉素抑制剂敏感性的方法可以提高植物对赤霉素抑制剂的敏感性的方法，本发明的提高植物赤霉素抑制剂敏感性的方法中的株高相关蛋白HRP和DPC可以调控拟南芥的株高，并且转基因拟南芥的株高随DPC浓度的增加而降低。DPC处理的HRP::ga1-1的株高降低率均远高于相应DPC浓度处理的ZmCPS::ga1-1、pSuper1300::ga1-1和ga1-1：30mg/L DPC处理的HRP::ga1-1的株高降低率为ga1-1的2.49倍；500mg/L DPC处理的HRP::ga1-1的株高降低率为ga1-1的3.47倍。DPC处理的HRP::ga1-5的株高降低率均远高于相应DPC浓度处理的ZmCPS::ga1-1、pSuper1300::ga1-5和ga1-5：30mg/L DPC处理的HRP::ga1-5的株高降低率为ga1-5的4.68倍；500mg/L DPC处理的HRP::ga1-5的株高降低率为ga1-5的6.66倍。

实验证明，本发明的株高相关蛋白HRP可以提高拟南芥的株高：未处理的HRP::ga1-1、30mg/L DPC处理的HRP::ga1-1和500mg/L DPC处理的HRP::ga1-1的株高分别为相应处理的ga1-1株高的3.54倍、2.71倍和1.71倍；未处理的HRP::ga1-5、30mg/L DPC处理的HRP::ga1-5和500mg/L DPC处理的HRP::ga1-5的株高分别为相应处理的ga1-5株高的2.26倍、1.65倍和1.00倍。

实验证明，本发明的提高植物赤霉素抑制剂敏感性的方法可以用来提高植物对赤霉素抑制剂的敏感性，并可用本发明的株高相关蛋白HRP调控植物的株高。

附图说明

图1为DPC处理前的转HRP和ZmCPS基因拟南芥的株高。其中，A为ZmCPS::ga1-1的株高，B为HRP::ga1-1的株高，C为ZmCPS::ga1-5的株高，D为HRP::ga1-5的株高。

图2为不同处理的拟南芥的株高。其中，A为不同浓度的DPC处理的ZmCPS::ga1-1的株高，B为不同浓度的DPC处理的HRP::ga1-1的株高，C为不同浓度的DPC处理的ZmCPS::ga1-5的株高，D为不同浓度的DPC处理的HRP::ga1-5的株高。

图3为不同浓度DPC处理的HRP::ga1-1和HRP::ga1-5的株高。其中，A为不同浓度DPC处理的HRP::ga1-1的株高；B为不同浓度DPC处理的HRP::ga1-5的株高。

图4为ZmCPSKO与WT的植株表型。

图5为转HRP的zmcps-ko植株对DPC敏感性分析。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的载体pSuper1300为文献(Lipid transfer protein 3 as atarget of MYB96mediates freezing and drought stress in Arabidopsis，Journal ofExperimental Botany,Guo et al.,Vol.64,No.6,pp.1755–1767,2013)中的pSuper1300::GFP，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的根癌农杆菌GV3101为文献(A Plasma Membrane ReceptorKinase,GHR1,Mediates Abscisic Acid-and Hydrogen Peroxide-Regulated StomatalMovement in Arabidopsis,Hua et al.,The Plant Cell,Vol.24:2546–2561,June 2012)中的Agrobacterium strain GV3101，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的拟南芥突变体ga1-1和ga1-5为俄亥俄州立大学拟南芥生物资源中心产品。

下述实施例中的0mg/L的DPC水溶液为超纯水，下述实施例中的30mg/L的DPC水溶液为向1L超纯水中加入30mg DPC得到的溶液，下述实施例中的500mg/L的DPC水溶液为向1L超纯水中加入500mg DPC得到的溶液。

下述实施例中拟南芥的生长条件均为：光周期为16h光/8h暗，光强为60μmol/m²/s，湿度60％-70％，温度为22℃的培养室中培养。

下述实施例中的缩节胺为江苏润泽农化有限公司公司产品，货号为HG/T2856-1997，缩节安为赤霉素生物合成抑制剂。

实施例1、利用调控植物株高的成套试剂调控拟南芥的株高

调控植物株高的成套试剂，由株高相关蛋白和缩节安(N,N-dimethylpiperidinium chloride,，DPC，也被称为1,1-二甲基哌啶翁氯化物)组成；所述株高相关蛋白，名称为HRP，其氨基酸序列为序列表中序列1的第1-821位。株高相关蛋白(HRP)基因为序列2的第1-2463位所示的DNA分子。

HRP基因来源于亚洲棉(G.arboreum)石系亚1号(SXY1)(Li et al.,Genomesequence of the cultivated cotton Gossypium arboreum，Nature GenNeticsVOLUME46 NUMBER 6 JUNE 2014)。株高相关蛋白HRP基因为序列表中序列2所示的DNA分子。

1、重组载体和重组农杆菌的构建

将载体pSuper1300的Xba I和Kpn I识别序列间的片段替换为序列2的第1-2463位核苷酸所示的DNA分子(即HRP基因)得到重组载体pSuper1300-HRP，pSuper1300-HRP与pSuper1300的差别仅在于将pSuper1300-HRP的Xba I和Kpn I识别序列间的DNA片段替换为序列2的第1-2463位核苷酸所示的DNA分子。重组载体pSuper1300-HRP表达序列1所示的株高相关蛋白HRP与GFP形成的融合蛋白。

将载体pSuper1300的Spe I和Kpn I识别序列间的片段替换为序列3的第1-2565位所示的DNA分子得到重组载体pSuper1300-ZmCPS，pSuper1300-ZmCPS与pSuper1300的差别仅在于将pSuper1300-ZmCPS的Spe I和Kpn I识别序列间的DNA片段替换为序列3的所示的DNA分子。重组载体pSuper1300-ZmCPS表达序列3第1-2565位编码蛋白与GFP形成的融合蛋白。

其中，序列3的第1-2565位为ZmCPS基因的核苷酸序列，ZmCPS基因来源于玉米(B73)。

将pSuper1300-HRP导入根癌农杆菌GV3101中，得到重组菌，将该重组菌命名为GV3101-pSuper1300-HRP；将pSuper1300-ZmCPS导入根癌农杆菌GV3101中，得到重组菌，将该重组菌命名为GV3101-pSuper1300-ZmCPS；将pSuper1300导入根癌农杆菌GV3101中，得到重组菌，将该重组菌命名为GV3101-pSuper1300。

2、转基因拟南芥的构建

分别利用步骤1的GV3101-pSuper1300-HRP、GV3101-pSuper1300-ZmCPS和GV3101-pSuper1300分别转化拟南芥突变体ga1-1和ga1-5，构建转基因拟南芥。向拟南芥突变体ga1-1转HRP基因的方法如下：

2.1拟南芥的培养:将突变体ga1-1种子在4℃条件下春化72h，点种于赤霉素培养基(赤霉素培养基为向MS培养基中加入赤霉素(GA₃)得到的GA₃浓度为10^-4M的固体培养基)中于22℃、16h光/8h暗、光强为60μmol/m²/s、湿度60％-70％的培养室中培养，生长到4片真叶时移栽到营养土与蛭石等比例混合的种植钵中，其中突变体要两天喷一次10^-4M GA₃。

2.2农杆菌菌液的制备:取检测正确、划线培养的单克隆GV3101-pSuper1300-HRP接种的农杆菌接种于5ml YEP液体培养基(含抗生素)中，28℃、220rpm下培养30h，按体积比为1:100将得到的菌液转接到50ml YEP(含抗生素)中，28℃，220rpm培养过夜，至OD₆₀₀为0.6-0.8；4℃于6000g离心15min，所收集的菌体重悬于1/2MS+5％蔗糖溶液，转化前加入0.02％-0.05％Silwet L-77(一种表面活性剂，为美国AMRESCO公司产品)。

