CN110511272B

CN110511272B - 一种玉米ZmbHLH55转录因子及其应用

Info

Publication number: CN110511272B
Application number: CN201910813445.4A
Authority: CN
Inventors: 余春梅; 严铭; 柯勇超; 罗杰; 梁璐; 陈艳红; 张健
Original assignee: Nantong University
Current assignee: Nantong University
Priority date: 2019-08-30
Filing date: 2019-08-30
Publication date: 2022-04-01
Anticipated expiration: 2039-08-30
Also published as: CN110511272A

Abstract

本发明涉及分子生物学领域和基因工程领域，具体涉及玉米维生素C合成相关的玉米ZmbHLH55转录因子及其应用。玉米ZmbHLH55转录因子通过与玉米GDP‑甘露糖‑3’,5’‑异构酶ZmGMEI的启动子结合，启动基因的表达。在玉米中，下调ZmbHLH55转录因子的表达，ZmGMEI基因表达下降，维生素C含量下降，玉米对盐胁迫的敏感性增加；在拟南芥中，过量表达ZmbHLH55，维生素C含量上升，拟南芥对盐胁迫的抗性增加。本发明不仅揭示了植物中一种调控维生素C合成的分子机制，为提高植物(尤其是作物)维生素C的含量和植物的盐胁迫能力提供一种基因资源。

Description

一种玉米ZmbHLH55转录因子及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域以及基因工程领域，具体涉及一种玉米ZmbHLH55转录因子及其应用。

背景技术

我国土地资源相对匮乏，人口庞大，且有大量的盐碱土(如我国西北地区和东部沿海地区海岸线)并不适合栽种普通作物品种，通过遗传改良结合栽培措施可提高作物耐盐碱的能力，其中遗传改良将会起根本性的作用。玉米是重要的粮食和饲料兼用型作物，提高玉米体内的维生素C(或称抗坏血酸，Ascorbicacid，AsA)的含量不仅能为人类以及牲畜提供更多的营养物质。同时维生素C是植物体内重要的小分子抗氧化物质，提高其含量也能提高植物自身的抗盐、旱等胁迫的能力。

植物中从头合成维生素C的主要途径为L-半乳糖/GDP-甘露糖途径，涉及9个基因以及酶参与，这些基因依次为磷酸葡萄糖异构酶(PGI)、磷酸甘露糖异构酶(PMI)、磷酸甘露糖酶(PMM)、GMP-D-甘露糖焦磷酸化酶(GMP/VTC1)，GDP-甘露糖-3’,5’-异构酶(GME)、GDP-L-半乳糖磷酸化酶(GGP/VTC2/VTC5)、GDP-L-1-半乳糖磷酸化酶(GPP/VTC4)、L-半乳糖脱氢酶(L-GalDH)和L-1,4-半乳糖内脂脱氢酶(GLDH)。经过该9个酶将将光合作用的产物6-磷酸葡糖在体内转化为维生素C。研究发现，在拟南芥和番茄中，转录因子AtERF或SiHZ24通过调控L-半乳糖/GDP-甘露糖途径中基因的表达，提高维生素C合成量，使得植物耐胁迫的能力得到提高。

玉米作为全球重要的粮饲兼用植物，尚未见L-半乳糖/GDP-甘露糖途径中的调控因子的报道。在玉米中寻找调控该途经的转录因子，将会为提高玉米的营养品质和抗逆能力提供基因资源。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是获得玉米中调控维生素C合成的转录因子，提高植物维生素C含量的同时，增加植物耐受盐胁迫的能力。本发明提供了一种玉米ZmbHLH55(basichelix-loop-helix，bHLH)转录因子基因，本发明提供的转录因子通过与ZmGME1启动子结合，调控ZmGME1的表达，进而调控植物中维生素C的含量。本发明提供的玉米ZmbHLH55转录因子，不仅揭示了一种中玉米中维生素C合成的分子机制，为提高植物维生素C的含量，进而提高植物耐受盐胁迫的能力提供了基因资源。

本发明第一方面是提供一种玉米ZmbHLH55转录因子，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的序列。

本发明第二方面是提供一种编码玉米ZmbHLH55转录因子的玉米基因，其cDNA分子核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

