CN107663233A - 植物转录因子stf1及其编码蛋白和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物盐胁迫诱导转录因子基因STF1及其应用，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，其编码氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。通过在水稻中过表达STF1基因能够提高转基因植株在盐胁迫下的存活率、生长速率和生物量。本发明STF1基因为培育耐盐性提高的作物提供了基因资源。

Description

植物转录因子STF1及其编码蛋白和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种植物转录因子STF1基因及其应用。

背景技术

水稻是重要的粮食作物。世界上有近一半人口都以稻米为主要食物(联合国粮农组织数据, http://faostat.fao.org)。水稻也是我国主要的口粮作物，水稻产量约占我国粮食总产量的 30%(国家统计局数据，http://data.stats.gov.cn)。因此，确保水稻的稳产高产是关系到全世界的粮食安全问题，对我国尤为重要。

在影响水稻产量的环境胁迫中，高盐胁迫是仅次于干旱的限制世界水稻产量提高的重要因素。土壤盐渍化是影响农业生产的世界性问题，预计到 2050 年世界上将有 50%的耕地受盐害影响。我国土壤盐渍化问题同样十分严重，调查数据显示我国盐渍土面积为3487 万公顷，其中具有农业发展潜力的面积占耕地总面积的 10%以上，盐碱地是我国最主要的中低产田土壤类型 (国土资源部数据，http://www.mlr.gov.cn)。沿海地区是我国水稻重要产区，但是由于环境和气候原因，我国沿海稻田经常会遇到返盐现象，严重影响水稻生长和产量。另外，除现有的稻区外，我国还有一些地区气候条件很适宜于水稻种植，但是由于土壤的盐渍化而未能种植。

随着我国经济和社会的发展以及城市化进程不断推进，将会不可避免的占用一部分高产农用耕地。在耕地面积不断压缩的条件下，为确保我国人民粮食、蔬菜等产量基本满足需要，提高盐碱地中低产田中作物的产量是一个重要途径。因此，培育耐逆作物新品种、保证遭遇环境胁迫后作物的稳产、高产和品质是缓解世界粮食危机的最佳方案但是，利用传统育种方法培育耐盐作物新品种耗时较长，进展缓慢，而解析作物耐盐生理机制和分子基础、利用分子育种技术可以加速育种进程。因此，挖掘和鉴定参与盐胁迫应答调控的新基因可以为培育耐盐作物新品种提供必要的理论基础和基因资源，对我国的粮食安全意义重大。

植物在转录水平通过调节一系列激活子和抑制子组成的网络影响生长发育和对干旱、低温、盐胁迫以及病虫害等胁迫的应答。如果植物体的防御反应和逆境胁迫反应机制持续激活，植物将增加代谢并消耗更多能量。因此，植物进化出一套适应机制以保证植物在正常生长发育情况下关闭这些反应，其中最重要的手段就是利用抑制子来抑制逆境胁迫相关基因的表达。转录抑制子在非逆境胁迫下抑制植物防御和逆境胁迫相关基因表达，通过抑制一些激活子相关蛋白在防御和逆境胁迫中的活性，以防止由于反应过于剧烈而对自身细胞产生伤害。

盐胁迫下植物转录因子参与的应答反应往往影响多个下游基因的表达，而每种转录因子调控的下游基因可能不同，它们共同组成了应答盐胁迫的复杂调控网络。拟南芥和水稻等植物的基因组各包括 2000 多个转录因子基因，表达谱数据表明盐胁迫会改变几十至数百个转录因子基因的表达。

我们对高盐处理前后的水稻转录组数据分析发现转录因子STF1的转录受盐胁迫诱导表达，在水稻中过表达STF1基因能够提高转基因水稻植株的耐盐性和产量。

发明内容

本发明的目的是提供一个来源于水稻的转录因子STF1基因，在水稻中过表达STF1基因能够提高转基因水稻植株的耐盐性和产量。

本发明提供的转录因子STF1基因，来源于水稻(Oryza sativa)，其编码蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

SEQ ID NO:1的序列由355个氨基酸残基组成。

本发明还提供将SEQ ID NO:1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由SEQ ID NO:1序列衍生的蛋白质。

为了使所述的STF1蛋白便于纯化，可在由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1 标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6（通常为5个）	RRRRR
Poly-His	2-10（通常为6个）	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述由SEQ ID NO:1序列衍生的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到，其编码基因可通过将SEQ ID NO:2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5´端和/或3´端连上表1所示的标签的编码序列得到。

本发明还提供一种编码所述植物盐胁迫诱导基因STF1，其核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示，或其简并序列。

