KR101149338B1

KR101149338B1 - 벼 유래의 환경스트레스 유도성 972 프로모터 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101149338B1
Application number: KR1020100028946A
Authority: KR
Inventors: 정화지; 박주영; 김미나; 이용욱
Original assignee: 주식회사 젠닥스
Priority date: 2009-04-16
Filing date: 2010-03-31
Publication date: 2012-05-24
Also published as: US8338667B2; US20110055967A1; KR20100114826A; WO2010120054A2; WO2010120054A3

Abstract

본 발명은 벼 유래의 환경스트레스 유도성 972 프로모터, 상기 프로모터를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터, 상기 재조합 식물 발현 벡터를 이용하여 목적 단백질을 생산하는 방법, 상기 재조합 식물 발현 벡터를 이용한 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 형질전환 식물, 상기 프로모터를 이용하여 식물의 환경스트레스 내성을 향상시키는 방법 및 상기 프로모터를 증폭하기 위한 프라이머 세트에 관한 것이다.

Description

벼 유래의 환경스트레스 유도성 972 프로모터 및 이의 용도{972 promoter inducible by environmental stress isolated from rice and uses thereof}

본 발명은 벼 유래의 환경스트레스 유도성 972 프로모터 및 이의 용도에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로 벼 유래의 환경스트레스 유도성 972 프로모터, 상기 프로모터를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터, 상기 재조합 식물 발현 벡터를 이용하여 목적 단백질을 생산하는 방법, 상기 재조합 식물 발현 벡터를 이용한 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 형질전환 식물, 상기 프로모터를 이용하여 식물의 환경스트레스 내성을 향상시키는 방법 및 상기 프로모터를 증폭하기 위한 프라이머 세트에 관한 것이다.

프로모터(promoter)는 구조유전자(gene)의 상부 쪽에 연결되어 있는 유전체(genome) 부위로서, 이에 연결된 구조유전자가 mRNA로 전사(transcription)되도록 조절하는 역할을 한다. 프로모터에는 여러 일반전사인자(general transcription factor)들이 결합함으로써 활성화(activation)되는데, 보편적으로 유전자 발현을 조절하는 TATA box, CAT box 등의 염기서열을 가지고 있다. 생체의 기본대사에 필요한 단백질들은 세포 내에서 일정 농도를 유지하여야 하므로 이들의 유전자에 연결된 프로모터는 일반전사인자의 작용만으로도 항시 활성화되어 있다. 이에 반하여 평시에는 역할이 없고 특수한 상황 하에서만 기능이 요구되는 단백질들은 해당 구조유전자의 발현을 유도하는 유도성 프로모터(inducible promoter)가 연결되어 있다. 즉 유도성 프로모터에는 생물체의 발달과정에서, 또는 주변으로부터의 환경적 요인에서 오는 외부 자극에 의해 활성화된 특이 전사인자(specific transcription factor)가 결합함으로써 활성화된다.

유전자 전이(transformation)를 통한 형질전환 식물체를 개발함에 있어 상시적이면서 강한 발현을 하는 프로모터들, 예를 들어 꽃양배추 모자이크 바이러스 35S(CaMV35S) 프로모터(Odell et al ., Nature 313: 810-812, 1985)가 널리 사용되고 있다. 그러나 이러한 프로모터에 연결된 특정 유전자의 상시적이고 과다한 발현(over-expression)은 생체대사에 불필요한 대량의 단백질이 주는 유독효과로 인하여 형질전환 식물체가 발아가 되지 않거나 왜소하게 되는 등의 부작용이 나타나는 경우가 많다. 대표적인 예로서, CaMV35S 프로모터를 사용하여 환경스트레스 전사인자 유전자 DREB1A를 과발현시킨 애기장대가 저온 및 저수분 조건에 대하여 저항성을 증진되는 것은 관찰되었으나, 성장이 저해되어 왜소증(dwarfed phenotype)을 보이면서 아미노산 프롤린 및 수용성 당류의 생산이 함께 증가하는 것이 확인되었다(Lie et al., Plant Cell 10: 1391-1406, 1998; Gilmour et al., Plant Physiol. 124: 1854-1865, 2000). 이러한 부작용은 CaMV35S 프로모터 대신 환경스트레스 관련 유전자인 rd29A의 유도성 프로모터를 사용함으로써 최소화할 수 있다(Kasuga et al, Nat . Biotechnol . 17: 287-291, 1999).

