KR20040057860A - 벼로부터 유래한 스트레스-유도된 프로모터 - Google Patents

Abstract

본 발명은 벼와 같은 단자엽 식물에서 효과적으로 작용하는 분리된 스트레스-유도된 프로모터, 및 이 프로모터를 사용하는 환경 스트레스 내성 식물에 관한 것이다.

Description

벼로부터 유래한 스트레스-유도된 프로모터{Stress-induced promoter derived from rice}

본 발명은 벼로부터 유래한 스트레스-유도된 프로모터(Stress-induced promoter) 및 그를 사용하는 방법에 관한 것이다.

식물은 탈수, 고온, 냉동 또는 염 스트레스와 같은 자연에 존재하는 다양한 유형의 환경적 스트레스에 대응하기 위한 내성 메카니즘을 보유하고 있다. 최근, 이러한 스트레스 내성 메카니즘이 분자 수준에서 규명됨에 따라서, 생명공학적 수법을 이용하여 스트레스 내성 식물이 제조되게 되었다. 예컨대, 세포가 스트레스에 노출될 때 세포에서 LEA 단백질, 물 채널 단백질 또는 상용성 용질에 대한 합성효소와 같은 스트레스 단백질이 유도된다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 보리의 LEA 단백질 또는 담배의 해독효소와 같은 유전자, 또는 삼투조절 물질(예컨대 설탕, 프롤린 또는 글리신베타인)에 대한 합성효소의 유전자를 숙주 식물에 도입하는 연구가 시도되어 왔다. 세포막 지질의 변형 효소인 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)의 w-3 지방산 불포화화효소(desaturase), 남조류의 D9-불포화화효소 등을 암호화하는 유전자를 사용한 연구도 또한 시도되어져왔다. 상술한 연구에서, 유전자는 꽃양배추 모자이크 바이러스의 35S 프로모터에 결합되어 식물에 도입된다. 그러나 재조합 식물의 스트레스 내성 수준은 불안정하며 도입된 유전자의 발현 수준은 낮았다. 따라서, 이들중 어떤 것도 실제로 이용될 수 없었다.

한편, 스트레스 내성 메카니즘은 몇 개 유전자와 복잡하게 연관되어 발견된다(Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K. Gene Expression and Signal Transduction in Water-Stress Response, Plant Physiol. 1997 Oct; 115(2) p327-334). 따라서, 전사인자를 암호화하고 그와 동시에 유전자의 발현을 활성화시키는 유전자를 구성적 프로모터에 결찰시키고 식물에 도입함으로써 식물의 스트레스 내성을 향상시키는 연구도 시도되어왔다(Liu et al., (1998) The Plant Cell, 10: 1391-1406). 그러나, 몇 개의 유전자가 동시에 활성화되면, 숙주 식물의 에너지가 유전자 산물의 생합성 또는 유전자 산물에 기인한 세포간 대사에만 집중되게된다. 따라서, 식물 자체의 성장이 지연되거나 왜소화되게된다.

대조적으로, 본 발명자들은 스트레스 반응성 요소에 결합되어 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)로부터의 요소의 하류에 위치하는 유전자의 전사를 활성화시키는 전사 인자를 특이적으로 암호화하는 유전자 DREB1A, DREB1B, DREB1C, DREB2A 및 DREB2B를 분리하였다(일본 특허공개(미심사 출원) 2000-60558호). 본 발명자들은 이러한 유전자를 스트레스-유도된 rd29A 프로모터에 결찰시키는 것에 의해 식물에 상기 유전자를 도입하면 식물성장을 지연시킴없이 스트레스 내성 식물의 생산을 가능하게한다고 보고하였다(일본 특허공개(미심사 출원) 2000-116260호).

상기 rd29A 프로모터는 쌍자엽 식물인 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)로부터 유래한다. 이것은 단자엽 식물에서 작용할 수 있지만, 그 활성 수준은 낮다. 따라서, 단자엽 식물에서 활성이 높은 스트레스-유도된 프로모터는 많은 연구의 과제로 되어왔다.

본 발명의 목적은 벼와 같은 단자엽 식물에서 효과적으로 작용할 수 있는 스트레스-유도된 프로모터를 발견하고 또 그러한 프로모터를 사용하는 신규한 환경 스트레스 내성 식물을 제공하는 것이다.

도 1은 각 스트레스가 적용될 때 a0528(OsNAC6) 및 a2660(SalT)상에서 노던 분석 결과를 도시,

도 2는 프로모터 영역에서 a2660(SalT)의 뉴클레오티드 서열을 도시,

도 3은 프로모터 영역에서 a0528(OsNAC6)의 뉴클레오티드 서열을 도시,

도 4는 Gus 발현 구조물의 구조를 도시하며, 이때 T_g7는 g7 터미네이터를 나타내고, HPT는 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제를 나타내며, P_nos는 Nos 프로모터를 나타내고 또 T_nos는 Nos 터미네이터를 나타냄,

도 5는 탈수 스트레스가 적용될 때, GUS 유전자에 결찰된 다양한 프로모터를 도입함으로써 제조한 형질전환 담배 또는 벼의 GUS 활성을 도시하는 그래프,

도 6은 염 스트레스가 적용될 때, GUS 유전자에 결찰된 SalT 프로모터를 도입함으로써 제조한 형질전환 벼에서 GUS 염색 결과를 도시하는 그래프,

도 7은 탈수 스트레스가 적용될 때, GUS 유전자에 결찰된 OsNAC6 프로모터를 도입함으로써 제조한 형질전환 담배 및 벼의 GUS 활성을 도시하는 그래프,

도 8은 다양한 유형의 스트레스가 적용될 때, GUS 유전자를 OsNAC6 프로모터에 결찰시켜 제조한 형질전환 벼에서 GUS 발현을 관찰하기 위해 조직염색한 결과를 도시.

본 발명자들은 상기 목적을 달성하기 위해 열심히 연구하였다. 그 결과, 벼 게놈으로부터 강한 스트레스-유도된 프로모터를 분리하는데 성공하였다. 본 발명자들은 또한 상기 프로모터의 사용에 의해 단자엽 식물의 환경 스트레스 내성이 현저하게 향상될 수 있다는 것도 밝혀내었다. 이러한 내용을 기초로 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

자세하게는, 본 발명은 벼로부터 유래된 스트레스-유도된 프로모터에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 상기 프로모터는 하기 (a) 또는 (b)에 따른 DNA로 구성된다:

(a) 서열번호 1 또는 2에 도시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA; 또는

(b) 서열번호 1 또는 2에 도시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA와 스트린젠트 조건하에서 하이브리드하고 또 스트레스-유도된 프로모터 활성을 발현하는 DNA.

여기서 사용된 용어 "스트레스"는 탈수 스트레스, 저온 스트레스 또는 염 스트레스를 지칭한다.

본 발명은 상기 프로모터를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 벡터는 본 발명에 따른 프로모터의 제어하에 다른 구조유전자 또는 조절유전자를 포함할 수 있다. 상기 벡터가 스트레스 내성을 향상시키기 위한 구조유전자 및/또는 조절유전자를 포함하면 특히 바람직하다.

스트레스 내성을 향상시키기 위한 바람직한 구조유전자의 예는 프롤린 합성에 대한 주요 효소인 P5CS 유전자(요시바 와이. 등, (1999) BBRC 261) 및 갈락티놀 합성을 위한 AtGolS3 유전자(타지 티. 등, (2002) Plant J. 29: 417-426)을 포함한다.

스트레스 내성을 향상시키기 위한 바람직한 조절유전자의 예는 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)-유래 DREB 전사인자 유전자(일본 특허공개(미심사출원) 2000-60558호), 벼-유래 OsDREB 전사인자 유전자(일본 특허공개(미심사 출원) 2001-358268호, Dubouzet et al Plant J. in press) 및 식물 호르몬, ABA의 생합성에 주요 효소인 NCED 유전자(Iuchi S. et al (2001) Plant J. 27: 325-333)를 포함한다.

본 발명은 본 발명의 벡터를 적합한 숙주에 도입하는 것에 의해 얻은 형질전환체를 제공한다. 일개 구체예로서, 형질전환체는 본 발명의 벡터를 숙주 식물에 도입함으로써 얻은 형질전환 식물이다. 상기 경우, 숙주 식물은 바람직하게는 단자엽 식물이고 단자엽 식물은 바람직하게는 벼이다.

본 발명의 프로모터를 식물에 도입함으로써, 본 발명은 또한 식물에서 스트레스 내성을 향상시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 프로모터는 단자엽 식물에서는 결코 관측되지 않았던 강력한 스트레스-유도된 프로모터 활성을 나타내므로, 본 발명의 프로모터는 단자엽 식물의 스트레스 내성을 향상시키는데 더욱 적합하다.

본 발명을 이하에 더욱 자세하게 설명한다.

발명을 실시하기 위한 실시형태

본 발명의 프로모터는 저온, 탈수 또는 염 스트레스와 같은 환경 스트레스에 의해 특이적으로 유도된, 분리된 벼-유래 프로모터이다.

1. 본 발명의 프로모터의 확인

본 발명의 프로모터는 다음과 같이 확인할 수 있다. 스트레스를 받은 식물과 스트레스를 받지 않은 식물을 비교하여, 현저하게 상이한 수준으로 발현된 유전자(스트레스-유도된 유전자)를 먼저 스크리닝한다. 이어, 게놈 정보를 기본으로하여, 유전자의 프로모터로 볼 수 있는 서열을 스크리닝한다.