同时，本发明还提供如SEQ ID NO:2所示的DNA序列具有90%以上同源性，且编码耐逆性相关蛋白的DNA分子。

本发明还提供以上任一所述基因（STF1）的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系。

可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。

所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。

使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒（CAMV）35S启动子、玉米的泛素启动子（Ubiquitin），它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、萤光素酶基因等）、具有抗性的抗生素标记物（庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等）或是抗化学试剂标记基因（如抗除莠剂基因）等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述重组表达载体是将所述基因插入pC5300的多克隆位点得到的重组质粒。

扩增所述基因（STF1）全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

本发明还提供所述的基因在培育耐盐性提高的转基因植物中的应用。

上述应用是将编码所述植物盐胁迫诱导基因片段导入目的植物（如植物细胞或组织）中，得到耐盐性高于所述目的植物的转基因植物。具体地，将所述重组表达载体导入目的植物中，得到转基因植物的耐盐性高于所述受体植物。

实验表明，将本发明所述的STF1基因在水稻中过表达，能够提高转基因水稻耐盐性，提高转基因水稻植株在盐胁迫下的存活率、生长速率、生物量和籽粒产量。本发明所述水稻STF1基因为培育其他具有耐盐性提高的作物提供了基础。

附图说明

图1为STF1转基因植株PCR鉴定，其中，1. 质粒模版正对照；2. 非转基因水稻植株阴性对照；3，4水稻转基因株系ox1, ox2。

图2为STF1转基因株系ox1, ox2叶片STF1基因表达实时定量PCR鉴定。

图3为水培对照和盐胁迫处理野生型和STF1转基因株系ox1和ox2。

图4为水培对照和盐胁迫处理野生型和STF1转基因株系ox1和ox2的存活率。

图5为含盐量0.3%的稻田中水稻植株在插秧后1个月时的生长情况。

图6为含盐量0.3%的稻田中水稻植株在插秧后1个月时的存活率。

图7为含盐量0.3%的稻田中水稻植株在插秧后1个月时的分蘖数。

图8为不含盐的对照及含盐量0.3%的稻田中水稻植株的单株产量。

具体实施方式

下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的，实验均设置三次重复，结果取平均值。

实施例1：STF1 cDNA的克隆

通过对盐胁迫处理前后水稻Pokkali转录组数据分析，我们发现转录因子基因STF1的表达受盐胁迫诱导。根据转录组拼接的基因序列，得到可能的STF1编码区序列，设计扩增STF1基因区编码序列特异引物如下：

上游引物：5’- ATGGAGTTGGCCACCAAACG -3’；

下游引物：5’- TCAGCGGCCAGTAGTTGCAGTG -3’。

取一月龄水稻叶片0.2g，液氮研磨，TRIzol法提取总RNA。取2μg总RNA用SuperScript® II RT 反转录酶进行反转录，合成cDNA第一链，以此为模板，以上述特异引物进行PCR反应。PCR产物经电泳分离回收后，克隆到pEASY-T（北京全式金生物技术有限公司），命名为pEASY-T-STF1ORF，进行测序。

测序结果表明，该片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，编码SEQ ID NO:1所示的蛋白质。

实施例2：水稻STF1的过表达

以限制性内切酶XbaI/BamHI消化实施1中重组质粒pEASY-T-STF1ORF的质粒，电泳分离，切胶回收1.3kb的片段。

2、用限制性内切酶XbaI/BamHI酶切质粒载体pc1307，回收骨架。

3、将步骤1得到的片段和步骤2得到的片段连接，转化大肠杆菌DH5α，测序确认正确，得到pC-STF1。

二、转基因植物的获得

1、利用电击法将重组表达载pC-STF1导入农杆菌AGL0(ATCC® BAA-100™，www.atcc.org)。

5、将含有pC-STF1的农杆菌AGL0侵染日本晴野生型诱导产生的胚型愈伤组织，然后在MS培养基 (含有30mg/L潮霉素) 中筛选抗性愈伤组织，每代15天，共计3代，而后将抗性愈伤组织诱导成完整植株，插秧于大田，收获转基因植物的T1代种子。

三、转基因植物的分子检测

CTAB法提取叶片DNA，以pC-STF1特异性引物5’- GGCGTCGGTTCACAGACTTG -3’和5’-GATCCTGGCCTCCCATTTGC -3’PCR检测，结果表明转基因植株中有特异性扩增条带，而野生型DNA无特异扩增条带(图1)，这表明pC-STF1载体片段已经导入转基因植株。

