JP2003219891A - 植物の転写因子をコードする遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 イネ等の単子葉植物よりストレス耐性遺伝子
に特異的な転写因子をコードする遺伝子を同定し、該遺
伝子を用いて新たな環境ストレス耐性植物を提供するこ
と。 【解決手段】 イネゲノムより、ストレス応答性タンパ
ク質をコードする遺伝子の上流に存在するシスエレメン
トに結合して、該遺伝子の転写を活性化する転写因子を
コードする遺伝子を同定する。さらに、該転写因子遺伝
子を用いて植物を形質転換し、低温、乾燥、塩などの環
境ストレスに対する耐性を向上させる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、イネ由来の環境ス
トレス耐性を制御するタンパク質及びこれをコードする
遺伝子並びにこれらの利用方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】植物は、乾燥、高温、凍結、塩など、自
然界における様々な環境ストレスに対応するための耐性
機構を有している。従来、こうした環境ストレス耐性を
有する植物の作出には、遺伝学的に乾燥・塩・低温耐性
な系統を選抜・交配する手法が用いられてきたが、選抜
には多くの時間を要する上、成功確率も低いという問題
があった。

【０００３】一方、ストレス耐性機構が分子レベルで明
らかになるにつれ、バイオテクノロジー的手法を用いた
ストレス耐性植物も作出されるようになってきた。例え
ば、ストレスを受けた細胞内にはLEAタンパク質、水チ
ャネルタンパク質、適合溶質合成酵素などのストレスタ
ンパク質が誘導され、細胞をストレスから防御する。そ
こで、オオムギのLEAタンパク質やタバコのdetoxificat
ion enzyme等の遺伝子、浸透圧調節物質(糖、プロリ
ン、グリシンベタイン等)合成酵素の遺伝子を植物に導
入する研究が試みられた。また、細胞膜脂質の修飾酵素
であるシロイヌナズナのw-3 fatty acid desaturaseや
らん藻のD9desaturaseの遺伝子等を用いた研究も試みら
れた。これらの研究では、いずれも一つの遺伝子をカリ
フラワーモザイクウイルスの35Sプロモーターに結合して
植物に導入された。しかし、組換え植物のストレス耐性
度が不安定であったり、レベルが低い等の問題から実用
化に至ったものはなかった。

【０００４】他方、ストレス耐性機構には複数の遺伝子
が複雑に関与することがわかってきた（例えば、非特許
文献１参照）。そこで、それらの発現を同時に活性化す
る転写因子をコードする遺伝子を植物に導入し、ストレ
ス耐性を高める研究も試みられた（例えば、非特許文献
２参照）。しかし、複数の遺伝子が同時期に活性化され
ると、宿主植物のエネルギーが該遺伝子産物の生成や、
該遺伝子産物に起因する細胞内代謝に向けられるため、
植物自体の成長が遅れたり矮化してしまうという問題が
あった。

【０００５】これに対し、発明者らはシロイヌナズナ(A
rabidopsis thaliana)からストレス応答性エレメントに
結合し、該エレメント下流の遺伝子の転写を特異的に活
性化する転写因子をコードする遺伝子、DREB1A、DREB1
B、DREB1C、DREB2A、DREB2Bを単離した（例えば、特許
文献１参照）。そして、前記遺伝子を植物に導入し過剰
発現させることにより、植物を矮化させることなく、ス
トレス耐性を付与できることを報告した（例えば、特許
文献２参照）。

【０００６】ところで、シロイヌナズナは双子葉植物に
分類され、イネやトウモロコシやコムギ等の主要穀物は
単子葉植物に分類されるが、植物の進化上、双子葉植物
と単子葉植物は比較的遠い位置にある。そのため、シロ
イヌナズナのDREB1A遺伝子は単子葉植物においても機能
すると考えられるが、双子葉植物ほどの効果は期待でき
ない。もし、単子葉植物由来のDREB類似遺伝子を単離す
ることができれば、これを用いてより効率的に単子葉植
物に環境ストレス耐性を付与することができる。

【０００７】

【特許文献１】特開平10-228457号公報

【特許文献２】特開平10-292348号公報

【非特許文献１】Plant Physiol., 115:327-334(1997)