본 발명의 프로모터를 확인하기 위한 방법은 다음과 같다.

1.1 mRNA의 제조

먼저, 스트레스-유도된 유전자를 스크리닝하기 위한 mRNA를 제조한다.

mRNA의 공급원으로서, 잎, 줄기, 뿌리 또는 꽃과 같은 식물의 부위, 또는 전체 식물을 사용할 수 있다. 다르게는, 종자를 GM 배지, MS 배지, 또는 #3 배지와 같은 고체배지에 파종한 다음 이들을 무균적으로 성장시켜 얻은 식물을 사용할 수 있다. 이 공급원은 캘러스 또는 무균적으로 성장한 식물의 배양세포일 수 있다.

이 스크리닝 방법에서, 유전자 발현수준이 상이함은 스트레스를 받은 식물과스트레스를 받지않은 식물간을 비교하여 관찰된다. 따라서, 각 식물의 mRNA를 제조하는 것이 필요하다. 스트레스를 적용하기 위한 방법은 사용하는 식물의 유형에 따라서 적합하게 결정할 수 있다. 일반적으로, 물을 2 내지 4주간 주지 않고 식물을 성장시키는 것에 의해 탈수 스트레스를 적용할 수 있다. 저온 및 냉동 스트레스는 식물을 15 내지 -10℃에서 1 내지 10일간 성장시키는 것에 의해 적용할 수 있다. 염 스트레스는 식물을 100 내지 600 mM NaCl중에서 1시간 내지 7일간 성장시키는 것에 의해 적용할 수 있다. 벼의 경우, 예컨대 수경재배된 벼를 저온 스트레스(10 내지 -4℃), 염 스트레스(150 내지 250 mM NaCl) 및 탈수 스트레스(건조 상태)에 노출시킨다.

스트레스를 받은 식물과 스트레스를 받지않은 식물을 액체 질소로 냉동시키고 모르타르 등에서 분쇄시킨다. 생성한 분쇄 물질로부터, 글리옥살법, 구아니딘 티오시아네이트 및 염화세슘법, 염화리튬 및 우레아법, 단백질분해효소(proteinase) K 및 데옥시리보뉴클레아제법 등을 이용하여 조 RNA 분획을 추출한다. 상기 조 RNA 분획으로부터, 올리고 dT-셀룰로오스를 사용한 친화성 칼럼법, 세파로오스 2B상에서 실시된 폴리 U-세파로오스법 등에 의해 또는 뱃치법에 의해 폴리(A)⁺RNA (mRNA)를 얻을 수 있다. 생성한 mRNA를 필요한 경우 수크로오스 밀도구배 원심분리법 등에 의해 더욱 분별할 수 있다.

1.2 스트레스-유도된 유전자의 스크리닝

스트레스-유도된 유전자는 스트레스를 받은 식물과 스트레스를 받지않은 식물 간의 유전자 발현 수준에서 상이함을 비교한 것을 기초로하여 스크리닝한다. 유전자 발현 수준을 비교하는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 사용가능한 방법의 특정 예는 RT-PCR, 실온 PCR, 치환, 분별 디스플레이, 분별 하이브리다이제이션 및 크로스 하이브리다이제이션과 같은 통상의 방법을 포함한다.

유전자 칩 및 cDNA 마이크로어레이(microarray)와 같은 고형상 샘플을 사용한 방법이 스크리닝 과정을 실시하기에 특히 적합한데, 이는 상기 방법이 수천 내지 수만의 유전자의 발현을 정량적으로 및 정성적으로 동시에 검출할 수 있기 때문이다.

(1) cDNA 마이크로어레이의 제조

스크리닝 과정에 사용된 cDNA 마이크로어레이는 단자엽 식물(예컨대 벼)의 cDNA, 즉 프로모터의 검출 표적이 그 위에 스포팅되어 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 기존의 어레이도 사용될 수 있고, 또는 통상의 방법(예컨대 The Plant Cell (2001) 13: 61-72 Seki et al)에 기초한 어레이도 제조될 수 있다.

cDNA 마이크로어레이를 제조할 때, 관심을 갖고 있는 식물의 cDNA 라이브러를 먼저 제조해야한다. cDNA 라이브러리는 (1)의 방법에 따라 제조한 mRNA를 주형으로 사용하여 통상적인 방법에 의해 작성할 수 있다. 스포팅될 cDNA는 단자엽 식물로부터 유래한 것인 한 특별히 제한되지 않는다. 나중의 게놈 데이터베이스 분석을 고려할 때, 벼와 같은 단자엽 식물로부터 유래하고 진보된 게놈 분석을 갖는 것이 바람직하다. 식물은 정상 상태(처리없음)일 수 있다. 그러나, 식물은 탈수, 염 또는 저온과 같은 스트레스에 노출되는 바람직하다.

cDNA 라이브러리를 제조할 때, mRNA의 역전사 및 단일쇄 cDNA 합성에 시판되는 키트(예컨대 ZAP-cDNA 합성 키트; Stratagene 제조)를 사용한다. 이어, 생성한 단일쇄 cDNA를 주형으로 사용하여 이중쇄 cDNA를 합성한다. 이어, 생성한 이중쇄 cDNA에 적합한 제한부위를 함유하는 어댑터를 부가한 다음 람다 파아지 벡터의 클로닝 부위에 삽입하였다. 생성한 DNA를 시판되는 키트(예컨대 Gigapack III 골드 팩케이징 추출물(Stratagene 제조)를 이용하여 시험관내에서 팩케이징처리하고 대장균(E. coli) 숙주에 감염시킨 다음 증폭시킨다. 따라서, 관심을 두고 있는 cDNA 라이브러리를 얻을 수 있다.

cDNA 라이브러리를 제작하면, 이 cDNA 또는 특이성이 높은 그의 영역(예컨대 3'측상에 반복 서열을 함유하지 않는 UTR 영역)은 PCR에 의해 증폭되어 어레이상에 고정화된 프로브(probe)를 생성한다. 상기 과정을 반복함으로써 목적하는 모든 유전자에 대한 프로브를 제조한 경우, 이들을 시판되는 스포터(spotter)(예컨대 Amersham 제조)를 이용하여 슬라이드 유리에 스포팅한다. 이렇게하여, 목적하는 cDNA 마이크로어레이를 얻는다.

(2) 유전자 발현 수준의 검출

유전자 발현 수준은, 적합한 시약으로 라벨링된 샘플 mRNA(또는 cDNA)를 마이크로어레이상의 cDNA 프로브와 하이브리다이즈시켜 얻은 신호 세기로서 cDNA 마이크로어레이에 의해 검출될 수 있다. 일반적으로, 유전자의 발현 수준은 적합한 대조용과 비교한 값 또는 어레이상에 스포팅된 cDNA 프로브 양의 차이와 관련한 2개 샘플간의 발현 수준의 비율로 결정하는 것이 바람직하다. 본 발명의 스크리닝과정의 경우, 스트레스를 받지 않은(처리없음) 식물로부터 유래한 mRNA는 대조용으로 이용되는 것으로, 이에 대하여 스트레스 받은 식물로부터 유래한 mRNA의 발현 검출 수준을 비율값으로 나타낸다.

검출은 다음과 같이 실시한다. 대조용의 mRNA 및 샘플(또는 그의 cDNA)을 상이한 형광 염료(예컨대 Cy3 및 Cy5)로 각각 라벨링하고 어레이상의 cDNA 프로브와 하이브리다이즈하였다. 예컨대, 스트레스 적용된 식물로부터 mRNA를 추출하고 Cy5로 라벨링된 dCTP 존재하에서 역전사처리하여 Cy5 라벨링된 cDNA를 제조한다. 이어, 스트레스 받지 않은(처리없음) 식물로부터 mRNA를 추출하고, 동일한 방식으로 Cy3 라벨링된 cDNA를 제조하였다. 동비율의 Cy5 라벨링된 cDNA (샘플) 및 Cy3 라벨링된 cDNA(대조용)을 서로 혼합하고 어레이상의 cDNA와 하이브리다이즈시킨다. 라벨링 염료로서, Cy3은 샘플에 사용하고 또 Cy5는 대조용에 사용한다. 다르게는, 기타 적합한 라벨 시약을 사용할 수 있다.

얻은 형광 세기는 형광 신호 검출기를 이용하여 판독하고 이를 수치값로 전환한다. 이 수치값은 대조용에 대한 샘플의 유전자 발현수준의 비율에 상응한다. 스캐너를 이용한 형광세기 판독은, 경우에 따라, 오차보정 또는 각 샘플에 대한 변수의 표준화처리된다. 표준화는 하우스 키핑 유전자(house keeping gene)와 같은 각 샘플에서 통상적으로 발현되는 유전자를 기본하여 실시될 수 있다. 또한, 신뢰성에 대한 임계치를 결정하여 상관성이 낮은 데이터를 제거할 수 있다.

(3) 스트레스-유도된 유전자의 선택

어레이에 의한 분석 결과를 기본으로하여, 스트레스 유도된 유전자는 스트레스를 받은 식물과 스트레스를 받지 않은 식물 사이에서 현저하게 상이한 수준으로 발현되는 유전자로 특정된다. 여기서 사용한 "현저하게 상이한"이라는 용어는 예컨대 1,000 또는 그 이상의 세기 수준, 즉 2개 식물간의 차이가 세배 이상인 것을 지칭한다.