相应地，本发明提供包含上述玉米基因的重组载体、重组菌以及表达上述基因的方法。

(1)本发明构建一种在烟草中表达玉米ZmbHLH55转录因子的cDNA重组载体以及重组菌。具体的该载体为植物表达载体，所述的重组菌为农杆菌。通过农杆菌，用注射方法，可在烟草中检测eGFP-ZmbHLH蛋白的表达。

(2)本发明构建了在原核中表达玉米ZmbHLH55转录因子蛋白的重组载体以及重组菌。具体制作方法如下：将具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的玉米转录因子ZmbHLH55编码基因，插入原核pSmart-I，转化大肠杆菌BL21(DE3)大肠杆菌，通过IPTG诱导重组菌，获得重组的HIS6-SUMO-ZmbHLH55蛋白。

(3)本发明构建一种在酵母中表达玉米ZmbHLH55转录因子蛋白的重组载体以及重组菌。所述载体为酵母表达载体，所述重组菌为酵母。具体制作方法如下：将具有SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列的玉米转录因子ZmbHLH55编码基因，插入到酵母表达载体pGADT7，转化含有ZmGME1启动子的酵母，获得的重组酵母能在含有AbA(金担子抗生素)的筛选培养基中生长，说明酵母中表达的bHLH55蛋白能与目标启动子结合。

(4)本发明构建了在拟南芥中表达玉米ZmbHLH55转录因子的cDNA重组载体以及重组菌，所述载体为pCAMBIA1307-35S-FLAG载体，所述重组菌为农杆菌。通过该重组农杆菌，用常规拟南芥花序浸入法，转化拟南芥并获得过量表达ZmbHLH55转录因子的植株。

(5)本发明提供了减量表达ZmbHLH55转录因子的植株，所述植物为玉米。具体方法通过玉米Mutator插入突变体方法，鉴定并通过自交获得了ZmbHLH55转录因子的纯合突变体，突变体中ZmbHLH55和ZmGME1的检测通过定量PCR检测。

通过上述发明提供的重组载体、重组菌，获得的拟南芥过量表达ZmbHLH55转录因子的植株中维生素C含量增加；所述的玉米减量表达突变体中维生素C的含量减少。

本发明的第三个方面提供了一种玉米ZmbHLH55转录因子在调控植物维生素C和调控植物耐受盐胁迫中的应用。该玉米ZmbHLH55转录因子通过上述发明提供的重组载体、重组菌，获得的拟南芥过量表达ZmbHLH55转录因子的植株增加了抗盐的效果；所述的玉米减量表达突变体中维生素C的含量减少，降低了其抗盐的特性。

本发明提供的玉米ZmbHLH55转录因子能够与ZmGME1基因的启动子结合，调控玉米中维生素C的合成。在减量表达的ZmbHLH55的突变体zmbhlh55中，ZmGME1大约为野生型的30％，在正常和盐胁迫条件下维生素C下降30～60％。在过量表达ZmbHLH55转录因子的拟南芥植株中，维生素C含量在正常和盐胁迫条件下，增高约15～30％，拟南芥在盐胁迫条件下，提前萌发，在含有75mM 1/2MS培养基中，具有更高的生物量(大约10～20％)。

附图说明

图1为ZmbHLH55亚细胞定位在植物细胞核(40倍物镜)。图1A为增强型绿色荧光蛋白(eGFP)；图1B为eGFP-ZmbHLH55定位(显示绿色)；图1C为H₂B-Mecherry定位(细胞核定位的蛋白，阳性对照，显示红色)；图1D为明场细胞照片；图1E为图1B、图1C、图1D叠加图，在所示的细胞中显示黄色。

图2为pSart-I-ZmbHLH55载体在大肠杆菌中表达、纯化SDS-PAGE凝胶考马斯亮蓝染色结果。

图3为转录因子ZmbHLH55与酵母单杂交验证结果。

图4为HIS₆-SUMO-ZmbHLH55与ZmGME1启动子结合的凝胶阻滞实验(EMSA)结果。

图5为玉米中减量表达ZmbHLH55基因降低了叶片中的Vc含量增加了盐的敏感性。图5A基因组水平分子检测和qPCR鉴定ZmbHLH55基因的表达。左侧电泳图为zmbhlh F和TIR6配对奠定的结果，中间和右侧柱状图分别为玉米ZmbHLH55和ZmGME1基因在野生型W22(黑色)和突变体(灰色)中的表达；图5B为突变体在正常和盐胁迫条件下的Vc含量。图5C为SOD酶活性。图5D为POD酶的活性。图5E为丙二醛的含量。