TRIzol方法提取2周龄野生型和STF1转基因植株(ox1, ox2)叶片总RNA，取2 μg总RNA，以2 u RQ1 RNase-free DNase (Promega) 37 °C 处理30 min，加终止反应液后，以polyA为引物，利用M-MLV反转录酶42 °C 1小时合成cDNA第一链，然后以cDNA为模板，以Ubiquitin (引物5’-CCATCCTCAAGCTGCTTACC-3’和5’-GACTGGCAAGACCATTACCC-3’)为内参，PCR方法检测STF1基因(引物5’- GTGGGAAGCAGGTGTTATTG -3’和5’-TGTAGTCATCCAGGGTGAAG -3’)表达，结果如图2所示。相对于野生型对照植株，STF1基因在pC-STF1转基因植株(ox1, ox2)中的表达水平为野生型的7.6和9.3倍。这表明在转基因植株中STF1的表达水平大大提高。

实施例3：STF1转基因水稻植株耐盐性检测

一、水培水稻植株耐盐性检测

野生型和STF1转基因水稻种子42°C处理3天后，于水中浸种24小时，37°C催芽，选取萌芽一致的种子于培养液中，28°C培养4天，然后在含100 mM NaCl的培养液中处理4天。结果如图3-5所示，未处理对照中野生型和STF1转基因水稻植株没有显著差异。100 mM NaCl处理后，野生型和转基因植株在处理过程中生长速度变缓，逐渐萎蔫、死亡，对生理指标统计表明，野生型植株存活率为31%；而STF1转基因株系ox1和ox2的存活率52%和62%。这表明在水培盐胁迫处理中，STF1转基因水稻植株耐盐性显著高于野生型对照。

上述培养液的配方为：四水硝酸钙 945 mg/L ，硝酸钾 506 mg/L，硝酸铵 80 mg/L ，磷酸二氢钾 136 mg/L，硫酸镁 493 mg/L ，铁盐溶液 2.5 ml /L，微量元素母液5 ml/L，pH=6.0。

其中，铁盐溶液配方为：七水硫酸亚铁 2.78g ，乙二胺四乙酸二钠（EDTA.Na）3.73g，蒸馏水 500ml，pH=5.5；

微量元素母液的配方为：碘化钾 0.83 mg/l ，硼 酸 6.2 mg/L ，硫酸锰 22.3mg/L ，硫酸锌 8.6mg/L ，钼酸钠 0.25mg/L，硫酸铜 0.025mg/L，氯化钴 0.025mg/L。

二、水稻植株田间耐盐性检测

野生型和STF1转基因水稻种子42°C处理3天后，于水中浸种24小时，37°C催芽，选取萌芽一致的种子种于装有营养土的小盆中，覆盖一层保鲜膜保湿，待幼苗出土后，去除保鲜膜，1个月后插秧于含盐量0.3%的稻田。然后1个月后统计田间稻苗存活率和分蘖数（参见图6、7、8）。野生型对照植株的存活率、分蘖数分别为30%和5.6，而转基因ox1和ox2的存活率、分蘖数分别为60%，76%，11.7，12.5。这表明苗期STF1转基因株系ox1和ox2的耐盐性显著高于野生型对照植株。植株成熟后，对单株产量统计表明，STF1转基因株系ox1和ox2的单株籽粒产量比野生型对照高11.3、13.1g。以上结果表明，在水稻中过表达STF1能够提高水稻的耐盐性。

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

<120> 植物转录因子STF1及其编码蛋白和应用

<130> 1

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 446

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 1

Met Glu Leu Ala Thr Lys Arg Arg Arg Phe Thr Asp Leu Gln Pro Gln

His Cys Thr Arg His Ala Arg Gly Arg Cys Gly Gly Arg Val Trp Glu

Gly Leu Trp Val Arg Arg Arg Arg Glu Arg Arg Arg Gln Asp Leu Val

Arg Thr Gln Gln Leu Phe Pro Met Thr Ala Ala Asp Ala Ala Leu Val

Pro Glu Ser Thr Glu Gln Arg His Val Ala Ala Ala Ala Glu Gln Trp

Ala Arg Pro Pro Ser Arg Lys Thr Arg Ser Ser Gln Tyr Arg Gly Val

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Gly Lys Gln Val Leu Leu Gly Gly Phe Asp Thr Ala Gln Ala Ala Ala

Arg Ala Tyr Asp Gln Ala Ala Ile Lys Phe Arg Lys Val Leu Arg Gln

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Ser Ala Ala Asn Gly Arg Pro Gly Ser Ala Ser Ser Trp Ala Arg Ser

Thr Cys Thr Leu Ala Cys Met Thr Arg Arg Trp Arg Leu Pro Arg Leu

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Leu Thr Pro Lys Arg Thr Arg Thr Ser Ser Thr Cys Asn Leu Gly Ile