그러므로, 식물체 조직에서 모든 시간대에 상시적으로 발현을 유도하는 프로모터 대신 특정 조건 또는 특정 시기에 목적 유전자의 발현을 유도할 수 있는 유도성 프로모터를 개발하기 위한 연구가 활발히 진행되어 왔다. 학술적으로는, 미생물이나 동물에서 분리된 프로모터를 식물에 도입하고 화학물질을 유도체로 사용하여 목적단백질의 생합성을 촉발하는 유도성 프로모터 시스템이 많이 개발되었다. 지금까지 화학물질에 의한 발현 유도 시스템으로서 식물에 적용된 예로서, 스테로이드 덱사메타손(dexamethasone), 항생제 테트라사이클린(tetracycline), 구리이온, IPTG 등 화학물질을 유도물질로 처리해 주는 방법이 소개된 바 있다(Gatz et al., Plant J. 2: 397-404, 1992; Weimann et al., Plant J. 5: 559-569, 1994; Aoyama T. and Chua N-H, Plant J. 11: 605-612, 1997). 그러나 이들 시스템에 사용하는 유도물질 화합물들의 가격이 극히 고가이고 그 화학물질 자체가 주는 유독한 효과를 발생하기도 하며 모든 식물에 적용되지 못하는 등의 문제점이 있다.

한국특허등록 제10-0781059호에는 환경스트레스에 의해 활성화되는 유도성 프로모터 및 상기 프로모터를 이용하여 공변세포에 특이적으로 목적단백질을 생산하는 형질전환 식물을 얻는 방법이 개시되어 있으며, 한국특허등록 제10-0578461호에는 벼로부터 유래한 스트레스-유도된 프로모터가 개시되어 있으나, 본 발명의 프로모터와는 상이하다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 환경스트레스, 특히 건조스트레스에 의해 유도되는 프로모터 개발에 노력한 결과, 벼 유래의 특정 프로모터가 건조스트레스에 의해 강하게 유도된다는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 벼 유래의 환경스트레스 유도성 972 프로모터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프로모터를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 식물 발현 벡터를 이용하여 목적 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 식물 발현 벡터를 이용한 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 형질전환 식물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프로모터를 이용하여 식물의 환경스트레스 내성을 향상시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프로모터를 증폭하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명은 형질전환 식물 조직에서 바람직한 폴리펩티드를 암호화하는 이형의 유전자에 결합 가능한 식물의 강력한 구조 프로모터를 포함하는 분리된 핵산 구조물을 제공하는 것으로, 상기 구조물은 키메릭 유전자에서 이형의 코딩 서열에 대한 구조물로서 사용될 때 건조스트레스하의 유도성 프로모터로 식물 잎 조직에서 바람직한 폴리펩티드를 높게 발현시키게 할 수 있다. 어느 키메릭 유전자가 상기 구조물에 결합된 벡터는 식물 조직에 도입될 수 있고, 그것에 의하여 계획적으로 식물을 형질전환하고 결과적 식물이 그 안에 외래의 성분을 생산하게 할 수 있다.

또한, 본 발명이 제공하는 프로모터와 이를 이용하여 환경스트레스 저항성 형질전환 식물의 품종개발 기술은 다양한 경제작물의 수확량 증대 등에 크게 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 벼에서 유래된 건조스트레스 유도성 972 프로모터의 pGEMTvec972promoter의 모식도이다.
도 2는 벼에서 유래된 건조스트레스 유도성 972 프로모터의 형질전환 운반용 벡터 pHC10::972promoter의 모식도이다.
도 3은 벼에서 유래된 건조스트레스 유도성 972 프로모터 유전자의 발현을 RT-PCR로 검증한 결과이다.
도 4는 벼에서 유래된 건조스트레스 유도성 972 프로모터의 GFP 발현 검증 결과이다. 972p-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10은 독립적인 형질전환체를 나타낸다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기 서열로 이루어진 벼 유래의 환경스트레스 유도성 972 프로모터를 제공한다.