(4) 노던 블러팅에 의한 발현 분석

상기와 같이 선택된 유전자를 노던 분석 등에 처리시킨다. 따라서, 유전자의 발현 수준은 스트레스 내성 수준에 관하여 향상되었음을 확인시켜 준다. 예컨대, 식물을 상술한 바와 같은 방식으로 염, 탈수, 또는 온도와 같은 다양한 수준의 스트레스에 노출시킨다. RNA를 식물로부터 추출해내고 전기영동에 의해 분리시킨다. 분리된 RNA를 니트로셀룰로오스 막으로 옮기고 상기 유전자에 대하여 특이적인 라벨링된 cDNA 프로브와 하이브리다이즈시킨다. 이어, 그의 발현 수준을 검출할 수 있다.

선택된 유전자의 발현수준이 스트레스-의존적 방식으로 향상되면, 유전자는 스트레스-유도된 것임이 확인될 수 있다. 벼 cDNA 라이브러리로부터 선택한 스트레스-유도된 유전자의 예는 a2660 (SalT: 서열번호: 3) 및 a0528(OsNAC6: 서열번호: 4)를 포함한다. a2660 및 a0528은 마이크로어레이상에 고정된 cDNA의 확인번호(서열번호)이다.

1.3 프로모터 서열의 스크리닝

(1) 유전자 데이터베이스로부터 스크리닝

이어, 검출 소프트웨어(예컨대 Blast)를 사용하여 기존의 유전자 데이터베이스(예컨대 DDBJ 데이터베이스)에 대해 스트레스-유도된 유전자의 프로모터 서열을 탐색한다. 그 게놈의 대부분이 해독되어 있는 벼와 같은 식물의 경우, 특정 스트레스-유도된 유전자를 제어하는 모든 프로모터 서열은 기존의 데이터베이스를 이용하여 찾을 수 있다. 프로모터 서열은 스트레스-유도된 유전자(cDNA)와 게놈적으로 고도로 상동인 게놈 유전자에서 상류 영역중으로부터 프로모터일 것으로 생각되는 영역으로 선택한다. 예컨대, 스트레스-유도된 유전자의 게놈 정보를 기초로하여, 이들 유전자에 대한 개시 코돈일 것으로 보여지는 부위의 약 1 내지 2 kb 상류 영역은 프로모터 영역으로 추론될 수 있다.

통상적인 스트레스-유도된 프로모터의 일부는 그들의 서열중에 프로모터 활성과 관련된 cis 요소, 예컨대 탈수 반응성 요소(DRE), 압시신산 반응성 요소(ABRE) 및 저온 스트레스 반응성 요소를 갖는다. 스트레스-유도된 전위 인자가 상기 cis 요소에 결합되면, 상술한 프로모터는 활성화되고, 또 상기 프로모터 제어하의 스트레스 내성을 부여하는 유전자는 발현하게된다. 따라서, cis 요소가 찾고있는 상류 영역에 함유되어 있으면, 이 영역은 스트레스-유도된 프로모터일 가능성이 높다.

따라서, 추론된 SalT 프로모터 서열(서열번호: 1)은 상술한 a2660 (SalT: 서열번호:3)과 고도로 상동인 유전자의 1.6 kb 상류 영역으로부터 스크리닝되며, 또 추론된 OsNAC6 프로모터 서열(서열번호: 2)는 a0528(OsNAC6: 서열번호: 4)와 고도로 상동인 유전자의 1.5 kb 상류 영역으로부터 스크리닝된다.

(2) 스트레스-유도된 프로모터의 작용성의 확인

이어, 추론된 프로모터 서열의 작용은 스트레스가 적용될 때 프로모터 활성에서의 변화로 확인한다.

먼저, 상기 부분에서 추론된 프로모터 서열을 기본으로하여 프라이머를 제조한다. 게놈 DNA를 주형으로 사용하여 PCR을 실시하고 상기 프로모터를 클론한다. 이어, 리포터 유전자를 프로모터의 하류에 결찰시켜 리포터 플라스미드를 제조한다. 이 제조된 리포터 플라스미드를 식물에 도입하고, 스트레스가 식물(바람직하게는 그의 T₂세대)에 가해질 때, 리포터 유전자의 발현을 조사한다. 리포터 유전자의 예는 β-글루쿠로니다제(예컨대 GUS: pBI121, Clontech 제조), 루시페라제 유전자 및 녹색 형광 단백질 유전자를 포함한다. 그 활성이 수치로 표시될 수 있고 그 발현이 염색으로 목측 관측될 수 있기 때문에 GUS가 바람직하다.

1.4 본 발명의 프로모터

상술한 내용을 기본으로하여, 벼 게놈-유래 SalT 프로모터(서열번호: 1) 및 OsNAC6 프로모터(서열번호: 2)는 탈수, 저온 또는 염 스트레스 의존적 방식으로 고도로 발현된 스트레스-유도된 프로모터라는 것이 밝혀졌다.

따라서, SalT 프로모터 및 OsNAC6 프로모터는 모든 스트레스에 특이적으로 유도된다. OsNAC6 프로모터는 cis 서열, ABA 반응성 요소(ABRE)를 포함하지만, SalT 프로모터의 서열은 특정 cis 서열을 포함하지 않는다. OsNAC6 프로모터는 탈수 스트레스에 의해 급속하게 유도되고 또 SalT 프로모터는 저온 스트레스에 의해 급속하게 유도된다.

본 발명의 프로모터는 서열번호 1 또는 2에 도시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA에 한정되지 않는다. 본 발명의 스트레스-유도된 프로모터는 스트린젠트 조건하에서, DNA가 스트레스-유도된 프로모터 활성을 갖는 한, 서열번호 1 또는 2에 도시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA와 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA와 하이브리다이즈하는 DNA를 포함한다. 여기서 사용된 "스트린젠트 조건"이라는 용어는 당업자가 숙지하고 있는 변수를 지칭한다. 스트린젠트 조건은 서열 의존적이며 상이한 환경에서 상이할 수 있다. 긴 서열은 좀 더 높은 온도에서 특이적으로 하이브리다이즈한다. 일반적으로, 스트린젠트 조건은 소정 이온세기 및 pH에서 특정 서열에 대한 열적 융점(Tm) 보다 약 5℃ 낮게 선택된다. Tm은 표적 서열에 상보적인 프로브의 50%가 평형에서 표적 서열에 하이브리다이즈하는 온도(소정 이온 세기, pH 및 핵산 농도하에서)이다. 핵산 하이브리다이제이션 변수는 그러한 방법을 편집한 참고문헌, 예컨대 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., CDs., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989에서 찾아볼 수 있다. 보다 자세하게는, 본 명세서에서 사용된 스트린젠트 조건은 예컨대 포름아미드 농도가 30 내지 50%이고, 온도가 37 내지 50℃이며 또 6 x SSC인 조건을 지칭한다. 바람직하게는, 포름아미드 농도는 50%, 온도는 42℃ 및 6 X SSC일 수 있다.

2. 재조합 벡터

본 발명의 재조합 벡터는 본 발명의 프로모터를 포함한다. 상기 벡터는 본 발명의 프로모터의 하류에 있는 다른 작용성 구조유전자 또는 조절유전자를 포함할수 있다. 바람직한 유전자의 예는 스트레스 내성을 향상시키기 위한 구조유전자 및/또는 조절유전자를 포함한다. 본 명세서에서 말하는 "작용성"이라는 용어는 다른 구조유전자 또는 조절유전자가 본 발명의 프로모터의 제어하에서 적합하게 발현되는 상태를 지칭한다.

스트레스 내성을 향상시키는 구조유전자는 탈수, 저온 또는 염 스트레스와 같은 환경 스트레스에 대한 식물의 내성을 향상시키는 데 역할을 담당하는 단백질을 암호화한다. 그의 예는 다음을 포함한다: LEA 단백질; 물 채널 단백질; 상용성 용질의 합성효소; 담배의 해독 효소; 삼투압조절 물질(예컨대 설탕, 프롤린, 또는 글리신베타인)에 대한 합성효소; 세포막 지질의 변형 효소인 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 의 w-3 지방산 불포화화효소 및 남조류의 D9-불포화화효소를 암호화하는 유전자; 프롤린 합성의 주요 효소인 P5CS; 및 갈락티놀 합성을 위한 AtGolS3 유전자.

스트레스 내성을 향상시키는 조절유전자는 스트레스-유도된 프로모터의 활성 및 스트레스 내성을 부여하기 위한 유전자의 발현을 조절함으로써, 식물에서 스트레스 내성을 향상시킨다. 그 예는 다음과 같다: DREB1A, DREB2A, DREB1B 및 DREB1C 유전자와 같은 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana)-유래 전사 인자(일본 특허공개(미심사 출원) 2000-60558호 참조); OsDREB1A, OsDREB1B, OsDREB1C, OsDREB1D 및 OsDREB2A 유전자와 같은 벼-유래된 전사인자(일본 특허출원 2001-358268호); 및 식물 호르몬, ABA의 생합성에 중요한 효소인 NCED 유전자.

본 발명의 프로모터가 특정 cis 요소를 포함하면, 이 cis 요소에 결합되어프로모터 활성을 향상시키는 전사인자 유전자는 프로모터의 하류에 결찰되는 것이 특히 바람직하다.