Ala Ser Leu Ile Leu Ser Ser Ala Ser Gly Ala Pro Val Ala Asn Gly

Pro Pro Ala Arg Ser Ser Thr Leu His Gln Ala Thr Arg Gly Arg Ala

Arg Thr Phe Met Leu Pro Glu Glu Glu Glu Met Thr Ala Cys His Arg

Gln Arg Ser Ile Trp Ala Arg Pro Ser Leu Ala Pro Ala Met Pro Asp

Gly Gly Ala Val Ile Arg Pro Asp Gln His Gln His His Pro Ser Ser

Arg Asn Met Leu Leu Met Ser Gln Val Ile Ser Ser Ser Gly Gly Gly

Gly Gly Ser Gly Arg Gln Gly Ala Ala Glu Leu His Met Arg Pro Arg

His Gly Trp Ser Ser Gly Gly Asn Asn Trp Ala Pro Pro Tyr Ala Ala

Arg Pro Arg Leu Pro Gly Ala Glu Asp Asp Glu Asp Asp Asp Ser Ala

Ala Ala Ala Ser Ser Gly Phe Pro Met Gly Gln Val Ala Thr Gly Gly

Ala Gly Ala Ser Ser Pro Ser Arg Pro Ser Ser Ser Ser Cys Ser Ser

Arg Arg Ser Ser Thr Ala Ala Ala Thr Ala Thr Thr Gly Arg

<210> 2

<211> 1341

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 2

atggagttgg ccaccaaacg gcgtcggttc acagacttgc agcctcagca ttgcactcgc 60

catgcacgag gacgatgtgg aggaagggtc tgggagggtc tttgggttcg ccgccggcga 120

gaacggcgac ggcaagatct tgtccggacc cagcagttgt tcccgatgac ggcggctgac 180

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gggggagctc gcggttcaga ggtgtcaccc tgcacaagtg cggcaaatgg gaggccagga 600

tcggccagct catgggcaag aagtacgtgt accttggcct gtatgacacg gagatggagg 660

ctgccaaggc ttatgacaaa gcggcgatca agtgctgtgg caaggaggct gtatccaact 720

ttgacaccca agcgtacgag gacgagctca acctgcaatc ttgggatagc gagcttgatc 780

ttgagctcag cctcgggtgc tccggtggcg aacgggccgc cggcgaggtc ctccactctg 840

caccaagcaa ccagaggacg agccagaacg ttcatgctgc cggaggagga ggagatgacc 900

gcctgccacc gtcagaggag catctgggct aggccttcct tggctccggc gatgccggac 960

ggcggcgcgg tcatccgccc tgatcagcat cagcatcacc ccagtagccg gaacatgctc 1020

ctgatgagcc aggtcatcag cagcagtggc ggaggaggag gaagcggcag gcagggcgca 1080

gcagagctac acatgcgtcc gcgccatggc tggtccagcg gcggcaataa ttgggcgccg 1140

ccgtacgccg cccggccccg gctgcccggc gccgaagacg acgaagacga cgacagcgcc 1200

gctgcagcat catcaggatt ccccatgggg caggtggcca cgggcggcgc tggggcgtcg 1260

tccccgtcca ggcccagcag cagcagctgc agcagcagga ggagcagcac tgccgctgcc 1320

actgcaacta ctggccgctg a

Claims (10)

1.一种植物转录因子基因，其编码蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.如权利要求1所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2。

3.如权利要求1所述的基因，其特征在于，其含有标签序列的编码序列。

4.如权利要求3所述的基因，其特征在于：所述标签序列为Poly-Arg、Poly-His、FLAG、Strep-tag、或c-myc，具体为RRRRR、HHHHHH、DYKDDDDK 、WSHPQFEK、或EQKLISEEDL。

5.如权利要求1至4任一项所述的基因的编码蛋白，优选其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

6.包含权利要求1至4任一项所述的基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系。

7.含有权利要求6所述的重组表达载体，优选为植物表达载体，更优选为双元农杆菌载体，或可用于植物微弹轰击的载体，优选是将所述基因插入pC5300的多克隆位点得到的重组质粒。

8.如权利要求7所述的重组表达载体，其包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号，或参与mRNA加工或基因表达的DNA片段；在其转录起始核苷酸前具有增强型启动子或组成型启动子，优选花椰菜花叶病毒（CAMV）35S启动子、玉米的泛素启动子（Ubiquitin）；或还包含增强子，优选翻译增强子或转录增强子。

9.如权利要求1至4任一项所述的基因，或权利要求6至8任一项所述的重组表达载体在培育抗盐胁迫能力提高的转基因植物中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其是将所述植物光合作用相关蛋白的基因导入目的植物中，进行过表达，得到抗盐胁迫能力高于所述目的植物的转基因植物，优选植物为水稻。