【非特許文献２】The Plant Cell, 10:1-17(1998)

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、イネ等の単
子葉植物よりストレス耐性遺伝子に特異的な転写因子を
コードする遺伝子を同定し、該遺伝子を用いて新たな環
境ストレス耐性植物を提供することを目的とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するため鋭意検討した結果、イネゲノムより全て
のDREB類似遺伝子の同定に成功した。また、これらを他
の植物に導入することにより、環境ストレスが著しく向
上することを見出し、本発明を完成した。

【００１０】すなわち、本発明は以下の(1)〜(12)を提
供する。 (1) 以下の(a)又は(b)のDNAを含む遺伝子。 (a) 配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７
又は配列番号９で表される塩基配列からなるDNA (b) 配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７
又は配列番号９で表される塩基配列からなるDNAに相補
的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下
でハイブリダイズし、かつストレス応答性エレメント下
流の遺伝子の転写を制御するタンパク質をコードするDN
A (2) 以下の(c)又は(d)のタンパク質をコードする遺伝
子。 (c) 配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８
又は配列番号10で表されるアミノ酸配列からなるタンパ
ク質 (d) 配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８
又は配列番号10で表されるアミノ酸配列において１若し
くは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたア
ミノ酸配列からなり、かつストレス応答性エレメント下
流の遺伝子の転写を制御するタンパク質 (3) 前記ストレスが乾燥ストレス、低温ストレス又は塩
ストレスである上記(1)又は(2)記載の遺伝子。 (4) 以下の(c)又は(d)の組換えタンパク質。 (c) 配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８
又は配列番号10で表されるアミノ酸配列からなるタンパ
ク質 (d) 配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８
又は配列番号10で表されるアミノ酸配列において１若し
くは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたア
ミノ酸配列からなり、かつストレス応答性エレメント下
流の遺伝子の転写を制御するタンパク質 (5) 前記ストレスが乾燥ストレス、低温ストレス又は塩
ストレスである上記(4)記載のタンパク質。 (6) 上記(1)〜(3)のいずれか1に記載の遺伝子を含有す
る、組換えベクター。 (7) 上記(6)記載の組換えベクターを含む形質転換体。 (8) 宿主が植物である、上記(7)記載の形質転換体。 (9) 宿主が単子葉植物である、上記(7)記載の形質転換
体。 (10) 上記(8)又は(9)記載の形質転換体を培地に培養
し、得られる培養物からストレス応答性エレメント下流
の遺伝子の転写を制御するタンパク質を採取することを
特徴とする、該タンパク質の製造方法。 (11) 上記(1)〜(3)のいずれか1に記載の遺伝子の植物体
内における転写レベルを測定することを特徴とする、植
物のストレスレベルの測定方法。 (12) 上記(1)〜(3)のいずれか1に記載の遺伝子を植物に
導入することにより、該植物のストレス耐性を向上させ
る方法。

【００１１】

【発明の実施の形態】本発明の遺伝子は、イネゲノム由
来の、低温、乾燥、塩などの環境ストレスに対する耐性
向上機能を有する遺伝子である。

【００１２】本発明の遺伝子は「低温、乾燥、塩などの
環境ストレスによって発現されるストレス応答性タンパ
ク質をコードする遺伝子の上流に存在するシスエレメン
トに結合して、転写を活性化する転写因子をコードする
遺伝子」である。前記シスエレメントには、乾燥ストレ
ス応答性エレメント(DRE；dehydration-responsive ele
ment)、アブシジン酸応答性エレメント(ABRE；abscisic
acid responsive element)、低温ストレス応答性エレ
メントなどがある。本発明の遺伝子がコードするタンパ
ク質は、前記ストレス応答性エレメント（DRE等）下流
の遺伝子の転写を活性化する機能を有するものである。