2.3转化:待拟南芥植株开花后，剪去主枝顶端，促进侧枝发展。在剪枝后的6天内，将准备好的农杆菌蘸湿拟南芥未露白的花序上。将转化后的拟南芥用充满气的黑色塑料袋包住，暗培养24h后去掉黑色塑料袋。恢复光照按正常方法培养植株至结实，收获成熟的转HRP基因ga1-1(HRP::ga1-1)T₁代种子。

按照如下方法获得HRP::ga1-1的纯系植株：①将T₁代HRP::ga1-1种子播种在含有潮霉素的MS固体培养基上进行筛选，将真叶健康呈深绿色、根伸长至培养基中的抗潮霉素的阳性植株移入土壤中，收获T₂代HRP::ga1-1种子；②将T₂代HRP::ga1-1种子播种在含有潮霉素的MS固体培养基上得到T₂代HRP::ga1-1植株，利用潮霉素进行筛选，选择抗潮霉素：不抗潮霉素＝3:1的T₂代HRP::ga1-1植株并将其中的抗潮霉素植株移入土壤中，收获T₃代HRP::ga1-1种子(抗潮霉素植株表现为：真叶健康呈深绿色，根伸长至培养基中；不抗潮霉素植株表现为：真叶发黄，根不伸长)；③将T₃代HRP::ga1-1种子播种在含有潮霉素的MS培养基上，得到T₃代HRP::ga1-1植株，利用潮霉素进行筛选，选择全部为抗潮霉素的T₃代HRP::ga1-1植株并将其移栽到土壤中，得到HRP::ga1-1的纯系植株。

按照上述方法，将ga1-1替换为ga1-5，其他步骤均不变，分别得到名称为HRP::ga1-1的转HRP基因ga1-1及其纯系植株。

按照上述方法，将GV3101-pSuper1300-HRP分别替换为GV3101-pSuper1300-ZmCPS和GV3101-pSuper1300，其他步骤均不变，分别得到名称为ZmCPS::ga1-1的转ZmCPS基因ga1-1及其纯系植株和名称为pSuper1300::ga1-1的转空载体ga1-1及其纯系植株。

按照上述方法，将ga1-1替换为ga1-5，并将GV3101-pSuper1300-HRP分别替换为GV3101-pSuper1300-ZmCPS和GV3101-pSuper1300，其他步骤均不变，分别得到名称为ZmCPS::ga1-5的转ZmCPS基因ga1-5及其纯系植株和名称为pSuper1300::ga1-5的转空载体ga1-5及其纯系植株。

3、转基因植株的鉴定

3.1转HRP基因的纯系拟南芥中HRP基因表达量的检测

利用Real-Time PCR鉴定步骤2的HRP::ga1-1的纯系植株和HRP::ga1-5的纯系植株中HRP基因的表达水平及步骤2的ZmCPS::ga1-1的纯系植株和ZmCPS::ga1-5的纯系植株中ZmCPS基因的表达水平，检测HRP基因的表达水平的引物为5’-ACCGAGGACTCGCAGAGTTA-3’和5’-ACCTTTAGCATTTGGCGATG-3’，检测ZmCPS基因的表达水平的引物为5’-TGCAGCCACTTATCGACCAG-3’和5’-AGGCGAGGGTGTTGATCATG-3’。内参为AtUbI基因，内参的引物为5’-ATTACCCGATGGGCAAGTCA-3’和5’-CACAAACGAGGGCTGGAACA-3’。结果显示，HRP::ga1-1的纯系植株和HRP::ga1-5的纯系植株中均表达HRP基因，ZmCPS::ga1-1的纯系植株和ZmCPS::ga1-5的纯系植株中均表达ZmCPS基因。

3.2转HRP基因的纯系拟南芥中HRP的检测

利用Westernblot鉴定步骤2的HRP::ga1-1的纯系植株、HRP::ga1-5的纯系植株中的HRP蛋白以及步骤2的ZmCPS::ga1-1的纯系植株和ZmCPS::ga1-5的纯系植株中的ZmCPS蛋白，一抗为Anti-GFP Tag Rabbit(Roche产品，货号为14717400)。结果显示，HRP::ga1-1的纯系植株和HRP::ga1-5的纯系植株中均有HRP蛋白表达，ZmCPS::ga1-1的纯系植株和ZmCPS::ga1-5的纯系植株中均有ZmCPS蛋白表达。

4、DPC对转HRP基因拟南芥株高的影响

实验重复三次，每次重复试验的具体步骤如下：

4.1 DPC可以降低转HRP基因拟南芥株高

随机选取步骤2的HRP::ga1-1的纯系植株30株，将其随机分为三组，每组10株，在这三组植株自播种(播种当天记为播种第1天)的第33天时分别进行以下处理：一组喷施水(即0mg/L的DPC水溶液)后，培养12天，得到未处理的HRP::ga1-1；一组喷施30mg/L的DPC水溶液后，培养12天，得到30mg/L DPC处理的HRP::ga1-1；一组喷施500mg/L的DPC水溶液后，培养12天，得到500mg/L DPC处理的HRP::ga1-1。

按照上述方法，将HRP::ga1-1的纯系植株分别替换为HRP::ga1-5的纯系植株、ZmCPS::ga1-1的纯系植株、ZmCPS::ga1-5的纯系植株、PsSuper1300::ga1-1的纯系植株和PsSuper1300::ga1-5的纯系植株，其他步骤均不变，分别得到未处理的HRP::ga1-5、30mg/LDPC处理的HRP::ga1-5、500mg/L DPC处理的HRP::ga1-5、未处理的ZmCPS::ga1-1、30mg/LDPC处理的ZmCPS::ga1-1、500mg/L DPC处理的ZmCPS::ga1-1、未处理的ZmCPS::ga1-5、30mg/L DPC处理的ZmCPS::ga1-5、500mg/L DPC处理的ZmCPS::ga1-5、未处理的PsSuper1300::ga1-1、30mg/L DPC处理的PsSuper1300::ga1-1、500mg/L DPC处理的PsSuper1300::ga1-1、未处理的PsSuper1300::ga1-5、30mg/L DPC处理的PsSuper1300::ga1-5和500mg/L DPC处理的PsSuper1300::ga1-5。

将ga1-1培养至自播种(播种当天记为播种第1天)的第33天时，取30株，将其随机分为三组，每组10株，在这三组植株分别进行以下处理：一组喷施0mg/L的DPC水溶液后，培养12天，得到未处理的ga1-1；一组喷施30mg/L的DPC水溶液后，培养12天，得到30mg/L DPC处理的ga1-1；一组喷施500mg/L的DPC水溶液后，培养12天，得到500mg/L DPC处理的ga1-1。

按照上述方法，将ga1-1替换为ga1-5，其他步骤均不变，分别得到未处理的ga1-5、30mg/L DPC处理的ga1-5和500mg/L DPC处理的ga1-5。

分别测量上述各拟南芥在处理前的的株高(图1)及不同处理后的株高(图2和表2)。

表2、不同处理的拟南芥的株高及株高降低率

结果显示，在相同的DPC浓度下，pSuper1300::ga1-1和ga1-1经DPC处理后株高降低率差异不大，而DPC对ZmCPS::ga1-1基本无影响，DPC处理的HRP::ga1-1的株高降低率均远高于相应DPC浓度处理的pSuper1300::ga1-1和ga1-1：30mg/L DPC处理的HRP::ga1-1的株高降低率为ga1-1的2.49倍；500mg/L DPC处理的HRP::ga1-1的株高降低率为ga1-1的3.47倍。在相同的DPC浓度下，pSuper1300::ga1-5和ga1-5经DPC处理后株高降低率差异不大，而DPC对ZmCPS::ga1-5基本无影响，DPC处理的HRP::ga1-5的株高降低率均远高于相应DPC浓度处理的pSuper1300::ga1-5和ga1-5：30mg/L DPC处理的HRP::ga1-5的株高降低率为ga1-5的4.68倍；500mg/L DPC处理的HRP::ga1-5的株高降低率为ga1-5的6.66倍。表明，HRP可以提高拟南芥对DPC的敏感性。