본 발명은 벼 유래의 특정 프로모터에 관한 것으로서, 구체적으로, 상기 프로모터는 서열번호 1의 염기서열을 가진다. 또한, 상기 프로모터 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 변이체는 염기 서열은 변화되지만, 서열번호 1의 염기 서열과 유사한 기능적 특성을 갖는 염기 서열이다. 구체적으로, 상기 프로모터는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다.

폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따른 프로모터에 있어서, 상기 환경스트레스는 건조, 고온, 냉해, 염해, 중금속 등일 수 있으며, 바람직하게는 건조스트레스이다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 프로모터를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터를 제공한다. 재조합 식물 발현 벡터의 일례로서, 도 2에 기재된 pHC10::972promoter 벡터를 예를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinotricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(Kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 따른 식물 발현 벡터에서, 터미네이터는 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알고 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

본 발명의 일 구현예에 따른 재조합 식물 발현 벡터에서, 상기 식물 발현 벡터는 본 발명의 프로모터의 하류(downstream)에 목적 단백질을 암호화하는 목적 유전자를 작동가능하게 연결시켜 제조된 것일 수 있다. 본 발명에서, "작동가능하게 연결된"은 이종 단백질을 발현하기 위한 단위로서 기능하는 발현 카세트의 성분을 말한다. 예를 들면, 단백질을 코딩하는 이종 DNA에 작동가능하게 연결된 프로모터는 이종 DNA에 해당하는 기능적 mRNA의 생산을 촉진한다.

상기 목적 단백질은, 모든 종류의 단백질일 수 있으며, 예컨대 효소, 호르몬, 항체, 사이토카인 등의 의학적 활용성이 있거나, 사람을 포함한 동물의 건강을 증진시킬 수 있는 영양성분을 다량 축적할 수 있는 단백질 및 셀룰로즈를 분해할 수 있는 효소이나, 이에 한정되는 것은 아니다. 목적 단백질의 일예로는, 인터루킨, 인터페론, 혈소판 유도 성장 인자, 헤모글로빈, 엘라스틴, 콜라겐, 인슐린, 섬유아세포 성장 인자, 인간 성장 인자, 인간 혈청 알부민, 에리스로포이에틴, 셀로바이오하이드로라제, 엔도셀룰라제, 베타글루코시다제, 자일나아제 등이 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 식물 발현 벡터로 식물체를 형질전환시킨 후, 형질전환된 식물체에 환경스트레스, 바람직하게는 건조스트레스를 가하여 상기 식물체 내에서 목적 단백질이 생산되도록 하는 것을 특징으로 하는 식물체 내에서 목적 단백질을 생산하는 방법을 제공한다. 생산된 목적 단백질은 전술한 바와 같다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다.

"식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 식물 발현 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계; 및