图6为转基因拟南芥的基因组水平和蛋白水平鉴定图。图6A为基因组水平的分子鉴定；图6B经A中鉴定的阳性植株的叶片总蛋白SDS-PAGE电泳图；图6C为FLAG标签的蛋白水平的鉴定

图7为过量表达ZmbHLH55基因提高拟南芥中的Vc含量。

图8为过量表达ZmbHLH55拟南芥株系的盐胁迫表型。图8A为不同株系的萌发表型；图8B为含有NaCl的1/2 MS固体培养基水平培养的各不同株系在75mM NaCl中生长两周的表型。

具体实施方式

下面结合具体实施事例，进一步阐述本发明。以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验，均参照分子克隆(Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd ed.)或植物分子生物学－实验手册(Plant Molecular Biology－A Laboratory Manual,MelodyS.Clark编，Springer-verlag Berlin Heidelberg,1997)中所述的方法进行，或按照试剂盒和产品说明书进行的；或参照文献中的方法进行；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实验材料和试剂：

涉及本申请创制的生物材料：拟南芥(Col)的转基因株系；鉴定获得玉米W22品种为背景的zmbhlh55突变体；本申请获得的ZmGME1p-Y1Hgold；ZmGME1p-Y1Hgold ZmbHL55H重组质粒以及酵母；BL21(DE3)-ZmbHLH55大肠杆菌；GV3301-eGFP-ZmbHLH55；GV3301-ZmbHLH55-FLAG质粒以及农杆菌。

实施例1：玉米ZmbHLH55转录因子的获得和克隆

以玉米ZmGME1基因的启动子为诱饵，通过常规的酵母单杂交筛选到阳性克隆，通过测序以及比对，在玉米的基因组中对比到ZmbHLH55序列。设计了ZmBHLH55基因的全长引物。

ZmbHLH F：5′-ATGAACTGCGGGCCGCCCGA-3′

ZmbHLH R：5′-TCAAAGCTCCATTTTCATGTGGA-3′

RNA的提取、cDNA合成以及基因扩增以及克隆等按以下步骤进行：

A、玉米叶片RNA提取，用宝生物的MiniBEST Plant RNA Extraction Kit提取试剂盒进程叶片RNA提取；

B、cDNA合成，用宝生物的PrimerScript^TM1^stStrand cDNA Synthesis Kit，按说明书进行；

C、ZmbHLH55基因全长cDNA克隆。

使用ExTaq(宝生物)进行扩增进行PCR扩增，反应体系为：cDNA模板3μL，引物ZmbHLH F和ZmbHLH R(10μmol/L)各0.5μL，2.5mmol/L dNTPs 5μL，10X ExTaq缓冲液5μL,ExTaq 1μL，加水补足体积至50μL。PCR的扩增程序为95℃变性5min，95℃变性30s，58℃退火30d，72℃延伸1min30s，共35个循环；最后72℃延伸10min。

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，将目标条带回收，与在pGEM-T easy载体连接，并转化大肠杆菌DH5α，阳性经过菌落PCR鉴定、质粒的测序等鉴定，获得阳性的克隆。所获的核酸序列详见本文Seq NO.2，其编码的氨基酸序列详见Seq NO.1。

实施例2：ZmbHLH55的亚细胞定位研究

转录因子需要进入细胞核与基因的启动子结合，调控基因的表达。为了明确ZmbHLH55的亚细胞定位，开展了下述实验。

(1)植物表达载体p2300-eGFP-ZmbHLH55的构建

通过同行交流，本实验室获得了pCAMBIA-2300-35S-N-eGFP-OCS空载体，设计了下述引物：

ZmbHLH-GFP F:5′-GACGAGCTGTACAAGGGATCCATGAACTGCGGGCCGCCCGA-3′

ZmbHLH-GFP R:5′-CTGCAGGTCGACTCTAGAtcaAAGCTCCATTTTCATGTGGA-3′

以实施例1获得的克隆做模板，以及PCR扩增方法进行。获得的PCR产物经1％琼脂糖电泳凝胶电泳回收。pCAMBIA-2300-35S-N-eGFP-OCS空载体用BamHI进行线性化处理后，用上海翊圣生物科技有限公司的一步克隆试剂盒(10911)进行连接，转化DH5α，克隆经过菌落PCR，酶切和测序等验证，获得pCAMBIA-2300-35S-N-eGFP-ZmbHLH55-OCS克隆(简称p2300-eGFP-ZmbHLH55)。将获得的克隆转化农杆菌GV3301，获得重组的阳性农杆菌。