结果显示，本发明的株高相关蛋白HRP可以提高拟南芥的株高：未处理的HRP::ga1-1、30mg/L DPC处理的HRP::ga1-1和500mg/L DPC处理的HRP::ga1-1的株高分别为相应处理的ZmCPS::ga1-1株高的1.03倍、0.68倍和0.41倍，分别为相应处理的ga1-1株高的3.54倍、2.71倍和1.71倍；未处理的HRP::ga1-5、30mg/L DPC处理的HRP::ga1-5和500mg/L DPC处理的HRP::ga1-5的株高分别为相应处理的ZmCPS::ga1-5株高的0.95倍、0.64倍和0.38倍，分别为相应处理的ga1-5株高的2.26倍、1.65倍和1.00倍。

4.2不同浓度的DPC对转HRP基因拟南芥株高的影响

随机选取步骤2的HRP::ga1-1的纯系植株70株，将其随机分为七组，每组10株，在这七组植株自播种(播种当天记为播种第1天)的第33天时时分别进行以下处理：一组喷施水(即0mg/L的DPC水溶液)后，培养12天，得到未处理的HRP::ga1-1；一组喷施30mg/L的DPC水溶液后，培养12天，得到30mg/L DPC处理的HRP::ga1-1；一组喷施50mg/L的DPC水溶液后，培养12天，得到50mg/L DPC处理的HRP::ga1-1；一组喷施100mg/L的DPC水溶液后，培养12天，得到100mg/L DPC处理的HRP::ga1-1；一组喷施300mg/L的DPC水溶液后，培养12天，得到300mg/L DPC处理的HRP::ga1-1；一组喷施500mg/L的DPC水溶液后，培养12天，得到500mg/LDPC处理的HRP::ga1-1一组喷施1000mg/L的DPC水溶液后，培养12天，得到1000mg/L DPC处理的HRP::ga1-1。

按照上述方法，将HRP::ga1-1的纯系植株替换为HRP::ga1-5的纯系植株，其他步骤均不变，分别得到未处理的HRP::ga1-5、30mg/L DPC处理的HRP::ga1-5、50mg/L DPC处理的HRP::ga1-5、100mg/L DPC处理的HRP::ga1-5、300mg/L DPC处理的HRP::ga1-5、500mg/LDPC处理的HRP::ga1-5和1000mg/L DPC处理的HRP::ga1-5。

分别测量上述不同处理拟南芥的株高(图3)，平均株高见表3。

结果显示，转HRP基因拟南芥的株高受DPC的浓度的影响，转HRP基因拟南芥的株高随DPC浓度的增加而降低。

表3、不同浓度DPC处理的转HRP基因拟南芥的株高(cm)

实施例2、DPC对转HRP到Zmcps-ko植株敏感性分析

一、利用CRISPR的技术获得了矮化的zmcps ko突变体植株

成功构建了pBUE411-2gR CRISPR-Cas9 ZmCPS载体，利用农杆菌侵染玉米自交系B73(Schnable P S,Wilson R K.The B73 maize genome:complexity,diversity,anddynamics.[J].Science,2009,326(5956):1112.)(WT)幼胚的方法成功把载体转入玉米胚中，敲除ZmCPS基因，所用靶序列为AGCTGAAGCGGATCCCAAG，经过筛选最后成功获得zmcpsKnock out突变体(ZmCPSKO，Zmcps-ko)植株。

CRISPR实验方案—pBUE411-2gR载体构建、PCR鉴定及测序确认，参考中国农业大学陈其军教授方法(Xing H L,Dong L,Wang Z P,et al.A CRISPR/Cas9 toolkit formultiplex genome editing in plants[J].BMC Plant Biology,2014,14(1):327.)

ZmCPS基因序列：

ATGAAGCTCCTCTCGCCGGCGGCCGCACCGTCGTCCTCGCCGTTGTTCCCTCCTCGCATCGTCGAAGCTGCAGCTCGTCAATCAGGTCCATGCCGTATCCGCATCCGTATCCGTGGCAAAGCAGCAGCAGCAGGAGGAGGAGGAGGCGCGGGCGCGACGGGGCCCCGCGGCAGCCTCAGGCTCGCCGGGTGGTGGAGAGCGCAGCAGCAGGCCCCGGCCACGGCGACGACAACGCAGCAGCCTGACAACGTCTCCAGTGCTAAAGTGTTCCAGACCAGCCGTGTGGAAACCGAGTCCGAAATTGCGAAATGGCCAGGGAAACCACAAGTAGCGGGAGATCCCGAGTGCTGAGGAGGCAGAGCTGCAGCCACTTATCGACCAGGTGAGGGCGATGCTACGGTCGATGAACGACGGGGATACCAGCGCCTCGGCGTACGACACGGCGTGGGTGGCGATGGTGCCGAAGGTGGGCGGCGACGGCGGCGCCCAGCCCCAGTTCCCGGCCACCGTGCGCTGGATCGTGGACCACCAGCTGCCCGACGGCTCCTGGGGCGACTCGGCCCTGTTCTCCGCCTACGACCGCATGATCAACACCCTCGCCTGCGTCGTCGCGCTGACCAAGTGGTCGCTGGAGCCCGCGAGGTGCGAGGCGGGGCTCTCGTTCCTGCACGAGAACATGTGGAGGCTAGCGGAGGAGGAGGCGGAGTCGATGCCCATCGGCTTCGAGATCGCCTTCCCTTCTCTCATCCAGACGGCTAGGGACCTGGGCGTCGTCGACTTCCCGTACGGACACCCGGCGCTGCAGAGCATATACGCCAACAGGGAAGTCAAGCTGAAGCGGATCCCAAGGGACATGATGCACAGGGTCCCGACGTCCATCCTGCACAGCCTTGAAGGGATGCCTGACCTGGACTGGCCGAGGCTTCTGAACCTCCAGTCCTGCGACGGCTCCTTCTTGTTCTCTCCTTCGGCTACCGCTTACGCGCTGATGCAAACCGGTGACAAGAAGTGCTTCGAATACATCGACAGGATTGTCAAAAAATTCAACGGGGGAGTCCCCAATGTTTATCCGGTCGATCTTTTCGAGCACATCTGGGTTGTGGATCGGTTGGAGCGACTCGGGATCTCCCGCTACTTCCAACGAGAGATTGAGCAGTGCATGGACTATGTGAACAGGCACTGGACTGAAGATGGGATTTGCTGGGCTAGGAAATCCAATGTGAAGGATGTGGATGACACAGCTATGGCTTTCCGACTACTAAGGCTACATGGATACAATGTCTCTCCAAGTGTGTTTAAGAACTTTGAGAAAGATGGAGAGTTCTTTTGTTTTGTGGGCCAATCGACTCAAGCCGTCACTGGGATGTATAACCTCAACAGAGCCTCTCAGATAAGTTTTCAAGGAGAGGATGTATTGCATCGTGCTAGGGTTTTCTCGTATGAGTTTCTGAGACAGAGAGAAGAACAAGGCATGATCCGTGATAAATGGATCGTTGCCAAGGATCTACCTGGCGAGGTGCAATATACACTAGACTTCCCTTGGTATGCAAGCTTGCCTCGTGTAGAGGCAAGAACCTATCTAGATCAATATGGTGGTAAAGATGACGTTTGGATTGGAAAGACACTCTACAGGATGCCTCTTGTGAATAACGACACATATCTAGAGTTGGCAATAAGGGATTTCAACCATTGCCAAGCTCTGCATCAGCTTGAGTGTAATGGGCTGCAAACGTGGTACAAGGATAATTGCCTTGACGCTTTTGGAGTAGAACCACAAGATGTTTTAAGATCTTACTTTTTAGCTGCTGCTTGCATTTTTGAACCTAGCCGTGCTGCTGAGCGGCTTGCATGGGCTAGAACGTCAATGATTGCCAATGCCATTTCTACACATCTTCGTGACATTTCGGAAGACAAGAAGAGATTGGAATGTTTCGTGCACTGTCTCTATGAAGAAAACGATGTATCATGGCTTAAACGAAATCCTAATGATGTTATTCTTGAGAGGGCACTTCGAAGATTAATTAACTTATTAGCACAAGAAGCATTGCCAATTCATGAAGGACAAAGATTCATACACAGTCTATTGAGTCTTGCATGGACCGAATGGATGTTGCAAAAGGCAAATAAAGAAGAAAACAAATATCACAAATGCAGTGGTATAGAACCACAATACATGGTTCATGATAGGCAAACATACTTACTTTTAGTTCAGGTTATTGAGATTTGTGCTGGACGAATTGGTGAGGCTGTGTCAATGATAAACAACAAGGATAATGATTGGTTTATTCAACTCACATGTGCTACTTGTGACAGTCTTAACCATAGGATGTTACTGTCCCAGGATACTATGAAGAATGAAGCAAGAATAAATTGGATTGAGAAGGAAATCGAGTTGAATATGCAAGAGCTTGCTCAATCTCTCCTTTTGAGATGTGATGAGAAAACTAGCAATAAGAAGACCAAGAAAACCTTATGGGATGTCCTAAGAAGTTTATACTATGCTACTCATTCCCCACAACATATGATCGATAGACATGTTTCCAGAGTTATCTTTGAGCCTGTTTAA