【００１３】本発明の遺伝子は、例えば以下のようにし
て同定することができる。 1. 本発明の遺伝子の同定 本発明の遺伝子は、類似の機能を有する公知の遺伝子、
すなわち植物のストレス耐性遺伝子に特異的な転写因子
をコードする遺伝子との相同性に基づいてスクリーニン
グすることができる。スクリーニングはイネのmRNA及び
cDNAライブラリーやイネゲノムライブラリーを調整して
これを対象に行うこともできるし、既存のイネDNAデー
タベースを対象に行ってもよい。

【００１４】(1) 遺伝子ライブラリーのスクリーニング i) mRNA及びcDNAライブラリーの調整 まず、mRNA及びcDNAライブラリーを以下のようにして調
整する。mRNAの供給源としては、イネの葉、茎、根、花
など植物体の一部又は植物体全体のいずれであってもよ
い。また、イネの種子をGM培地、MS培地、#3培地などの
固体培地に播種し、無菌条件下で生育させた植物体を用
いてもよい。またカルスや無菌条件下で育てたイネの培
養細胞などでもよく、目的とする遺伝子のmRNAを含んで
いる細胞であればその種類は問わない。さらに、検索対
象である遺伝子は環境ストレスに対して発現する遺伝子
であるため、低温ストレス(例えば、10〜-4℃)、塩スト
レス(例えば、150〜250mM NaCl)あるいは乾燥ストレス
(例えば、脱水状態にする)に曝露させた植物体も好適に
用いることができる。

【００１５】mRNAの調製は、例えば水耕栽培で生育させ
たイネの植物体を、低温ストレス、乾燥ストレス又は塩
ストレスに曝露後、液体窒素で凍結する。凍結した植物
体を乳鉢などで摩砕後、得られた摩砕物から、グリオキ
サール法、グアニジンチオシアネート-塩化セシウム
法、塩化リチウム-尿素法、プロテイナーゼK-デオキシ
リボヌクレアーゼ法などにより粗RNA画分を抽出調製す
る。次いで、この粗RNA画分から、オリゴdT-セルロース
やセファロース2Bを担体とするポリ U-セファロースな
どを用いたアフィニティーカラム法、あるいはバッチ法
によりポリ(A)⁺RNA(mRNA)を得ることができる。さら
に、ショ糖密度勾配遠心法などによりmRNAをさらに分画
してもよい。

【００１６】さらにこうして得られたmRNAを鋳型として
cDNAライブラリーを作製することができる。たとえば、
市販のキット(例えば、ZAP-cDNASynthesis Kit(STRATAG
ENE社製))を用いて、オリゴdtプライマーまたはランダ
ムプライマーと逆転写酵素によって一本鎖cDNAを合成し
た後、該一本鎖cDNAから二本鎖cDNAを合成する。次い
で、得られた二本鎖cDNAに適切な制限酵素切断部位を含
むアダプターを付加した後、ラムダファージベクターの
クローニング部位に挿入数する。得られたDNAはGigapac
k III Gold packaging extract（STRATAGENE社製）等を
用いてパッケージングし、宿主大腸菌に感染、増幅させ
た後、ファージ粒子を回収し保存する。

【００１７】ii) ゲノムライブラリーの作製 例えばラムダファージベクターを用いてゲノムライブラ
リーを作成するには以下のような手順で行う。DNAの供
給源としては、イネの葉、茎、根、花など植物体の一部
または植物全体のいずれであっても、DNA を含む組織で
あればその種類は問わない。植物体を液体窒素存在下で
粉砕し、CTAB 法、塩化ベンジル法などで DNA を抽出す
る。得られた DNA を制限酵素 Sau3AI で部分分解を行
った後、NaCl 密度勾配超遠心法等により分画し、10-20
kb の断片を回収する。この断片をλEMBL3、λFIX II
等のラムダファージベクターの BamHI 切断部位に挿入
する。その後、Gigapack III Gold packaging extract
（STRATAGENE 社製）等を用いてパッケージングし、宿
主大腸菌に感染させる。増幅したファージ粒子を回収し
保存する。