상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 형질전환 식물의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 식물 발현 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 예를 들면, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefiaciens)에 의해 매개될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 형질전환 식물의 제조 방법에 의해 제조된 형질전환 식물을 제공한다. 상기 식물은 벼, 밀, 보리, 옥수수, 대두, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수로 이루어진 군에서 선택된 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근으로 이루어진 군에서 선택된 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채로 이루어진 군에서 선택된 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나로 이루어진 군에서 선택된 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립으로 이루어진 군에서 선택된 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스로 이루어진 군에서 선택된 사료작물류일 수 있으며, 바람직하게는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수 수, 귀리, 양파와 같은 단자엽 식물일 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 프로모터를 식물에 도입함으로써 식물의 환경스트레스 내성을 향상시키는 방법을 제공한다. 상기 환경스트레스는 바람직하게는 건조스트레스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 방법은 본 발명의 프로모터에 스트레스 내성을 향상시키는 구조유전자를 작동가능하게 연결하여 식물에 도입함으로써 수행될 수 있다. 상기 스트레스 내성을 향상시키는 구조유전자는 탈수, 저온 또는 염 스트레스와 같은 환경스트레스에 대한 식물의 내성을 향상시키는 데 역할을 담당하는 단백질을 암호화한다. 그의 예는 다음을 포함한다: LEA 단백질; 물 채널 단백질; 상용성 용질의 합성효소; 담배의 해독 효소; 삼투압조절 물질(예컨대 설탕, 프롤린, 또는 글리신베타인)에 대한 합성효소; 세포막 지질의 변형 효소인 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)의 w-3 지방산 불포화화효소 및 남조류의 D9-불포화화효소를 암호화하는 유전자; 프롤린 합성의 주요 효소인 P5CS; 및 갈락티놀 합성을 위한 AtGolS3 유전자.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 프로모터를 증폭하기 위한 서열번호 2 및 3으로 이루어진 프라이머 세트를 제공한다.

상기 프라이머는 서열번호 2의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상, 26개 이상, 27개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다.

상기 프라이머는 서열번호 3의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 벼 whole plant 로부터 genomic DNA 의 분리

3주 정도된 동진벼 (Oryza sativa L.)의 잎 1g을 액체질소로 냉각하여 분쇄기를 이용하여 분말로 만든다. Qiagen 회사의 DNeasy Plant mini kit 을 이용하여 100mg 의 분말을 400ul AP1과 4ul RNaseA 4ul를 넣은 다음 10분간 65℃에서 정치시킨다. AP2 130ul를 넣은 다음 아이스에서 5분간 정치시킨 다음 14000rpm에서 2분간 원심분리한 후 다당류를 걸러내기 위해 그 상등액을 650ul씩 spin 칼럼에 넣고 원심분리한 다음 수용액을 수집하여 AP3/E를 1.5배를 넣고 잘 섞어준다. DNA binding 컬럼에 650ul씩 넣고 8000rpm에서 1분간 원심분리한 다음 AW 버퍼 500ul로 두 번 세척해 준 다음 컬럼을 잘 건조시킨 후 100ul의 멸균된 물에 녹인다.

실시예 2: 1859 bp 972 유전자 프로모터의 PCR 클로닝

972 프로모터를 클로닝하기 위해, 유전자 특정 프라이머 세트는 972pro5'-PstI: 5'-CTGCAGCACCTCTTTACAACTATGGCCT-3'(서열번호 2), 972pro3'-SalI: 5'-GTCGACTTGAGATGAGGCAGAGAGAT-3'(서열번호 3)를 사용하여 게놈 DNA로부터 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의해 증폭되었다. PCR 반응 혼합물은 DNA 200ng, 10X ExTaq 중합효소 완충액(pH8.0), 200mM dNTPs, 5X BandDoctor, 10pmole의 각 프라이머 및 5U Extaq(Takara사) 중합효소를 포함하였다. 반응은 효소를 넣지 않은 채 시작되어, 다음 조건에 따라 증폭되었다: 예비변성으로 5분동안 95℃의 1사이클; 1분동안 95℃, 1분동안 64℃, 2분동안 72℃의 35사이클; Applied Biosystem GeneAmp PCR system9700 증폭기에서 후-연장(extension)으로 10분동안 72℃의 1사이클. PCR 반응으로부터 증폭된 주요 생성물은 Gel Purification Kit (Bioneer, Korea)를 사용하여 젤-정제되었고, 순차적으로 pGEM-T 이지(easy) 벡터(Promega, USA)로 클로닝되었고, 제조업자의 지시에 따라 플라스미드 구조물 pGEMTvec972promoter (도 1)를 생성하여 서열화되었다(서열번호 1).