引物如下：

MT1-BsF:ATATATGGTCTCTGGCGAAATTGCGAAATGGCCAGGTT

MT1-F0:TGAAATTGCGAAATGGCCAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC

MT2-R0:AACCTTGGGATCCGCTTCAGCTGCTTCTTGGTGCC

MT2-BsR:ATTATTGGTCTCTAAACCTTGGGATCCGCTTCAGCT

下划线的是Msc1和BamH1的识别序列。

PCR扩增：以稀释100倍的pCBC-MT1T2(Xing H L,Dong L,Wang Z P,et al.ACRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants[J].BMC PlantBiology,2014,14(1):327.)为模板进行四引物PCR扩增。-BsF/-BsR为正常引物浓度；-F0/-R0稀释20倍。

纯化回收PCR产物，建立如下酶切-连接体系(restriction-ligation)：

取5ul转化大肠杆菌感受态。Kan板筛选。OsU3-FD3+TaU3-RD＝831bp菌落PCR鉴定，OsU3-FD3和TaU3-FD2测序确认。

注1：菌落PCR及测序引物：

OsU3-FD3 GACAGGCGTCTTCTACTGGTGCTAC

TaU3-RD:CTCACAAATTATCAGCACGCTAGTC[rc:GACTAGCGTGCTGATAATTTGTGAG]

TaU3-FD:TTAGTCCCACCTCGCCAGTTTACAG

TaU3-FD2:TTGACTAGCGTGCTGATAATTTGTG

农杆菌介导玉米幼胚转化流程如下：

1.材料与方法

1.1实验材料

1.1.1植物材料

玉米(Zea mays L.)自交系B73(Schnable P S,Wilson R K.The B73 maizegenome:complexity,diversity,and dynamics.[J].Science,2009,326(5956):1112.)

1.1.2实验菌株

农杆菌EHA105(单子叶植物侵染率高)

1.1.3质粒载体

由陈其军老师提供CRISPR/Cas9体系相关质粒：pBUE411；pCBC-MT1T2。

1.2常用的培养基和溶液的配置

1.2.1常用培养基的配置

LB培养基:Tryptone 10g,NaCl 10g,Yeast Extract 5g。若为固体培养基，则再加15g Agar,

定容至1L。

YEP培养基：Tryptone 10g,NaCl 5g,Yeast Extract 10g。若为固体培养基，则再加15g Agar,定容至1L。

YEB培养基:Tryptone 10g,Sucrose 5g,Yeast Extract 1g,MgS04}7H20 0.5g。若为固体培养基，则再加15g Agar,定容至1L。

1.2.2母液的配置

(1)N6大量元素(母液浓度20×):2L

配2L母液的方法:先称取6.64g CaCl₂·2H₂0溶于700mL蒸馏水中，再称取其余4种成分，溶于700mL蒸馏水中，待两种溶液均完全溶解后，然后混在一起后，定容至2L。

(2)B 5微量(母液浓度100×):1L

(3)Fe盐(母液浓度100×):1L

方法:先用热水将Na₂EDTA溶解，然后将FeS0₄·7H₂0逐渐溶于Na₂EDTA溶液中，定容至1L。

(4)RT V(母液浓度200×):1L

以上各种维生素均先溶于水，而叶酸先用1mL稀氨水溶解后，再加蒸馏水定容至1L。

(5)MS大量元素(母液浓度20×)：1L

(6)MS微量元素(母液浓度200×)：500mL

(7)MS有机物(母液浓度200×):500mL

(8)Fe盐(母液浓度100×):1L

1.2.3转化玉米所用的培养基的配置

1.2.4常用溶液的配置

Amp(100mg/mL)：称取5g Amp定容于50mL无菌水中，过滤灭菌分装，-20℃保存。

Kan(100mg/mL)：称取5g Kan定容于50mL无菌水中，过滤灭菌分装，-20℃保存。

Rif(50mg/mL)：称取0.5gRif定容于10mLDMSO中，过滤灭菌分装，-20℃保存。

AS(200mmoL/L)：称取0.3924gAS药品定容于10mLDMSO中，过滤灭菌分装，-20℃避光保存。

Cef(100mg/mL)：称取25g Cef定容于250mL无菌水中，过滤灭菌分装，-20℃保存。

Cb(100mg/mL)：称取25g Cb定容于250mL无菌水中，过滤灭菌分装，-20℃保存。

AgNO₃(5mg/mL)：称取50mg AgNO₃定容于10mL无菌水中，过滤灭菌分装，-20℃避光保存。注意：配置的时候要戴手套。

草丁膦(10mg/L)：称取100mg草丁膦溶于10ml无菌水中，过滤灭菌后分装，-20℃保存。

6-BA(2mg/mL)：称取0.2g6-BA先用1mol/L NaOH溶解完全加水定容至100mL，过滤灭菌分装，4℃保存。

2,4-D(1mg/mL)：称取100mg 2,4-D溶于少量的无水乙醇中，用无菌水定容至100mL，过滤灭菌分装，4℃保存。

NAA(1mg/mL)：称取100mg NAA溶于少量的1mol/L NaOH中，待完全溶解后用无菌水定容至100mL，过滤灭菌分装，4℃保存。

1.3农杆菌转化玉米幼胚

1.3.1玉米的授粉

(1)待雌穗出现时及时套袋，花丝抽出后授粉，并保持套袋至收获；

(2)授粉后挂上小牌，写上授粉的父母本或授粉方式和日期，10-12天后收获。

1.3.2幼胚的剥离

(1)取授粉后10-12天，幼胚大小为1.5-2.0mm的B73雌穗；

(2)将新收获的玉米雌穗去掉苞叶、花丝以及雌穗的头尾部分，将一只枪式镊子从顶部插入雌穗，玉米喷完酒精拿到超净台中，放到装有70％酒精的广口瓶中浸泡3分钟；

(3)取出雌穗，置于空培养皿中备用；

(4)用左手持住镊子，右手用装有22号刀片的手术刀切去籽粒的上半部分；

(5)用10号刀片，将刀尖插入籽粒下部的果皮与胚乳之间，将胚乳挑出，轻轻的将幼胚剥离，置于装有侵染液(含AS和AgN0₃)的2mL离心管中；

剥胚过程中的注意事项：

(1)提前把侵染液配好，用之前加AS(1L侵染液加500uLAS，AS现用现加，侵染液使用之前分装到小瓶中，避免交叉污染，侵染液不能放太长时间，出现沉淀，要重新配置；