(2)ZmbHLH55的亚细胞定位

用上一步实验所得的阳性农杆菌注射烟草叶片，注射后40～72小时内进行激光共聚焦显微镜的观察。观察结果如图1所示，图1中箭头所示为目标蛋白和阳性对照蛋白H₂B-Mechery具有相同的细胞核定位的细胞，表明eGFP-ZmbHLH55融合蛋白定位在细胞核上。

实施例3：原核表达载体pSart-I-ZmbHLH55载体的构建以及蛋白表达

(1)pSart-ZmBHLH55载体克隆

根据pSmart-I载体的MCS的序列，设计了如下引物：

ZmbHLH Bam F:5′-taaGGATCCATGAACTGCGGGCCGCCCGA-3′

ZmbHLH Xho R2:5′-cctCTCGAGAAGCTCCATTTTCATGTGGA-3′

将Seq NO.2的T载体质粒稀释后(大约5～10ng/μL)，按实施例1中的PCR体系和扩增程序进行扩增，PCR产物回收。PCR产物和载体pSart-I经过BamHI和XhoI酶切处理，经过常规的克隆鉴定，获得重载体。

(2)蛋白诱导表达

将实施例3(1)获得pSart-ZmBHLH55载体转化BL21(DE3)菌，并按pET system操作手册进行蛋白的诱导表达，IPTG至终浓度为0.5mM，温度为15℃，培养时间10-14小时(过夜培养)，小量诱导的菌为5ml，大量诱导的菌为500ml。进行菌收集。

(3)蛋白纯化

按培养液的5％比例加入Lysis Buffer悬浮菌体，同时加入终浓度0.25mM的PMSF，超声破碎(冰浴)3min，后再加入一次PMSF。菌悬液超声波破碎(冰浴)3-4次，至溶液澄清。4℃条件下，20000rpm离心1h，收集上清，取少量沉淀用无菌去离子水重悬及20μL上清用于后续鉴定，余下的上清在4℃下进行蛋白纯化步骤。取2-4mL Ni-NTA Agrose装入亲和层析柱中，用Wash Buffer洗4-5个柱体积。超声获得的菌加入预处理过Ni-NTA Agrose，用ElutionBuffer洗脱亲和柱中的蛋白，收集大概10mL，取20μL用于后续鉴定。SDS-PAGE电泳检测破碎前的菌液，破碎后的沉淀、上清以及纯化后的洗脱蛋白。结果如图2，其中，1、2泳道为Ni柱纯化后的蛋白样品；3、4泳道为超声波离心后的上清样品；5、6泳道为超声波破碎离心后的沉淀样品；7、8泳道为超声波破碎前的菌液样品；箭头所示为目标蛋白条带。图2所示结果表明目标蛋白可在原核中有效表达。

备注：(1)Lysis Buffer(1L)：NaH₂PO₄·2H₂O 7.8g，NaCl 17.54g，imidazole0.68g，加入去600mL离子水充分混匀溶解后调节pH至8.0，而后加去离子水定容到1L，保存于4℃。

(2)Wash Buffer(1L)：NaH₂PO₄·2H₂O 7.8g，NaCl 17.54g，imidazole 1.36g，加入去600mL离子水充分混匀溶解后调节pH至8.0，而后加去离子水定容到1L，保存于4℃。

(3)Elution Buffer(1L)：NaH₂PO₄·2H₂O 7.8g，NaCl 17.54g，imidazole 17g，加入去600mL离子水充分混匀溶解后调节pH至8.0，而后加去离子水定容到1L，保存于4℃。