본 발명의 벡터는 본 발명의 프로모터 또는 상기 프로모터와 다른 조절유전자 또는 구조유전자를 적합한 벡터에 결찰(삽입)함으로써 작용가능하게 작성된다. 프로모터가 삽입된 이 벡터는 그것이 숙주에서 복제가능한한 특별히 제한되지 않는다. 예컨대, 플라스미드 DNA, 파아지 DNA 등이 사용될 수 있다. 플라스미드 DNA는 pBR322, pBR325, pUC118 및 pUC119와 같은 대장균(E.coli) 숙주용 플라스미드; pUB110 및 pTP5와 같은 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)용 플라스미드; YEp13, YEp24 및 YCp50과 같은 효모 숙주용 플라스미드; 및 pBI221 및 pBI121과 같은 식물세포 숙주용 플라스미드를 포함한다. 파아지 DNA는 λ파아지 등을 포함한다. 또한 레트로바이러스 또는 백시니아 바이러스와 같은 동물 바이러스 벡터, 또는 배큘로바이러스와 같은 곤충 바이러스 벡터도 또한 사용될 수 있다.

본 발명의 프로모터는 정제된 DNA를 적합한 제한효소로 절단한 다음 결찰용의 적합한 벡터의 제한부위 또는 멀티클로닝 부위에 삽입하는 것에 의해 벡터에 삽입된다.

본 발명의 재조합 벡터는 스플라이싱 신호, 폴리(A) 부가신호, 선택마커, 리보솜 결합서열(SD 서열) 등을 필요에 따라 포함할 수 있다. 선택 마커의 예는 디히드로폴레이트 환원효소 유전자, 암피실린 내성 유전자, 네오마이신 내성 유전자 등이다.

3. 형질전환체

본 발명의 형질전환체는 본 발명의 재조합 벡터를 숙주에 도입하여 프로모터 활성이 발현되게하는 것에 의해 생산될 수 있다. 숙주는 본 발명의 프로모터가 그 속에서 작용하는 한 특별히 제한되지 않는다. 바람직하게는, 숙주는 식물이고, 벼와 같은 단자엽 식물이 특히 바람직하다.

식물 또는 식물 세포를 숙주로서 사용할 때, 예컨대 벼, 옥수수, 밀, 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 담배 또는 당근으로부터 확립된 세포 또는 이들 식물로부터 제조된 원형질이 사용될 수 있다. 재조합 벡터를 식물에 도입하기 위한 방법은 폴리에틸렌 글리콜을 이용하는 Abel 등에 의한 방법[Abel, H. et al. Plant J. 5: 421-427 (1994)] 및 엘렉트로포레이션법을 포함한다.

4. 스트레스 내성인 형질전환 식물

(1) 형질전환 식물의 제조

스트레스 내성을 향상시키기 위한 구조유전자 및/또는 조절유전자를 식물에 도입하여 본 발명의 프로모터 제어하에 있도록 위치시킨다. 이렇게하여, 저온, 냉동 또는 탈수 스트레스와 같은 환경적 스트레스에 대해 향상된 내성을 갖는 작용성 형질전환 식물을 제조할 수 있다. 특히 바람직한 숙주식물은 단자엽식물이다.

본 발명의 프로모터를 숙주 식물에 도입하기 위한 방법은 아그로박테륨(Agrobacterium) 감염법과 같은 간접도입법 및 입자 건(gun)법, 폴리에틸렌 글리콜법, 리포좀법 및 미량주입법과 같은 직접도입법을 포함한다. 지금까지, 벼와 같은 단자엽 식물로부터 형질전환 식물을 제조하기 위하여 아그로박테륨(Agrobacterium) 감염법을 이용하기가 어려웠다. 그러나, 아세토시린곤의 부가로 인하여 아그로박테륨(Agrobacterium)이 벼를 감염시킬 수 있게 되었다. 따라서, 아그로박테륨(Agrobacterium) 감염법도 단자엽 식물에 대해 이용될 수 있게 되었다.

아그로박테륨(Agrobacterium)을 이용한 형질전환 식물의 제조를 이하에 기재한다.

식물에 도입할 재조합 벡터는 본 발명의 프로모터 및 스트레스 내성을 향상시키기 위한 구조유전자 및/또는 조절유전자를 포함하는 DNA를 적합한 제한효소로 절단하고, 생성한 DNA에 필요에 따라 적합한 링커를 결찰시킨 다음 이 DNA를 식물 세포 숙주용 클로닝 벡터에 삽입함으로써 제조할 수 있다. pBI2113Not, pBI2113, pBI101, pBI121, pGA482, pGAH 및 pBIG와 같은 바이너리 벡터 유형의 플라스미드, 또는 pLGV23N대, pNCAT 및 pMON200과 같은 중간 벡터 유형의 플라스미드가 클로닝 벡터로서 사용될 수 있다.

바이너리 벡터 유형의 플라스미드를 사용할 때, 목적하는 유전자는 바이너리 벡터의 보더 서열(LB, RB) 사이에 삽입된다. 생성한 재조합 벡터를 대장균에서 증폭시킨다. 증폭된 재조합 벡터를, 냉동-해동법, 엘렉트로포레이션법 등에 의해 아그로박테륨 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) C58, LBA4404, EHA101, C58C1Rif^R, EHA105 등에 도입하였다. 생성한 아그로박테륨(Agrobacterium)을 사용하여 식물을 형질전환시킨다.

본 발명에서는 식물에 도입할 아그로박테륨(Agrobacterium)을 제조하기 위해상술한 방법 이외에 3원 콘쥬게이트법[Nucleic Acids Research, 12: 8711 (1984)]을 이용할 수 있다. 상세하게는, 목적하는 유전자를 포함하는 플라스미드-함유 대장균, 헬퍼 플라스미드-함유 대장균(예컨대 pRK2013) 및 아그로박테륨(Agrobacterium)을 혼합하고 리팜피신 및 카나마이신을 함유하는 배지에서 배양한다. 따라서, 식물에 감염시킬 접합체 아그로박테륨(Agrobacterium)을 얻을 수 있다.

외래 유전자 등을 식물체에서 발현시키기 위하여, 식물에 대한 터미네이터 등은 구조유전자의 하류에 존재해야한다. 본 발명에서 이용될 수 있는 터미네이터 서열의 특정 예는 꽃양배추 모자이크 바이러스-유래 터미네이터 및 노팔린 합성효소 유전자-유래 터미네이터를 포함한다. 터미네이터는 이들이 식물체에서 작용하는 것으로 알려져 있는 이상 상술한 것에 한정되지 않는다.

목적하는 형질전환 세포를 효과적으로 선택하기 위하여, 효과적인 선택 마커 유전자를 사용하는 것이 바람직하다. 선택마커로서는, 카나마이신 내성(NPTII) 유전자, 식물상에서 항생물질 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제(htp) 유전자, 비알라포스에 대한 내성을 부여하는 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제(bar) 유전자 등으로부터 선택된 하나 이상의 유전자가 사용될 수 있다. 본 발명의 프로모터 및 선택 마커 유전자는 단일 벡터에 함께 혼입될 수 있다. 다르게는, 이들은 각기 별도의 벡터에 혼입될 수도 있다.

식물이 상술한 바와 같이 제조된 아그로박테륨(Agrobacterium)으로 감염되면, 목적하는 형질전환 식물이 제조될 수 있다.

이러한 형질전환 식물을 적합한 항생물질을 함유하는 배지에 심고, 목적하는 프로모터 또는 유전자를 함유하는 식물을 선택한다. 선택된 식물을 Bonsol No. 1 (흑색 토양) 등을 함유하는 화분에 옮겨심고 더 성장시킨다. 일반적으로, 유전자들은 유사한 방식으로 숙주 식물의 게놈으로 도입된다. 그러나, 유전자가 도입된 게놈상의 위치차이로 인하여, 도입된 유전자의 발현이 달라지게 된다. 이 현상을 "위치효과"라 칭한다. 형질전환체를 도입된 유전자로부터의 DNA 단편을 프로브로 하여 노던 블러팅에 의해 분석함으로써, 도입된 유전자가 더 고도로 발현된 형질전환체를 선택할 수 있다.

(2) 스트레스 내성의 확인

본 발명의 프로모터 또는 스트레스 내성을 향상시키기 위한 구조유전자 및/또는 조절유전자는 본 발명의 유전자가 도입된 형질전환 식물에 통합되어서 그 후대에도 존재한다는 것의 확인은, 이들 식물의 세포 및 조직으로부터 DNA를 추출하고 도입된 유전자를 당업자에게 통상의 방법인 PCR 또는 써던 분석법에 의해 검출하는 것에 의해 실시할 수 있다.

형질전환 식물중의 유전자의 발현 수준 및 발현 기관은, 식물의 세포 및 조직으로부터 RNA를 추출하고 도입된 유전자의 mRNA를 당분야의 통상의 방법인 RT-PCR 또는 노던 분석법에 의해 검출하는 것에 의해 분석될 수 있다. 다르게는, 도입된 유전자의 전사 생성물의 발현 수준 및 발현 부위는 상기 생성물에 대한 항체를 사용한 웨스턴 블러팅에 의해 직접적으로 분석될 수 있다.