(2)加完AS的侵染液要分装到2mL的离心管中，灭菌的离心管提前准备好，一般一个玉米一个离心管，注意避光，用报纸盖住，AS一定用之前加，因为其活化需要时间；

(3)剥胚注意不要污染，一般剥完胚用侵染液清洗至少两次，每次30秒；

1.3.3农杆菌菌液的制备

提前从-80℃冰箱里取出保存的菌液，充分解冻之后，取200ul加到30mL LB培养基中(含Kan,Rif)26℃，180rpm过夜培养。第二天当菌液变浑浊时，从摇床取出，进行二次活化，取3～5mL加到30mL LB培养基中，26℃，180rpm摇4～6小时，注意在菌液使用前一个小时，向菌液中加入AS(30mL加3ul)。把摇好的菌液分别倒在两个50mL离心管中进行离心，离心机设置为26℃,4000rpm,10min。离心后将上清液倒掉，然后加入侵染液重悬菌体，调OD值至0.6～0.8，注意添加时先加少部分，不够再加，若测出来高就再加侵染液，调好备用。

1.3.4幼胚的农杆菌侵染

(1)吸出保存幼胚的离心管中侵染液，加入1.5ml准备好的菌液，垂直静放15分钟；

(2)准备灭过菌的空皿，往里面铺2～3层滤纸，再往玉米共培养基里铺一层滤纸；

(3)15分钟后，将幼胚连同菌液倒在铺有无菌滤纸的培养皿中，超净台中吹干，但不要使幼胚失水；

(4)将吹干的幼胚转移至共培养培养基中，盾片朝上，24℃黑暗共培养三天；

1.3.5玉米转化材料的恢复、筛选、分化和生根培养

(1)恢复培养:将共培养三天的幼胚转移到恢复培养基中，如果共培养的幼胚长菌，可将长菌的幼胚小心地挑到2ml灭菌的离心管或三角瓶中，用无菌水洗菌直至水清，然后用含有100mg/mL头孢的无菌水洗30min，最后将幼胚倒在铺有无菌滤纸的培养皿中吹干，再将幼胚转移到恢复培养基中，28℃黑暗培养7天；

(2)筛选培养:将恢复培养的幼胚转移到筛选培养基中暗培养，每两周继代一次，筛选次数和筛选浓度视情况而定；(目前为PPT筛选，2～3次，筛选压力为5～10mg/L)

(3)诱导分化培养:将筛选后的愈伤转移到诱导培养基(高糖培养基)中，暗培养两周；

(4)分化培养:将恢复培养两周的抗性愈伤转移到分化培养基中，见光培养，光照周期为光照/黑暗:16h/8h，每两周继代一次；

(5)生根培养:待分化出的幼苗长至1至2个叶片以上时，将幼苗从抗性愈伤上切下，移入广口瓶中进行生根培养；当再生苗长至瓶口，根上长出足够侧根后可进行炼苗；

(6)再生苗的炼苗移栽:将小苗移到温室中放置2-3天后，将封口膜打开，加入一层无菌水，再放置2-3天，然后将小苗移栽入小盆中，移栽之前用自来水将小苗根上的培养基冲洗干净，待小苗比较壮实后移入温室大盆中继续培养。

1.4阳性植株检测

待幼苗长至4展叶后取幼叶进行检测鉴定。

针对目的片段进行PCR扩增和测序鉴定。

突变体转基因材料PCR和测序检测引物

转基因植株目的片段检测引物

棉花HRP-CDS-F CTAGTCTAGAATGTTTTCCCATTCCTTCCT

棉花HRP-CDS-R CGGGGTACCGCGTACTTTCTCAAAG

经过检测测序突变的植株与WT相比，插入了一个碱基导致整个蛋白翻译错乱，靶序列AGCTGAAGCGGATCCCAAG突变为AGCTGAAGCGGATCTCCAAG，ZmCPS基因的其他序列未发生编码，最后不能合成有活性的CPS蛋白，导致GA合成途径下游无法合成赤霉素，导致植株矮化(图4)。

二、DPC对转HRP的Zmcps-ko株系敏感性分析

利用农杆菌侵染玉米幼胚的方法，将实施例1的GV3101-pSuper1300-HRP转化步骤1.1的ZmCPSKO玉米胚，经过筛选获得阳性转HRP的玉米，该转HRP的玉米中含有目的基因HRP，并利用GV3101-pSuper1300-ZmCPS和GV3101-pSuper1300作为对照，分别得到ZmCPS对照玉米和空载对照玉米。

将WT以及转基因植株在拔节期间喷施DPC，检测其DPC敏感性：玉米长至7展叶和12展叶时利用500ppm(5mM)DPC对整株进行喷施，分别于处理后2周和抽雄后测定株高、穗位高。

结果说明，WT对DPC是不敏感的，而转基因植株对DPC变得敏感(图5，株系号为443的结果)。从表4分析，转HRP的Zmcps-ko株系与野生型(B73)在正常条件下株高没有差异，但DPC处理显著降低了转基因株系株高和穗位，但野生型对DPC不敏感。

表4、DPC对转HRP的zmcps-ko株系株型的调控

<110> 中国农业大学

<120> 提高植物对赤霉素抑制剂敏感性的方法及其应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1062

<212> PRT

<213> 亚洲棉(G.arboreum)