实施例4：ZmbHLH55与ZmGME1启动子结合的验证

(1)酵母表达载体pGAD-ZmBHLH55的构建以及酵母单杂交的验证

根据pGAD T7载体的MCS位点，设计了引物：

ZmbHLH Nde F：5′-tccCATATGAACTGCGGGCCGCCCGA-3′

ZmbHLH Xho R1 5′-cctCTCGAGTCAAAGCTCCATTTTCATGT-3′

按实施例1C中的PCR体系和扩增程序进行扩增，PCR产物回收、酶切处理，连接、转化、阳性克隆鉴定等，获得了pGAD-ZmBHLH5载体克隆。

将获得pGAD-ZmBHLH5载体，按照Clontech PT1172-1(PR0Y3570)方法，转化诱饵酵母Bait Y1Hgold ZmGMEp(含有GMEI启动子)。转化的酵母菌在双缺SD-Lue-Ura固体培养基上生长。获得的克隆，在SD-Lue-Ura+AbA(200ng)液体培养基培养至OD₆₀₀＝1，将均按1X，10X，100X，1000X稀释，每个均吸取1μL，在SD-Lue-Ura+AbA固体培养基上进行培养40小时。观察结果如图3所示，图3中ZmGME1p为ZmGME1基因的启动子。图3表明ZmbHLH55转录因子在酵母中可与ZmGME1基因的启动子结合。

(2)凝胶阻滞实验证明原核表达的蛋白与GME2启动子的探针G-box结合。

用表1中所示探针按碧云天生物技术公司EMSA/Gel-Shift试剂盒(GS002)进行凝胶阻滞实验，结果如图4所示，图4中箭头表示探针与目标蛋白结合条带。表明在体外实验中ZmbHLH55转录因子可与ZmGME1基因的启动子结合。

表1本申请中用于EMSA实验所设计的生物素标记的探针及突变探针

实施例5：玉米zmbhlh55突变体的鉴定及表型观察

本申请的玉米突变体材料UniformMu免费获自佛罗里达大学(University ofFlorida)玉米Maize Genetics COOP Stock Center，因此本申请中此材料只用于对基因功能的说明。

按照Liu(Current Protocols in Plant Biology 1:451-465)的方法，用通用的Tair6引物和基因特异的引物(zmamrF：5′-AGCTGATATGCTAATTTGTG-3′或者zmamrR：5′-GCGAGGAACTGGTCTAGATG-3′)对突变体进行鉴定的结果表明，本申请获得了纯合突变株系，本申请命名为zmbhlh55。

用引物bHLH55 qF1:CCCTAGCAGTGTTTCAGCCT，qR1:CTGAAACGAAACAGGCGACG；ZmGME1qF1：ATTTAATTGCCACCGGCACA；R1：ACGTATAGCCAATGTGTGGCA分别对bHLH55和ZmGME1进行检测，检测的方法按照宝生物PrimeScript^TMRT Master Mix(Perfect Real Time)试剂盒说明书进行，调整模板量以Ct值为22-25循环数为合适，总体积为20微升，执行仪器为ABI7500。结果如图5A。结果表明，zmbhlh55突变体是表达下降的突变体(敲降)，在突变体中目标基因ZmGME1表达同样下降大约70％。参照Gillespie KM和Ainsworth EA，Nat Protoc.2007,2(4):871-874)方法检测维生素C含量，结果如图5B～E。表明无论是在正常情况下还是胁迫条件下，突变体中维生素C的含量均有下降；活性氧清除相关酶活性以及膜脂的氧化程度的检测(利用南京建成相关的试剂盒并按试剂盒的说明书进行)表明，活性氧清除的能力稍有下降(SOD和POD的活性)，丙二醛含量(MDA)含量上升，说明膜脂氧化程度高。

实施例6：过量表达ZmbHLH基因的拟南芥的获得

(1)植物过量表达载体pCAMBIA1307-bHLH55-FLAG载体的构建

根据载体的MCS位点，设计了以下引物：

p1307-ZmbHLH BamH F：5′-ACTAGTGGATCCAACTGCGGGCCGCCCGACCA-3′

p1307-ZmbHLH SalI R：5′-ACGCGTCGACAAGCTCCATTTTCATGTGGA-3′

以实施例1中的方法进行扩增和克隆。对测序正确的克隆转化农杆菌GV3101。

(2)过量表达ZmbHLH55基因的拟南芥的获得

按拟南芥操作手册(英文影印版p119-140页)进行拟南芥的转化，获得T1种子。将T1种子在1/2 MS含潮霉素(20μg/mL)固体培养基上进行筛选。具有潮霉素抗性的植株，进一步提取基因组DNA(天根植物基因组提取试剂盒(非离心柱型)，用实施例1中的引物ZmbHLHF/R进行鉴定基因组鉴定。对叶片总蛋白进行提取后，用FLAG抗体(sigma公司)按常规蛋白免疫杂交方法进行，鉴定阳性植株中蛋白的表达。结果如图6，图6中数字为单株编号。结果表明，在HPT阳性的株系中，ZmbHLH55在蛋白水平进行了有效的表达。