실시예 3: 972 프로모터 발현 벡터의 제조

mGFP를 암호화하는 리포터 유전자를 지닌 프로모터의 DNA 융합 구조물은 다음과 같이 만들어졌다. 바이너리(binary) 벡터 pHC10으로 편리하게 클로닝하기 위해, 플라스미드 pGEMTvec972promoter는 Pst I과 Sal I으로 분해되고, pHC10의 Pst I 과 Sal I 사이트로 서브클론되었다. 이 클론들은 pHC10::972promoter 명명하고 식물 형질전환 운반용 발현 벡터를 생성하였다(도 2).

실시예 4: 건조스트레스 하의 972 프로모터 유전자의 기능 평가: RT - PCR 검증

3주된 벼 잎에서 건조처리(0hr, 6hr, 12hr, 24hr)를 한 후 액체 질소로 냉각하여 분쇄한 후 100mg을 TRI reagent 1ml을 넣고 상온에서 5분 동안 방치한다. 0.1ml의 bromochloropropane을 넣고 상온에서 15분간 정치시킨 후 4℃, 12000rpm에서 15분간 원심분리한다. 상등액만 새로운 튜브에 옮겨서 0.65배 이소프로판올을 넣은 다음 상온에서 10분간 정치 후 4℃, 12000rpm에서 15분간 원심분리한 다음 75% DEPC-에탄올로 RNA 펠렛을 세척한 다음 건조시켜서 30ul에 녹인다. 1% 아가로스-포름알데히드 젤로 전기영동해서 확인한 후 total RNA 5ug 으로 다음 조건에 따라 1st cDNA를 합성했다: total RNA 5ug, Oligo dT(10pmole), 10mM dNTPs를 넣고 65℃에서 5분; 5X First strand buffer, 0.1M DTT, RNaseOut(40U/ul)을 넣고 42℃에서 2분; Supersript^TM II RT(200units)을 넣고 42℃에서 50분간 처리한 다음 72℃에서 15분간 처리 후 PCR 검증시 사용하였다. 972 GSP-F: 5'-ACTCCTCCTCCTGCTGCCAC-3'(서열번호 4), 972 GSP-R: 5'-GAAGCACATGTCGAGGAGGC-3'(서열번호 5) 프라이머 세트를 사용하여 다음 조건에 따라 PCR 증폭되었다: 예비변성으로 5분동안 95℃의 1사이클; 30초 동안 95℃, 30초 동안 58℃, 30초 동안 72℃의 25사이클; Applied Biosystem GeneAmp PCR system9700 증폭기에서 후-연장(extension)으로 5분동안 72℃의 1사이클. PCR 반응으로부터 증폭된 주요 생성물은 2.5% 아가로스 젤에서 전기영동으로 확인하였다 (도 3).

도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 건조스트레스를 처리하지 않은 벼 잎과 비교하여, 건조스트레스를 처리한 벼 잎에서 유전자 발현이 증가함을 알 수 있으므로, 본 발명의 프로모터는 건조스트레스 유도성 프로모터라는 것을 알 수 있다.

실시예 5: 벼 캘러스로의 형질전환 후 GFP 조사

벡터 pHC10::972promoter는 벼 핵 형질전환에 따른 아그로박테리움-매개된 진공 침윤법에 따라 동진벼 (Oryza sativa L.)로 도입된다. 하이그로마이신 내성-양성 유전자 변형체를 선택하기 위해, 벼 종자는 캘러스 유기를 위해서 종피를 제거한 현미를 사용한다. 종피 제거는 간단한 현미기를 사용하고 종피가 제거된 종자는 70% 에탄올 1회 10분간 소독 후 다시 2~3% sodium hypochlorite 용액에 30분 소독한 후 멸균수로 3회 이상 세척한다. 캘러스 유기배지에 소독이 끝난 종자를 10~12개 치상한 후 28℃ 3~4주 암배양한다. 직경 1~2mm 정도의 연황색 캘러스를 선발해서 2N6 배지에서 3일간 증식시킨다. 캘러스를 선발한 다음 날 아그로박테리움을 카베니실린과 하이그로마이신을 첨가한 배지에서 28℃에서 3~5일간 암배양한다. 3일간 증식한 캘러스를 옮긴 후 아그로박테리움 현탁액으로 공동배양한 후 25℃ 암조건에서 3일간 배양한다. 공동배양한 캘러스로부터 카베니실린이 포함된 멸균된 물로 세척한 후 형질전환 캘러스를 2~3주간 28℃ 조건에서 암배양 후 건전한 생육을 보이는 것을 선발한다. 새로운 배지에 옮긴 후 동일 조건에서 배양 후 건전한 캘러스를 선발 재분화 배지에 치상한다. 유전자가 도입된 형질전환체들은 genomic PCR로 증명하였다.