<400> 1

Met Phe Ser His Ser Phe Leu Ser Leu Pro Ser Ser Ser Pro Ser Ser

1 5 10 15

Ile Val Ser Phe Ser Asp Asn Gln Tyr His Pro Pro Leu Pro Phe Ala

20 25 30

Gly Ile Trp Pro Leu Trp Gly Lys Asp Lys Gly Asp Asn Val Asp Ile

35 40 45

Arg Pro Leu Cys Arg Ala Ile Ser Lys Pro Arg Thr Gln Glu Tyr Ala

50 55 60

Gly Val Phe Gln Asn Gly Leu Pro Val Ile Lys Trp Lys Glu Ile Val

65 70 75 80

Asp Asp Asp Ile Glu Glu Glu Gly Ala Leu Lys Val Tyr Glu Ser Asn

85 90 95

Lys Val Lys Glu Arg Val Asp Thr Ile Lys Ser Met Leu Gly Ser Met

100 105 110

Glu Asp Gly Glu Ile Ser Ser Ser Ala Tyr Asp Thr Ala Trp Val Ala

115 120 125

Leu Val Glu Asp Val Ser Gly Ser Gly Ala Pro Gln Phe Pro Ser Ser

130 135 140

Leu Glu Trp Ile Ala Asn Asn Gln Leu Pro Asp Gly Ser Trp Gly Asp

145 150 155 160

Arg Gln Ile Phe Met Ala His Asp Arg Leu Ile Asn Thr Leu Ala Cys

165 170 175

Val Ile Ala Leu Lys Thr Trp Gly Ile His Pro Asp Lys Cys Gln Lys

180 185 190

Gly Val Ser Phe Phe Lys Asp Asn Ile Ser Lys Leu Glu Asn Glu Ser

195 200 205

Glu Glu His Met Pro Ile Gly Phe Glu Val Ala Phe Pro Ser Leu Leu

210 215 220

Glu Ile Ala Arg Ser Leu His Ile Glu Val Pro Tyr Asp Ser Pro Val

225 230 235 240

Phe Lys Asp Ile Tyr Ala Lys Arg Asp Leu Lys Leu Thr Arg Ile Pro

245 250 255

Lys Glu Ile Met His Asn Val Pro Thr Thr Leu Leu His Ser Leu Glu

260 265 270

Gly Met Pro Asp Leu Asp Trp Glu Lys Leu Leu Lys Leu Gln Cys Ile

275 280 285

Asp Gly Ser Phe Leu Phe Ser Pro Ser Ser Thr Ala Phe Ala Leu Met

290 295 300

Gln Thr Lys Gly Glu Asn Cys Leu Arg Tyr Leu Met Lys Thr Val Gln

305 310 315 320

Arg Phe Asn Gly Gly Val Pro Asn Val Tyr Pro Val Asp Leu Phe Glu

325 330 335

His Ile Trp Thr Val Asp Arg Leu Gln Arg Leu Gly Ile Ser Arg Tyr

340 345 350

Phe His Pro Glu Ile Lys Glu Cys Leu Asp Tyr Val Tyr Arg Tyr Trp

355 360 365

Thr Glu Asp Gly Ile Ser Trp Ala Arg Asn Thr Arg Val Tyr Asp Ile

370 375 380

Asp Asp Thr Ala Met Gly Phe Arg Leu Leu Arg Val His Gly Tyr Glu

385 390 395 400

Val Ser Ser Asp Val Phe Arg His Phe Glu Lys Gly Gly Glu Phe Phe

405 410 415

Cys Phe Val Gly Gln Ser Asn Gln Ala Ile Thr Gly Ile Phe Asn Leu

420 425 430

Tyr Arg Ala Ser Gln Val Leu Phe Pro Gly Glu Lys Ile Leu Glu Asp

435 440 445

Ala Lys Arg Phe Ser Ser Lys Phe Leu Thr Gln Lys Gln Ala Ala Asp

450 455 460

Glu Leu Leu Asp Lys Trp Ile Ile Thr Lys Asp Leu Pro Gly Glu Val

465 470 475 480

Gly Leu Ala Leu Asn Leu Pro Trp Tyr Ala Ser Leu Pro Arg Val Glu

485 490 495

Thr Arg Phe Tyr Ile Glu Gln Tyr Gly Gly Glu Asp Asp Val Trp Ile

500 505 510

Gly Lys Thr Leu Tyr Arg Met Arg Tyr Val Asn Asn Asn Val Phe Leu

515 520 525

Asp Leu Ala Lys Gln Asp Tyr Asn Asn Cys Gln Ala Leu His Arg Met

530 535 540

Glu Trp Asp Ser Met Gln Lys Trp Tyr Ser Glu Met Gly Leu Ala Asp

545 550 555 560

Phe Gly Val Thr Arg Arg Ser Leu Leu Leu Thr Tyr Phe Met Ala Ala

565 570 575

Ala Ser Ile Phe Glu Leu Glu Arg Ser Gln Glu Arg Leu Ala Trp Ala

580 585 590

Lys Thr Ala Phe Leu Val Asp Thr Ile Ser Ser Ser Phe Asp Asn Ala

595 600 605

Arg Lys Pro Lys Asp Leu Arg Asn Ser Phe Leu Leu Val Phe Arg Thr

610 615 620

Val Val Asp Ala Arg Phe Gly His Ile Asn Ala Arg Lys Leu Asp Ser

625 630 635 640

Asn Arg Thr Ile Gln Lys Met Ile Asp Ile Leu Leu Arg Thr Leu Asn

645 650 655

His Leu Ser Leu Asp Ala Leu Val Ala His Gly Arg Asp Ile Ser Cys

660 665 670

Ser Ile Arg Arg Ala Trp Glu Lys Trp Met Leu Met Trp Val Glu Asp

675 680 685

Gly Asp Arg His Arg Gly Leu Ala Glu Leu Val Val Gln Thr Ile Asn

690 695 700

Leu Ser Ser Gly Arg Trp Ser Leu Asp Glu Leu Leu Ser His Pro Arg

705 710 715 720

Tyr Asp Pro Leu Ser Ser Leu Thr Asn Ser Val Cys His Gln Leu Tyr

725 730 735

His Arg Gln Met Leu Lys Val His Val Asn Gly Cys Tyr Asn Asn Glu

740 745 750

Thr Glu Asn Asn Ile Thr Arg Glu Ile Asp Ser Asn Met Gln Glu Leu

755 760 765

Val Gln Leu Val Leu Gln Asn Pro Ser Ala Ala Asp Asp Gln Asn Ser

770 775 780

Glu Phe Arg Gln Thr Phe Leu Thr Val Ala Arg Ser Phe Tyr Tyr Ala

785 790 795 800

Ala His Cys Asp Leu Asp Thr Ile Thr Phe His Ile Ala Lys Val Leu

805 810 815

Phe Glu Lys Val Arg Gly Thr Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe

820 825 830

Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly

835 840 845

His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly

850 855 860

Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro

865 870 875 880

Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser

885 890 895

Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met

900 905 910

Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly

915 920 925

Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val

930 935 940

Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile

945 950 955 960

Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile

965 970 975

Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg

980 985 990

His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln

995 1000 1005

Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His

1010 1015 1020

Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys

1025 1030 1035

Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile

1040 1045 1050

Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys

1055 1060

<210> 2

<211> 3195

<212> DNA

<213> 亚洲棉(G.arboreum)