实施例7：过量表达ZmbHLH55拟南芥表型的鉴定

(1)过量表达植株的Vc含量测定。

通过用不同0，75和100mM NaCl浓度的盐溶液，对生长4周的拟南芥苗，处理3天，进行拟南芥中的维生素C含量的检测。维生素C含量的检测测定的方法按照文献(Gillespieand Ainsworth,Nat Protoc,2007,2(4):871-4)进行。结果如图7，表明过量表达株系中维生素C的含量增加大约15～30％。本测试中所用的所有试剂均从Sigma购买。

(2)耐盐特性观察

对实施例6中获得阳性植株系(T2和T3)，在含有不同NaCl浓度的平板上进行萌发(0，100和120mM NaCl)和生长实验(75mM NaCl)，进行其耐盐性观察，结果如图8。结果表明，在萌发期间，过量表达ZmbHLH55的拟南芥在盐胁迫条件下，能够提前萌发。在含有75mMNaCl的1/2 MS培养基中，过量表达株系的生物量大约增加10-15％。说明，在拟南芥中过量表达ZmbHLH55能有效增加拟南芥的抗盐能力。

最后说明的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的内容。

序列表

<110> 南通大学

<120> 一种玉米ZmbHLH55转录因子及其应用

<130> 1234

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 480

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 1

Met Asn Cys Gly Pro Pro Asp Gln Leu Pro Pro Gly Ser Ala Pro Ser

1 5 10 15

Cys Phe Leu Asn Leu Asn Trp Asp Gln Ser Met Ala Ala Asp Gln Leu

20 25 30

Asp Pro Ala Leu Ser Ser Met Val Ser Ser Pro Ala Ser Asn Ser Thr

35 40 45

Ala Ala Ala Ala Val Thr Asp Gly Arg Ala Leu His Gly Ile Ser Pro

50 55 60

Gln Gln Gln Tyr Gly Gly Thr Pro Leu Ser Ser Pro Pro Lys Leu Asn

65 70 75 80

Leu Phe His Gln Thr Arg Pro Gln Phe His His Phe Pro Pro Pro Gln

85 90 95

Val Gly Gly Leu Pro Ile Leu Glu Asn Leu Met Pro Met Gly His Leu

100 105 110

Asp Gln Phe Leu Ala Asp Pro Gly Phe Ala Glu Arg Ala Ala Arg Leu

115 120 125

Ser Gly Phe Asp Gly Arg Pro Gly Gly Ser Gly Tyr Gly Gly Val Gly

130 135 140

Val Pro Gly Gln Phe Gly Ile Pro Asp Ala Gly Pro Ile Gly Ala Leu

145 150 155 160

Lys Glu Leu Glu Leu Gly Asn Gly Arg Asp Glu Ser Ser Val Ser Asp

165 170 175

Pro Ala Ser Gly Ser Ala Glu Met Ala Leu Asn Lys Gly Pro Ser Asp

180 185 190

Gly Asn Ala Lys Lys Arg Lys Ala Ser Gly Lys Gly Lys Gly Lys Asp

195 200 205

Gly Pro Gly Ser Ala Ala Ala Gly Ala Ala Lys Glu Glu Ser Ser Gly

210 215 220

Lys Arg Cys Arg Ser Ala Asp Glu Ser Ser Gly Ala Glu Asp Asn Asn

225 230 235 240

Pro Thr Thr Lys Gly Lys Ala Ala Gln Ser Ser Ser Glu Asn Gly Gly

245 250 255

Gly Arg Lys Gln Gln Gly Lys Glu Ser Ala Thr Lys Pro Pro Ala Glu

260 265 270

Ala Pro Lys Asp Tyr Ile His Val Arg Ala Arg Arg Gly Glu Ala Thr

275 280 285

Asp Ser His Ser Leu Ala Glu Arg Val Arg Arg Glu Lys Ile Ser Gln

290 295 300

Arg Met Lys Leu Leu Gln Asp Leu Val Pro Gly Cys Asn Lys Val Val

305 310 315 320

Gly Lys Ala Val Met Leu Asp Glu Ile Ile Asn Tyr Val Gln Ser Leu