【００１８】iii) ライブラリーのスクリーニング ライブラリーのスクリーニングは以下のようにして行う
ことができる。植物のストレス耐性遺伝子に特異的な転
写因子をコードする公知の遺伝子、例えばシロイヌナズ
ナ由来のDREB遺伝子（DREB1A遺伝子：配列番号11、DREB
2A遺伝子：配列番号12、DREB1B遺伝子：配列番号13、DR
EB1C遺伝子：配列番号14、DREB2B：配列番号15）等の、
保存性の高い領域の配列をもとにDNA断片を作製し、プ
ローブとする。該プローブDNAはPCR増幅してもよい。PC
R用プライマーは保存性の高い領域を増幅するように、
これを挟む２か所の 15 bp - 25 bp 程度のプライマー
を設計すればよい。なお、保存性の高い領域が短くプロ
ーブとして不十分な場合は、複数の保存性の高い領域を
これらに隣接する領域とともに増幅するようにプライマ
ーを設計しても良い。

【００１９】こうして作製したプローブを用いて、プラ
ークハイブリダイゼーション又はコロニーハイブリダイ
ゼーションにより、cDNA ライブラリー又はゲノムライ
ブラリーをスクリーニングする。

【００２０】(2) 遺伝子データベースを利用したスクリ
ーニング 植物のストレス耐性遺伝子に特異的な転写因子をコード
する公知の遺伝子、例えばシロイヌナズ由来のDREB遺伝
子（DREB1A遺伝子、DREB1B遺伝子、DREB1C遺伝子、DREB
2A遺伝子、DREB2B）等の重要な配列（保存性の高い領域
や機能を有していると予想される領域）を特定する。つ
ぎに、特定した配列をもとに既存の遺伝子データベース
をホモロジー検索する。対象となる遺伝子データはEST
であっても、全長遺伝子であってもよい。ホモロジー検
索は、例えば BLAST や FASTA 等の解析ソフトを用い
て、GenBank や DDBJ のデータベースに対して行うこと
ができる。検出対象は保存性の高い領域や機能を有して
いると予想されている領域のアミノ酸配列において、特
に高い相同性を有している遺伝子であり、タンパク質の
機能に必須とされているアミノ酸を保存している配列で
あることが好ましい。得られた配列を基にプライマーを
設計し、クローニングしていない cDNA（RT-PCR）、cDN
A ライブラリー、ゲノムDNA又はゲノムライブラリーを
鋳型としてPCRを行い、目的の遺伝子を得る。あるい
は、PCRで増幅したDNA断片をプローブとして、cDNAライ
ブラリー又はゲノムライブラリーをスクリーニングして
目的の遺伝子を得る。

【００２１】(3) 塩基配列の決定 クローニングされたcDNAは、公知の方法により全塩基配
列の決定を行うことができる。塩基配列の決定法として
は、マキサム-ギルバートの化学修飾法又はM13ファージ
を用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法などを挙げる
ことができるが、通常は自動塩基配列決定機（例えばPE
RKIN-ELMER社製377 DNAシークエンサーなど）を用いて
行われる。

【００２２】こうして、イネ由来のDREB類似遺伝子とし
て、OsDREB1A（配列番号１）、OsDREB1B（配列番号
３）、OsDREB1C（配列番号５）、OsDREB1D（配列番号
７）、OsDREB2A（配列番号９）が同定された。

【００２３】また該遺伝子のORFを解析することにより
該遺伝子がコードするタンパク質、OsDREB1Aタンパク質
（配列番号２）、OsDREB1Bタンパク質（配列番号４）、
OsDREB1Cタンパク質（配列番号６）、OsDREB1Dタンパク
質（配列番号８）、OsDREB２Aタンパク質（配列番号１
０）が同定された。

【００２４】しかし、本発明の遺伝子は配列番号１、配
列番号３、配列番号５、配列番号７又は配列番号９で示
すDNAからなる遺伝子に限定されるものではない。配列
番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７又は配列
番号９で表される塩基配列からなるDNAに相補的な塩基
配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブ
リダイズしうるDNAからなる遺伝子も、ストレス応答性
エレメント下流の遺伝子の転写を制御するタンパク質を
コードする限り、本発明の遺伝子である。ここで、スト
リンジェントな条件とは、ホルムアミド濃度が30〜50
％、37〜50℃、6×SSCの条件、好ましくはホルムアミド
濃度が50％、42℃、6×SSCの条件をいう。