본 발명의 프로모터가 도입된 형질전환 식물의 환경적 스트레스에 대한 내성은 상기 형질전환 식물을 버미큘라이트, 퍼얼라이트, 본솔 등을 포함하는 토양을 함유하는 화분에 심거나 또는 식물을 수경적으로 성장시키고, 상기 식물을 다양한 환경적 스트레스에 노출시키며 생존하는 식물을 조사하는 것에 의해 평가할 수 있다. 환경적 스트레스는 저온, 탈수 및 염 스트레스를 포함한다. 예컨대, 탈수 스트레스에 대한 내성은 식물을 물없이 2 내지 4주간 방치한 다음 생존을 조사하는 것에 의해 평가할 수 있다. 저온 및 냉동 스트레스에 대한 내성은 식물을 15 내지 -10℃에서 1 내지 10일간 방치하고, 20 내지 35℃에서 2일 내지 3주간 성장시킨 다음 그 생존율을 조사하는 것에 의해 평가할 수 있다. 염 스트레스에 대한 내성은 식물을 100 내지 600 mM NaCl중에서 1시간 내지 7일간 방치하고, 그 식물을 20 내지 35℃에서 1 내지 3주간 성장시킨 다음 그 생존율을 조사하는 것에 의해 평가할 수 있다.

따라서, 본 발명의 프로모터의 사용은 식물(특히 단자엽 식물)의 성장을 지연시킴없이 스트레스 내성을 현저하게 향상시킬 수 있다.

실시예

본 발명을 하기 실시예를 참조하여 보다 상세하게 설명하지만, 본 발명의 범위는 이들에 제한되지 않는다.

실시예 1: 스트레스-유도된 벼 유전자의 확인

cDNA 마이크로어레이 및 노던 분석법에 의해 스트레스-유도된 벼 유전자를 탐색하였다.

1. 벼 cDNA 마이크로어레이의 제조

2 내지 3주간 수경적으로 성장한 벼 종자(니혼바레 종)를 탈수, 염 또는 저온 스트레스에 처리시켰다. 탈수 스트레스는 실온에서 공기 건조시키는 것에 의해 적용하였고, 염 스트레스는 250 mM NaCl 용액중에서 배양하는 것에 의해 적용하였으며 또 저온 스트레스는 4℃에서 재배하는 것에 의해 적용하였다. 각 스트레스에 처리된 벼를 액체 질소로 냉동시켰다. 냉동된 샘플로부터 구아니딘 티오시아네이트 및 염화세슘법을 이용하여 전체 RNA를 추출하고, 올리고(dt)-셀룰로오스 칼럼을 사용하여 mRNA를 제조하였다. 생성한 mRNA를 주형으로 사용하고 HybriZAP-2.1 two-hybrid cDNA Gigapack cloning kit(Stratatene 제조)를 사용하여 cDNA를 합성하고, 또 이 cDNA를 HybriZAP-2.1 파아지미드(phagemid) 벡터의EcoRI-XhoI 절단부위에 삽입하여 클로닝하였다. Gigapack III Gold packaging extract (Stratagene 제조)를 사용하여 상기 파아지미드 DNA를 팩케이징하였다. cDNA를 함유하는 수득한 람다 파아지 입자를 사용하여 숙주 대장균을 감염시킨 다음 증폭시키고 또 이들을 다시 파아지 현탁액으로서 재회수하였다.

cDNA 클론의 뉴클레오티드 서열을 서열분석하여 약 1,500개의 독립적인 클론을 선택하였다. 선택된 클론을 PCR에 의해 증폭시키고 GTMASS System (니뽄 레이저 엔드 엘렉트로닉 라보라토리 제조)를 이용하여 폴리-L-리신-코팅된 마이크로슬라이드 유리(모델 S7444, 마쓰나미 제조)상에 스탬핑하였다. 그후, 클론들을 UV 가교에 의해 고정화시켜 벼 cDNA 마이크로어레이를 생성하였다(The Plant Cell (2001) 13: 61-72 Seki et al.).

2. 마이크로어레이 분석

탈수, 염 또는 저온 스트레스 처리되고 상기 부분에서와 동일한 방식으로 100 μM 압시신산(5시간 또는 10시간)으로 처리한 벼 식물로부터 mRNA를 각기 정제하였다. 처리받지 않은 벼 식물로부터 유래한 mRNA를 대조용으로 사용하였고, 각 스트레스 또는 압시신산으로 처리된 벼 식물로부터 유래한 mRNA를 샘플로 사용하였다. Cy3 및 Cy5를 사용한 듀얼-형광 라벨링법에 의해 cDNA 마이크로어레이 분석을 실시하였다. 마이크로어레이 분석 결과, 1,000 세기 이상의 유전자, 즉 발현수준이 대조용과 비교하여 3배 이상 높은 유전자를 스트레스-유도된 유전자 후보로서 선택하였다.

3. 노던 하이브리다이제이션에 의한 발현 분석

상기 부분에서 선택한 유전자의 특징적인 발현은 노던 하이브리다이제이션법에 의해 분석하였다. 벼 식물을 먼저 압시신산, 탈수, 저온, 염 또는 물 스트레스에 노출시키고 스트레스가 적용된 벼에서 각기 0, 1, 2, 5 및 10시간 당 샘플링을 실시하였다. 압시신산, 탈수, 저온 및 염 스트레스는 각기 상기 1에서와 동일한 방식으로 적용하였고, 또 물 스트레스는 식물을 순수에 침지시키는 것에 의해 적용하였다. 각 샘플로부터 전체 RNA를 제조하고, 전기영동을 실시하며, 각 유전자의 발현을 노던법에 의해 관찰하였다. 결과를 도 1에 도시한다.

도 1로부터 분명하듯이, a0528 유전자(OsNAC6: 서열번호: 3) 및 a2660 유전자(SalT: 서열번호: 4)의 발현은 압시신산, 탈수, 저온, 염 또는 물 스트레스에 의해 유도되었다. 특히, a0528의 발현은 탈수 스트레스에 의해 급격히 유도되었고a2660의 발현은 저온 스트레스에 의해 급격히 유도되었다.

실시예 2: 프로모터 서열의 스크리닝

1. 벼 게놈 데이터베이스의 스크리닝

blast를 이용하여, 실시예 1에서 스트레스-유도된 유전자로서 선택된 cDNA: a0528 (OsNAC6: 서열번호: 3) 및 a2660 (SalT: 서열번호: 4)의 상동부위에서 DDBJ의 벼 게놈 데이터베이스를 탐색하였다. 그 결과, 상동성이 관찰된 유전자에서, 그 유전자의 5'측을 향하여 개시코돈의 1.5 kb 상류에 위치하는 서열을 a0528의 프로모터 서열로서 선택하고, 또 유전자의 1.6 kb 상류에 위치하는 서열을 a2660의 프로모터로서 선택하였다(각각 서열번호: 1 및 서열번호: 2).

상기 프로모터 영역 각각의 구조를 도 2 및 도 3에 도시한다. OsNAC6은 cis서열 ABA 반응성 요소(ABRE)를 갖지만, SalT는 프로모터 서열에 특정 cis 서열을 갖지 않는다.

2. 클로닝

선택된 프로모터 서열을 기본으로하여, 프라이머를 고안하고, 벼 게놈 DNA를 주형으로 사용하여 PCR을 실시하며, 또 클로닝을 실시하였다. 프라이머 서열 및 이용된 PCR 조건은 다음과 같다:

프라이머 서열:

OsNAC 정방향:

OsNAC 역방향:

SalT 정방향:

SalT 역방향:

PCR 조건: 95℃에서 1분간, 55℃에서 1분간 및 68℃에서 2분간 30 주기.

실시예 3: SalT 프로모터의 작용 분석

pBIG29APHSNot의 프로모터 부위를 옥수수의 유비퀴틴 프로모터로 치환하여 G-ubi 플라스미드를 생성하였다. 이 G-ubi 플라스미드를BamHI-HindIII으로 절단시키고 유사하게 절단된 SalT 프로모터의 단편에 결찰시켰다. SalT 프로모터가 삽입된 플라스미드를BamHI-EcoRI으로 절단하고,BamHI-EcoRI을 사용하여 pBI221 (Clontech 제조)로부터 절단된 Gus 유전자에 결찰시켜 GUS-발현 구조물 G-SalT:GUS를 생성하였다(도 4). 이 플라스미드 G-SalT:GUS를 엘렉트로포레이션에 의해 아그로박테륨(Agrobacterium) EHA105에 도입하고, 배양후 10% 글리세롤로 세척함으로써 형질전환체를 생성하는 아그로박테륨(Agrobacterium) EHA105 (G-SalT: GUS)를 제조하였다.

벼 종자를 70% 에탄올에 1분간 침지시키고 2% 하이포아염소산염에 1시간 동안 침지시키는 것에 의해 멸균시켰다. 멸균된 종자를 멸균수로 세척하고 종자중 9개를 N6D 고체 배지(3.98g의 ChU[N₆]Basal Salt Mixture (Sigma 제조), 30g의 수크로오스, 100 mg의 미오-이노시톨, 300 mg의 사카미노산, 2 878 mg의 L-프롤린, 2mg의 글리신, 0.5 mg의 니코틴산, 0.5 mg의 피리독신 하이드로클로라이드, 1 mg의 티아민 하이드로클로라이드, 2 mg의 2,4-D 및 4 g의 겔라이트, 리터당, pH 5.8)의 플레이트상에 파종한 다음 24일간 배양하였다. 따라서 캘러스를 유도하였다. 상기 종자 약 20개로부터 형성된 캘러스를 새로운 N6D 고체 배지로 옮기고 추가로 3일간 더 배양하였다.