325 330 335

Gln Arg Gln Val Glu Phe Leu Ser Met Lys Leu Ala Thr Val Asn Pro

340 345 350

Gln Leu Asp Phe Asn Ser Leu Pro Asn Leu Leu Leu Pro Lys Asp Ile

355 360 365

His Gln Pro Cys Gly Pro Pro His Phe Pro Leu Glu Thr Ser Gly Ala

370 375 380

Pro Leu Pro Tyr Leu Ser Gln Pro His His Gly Ser Pro Leu Gly Cys

385 390 395 400

Cys Met Asp Thr Gln Gly Gly Ser Met His Pro Leu Asp Ala Ala Phe

405 410 415

Cys Arg Pro Met Asn Pro Gln His Pro Phe Leu Asn Gly Ala Ser Asp

420 425 430

Ala Ala Ser Gln Val Gly Thr Phe Trp Gln Asp Asp Leu Gln Ser Val

435 440 445

Val His Met Asp Ile Gly Gln Ser Gln Glu Ile Ala Pro Thr Ser Ser

450 455 460

Asn Ser Tyr Asn Gly Ser Leu Gln Thr Val His Met Lys Met Glu Leu

465 470 475 480

<210> 2

<211> 1443

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 2

atgaactgcg ggccgcccga ccagctgccg ccggggtcgg cgccgtcgtg cttcctcaac 60

ctgaactggg accagtctat ggccgccgac cagctcgacc cggcgctcag ctcgatggtc 120

tcctccccgg cgtccaactc gacggccgcc gccgcggtta ctgacggccg cgctctccac 180

gggatctctc cgcagcagca gtacggaggc actccgctca gctcgccccc caagctcaac 240

ctgttccacc aaactcgccc ccagttccac cacttcccgc cgccgcaggt cggcggcctg 300

ccaatcctgg agaacctgat gccgatgggc catctagacc agttcctcgc cgacccaggc 360

ttcgccgagc gcgcggcgcg gctgtccggc ttcgacggcc gccccggtgg aagtggctat 420

ggaggcgtcg gcgtcccggg acagtttggc atcccggacg ccggccccat cggcgcattg 480

aaggagctgg agctcgggaa cggccgggac gagtcgtcgg tgtccgatcc ggcgtccggc 540

agcgcggaga tggcgctcaa caaggggcct tccgacggca atgcgaagaa acggaaggct 600

agcgggaagg gcaaaggcaa ggacggcccc gggtccgccg ccgccggcgc cgccaaggag 660

gagtcgagtg ggaagcggtg ccgatcggcg gacgagagca gtggcgcgga ggacaacaac 720

cccaccacca agggcaaggc cgcgcagagc agtagcgaga atggtggtgg caggaagcag 780

caggggaagg agagcgcgac gaagcccccc gccgaggcgc ccaaggacta catccatgtc 840

cgggcgcggc gcggcgaggc gacggacagc cacagcctcg cggagagggt gagaagggag 900

aagatcagcc agcggatgaa gctgctgcag gatctcgtgc cgggttgcaa caaggtggtg 960

ggcaaggcag tgatgctgga cgaaatcata aactacgtgc agtccctgca acggcaagtc 1020

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cccacctctt ccaacagcta caacggttca ttgcagacag tccacatgaa aatggagctt 1440

tga 1443

Claims

1. 一种玉米ZmbHLH55转录因子在调控植物维生素C中的应用，所述玉米ZmbHLH55转录因子的氨基酸序列是SEQ ID NO.1所示的序列，所述植物为玉米或拟南芥。

2.一种玉米ZmbHLH55转录因子在调控植物耐受盐胁迫中的应用，所述玉米ZmbHLH55转录因子的氨基酸序列是SEQ ID NO.1所示的序列，所述植物为玉米或拟南芥。