【００２５】また、本発明の遺伝子は配列番号２、配列
番号４、配列番号６、配列番号８又は配列番号10で表さ
れるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝
子である。ただし、配列番号２、配列番号４、配列番号
６、配列番号８、又は配列番号10で表されるアミノ酸配
列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若し
くは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であっ
ても、該タンパク質がストレス応答性エレメント下流の
遺伝子の転写を制御する機能を有する限り、これをコー
ドする遺伝子も本発明の遺伝子に含まれる。なお、前記
数個とは好ましくは20個以下、さらに好ましくは5個以
下を意味する。

【００２６】本発明のタンパク質は、配列番号２、配列
番号４、配列番号６、配列番号８又は配列番号10で表さ
れるアミノ酸配列からなるタンパク質に限定されるもの
ではない。配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列
番号８又は配列番号10で表されるアミノ酸配列において
１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加さ
れたアミノ酸配列からなるタンパク質も、ストレス応答
性エレメント下流の遺伝子の転写を制御する機能を有す
る限り、本発明のタンパク質に含まれる。なお、前記数
個とは好ましくは20個以下、さらに好ましくは5個以下
を意味する。

【００２７】なお、本発明の遺伝子に変異を導入するに
は、Kunkel法や Gapped duplex法などの公知の手法又は
これに準ずる方法により、例えば部位特異的突然変異誘
発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-K(TAK
ARA社製)やMutant-G(TAKARA社製)など）を用いて、ある
いは、TAKARA社のLA PCR in vitro Mutagenesis シリー
ズキットを用いて行うことができる。

【００２８】一旦本発明の遺伝子の塩基配列が確定され
ると、その後は化学合成によって、又は本遺伝子のcDNA
ないしゲノムDNAを鋳型としたPCRによって、あるいは該
塩基配列を有するDNA断片をプローブとしてハイブリダ
イズさせることにより、本発明の遺伝子を得ることがで
きる。

【００２９】2．本発明のタンパク質のDRE結合能及び転
写活性化能の解析 (1) DRE結合能の解析 本発明のタンパク質のDREへの結合能は、該タンパク質
とGST等との融合タンパク質を用い、ゲルシフトアッセ
イ［Urao,T et al.：Plant Cell 5:1529-1539(1993)］
を行うことにより確かめることができる。本発明のタン
パク質は、本発明の遺伝子をグルタチオン-S-トランス
フェラーゼ(GST)遺伝子をコードするプラスミド(例え
ば、pGEX-4T-1ベクター(Pharmacia社製)など)のGSTコー
ド領域の下流にフレームを合わせて連結し、該プラスミ
ドにより形質転換した大腸菌を誘導条件下で培養し、こ
の大腸菌から精製して得ることができる。

【００３０】ゲルシフトアッセイは、DNAとタンパク質
との相互作用を調べる方法であり、^{3 2}Pなどで標識したD
REを含むDNA断片と前記融合タンパク質とを混合してイ
ンキュベーションした後、該混合物を電気泳動し、ゲル
を乾燥後、オートラジオグラムをとり、DNA断片とタン
パク質との結合に起因する遅れて泳動されたバンドを検
出する方法である。本発明のタンパク質がDRE配列に特
異的に結合していることは、DRE配列に変異を加えたDNA
断片を用いた場合に、前記のバンドが検出されないこと
により確認することができる。

【００３１】(2) 転写活性化能の解析 本発明のタンパク質の転写活性化能は、イネのプロトプ
ラストの系を用いるトランスアクチベーション実験法を
用いることにより解析することができる。例えば、OsDR
EB1A cDNAをCaMV35Sプロモーターを含むpBI221プラスミ
ド(Clonetech社製)に連結し、エフェクタープラスミド
を構築する。一方、DREを含むDNA断片を、β-グルクロ
ニダーゼ(GUS)遺伝子上流のTATAプロモーターのさらに
上流に連結し、レポータープラスミドを構築する。次い
でこの２種のプラスミドをイネのプロトプラストに導入
した後、GUS活性を測定する。OsDREB1Aタンパク質を同
時に発現させることにより、GUS活性の上昇が見られれ
れば、プロトプラスト内で発現したOsDREB1Aタンパク質
が、DREの配列を介して転写を活性化していることがわ
かる。