이와 별도로, 100 mg/l의 리팜피실린 및 20 mg/l의 카나마이신을 함유하는 5 ml의 YEP 배지(10 g의 박토 펩톤, 10g의 박토 효모 추출물, 5 g의 NaCl 및 406 mg의 MgCl₂·6H₂O, 리터당, pH 7.2), 28℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이 아그로박테륨(Agrobacterium)을, 20 mg/l 아세토시린곤을 함유하는 AAM 배지(10 mg의 MnSO₄·5H₂O, 3 mg의 H₃BO₃, 2 mg의 ZnSO₄·7H₂O, 250 ㎍의 Na₂MoO₄·2H₂O, 25㎍의 CuSO₄·5H₂O, 25 ㎍의 CoCl₂·6H₂O, 750 ㎍의 KI, 150 mg의 CaCl₂·2H₂O, 250 mg의 MgSO₄·7H₂O, 40 mg의 Fe-EDTA, 150 mg의 NaH₂PO₄·2H₂O, 1 mg의 니코틴산, 10 mg의 티아민 히드로클로라이드, 1 mg의 피리독신 히드로클로라이드, 100 mg의 미오-이노시톨, 176.7 mg의 L-아르기닌, 7.5 mg의 글리신, 900 mg의 L-글루타민, 300 mg의 아스파르트산 및 3 g의 KCl, 리터당, pH 5.2)로 희석시켜 O.D₆₆₀를 0.1로 만들었다. 이렇게하여 20 ml의 아그로박테륨(Agrobacterium) 현탁액을 제조하였다.

이어, 3일간 배양된 상기 캘러스에 아그로박테륨(Agrobacterium) 현탁액을 부가한 다음 1분간 혼합하였다. 그후, 상기 캘러스를 멸균된 종이 타월상에 놓고과량의 아그로박테륨(Agrobacterium) 현탁액을 제거한 다음 N6-As 고체 배지(3.98 g의 CHU[N₆] Basal Salt Mixture, 30 g의 수크로오스, 10 g의 글루코오스, 100 mg의 미오-이노시톨, 300 mg의 카사미노산, 2 mg의 글리신, 0.5 mg의 니코틴산, 0.5 mg의 피리독신 히드로클로라이드, 1 mg의 티아민 히드로클로라이드, 2 mg의 2,4-D, 10 mg의 아세토시린곤, 및 4 g의 겔라이트, 리터당, pH 5.2)에 놓고 그 위에 멸균 여과지를 놓고, 25℃에서 3일간 암소에서 배양하였다. 3일간 배양한 후, 500 mg/리터의 카르베니실린을 함유하는 3% 수크로오스 수용액을 사용하여 배양 생성물이 백색으로 되지 않을 때 까지 배양 생성물을 완전히 세척하였다. 세척된 배양 생성물을 500 mg/리터의 카르베니실린 및 10 mg/리터의 하이그로마이신을 함유하는 N6D 고체배지상에서 1주간 더 배양하였다. 그후, 생성한 배양 생성물을 500 mg/리터의 카르베니실린 및 50 mg/리터의 하이그로마이신을 함유하는 N6D 고체 배지상으로 옮기고 18일간 배양하였다. 또한, 상기 캘러스를 재분화 배지[4.6 g의 무라시게 및 스쿠그 Plant Salt Mixture (니혼 파마슈티컬 컴패니 리미티드 제조), 30 g의 수크로오스, 30g의 소르비톨, 2g의 카사미노산, 100 mg의 미오-이노시톨, 2 mg의 글리신, 0.5 mg의 니코틴산, 0.5 mg의 피리독신 히드로클로라이드, 0.1 mg의 티아민 히드로클로라이드, 0.2 mg의 NAA, 2 mg의 키네틴, 250 mg의 카르베니실린, 50 mg의 하이그로마이신 및 8 g의 아가로오스, 리터당, pH 5.8]로 옮겼다. 이 생성물을 매주 새로운 배지로 옮기고 재분화시켰다. 약 1 cm 정도 자란 싹을 갖는 것을 호르몬을 갖지 않는 배지(4.6 g의 무라시게 및 스쿠그 Plant Salt Mixture (니혼 파마슈티컬 컴패니 리미티드 제조), 30 g의 수크로오스, 2 mg의 글리신, 0.5 mg의 니코틴산, 0.5 mg의 피리독신 히드로클로라이드, 0.1 mg의 티아민 히드로클로라이드, 50 mg의 하이그로마이신 및 2.5 g의 겔라이트, 리터당, pH 5.8)로 옮겼다. 호르몬을 갖지 않는 배지에서 약 8 cm 성장한 식물체를 합성 미립자 포팅토양(Bonsol No. 1, 스미토모 케미컬 컴패니 리미티드 제조)을 함유하는 화분으로 옮겨서 이 형질전환 식물이 종자를 생성하게 하였다.

수득한 GUS-발현 형질전환 벼의 T₂세대를 2주간 수경재배하고 실시예 1에서와 동일한 방식으로 탈수 스트레스에 노출시켰다.

유사하게, rd29A 프로모터(서열번호: 9: Nature Biotechnology (1999) 17: 287-291) 또는 35S 프로모터 (서열번호: 10)을 GUS 유전자의 상류에 결찰시켜 구조물을 작성하였다. 수득한 구조물을 벼 및/또는 담배에 도입하였다.

GUS-발현 형질전환 담배의 경우, T1 세대 식물로부터 재생된 식물을 식물 구과로 3 내지 5주간 성장시키고 성장한 잎을 양분하였다. 그중 하나를 대조용으로 사용하고 나머지 하나는 실온에서 공기 건조시킨 다음 탈수 스트레스에 노출시켰다.

각 형질전환 벼 및 담배의 GUS 활성은 4-메틸움벨리페릴-β-D-글루쿠로니드의 분해에 의해 유발된 형광세기의 변화를 기본으로 측정하였다. 도 5는 탈수 스트레스 적용시, 다양한 프로모터가 도입된 형질전환 식물의 GUS 활성을 도시한다.

도 5로부터 분명하듯이, 단자엽 식물, 즉 벼에서 스트레스-유도된 SalT 프로모터의 활성 수준은 rd29A 프로모터의 활성수준 보다 더 높다. 대조적으로, SalT 프로모터는 쌍자엽식물인 담배에서는 스트레스-유도된 프로모터 활성을 나타내었지만, 그의 활성은 벼에서보다 더 약했다.

또한 SalT 프로모터-GUS 구조물이 도입된 벼의 전체 식물을 염수에 침지시키고 GUS 염색을 실시하였다. 그 결과, 전체 식물이 염색되었다(도 6). 이를 기본으로하여, SalT 프로모터는 스트레스를 받은 전체 식물에서 작용하고 있는 것으로 밝혀졌다.

실시예 4: OsNAC6 프로모터의 작용 분석

pBIG29APHSNot의 프로모터 부위를 옥수수의 유비퀴틴 프로모터로 치환하여 G-ubi 플라스미드를 생성하였다. 이 G-ubi 플라스미드를BamHI-HindIII으로 절단하고 그와 유사하게 절단된 OsNAC6 프로모터의 단편에 결찰시켰다. OsNAC6 프로모터가 삽입된 플라스미드를BamHI-EcoRI으로 절단하고,BamHI-EcoRI을 사용하여 pBI221(Clontech 제조)로부터 유사하게 절단해낸 Gus 유전자에 결찰시켜 GUS-발현 구조물을 생성하였다(도 4). 생성된 구조물을, 아그로박테륨(Agrobacterium)을 사용하여 벼 또는 담배에 도입하여 형질전환체를 제조하였다.

이 형질전환 담배 및 벼를 실시예 1에서와 같이 탈수 스트레스에 노출시키고 또 GUS 활성은 실시예 3에서와 동일하게 분석하였다. 그 결과, 탈수 유도된 OsNAC6 프로모터 활성 수준은 높았다(도 7). OsNAC6의 프로모터 활성 수준은 담배에서 보다 벼에서 더 높았다. 형질전환 벼의 T₂세대를 실시예 1에 따라서 탈수, 염 또는 저온 스트레스에 노출시켰고 또 스트레스가 적용된 후 식물에서 GUS 발현은 조직 염색에 의해 조사하였다. 그 결과, OsNAC6 프로모터는 탈수, 염 또는 저온 스트레스-의존적 방식으로 전체 식물에서 GUS를 발현하는 것으로 밝혀졌다.

따라서, SalT 프로모터 및 OsNAC6 프로모터는 스트레스-유도된 방식으로 활성화되며 그의 제어하에 스트레스 내성 유전자가 발현되게 된다는 것도 밝혀졌다. 또한, 상기 프로모터의 스트레스-유도된 프로모터 활성 수준은 높았고, 그 수준은 단자엽 식물에서는 전에는 관찰되지 않았던 수준이었다. 따라서, 스트레스 내성을 향상시키기 위한 구조유전자 및/또는 조절유전자가 본 발명의 프로모터의 제어하에 존재하도록 결찰시켜서 식물에 도입하면, 벼와 같은 중요한 곡식식물을 포함하는 단자엽 식물에서 고 스트레스 내성 형질전환 식물이 생성될 수 있다.