<400> 2

atgttttccc attccttcct ctccctcccc tcctcctctc cttcttctat agtttccttc 60

tccgataatc aatatcatcc tcccttaccc tttgcaggca tttggccgtt atggggtaaa 120

gacaaaggcg ataacgttga tattcggccc ttatgcagag ctatatccaa accccgcact 180

caagaatatg ctggcgtgtt tcaaaatggt ctgccagtta taaagtggaa ggagattgtg 240

gatgatgaca tagaagaaga gggagctctt aaggtttatg agtcgaataa ggtaaaggaa 300

cgtgtggaca ccattaagtc gatgctgggt tccatggagg atggagagat aagtagctca 360

gcttatgaca cagcctgggt tgctctggtt gaagacgtta gcggtagcgg tgctcctcag 420

tttccatcca gcctcgaatg gatcgctaac aatcagctcc ccgatggatc ctggggcgat 480

agacaaatat tcatggcaca tgatcgtctg atcaacactt tagcttgtgt tattgccttg 540

aaaacatggg gtattcatcc tgacaaatgc cagaaagggg tgtcgttttt caaagataat 600

ataagcaaac tcgaaaacga gagtgaggag cacatgccaa tcgggtttga agtggctttt 660

ccttcgcttc tggagatagc tcgaagttta cacattgaag taccgtatga ctcccctgtc 720

tttaaagaca tctatgcaaa gagagatcta aagctcacaa ggataccaaa ggagataatg 780

cataatgtac ccacaacact actccatagc cttgaaggga tgccagactt ggactgggaa 840

aagcttttga agttgcagtg catagatggg tctttcttgt tctcgccatc ctccactgcc 900

ttcgcactca tgcaaaccaa aggtgagaat tgcctcagat atttaatgaa aactgttcaa 960

agattcaatg ggggagtccc caatgtgtat ccggttgacc tgtttgaaca tatttggact 1020

gtcgaccgct tgcaacgcct tgggatttca agatatttcc acccagaaat taaagaatgc 1080

ctagattacg tttatagata ctggactgaa gatggaattt cctgggcaag aaacactcgg 1140

gtttatgaca ttgacgacac ggccatgggg tttaggttac taagggtaca tggatacgag 1200

gtttcttcag atgtgttccg acattttgag aaaggcgggg agttcttctg ctttgtgggg 1260

cagtccaacc aagccataac cgggattttc aacctgtata gggcttccca ggtgctgttc 1320

cctggagaaa agattcttga ggatgccaag cgcttttcat ccaaattttt aacacaaaaa 1380

caagcggctg atgaattatt agacaaatgg atcattacca aagacttacc tggtgaggtt 1440

gggttggcat tgaatctccc atggtatgca agcctgccta gagttgaaac aaggttttac 1500

atagaacaat atggaggtga agatgatgtg tggattggaa aaactcttta caggatgcgg 1560

tatgtgaaca ataatgtgtt ccttgatctt gcaaaacaag actacaataa ttgccaagct 1620

ttgcatagga tggaatggga tagtatgcaa aagtggtact cggaaatggg tctggctgat 1680

tttggggtga cccgtagatc tcttctctta acttatttta tggcggcagc cagcatattc 1740

gagcttgaaa ggtcgcaaga gcggctggct tgggctaaga ccgctttctt ggtcgacacc 1800

atctcctctt cttttgacaa tgcaaggaaa cctaaggacc ttaggaattc tttcctccta 1860

gtcttcagaa ctgttgttga tgcacgattt ggccacatta atgcgaggaa gttggactca 1920

aacaggacaa ttcagaagat gatagacatc ttgcttcgga ccctgaacca tctatcattg 1980

gacgcacttg tggctcatgg tcgagacatt agctgcagca ttcgccgtgc ttgggaaaag 2040

tggatgctga tgtgggtgga ggatggtgat aggcaccgag gactcgcaga gttagtggtg 2100

cagaccatca acctcagctc tggccgttgg tccttggacg aactgttgtc tcatccccga 2160

tacgacccac tctccagcct cacaaattca gtttgccatc agctttatca tcgccaaatg 2220

ctaaaggtgc acgtcaatgg ctgctacaat aatgaaacag agaacaacat aacccgggaa 2280

atagattcca acatgcaaga gctcgttcag ttagtactgc aaaatccctc ggccgctgat 2340

gaccaaaact cagaattcag gcaaacattt cttacggtgg cacggagttt ttactatgct 2400

gcacactgtg acttagacac catcacattt catattgcta aagtactctt tgagaaagta 2460

cgcggtacca tggtgagcaa gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc 2520

gagctggacg gcgacgtaaa cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat 2580

gccacctacg gcaagctgac cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc 2640

tggcccaccc tcgtgaccac cctgacctac ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac 2700

cacatgaagc agcacgactt cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc 2760

accatcttct tcaaggacga cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc 2820

gacaccctgg tgaaccgcat cgagctgaag ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc 2880

ctggggcaca agctggagta caactacaac agccacaacg tctatatcat ggccgacaag 2940

cagaagaacg gcatcaaggt gaacttcaag atccgccaca acatcgagga cggcagcgtg 3000

cagctcgccg accactacca gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc 3060

gacaaccact acctgagcac ccagtccgcc ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat 3120

cacatggtcc tgctggagtt cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg 3180