【００３２】本発明において、プロトプラストの調製及
び該プロトプラストへのプラスミドDNAの導入は、Abel
らの方法[Abel,S.：Plant J. 5:421-427(1994)]により
行うことができる。また、実験ごとのプラスミドDNAの
導入効率の差による実験誤差を最小限にするため、上記
２種のプラスミドとともに、CAMV35Sプロモーター下流
にルシフェラーゼ遺伝子を連結したプラスミドをプロト
プラストに導入し、ルシフェラーゼ活性に対するβ-グ
ルクロニダーゼ活性を測定し、得られた測定値を転写活
性化能の値とすることができる。β-グルクロニダーゼ
活性は、Jeffersonらの方法[Jefferson,R.A.：EMBO J.
83：8447-8451(1986)]により、ルシフェラーゼ活性はPi
caGeneルシフェラーゼアッセイキット(Toyo-Ink社製)を
用いることにより測定することができる。

【００３３】3．組換えベクター及び形質転換体の作製 (1) 組換えベクターの作製 本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明の
遺伝子を連結(挿入)することにより得ることができる。
本発明の遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で
複製可能なものであれば特に限定されず、例えばプラス
ミド DNA、ファージ DNAなどが挙げられる。プラスミド
DNAとしては、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119などの
大腸菌宿主用プラスミド、pUB110、pTP5などの枯草菌用
プラスミド、YEp13、YEp24、YCp50などの酵母宿主用プ
ラスミド、pBI221、pBI121などの植物細胞宿主用プラス
ミドなどが挙げられ、ファージDNAとしてはλファージ
などが挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシ
ニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスな
どの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。

【００３４】ベクターに本発明の遺伝子を挿入するに
は、まず、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、
適当なベクター DNAの制限酵素部位又はマルチクローニ
ングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採
用される。本発明の遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮
されるようにベクターに組み込まれることが必要であ
る。そこで、本発明のベクターには、プロモーター、本
発明の遺伝子のほか、所望によりエンハンサーなどのシ
スエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シ
グナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（SD配列）
などを含有するものを連結することができる。なお、選
択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝
子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子
などが挙げられる。

【００３５】(2) 形質転換体の作製 本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを、目
的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することによ
り得ることができる。ここで、宿主としては、本発明の
遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるもので
はない。例えば、エッシェリヒア・コリ(Escherichia c
oli)などのエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス(B
acillus subtilis)などのバチルス属、シュードモナス
・プチダ(Pseudomonas putida)などのシュードモナス
属、リゾビウム・メリロティ(Rhizobium meliloti)など
のリゾビウム属に属する細菌が挙げられ、サッカロミセ
ス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッ
カロマイセス・ポンベなどの酵母が挙げられ、シロイヌ
ナズナ、タバコ、トウモロコシ、イネ、ニンジンなどか
ら株化した植物細胞や該植物から調製したプロトプラス
トが挙げられ、COS細胞、CHO細胞などの動物細胞が挙げ
られ、あるいはSf9、Sf21などの昆虫細胞が挙げられ
る。

【００３６】大腸菌などの細菌を宿主とする場合は、本
発明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能である
と同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明
の遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好
ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれ
ていてもよい。大腸菌としては、例えばエッシェリヒア
・コリ(Escherichia coli)HMS174(DE3)、K12、DH1など
が挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチ
リス(Bacillus subtilis)MI 114、207-21などが挙げら
れる。

【００３７】プロモーターとしては、大腸菌などの宿主
中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例
えばtrpプロモーター、lacプロモーター、P_Lプロモータ
ー、P_Rプロモーターなどの、大腸菌やファージに由来す
るプロモーターが用いられる。tacプロモーターなどの
ように、人為的に設計改変されたプロモーターを用いて
もよい。細菌への組換えベクターの導入方法は、特に限
定されず、例えばカルシウムイオンを用いる方法[Cohe
n, S.N. et al.：Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69：2
110-2114 (1972)]、エレクトロポレーション法などが挙
げられる。