참고예 1: pBE35S: OsDREB1A, G-ubi: OsDREB1A 및 G35S-ShΔ:OsDREB1A의 생산

G-ubi 및 G35S-ShΔ는 다음과 같이 제조하였다. 먼저, pBIG 플라스미드(Nucleic Acids Research 18: 203 (1990))를BamHI으로 절단하여 비점착 말단으로 만들고 결찰시켜BamHI 절단부위를 제거하였다. 그후, 이 플라스미드를HindIIII 및EcoRI으로 절단하였다. 생성한 단편 및 pBE2113Not 플라스미드를 동일한 방식으로 절단하여 얻은 약 1.2 kb 단편을 서로 결찰시켜 pBIG2113Not 플라스미드를 제조하였다.

이어, pBIG2113Not를HindIII 및BamHI으로 절단하고 동일한 방식으로 절단된 rd29A 프로모터의 단편(약 0.9 kb, Nature Biotechnology 17: 287-291 (1999))에 결찰시켜 pBIG29APHSNot 플라스미드를 제조하였다. 또한, 이 pBIG29APHSNot 플라스미드를HindIII 및SalI으로 절단한 다음 옥수수의 유비퀴틴 유전자(Ubi-1) 프로모터(약 2.0 kb, Plant Molecular Biology 18: 675-689 (1992)) 또는 p35S-shΔ-stop의 CaMV 35S 프로모터 및 옥수수의 수크로오스 합성효소 유전자(Sh1)의 인트론의 일부를 함유하며 동일 방식으로 절단된 단편(약 1.6 kb, Proceeding National Academy of Science USA 96: 15348-15353 (1999))에 결찰시켰다. 이렇게하여 G-ubi 플라스미드 또는 35S-shΔ 플라스미드를 제조하였다.

상술한 pBE2113Not, G-ubi 및 G35S-shΔ를BamHI으로 절단하고 Ligation High (Toyobo 컴패니 리미티드 제조)를 사용하여 벼의 전사 인자를 암호화하는 유사하게 절단된 OsDREB1A 유전자 (서열번호: 11) 단편에 결찰시켰다. 이렇게하여 얻은 결찰 생성물을 사용하여E. coliDH5α를 형질전환시켰다. 형질전환체를 배양한 후, 그로부터 플라스미드 pBE35S: OsDREB1A, G-ubi: OsDREB1A 및 G35S-ShΔ: OsDREB1A를 정제하였다.

서열목록의 설명:

서열번호 5: 인공서열의 기재: 프라이머

서열번호 6: 인공서열의 기재: 프라이머

서열번호 7: 인공서열의 기재: 프라이머

서열번호 8: 인공서열의 기재: 프라이머

본 발명은 단자엽 식물에서 효과적으로 작용하는 스트레스-유도된 프로모터를 제공한다. 이 프로모터를 사용하여, 벼와 같은 곡식 식물을 포함하는 단자엽 식물에 탁월한 스트레스 내성을 부여할 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Japan International Research Center for Agricultural Sciences Bio-oriented Technology Research Advancement Institute <120> Stress Inducible Promoter derived from Oryza sativa <130> PH-1725 <140> <141> <150> JP 2002-377316 <151> 2002-12-26 <160> 11 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1608 <212> DNA <213> Oryza sativa <220> <223> Inventor: Shinozaki, Kazuko ; Katsura, Koji ; Ito, Yusuke <400> 1 caacaaccac tactgaacac ggctaagtgt gtttcctctc ctcgaagatg tcgttattgc 60 gttcttttct gctattccat acatatcaat ctctagagga acaccttact ctagctttca 120 gacaagggac ggtggtaaat cacgtcgtat cctccatggg gtgtgctccg aaaaaccttc 180 cctcatgcat tagagatcat gggtggaatt tagcgatggc acaccttatt tataatttag 240 ttactctccg gcggtaccat ctgcttccgt ttgttgatcg atgctggcga tgatgtgtgt 300 gagtatcgat caacagaatg atcggacgct atttttgggg tcgttttttt tcagcattga 360 ggagggatga ggattgcttg caacatgcag gtgctgctca aaacaacggt taagcagata 420 tccgtcaatt tgatagtaag atctgtaacg cgtggtcttt cgagctgaaa actatggact 480 ctttgaaaca aagataatat tatattaaat tctattattc aaagatatct aaatatttag 540 aaagatatta ataatgttat taaactttga cttacttaaa acaagtccaa aactgcatgt 600 ccctaaatcg ccagaagata aggaacacct gtacccgtga taacagaggg gtatgaaatt 660 tggacacgag gcttctttgg cagacgtggc gctgagtgag cttggctcgc ttggtcaaac 720 tccgtgcagg gacattcagt tagctagcta gcagcattgt cgacaataag atagccttta 780 aatgttagca ctcaccagct tgtcaaaaac caaggcttgg tgacggcggc ttcagaatga 840 aggatagatg gataaatgtc tagaatatta taaagtccaa caaaagatgg agcacatgca 900 tgaaagatta cgtacacgaa tgcagttgat acagtggatg ttaggcataa gaagcactat 960 aaatagaggg tgcaatcccc attgccctac acaactacac aagtcgacta tcattacaag 1020 gaaatttaag cgaccacgaa ggtatgaaag catagcagta ctctgcattt tttttttttg 1080 atgttgttct agctagctct gcttaaggtt ttcctttctt tcgttctttg tttttttttt 1140 gtaagctcaa ctagttgcat gcaatttaga ttttatcctt ttacagttgg aaaaacatcc 1200 ctataaatat taccatgaat gcatagagat tcgaggaagc tacaaattgg acgactgatt 1260 ccaaaaaaaa aaaaaaaatc agatggtcac atcattgcta ttgttttgtg aaagtacaaa 1320 agcactcgtt cggattcaaa ttacttgtgc aaattaatta aaaaccatag aaatgatcat 1380 gttaccccta cacatttcgg aaacaatacc atatatgtta gtgtgcgatc attcaaattg 1440 atttatatct gaacaaaact gagtgggaat acggtgagca aacttgacga ttccaaaata 1500 atttatattt aggcaaaatt ttacaacttc aaagttcaaa caagctaacc tgaaaaatca 1560 tgtttgaatt tactaagatg tgcttttgta tttactaaac agagtatg 1608 <210> 2 <211> 1520 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 2 ctcccctacg aagcttaggt gtagtgataa gaaaaatcga gaaggattgg tacaagttaa 60 caacttaatc aatagattgt gcatatagca aacaagtcta tataataaca caaagagaaa 120 gaaagaagac ccattttagt tgatagtggt attattaccc aaaaattaaa aatacgttca 180 atttagacct acttttataa gcatcatgcc agctacagct acagtcacag cctctttcat 240 ccctttttct ttcttccaaa aaacgctcac ctgtagtgat ggatctatgt gaaagttgtg 300 aggtcgaatg tcgaatgacc ctacagcttc ttcacattca ttcttgagta ctaaattttt 360 catggaaatc cattcaaatc tacacaaata atcccactga aatatttaat aataataatc 420 gatctcacaa agtaacttta tctaataatt tattgactcc gccactgaat ttaagtgtag 480 tgataaaaaa tcgagaagaa ggtttggtgc aaattaacaa cttaaacatg aaattaaatt 540 gtacatgtag caaacaacct ttataataac acaaaaaaaa ccattttagt tgaaagtggt 600 attgctaaaa gagttaaaag tatttcaatt tagagcaaca tgccagctac ggctacagtc 660 acaacccctt tatccttttt ctttcttcca aaatacaaac gcttacctta cagtgatggt 720 tctatgtcaa agctgtgggg tccgttgacc ccatagtttc ttaccatcat cgtttagagt 780 ttcttaaatt ttctatattt atccgttgaa atttacacaa ataatcccac taaaatatat 840 agtaatgata atcgatgtca cagagtaaat ttgctggctc tgccactact cacctgtaac 900 cccccaacta tgccaccaaa cacacataac tcatcgcctc atcatcgtca tctatctccg 960 catgagaccg catccttatc ccaccacgtc cccctcgcgc tcacgcgcac agcaacaaag 1020 aaaaaaaaaa aaacccgtcc cttttccctc gccgccccac cgctccccca ccccacgtgt 1080 cgccggccca tcggcggcgg cgcctgcgtg ggccgtgtgg cccaccctgc ggccccttcc 1140 cgaaaacgga acgccccccc cctcctcccc tctccacgtc actgcgcggt gggcccgcgc 1200 gtgcgtccaa gaagcgtgac gtaagcagtg acagaatccg cgccgcctct cggggcgccc 1260 acgtgtcgcg gtcaaacggt cagcgcgggg cgggggctcg catcgcatct gctccacgtg 1320 tgcgctatcg cggctgcggc cgcacgggcc acacgtgtcg cttgcccccg gctctataaa 1380 tgcccggctc ctcacccgga acaagtttca agccctcctc tcctcttccc aacactagta 1440 ggataaagcc acagagagag cagtagtagt agcgagctcg ccggagaacg gacgatcacc 1500 ggagaagggg gagagagatg 1520 <210> 3 <211> 545 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 3 cgactatcat tacaaggaaa tttaagcgac cacgaagagt atgacgctgg tgaagattgg 60 tccgtggggc ggaaatggag ggtcagctca ggacatcagt gtgccaccca agaagctgtt 120 aggcgtgaca atctacagct cagatgcaat cagatccatt gccttcaact acatcggtgt 180 ggatggacag gaatatgcca ttggtccatg gggtgggggc gaaggcacct ctacagagat 240 taaactgggc tcctctgagc agatcaagga gatttctgga acccatggcc cagtctatga 300 tctggctgac attgtcacct atcttaagat tgtgacaagt gctaataata catacgaggc 360 tggagtccca aatggaaagg aattcagcat tccactgcaa gactctggcc atgtcgttgg 420 attctttgga aggtctggaa cgcttatcga cgcaattggc atctacgtcc acccttgatt 480 cccagtggtc aaagaattac tacctactac catatctacg aaataatgtt ccatggtgtt 540 gttgt 545 <210> 4 <211> 1423 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 4 tcgacccacg cgtccgctct tcccaacact agtaggataa agccacagag agagcagtag 60 tagtagcgag ctcgccggag aacggacgat caccggagaa gggggagaga gatgagcggc 120 ggtcaggacc tgcagctgcc gccggggttc cggttccacc cgacggacga ggagctggtg 180 atgcactacc tctgccgccg ctgcgccggc ctccccatcg ccgtccccat catcgccgag 240 atcgacctct acaagttcga tccatggcag cttccccgga tggcgctgta cggagagaag 300 gagtggtact tcttctcccc gcgagaccgc aagtacccga acgggtcgcg gccgaaccgc 360 gccgccgggt cggggtactg gaaggcgacc ggcgccgaca agccggtggg ctcgccgaag 420 ccggtggcga tcaagaaggc cctcgtcttc tacgccggca aggcgcccaa gggcgagaag 480 accaactgga tcatgcacga gtaccgcctc gccgacgtcg accgctccgc ccgcaagaag 540 aacagcctca ggttggatga ttgggtgctg tgccggattt acaacaagaa gggcgggctg 600 gagaagccgc cggccgcggc ggtggcggcg gcggggatgg tgagcagcgg cggcggcgtc 660 cagaggaagc cgatggtggg ggtgaacgcg gcggtgagct ccccgccgga gcagaagccg 720 gtggtggcgg ggccggcgtt cccggacctg gcggcgtact acgaccggcc gtcggactcg 780 atgccgcggc tgcacgccga ctcgagctgc tcggagcagg tgctgtcgcc ggagttcgcg 840 tgcgaggtgc agagccagcc caagatcagc gagtgggagc gcaccttcgc caccgtcggg 900 cccatcaacc ccgccgcctc catcctcgac cccgccggct ccggcggcct cggcggcctc 960 ggcggcggcg gcagcgaccc cctcctccag gacatcctca tgtactgggg caagccattc 1020 tagacgacca aaaaaaaaaa aaaacaaccg cattggcagc aatggtgtca ctgaacaccg 1080 tgcaggctag ctagcttcat ggccggtgaa ctttgactca ggcgagccgc cggagttgac 1140 tcaaagataa ttaaaagaag tgttttaagt ggattggatt ggattagaca gaggagatga 1200 ggactcgaga aaggcggcga tgagaccgtg gttgggggga ccctggcctg gactgaacga 1260 cgacgaggca gcagcagaaa gatggtgcaa ttgcatcggg tggcatgtca gtgtgtgtgt 1320 atagtggcat gtacatagta catggtgatt gattcggtat acagggggct agctttcctg 1380 tttctgttta aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 1423 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 5 ctcccctacg aagcttaggt agt 23 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 6 aaggatcctc tctccccctt ctccggt 27 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer 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gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa cctcctcgga ttccattgcc 540 cagctatctg tcactttatt gtgaagatag tggaaaagga aggtggctcc tacaaatgcc 600 atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg aagatgcctc tgccgacagt ggtcccaaag 660 atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc acgtcttcaa 720 agcaagtgga ttgatgtgat atctccactg acgtaaggga tgacgcacaa tcccactatc 780 cttcgcaaga cccttcctct atataaggaa gttcatttca tttggagaga acacg 835 <210> 11 <211> 927 <212> DNA <213> Oryza sativa <220> <221> CDS <222> (69)..(782) <400> 11 cacactcgag cagagcaaat acagttcagg aatcaggagc aagcagaaac acacacacaa 60 atccgaag atg tgc ggg atc aag cag gag atg agc ggc gag tcg tcg ggg 110 Met Cys Gly Ile Lys Gln Glu Met Ser Gly Glu Ser Ser Gly 1 5 10 tcg ccg tgc agc tcg gcg tcg gcg gag cgg cag cac cag acg gtg tgg 158 Ser Pro Cys Ser Ser Ala Ser Ala Glu Arg Gln His Gln Thr Val Trp 15 20 25 30 acg gcg ccg ccg aag agg ccg gcg ggg cgg acc aag ttc agg gag acg 206 Thr Ala Pro Pro Lys Arg Pro Ala Gly Arg Thr Lys Phe Arg Glu Thr 35 40 45 agg cac ccg gtg ttc cgc ggc gtg cgg cgg agg ggc aat gcc ggg agg 254 Arg His Pro Val Phe Arg Gly Val Arg Arg Arg Gly Asn Ala Gly Arg 50 55 60 tgg gtg tgc gag gtg cgg gtg ccc ggg cgg cgc ggc tgc agg ctc tgg 302 Trp Val Cys Glu Val Arg Val Pro Gly Arg Arg Gly Cys Arg Leu Trp 65 70 75 ctc ggc acg ttc gac acc gcc gag ggc gcg gcg cgc gcg cac gac gcc 350 Leu Gly Thr Phe Asp Thr Ala Glu Gly Ala Ala Arg Ala His Asp Ala 80 85 90 gcc atg ctc gcc atc aac gcc ggc ggc ggc ggc ggc ggg gga gca tgc 398 Ala Met Leu Ala Ile Asn Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Cys 95 100 105 110 tgc ctc aac ttc gcc gac tcc gcg tgg ctc ctc gcc gtg ccg cgc tcc 446 Cys Leu Asn Phe Ala Asp Ser Ala Trp Leu Leu Ala Val Pro Arg Ser 115 120 125 tac cgc acc ctt cgc cga cgt ccg cca cgc cgt gcc gag gcc gtc gag 494 Tyr Arg Thr Leu Arg Arg Arg Pro Pro Arg Arg Ala Glu Ala Val Glu 130 135 140 gac ttc ttc cgg cgc cgc ctc gcc gac gac gcg ctg tcc gcc acg tcg 542 Asp Phe Phe Arg Arg Arg Leu Ala Asp Asp Ala Leu Ser Ala Thr Ser 145 150 155 tcg tcc tcg acg acg ccg tcc acc cca cgc acc gac gac gac gag gag 590 Ser Ser Ser Thr Thr Pro Ser Thr Pro Arg Thr Asp Asp Asp Glu Glu 160 165 170 tcc gcc gcc acc gac ggc gac gag tcc tcc tcc ccg gcc agc gac ctg 638 Ser Ala Ala Thr Asp Gly Asp Glu Ser Ser Ser Pro Ala Ser Asp Leu 175 180 185 190 gcg ttc gaa ctg gac gtc ctg agt gac atg ggc tgg gac ctg tac tac 686 Ala Phe Glu Leu Asp Val Leu Ser Asp Met Gly Trp Asp Leu Tyr Tyr 195 200 205 gcg agc ttg gcg cag ggg atg ctc atg gag cca cca tcg gcg gcg ctc 734 Ala Ser Leu Ala Gln Gly Met Leu Met Glu Pro Pro Ser Ala Ala Leu 210 215 220 ggc gac gac ggt gac gcc atc ctc gcc gac gtc cca ctc tgg agc tac 782 Gly Asp Asp Gly Asp Ala Ile Leu Ala Asp Val Pro Leu Trp Ser Tyr 225 230 235 tagagctcaa tcaactgtac aattttgcct cttttttctc tcttttctgg cttccgatgc 842 caaaattttg gtactgtacg gacactactt tcggtaatgt gatggaacaa gttgcaaaac 902 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 927 1/1

Claims (9)

1. (a) 서열번호 1 또는 2에 도시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA; 또는

   (b) 서열번호 1 또는 2에 도시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA와 스트린젠트 조건하에서 하이브리드하고 또 스트레스-유도된 프로모터 활성을 발현하는 DNA로 구성된, 분리된 벼-유래 프로모터.
2. 제1항에 있어서, 상기 스트레스가 탈수 스트레스, 저온 스트레스 또는 염 스트레인 프로모터.
3. 제1항 또는 제2항에 따른 프로모터를 포함하는 재조합 벡터.
4. 제3항에 있어서, 스트레스 내성을 향상시키기 위한 구조유전자, 조절유전자 또는 구조유전자와 조절유전자는 제1항 또는 제2항의 프로모터의 제어하에서 작용가능하게 함유되어 있는 재조합 벡터.
5. 제4항에 있어서, 스트레스 내성을 향상시키기 위한 구조유전자, 조절유전자 또는 구조유전자와 조절유전자는 프롤린 합성에 대한 주요 효소인 P5CS 유전자, 갈락티놀 합성을 위한 AtGolS3 유전자, 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)-유래 DREB 전사인자 유전자, 벼-유래 OsDREB 전사인자 유전자 및 ABA의생합성에 주요 효소인 NCED 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 재조합 벡터.
6. 제3항에 따른 벡터를 숙주에 도입하여 얻은 형질전환체.
7. 제6항에 있어서, 숙주가 식물인 형질전환체.
8. 제7항에 있어서, 숙주가 단자엽 식물인 형질전환체.
9. 제1항 또는 제2항에 따른 프로모터를 식물에 도입함으로써 식물의 스트레스 내성을 향상시키는 방법.