tacaagtaag agctc 3195

<210> 3

<211> 2565

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

atgaagctcc tctcgccggc ggccgcaccg tcgtcctcgc cgttgttccc tcctcgcatc 60

gtcgaagctg cagctcgtca atcaggtcca tgccgtatcc gcatccgtat ccgtggcaaa 120

gcagcagcag caggaggagg aggaggcgcg ggcgcgacgg ggccccgcgg cagcctcagg 180

ctcgccgggt ggtggagagc gcagcagcag gccccggcca cggcgacgac aacgcagcag 240

cctgacaacg tctccagtgc taaagtgttc cagaccagcc gtgtggaaac cgagtccgaa 300

attgcgaaat ggccagggaa accacaagac cttgaggatg agcaccaggc tgaggaggca 360

gagctgcagc cacttatcga ccaggtgagg gcgatgctac ggtcgatgaa cgacggggat 420

accagcgcct cggcgtacga cacggcgtgg gtggcgatgg tgccgaaggt gggcggcgac 480

ggcggcgccc agccccagtt cccggccacc gtgcgctgga tcgtggacca ccagctgccc 540

gacggctcct ggggcgactc ggccctgttc tccgcctacg accgcatgat caacaccctc 600

gcctgcgtcg tcgcgctgac caagtggtcg ctggagcccg cgaggtgcga ggcggggctc 660

tcgttcctgc acgagaacat gtggaggcta gcggaggagg aggcggagtc gatgcccatc 720

ggcttcgaga tcgccttccc ttctctcatc cagacggcta gggacctggg cgtcgtcgac 780

ttcccgtacg gacacccggc gctgcagagc atatacgcca acagggaagt caagctgaag 840

cggatcccaa gggacatgat gcacagggtc ccgacgtcca tcctgcacag ccttgaaggg 900

atgcctgacc tggactggcc gaggcttctg aacctccagt cctgcgacgg ctccttcttg 960

ttctctcctt cggctaccgc ttacgcgctg atgcaaaccg gtgacaagaa gtgcttcgaa 1020

tacatcgaca ggattgtcaa aaaattcaac gggggagtcc ccaatgttta tccggtcgat 1080

cttttcgagc acatctgggt tgtggatcgg ttggagcgac tcgggatctc ccgctacttc 1140

caacgagaga ttgagcagtg catggactat gtgaacaggc actggactga agatgggatt 1200

tgctgggcta ggaaatccaa tgtgaaggat gtggatgaca cagctatggc tttccgacta 1260

ctaaggctac atggatacaa tgtctctcca agtgtgttta agaactttga gaaagatgga 1320

gagttctttt gttttgtggg ccaatcgact caagccgtca ctgggatgta taacctcaac 1380

agagcctctc agataagttt tcaaggagag gatgtattgc atcgtgctag ggttttctcg 1440

tatgagtttc tgagacagag agaagaacaa ggcatgatcc gtgataaatg gatcgttgcc 1500

aaggatctac ctggcgaggt gcaatataca ctagacttcc cttggtatgc aagcttgcct 1560

cgtgtagagg caagaaccta tctagatcaa tatggtggta aagatgacgt ttggattgga 1620

aagacactct acaggatgcc tcttgtgaat aacgacacat atctagagtt ggcaataagg 1680

gatttcaacc attgccaagc tctgcatcag cttgagtgta atgggctgca aacgtggtac 1740

aaggataatt gccttgacgc ttttggagta gaaccacaag atgttttaag atcttacttt 1800

ttagctgctg cttgcatttt tgaacctagc cgtgctgctg agcggcttgc atgggctaga 1860

acgtcaatga ttgccaatgc catttctaca catcttcgtg acatttcgga agacaagaag 1920

agattggaat gtttcgtgca ctgtctctat gaagaaaacg atgtatcatg gcttaaacga 1980

aatcctaatg atgttattct tgagagggca cttcgaagat taattaactt attagcacaa 2040

gaagcattgc caattcatga aggacaaaga ttcatacaca gtctattgag tcttgcatgg 2100

accgaatgga tgttgcaaaa ggcaaataaa gaagaaaaca aatatcacaa atgcagtggt 2160

atagaaccac aatacatggt tcatgatagg caaacatact tacttttagt tcaggttatt 2220

gagatttgtg ctggacgaat tggtgaggct gtgtcaatga taaacaacaa ggataatgat 2280

tggtttattc aactcacatg tgctacttgt gacagtctta accataggat gttactgtcc 2340

caggatacta tgaagaatga agcaagaata aattggattg agaaggaaat cgagttgaat 2400

atgcaagagc ttgctcaatc tctccttttg agatgtgatg agaaaactag caataagaag 2460

accaagaaaa ccttatggga tgtcctaaga agtttatact atgctactca ttccccacaa 2520

catatgatcg atagacatgt ttccagagtt atctttgagc ctgtt 2565

<210> 4

<211> 2566

<212> DNA

<213> 玉米

<400> 4

atgaagctcc tctcgccggc ggccgcaccg tcgtcctcgc cgttgttccc tcctcgcatc 60

gtcgaagctg cagctcgtca atcaggtcca tgccgtatcc gcatccgtat ccgtggcaaa 120

gcagcagcag caggaggagg aggaggcgcg ggcgcgacgg ggccccgcgg cagcctcagg 180

ctcgccgggt ggtggagagc gcagcagcag gccccggcca cggcgacgac aacgcagcag 240

cctgacaacg tctccagtgc taaagtgttc cagaccagcc gtgtggaaac cgagtccgaa 300

attgcgaaat ggccagggaa accacaagta gcgggagatc ccgagtgctg aggaggcaga 360

gctgcagcca cttatcgacc aggtgagggc gatgctacgg tcgatgaacg acggggatac 420

cagcgcctcg gcgtacgaca cggcgtgggt ggcgatggtg ccgaaggtgg gcggcgacgg 480

cggcgcccag ccccagttcc cggccaccgt gcgctggatc gtggaccacc agctgcccga 540

cggctcctgg ggcgactcgg ccctgttctc cgcctacgac cgcatgatca acaccctcgc 600

ctgcgtcgtc gcgctgacca agtggtcgct ggagcccgcg aggtgcgagg cggggctctc 660

gttcctgcac gagaacatgt ggaggctagc ggaggaggag gcggagtcga tgcccatcgg 720

cttcgagatc gccttccctt ctctcatcca gacggctagg gacctgggcg tcgtcgactt 780

cccgtacgga cacccggcgc tgcagagcat atacgccaac agggaagtca agctgaagcg 840

gatcccaagg gacatgatgc acagggtccc gacgtccatc ctgcacagcc ttgaagggat 900

gcctgacctg gactggccga ggcttctgaa cctccagtcc tgcgacggct ccttcttgtt 960

ctctccttcg gctaccgctt acgcgctgat gcaaaccggt gacaagaagt gcttcgaata 1020

catcgacagg attgtcaaaa aattcaacgg gggagtcccc aatgtttatc cggtcgatct 1080

tttcgagcac atctgggttg tggatcggtt ggagcgactc gggatctccc gctacttcca 1140

acgagagatt gagcagtgca tggactatgt gaacaggcac tggactgaag atgggatttg 1200

ctgggctagg aaatccaatg tgaaggatgt ggatgacaca gctatggctt tccgactact 1260

aaggctacat ggatacaatg tctctccaag tgtgtttaag aactttgaga aagatggaga 1320

gttcttttgt tttgtgggcc aatcgactca agccgtcact gggatgtata acctcaacag 1380

agcctctcag ataagttttc aaggagagga tgtattgcat cgtgctaggg ttttctcgta 1440

tgagtttctg agacagagag aagaacaagg catgatccgt gataaatgga tcgttgccaa 1500

ggatctacct ggcgaggtgc aatatacact agacttccct tggtatgcaa gcttgcctcg 1560

tgtagaggca agaacctatc tagatcaata tggtggtaaa gatgacgttt ggattggaaa 1620

gacactctac aggatgcctc ttgtgaataa cgacacatat ctagagttgg caataaggga 1680

tttcaaccat tgccaagctc tgcatcagct tgagtgtaat gggctgcaaa cgtggtacaa 1740

ggataattgc cttgacgctt ttggagtaga accacaagat gttttaagat cttacttttt 1800

agctgctgct tgcatttttg aacctagccg tgctgctgag cggcttgcat gggctagaac 1860

gtcaatgatt gccaatgcca tttctacaca tcttcgtgac atttcggaag acaagaagag 1920

attggaatgt ttcgtgcact gtctctatga agaaaacgat gtatcatggc ttaaacgaaa 1980

tcctaatgat gttattcttg agagggcact tcgaagatta attaacttat tagcacaaga 2040

agcattgcca attcatgaag gacaaagatt catacacagt ctattgagtc ttgcatggac 2100

cgaatggatg ttgcaaaagg caaataaaga agaaaacaaa tatcacaaat gcagtggtat 2160

agaaccacaa tacatggttc atgataggca aacatactta cttttagttc aggttattga 2220

gatttgtgct ggacgaattg gtgaggctgt gtcaatgata aacaacaagg ataatgattg 2280

gtttattcaa ctcacatgtg ctacttgtga cagtcttaac cataggatgt tactgtccca 2340

ggatactatg aagaatgaag caagaataaa ttggattgag aaggaaatcg agttgaatat 2400

gcaagagctt gctcaatctc tccttttgag atgtgatgag aaaactagca ataagaagac 2460

caagaaaacc ttatgggatg tcctaagaag tttatactat gctactcatt ccccacaaca 2520

tatgatcgat agacatgttt ccagagttat ctttgagcct gtttaa 2566

Claims

1.提高植物对赤霉素抑制剂敏感性的方法，包括A1)或A2)：

所述蛋白质为如下a)或b)或c)的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列1的第1-821位氨基酸的蛋白质；

b)氨基酸序列是序列1的蛋白质；

c)在a)或b)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法还包括将所述受体植物中序列4所示的基因敲除。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述蛋白质的编码基因为如下1)或2)或3)或4)或5)或6)所示的基因：

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1所述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

3)在严格条件下与1)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

4)核苷酸序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；

5)与4)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1所述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

6)在严格条件下与4)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述赤霉素抑制剂为赤霉素合成抑制剂。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述植物为A1)或A2)：

A1)双子叶植物或单子叶植物；

A2)玉米或拟南芥。

6.权利要求1所述蛋白质。

7.与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料，为下述B1)至B20)中的任一种：

B1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；

B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；

B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；

B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；

B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；

B9)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

B10)含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B11)含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

B12)含有B4)所述重组载体的转基因植物细胞系；

B13)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织；

B14)含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；

B15)含有B3)所述重组载体的转基因植物组织；

B16)含有B4)所述重组载体的转基因植物组织；

B17)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官；

B18)含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；

B19)含有B3)所述重组载体的转基因植物器官；

B20)含有B4)所述重组载体的转基因植物器官。

8.下述N1或N2的应用：

N1、权利要求1-5中任一所述的方法在调控植物株高中的应用；

N2、权利要求1所述蛋白质或权利要求7所述生物材料在调控植物株高中的应用；

N3、权利要求1所述蛋白质或权利要求7所述生物材料在培育对赤霉素抑制剂敏感性增加植物中的应用；

N4、权利要求1所述蛋白质或权利要求7所述生物材料在培育株高增加植物中的应用。

9.根据权利要求8所述应用，其特征在于：N4所述应用包括向受体植物中导入权利要求1所述蛋白质的编码基因得到转基因植物的步骤；所述转基因植物与所述受体植物相比株高增加。

10.根据权利要求8所述应用，其特征在于：N1或N2所述应用包括S1)和S2)：

S1)向受体植物中导入权利要求1所述蛋白质的编码基因得到转基因植物；

S2)对所述转基因植物施用权利要求1-5中任一所述赤霉素抑制剂得到与所述转基因植物相比株高降低的植物。

11.根据权利要求9或10所述的应用，其特征在于：权利要求1所述蛋白质的编码基因的编码序列是序列表中序列2的DNA分子。