【００３８】酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロ
ミセス・セレビシエ(Saccharomycescerevisiae)、シゾ
サッカロマイセス・ポンベ、ピヒア・パストリス(Pichi
a pastoris)などが用いられる。この場合、プロモータ
ーとしては酵母中で発現できるものであれば特に限定さ
れず、例えばgal1プロモーター、gal10プロモーター、
ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモ
ーター、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロ
モーター、ADHプロモーター、AOX1プロモーターなどが
挙げられる。

【００３９】酵母への組換えベクターの導入方法は、特
に限定されず、例えばエレクトロポレーション法[Becke
r, D.M. et al.：Methods. Enzymol., 194： 182-187
(1990)]、スフェロプラスト法[Hinnen, A.et al.：Pro
c. Natl. Acad. Sci., USA, 75： 1929-1933 (1978)]、
酢酸リチウム法[Itoh, H.：J. Bacteriol., 153：163-1
68 (1983)]などが挙げられる。

【００４０】植物細胞を宿主とする場合は、例えばイ
ネ、トウモロコシ、コムギ、シロイヌナズナ、タバコ、
ニンジンなどから株化した細胞や該植物から調製したプ
ロトプラストが用いられる。この場合、プロモーターと
しては植物中で発現できるものであれば特に限定され
ず、例えばカリフラワーモザイクウイルスの35S RNAプ
ロモーター、rd29A遺伝子プロモーター、rbcSプロモー
ターなどが挙げられる。

【００４１】植物への組換えベクターの導入方法として
は、Abelらのポリエチレングリコールを用いる方法[Abe
l,H. et al. Plant J. 5:421-427(1994)]やエレクトロ
ポレーション法などが挙げられる。動物細胞を宿主とす
る場合は、サル細胞COS-7、Vero、チャイニーズハムス
ター卵巣細胞（CHO細胞）、マウスL細胞、ラットGH3、
ヒトFL細胞などが用いられる。プロモーターとしては、
SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモータ
ー、CMVプロモーターなどを用いることができる。ま
た、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモータ
ーなどを用いてもよい。

【００４２】動物細胞への組換えベクターの導入方法と
しては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カル
シウム法、リポフェクション法などが挙げられる。昆虫
細胞を宿主とする場合は、Sf9細胞、Sf21細胞などが用
いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法とし
ては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション
法、エレクトロポレーション法などが用いられる。

【００４３】4．本発明のタンパク質の生産 本発明のタンパク質は、本発明の遺伝子によりコードさ
れるアミノ酸配列を有するもの、または該アミノ酸配列
において少なくとも1個のアミノ酸に前記変異が導入さ
れたアミノ酸配列を有し、かつストレス応答性エレメン
ト下流の転写を制御する機能を有するものである。

【００４４】本発明のタンパク質は、前記形質転換体を
培地に培養し、その培養物から採取することにより得る
ことができる。「培養物」とは、培養上清、あるいは培
養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物
のいずれをも意味するものである。本発明の形質転換体
を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常
の方法に従って行われる。

【００４５】大腸菌や酵母菌などの微生物を宿主として
得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が
資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類などを含有し、形
質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれ
ば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。また
植物細胞を宿主として用いている場合には、必要に応じ
て、培地にチアミン、ピリドキシンなどのビタミン類を
添加し、動物細胞を宿主として用いている場合には、RP
MI1640などの血清を添加する。

【００４６】炭素源としては、グルコース、フラクトー
ス、スクロース、デンプンなどの炭水化物、酢酸、プロ
ピオン酸などの有機酸、エタノール、プロパノールなど
のアルコール類が用いられる。窒素源としては、アンモ
ニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アン
モニウム、リン酸アンモニウムなどの無機酸若しくは有
機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほ
か、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーなど
が用いられる。

【００４７】無機物としては、リン酸第一カリウム、リ
ン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシ
ウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫
酸銅、炭酸カルシウムなどが用いられる。培養は、通
常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、30
〜37℃位で６時間〜3日間程度行う。培養期間中、pHは
7.0〜7.5程度に保持する。pHの調整は、無機又は有機
酸、アルカリ溶液などを用いて行う。