- GFP 조사

972 프로모터의 기능을 조사하기 위해 GFP 항체를 이용한 ELISA 분석을 수행하였다. Genomic PCR로 선발된 형질전환체 잎으로부터 0hr, 6hr 건조스트레스를 준 후 50mM Tris-HCl(pH7.5), 1mM EDTA, 8mM MgCl₂, proteinase inhibitor 가 포함된 용액으로 총 단백질을 추출해서 사용한다. 총 단백질을 Bradford assay 용액으로 정량한 후 10ug을 사용하였다. 마이크로플레이트에 코팅 버퍼 200ul에 총 단백질을 넣은 항원을 4℃에서 12시간 반응시킨다. 4% skim milk가 포함된 1X PBS로 상온에서 2시간동안 블로킹시킨 다음 GFP 항체를 1% skim milk가 포함된 1X PBS로 1/4000로 희석해서 상온에서 2시간동안 두어서 항원에 바인딩시킨다. 1X PBS에 Tween20을 0.05% 포함시켜서 세척한 후 두번째 항체를 1% skim milk가 포함된 1X PBS로 1/2000로 희석해서 상온에서 1시간동안 두어서 바인딩시킨 다음 세척하고 30% H₂O₂, PC 버퍼, OPD를 넣은 용액으로 10분쯤 현상한 후 2.5M H₂SO₄로 반응을 중지시키고 마이크로플레이트 판독기로 490nm에서 읽은 후 분석한다 (도 4).

도 4에서 알 수 있는 바와 같이, 건조스트레스를 처리하지 않은 벼 형질전환체와 비교하여, 건조스트레스를 처리한 벼 형질전환체에서 GFP 발현이 현저하게 증가함을 알 수 있으므로, 본 발명의 프로모터는 건조스트레스 유도성 프로모터라는 것을 알 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 1의 염기 서열로 이루어진 벼 유래의 건조스트레스 유도성 972 프로모터.
삭제
제1항에 따른 프로모터를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터.
제3항에 있어서, 상기 프로모터의 하류(downstream)에 목적 단백질을 암호화하는 목적 유전자를 작동 가능하게 연결시켜 제조된 재조합 식물 발현 벡터.
제4항에 따른 재조합 식물 발현 벡터로 식물체를 형질전환시킨 후, 형질전환된 식물체에 건조스트레스를 가하여 상기 식물체 내에서 목적 단백질이 생산되도록 하는 것을 특징으로 하는 식물체 내에서 목적 단백질을 생산하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 목적 단백질은 인터루킨, 인터페론, 혈소판 유도 성장 인자, 헤모글로빈, 엘라스틴, 콜라겐, 인슐린, 섬유아세포 성장 인자, 인간 성장 인자, 인간 혈청 알부민, 에리스로포이에틴, 셀로바이오하이드로라제, 엔도셀룰라제, 베타글루코시다제 및 자일나아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제3항에 따른 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 형질전환 식물의 제조 방법.
제7항의 방법에 의해 제조된 형질전환 식물.
제8항에 있어서, 상기 식물은 단자엽 식물인 것을 특징으로 하는 식물.
제1항에 따른 프로모터를 식물에 도입함으로써 식물의 건조스트레스 내성을 향상시키는 방법.
삭제
제1항의 프로모터를 증폭하기 위한 서열번호 2 및 3으로 이루어진 프라이머 세트.