【００４８】培養中は必要に応じてアンピシリンやテト
ラサイクリンなどの抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現
ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要
に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例え
ば、Lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換
した微生物を培養するときにはイソプロピル-β-D-チオ
ガラクトピラノシド(IPTG)などを、trpプロモーターを
用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養すると
きにはインドールアクリル酸(IAA)などを培地に添加し
てもよい。

【００４９】培養は、通常、5％CO₂存在下、30〜37℃位
で6時間〜3日間程度行う。培養中は必要に応じてカナマ
イシン、ペニシリンなどの抗生物質を培地に添加しても
よい。培養後、本発明のタンパク質が菌体内又は細胞内
に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することに
より該タンパク質を抽出する。また、本発明のタンパク
質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液を
そのまま使用するか、遠心分離などにより菌体又は細胞
を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられ
る一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈
殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラ
フィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを単独
で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物
中から本発明のタンパク質を単離精製することができ
る。

【００５０】5．本発明の遺伝子を導入したトランスジ
ェニック植物の作製 遺伝子工学的手法を用いて本発明のタンパク質をコード
するDNAを植物宿主に導入することによリ、環境ストレ
ス、特に、低温ストレス、凍結ストレス、乾燥ストレス
などに対して抵抗性を有するトランスジェニック植物を
作製することができる。本発明の遺伝子の植物宿主への
導入方法としては、アグロバクテリウム感染法などの間
接導入法や、パーティクルガン法、ポリエチレングリコ
ール法、リポソーム法、マイクロインジェクション法な
どの直接導入法などが挙げられる。アグロバクテリウム
感染法を用いる場合、以下のようにして本発明の遺伝子
導入植物を作製ことができる。

【００５１】(1) 植物導入用組換えベクターの作製及び
アグロバクテリウムの形質転換 植物導入用組換えベクターは、本発明の遺伝子を含むDN
Aを適当な制限酵素で切断後、必要に応じて適切なリン
カーを連結し、植物細胞用のクローニングベクターに挿
入することにより得ることができる。クローニング用ベ
クターとしては、pBI2113Not、pBI2113、pBI101、pBI12
1、pGA482、pGAH、pBIG等のバイナリーベクター系のプ
ラスミドやpLGV23Neo、pNCAT、pMON200などの中間ベク
ター系のプラスミドを用いることができる。

【００５２】バイナリーベクター系プラスミドを用いる
場合、上記のバイナリーベクターの境界配列(LB,RB)間
に、目的遺伝子を挿入し、この組換えベクターを大腸菌
中で増幅する。次いで、増幅した組換えベクターをアグ
ロバクテリウム・チュメファシエンスC58、LBA4404、EH
A101、C58C1Rif^R、EHA105等に、凍結融解法、エレクト
ロポレーション法等により導入し、該アグロバクテリウ
ムを植物の形質導入用に用いる。

【００５３】上記の方法以外にも、本発明においては、
三者接合法[Nucleic Acids Research, 12：8711(1984)]
によって本発明の遺伝子を含む植物感染用アグロバクテ
リウムを調製することができる。すなわち、目的遺伝子
を含むプラスミドを保有する大腸菌、ヘルパープラスミ
ド(例えばpRK2013など)を保有する大腸菌、及びアグロ
バクテリウムを混合培養し、リファンピシリン及びカナ
マイシンを含む培地上で培養することにより植物感染用
の接合体アグロバクテリウムを得ることができる。

【００５４】植物体内で外来遺伝子などを発現させるた
めには、構造遺伝子の前後に、それぞれ植物用のプロモ
ーターやターミネーターなどを配置させる必要がある。
本発明において利用可能なプロモーターとしては、例え
ばカリフラワーモザイクウイルス(CaMV)由来の35S転写
物[Jefferson, R.A. et al.: The EMBO J 6:3901-3907
(1987)]、トウモロコシのユビキチン[Christensen, A.
H. et al.: Plant Mol. Biol. 18:675-689(1992)]、ノ
パリン合成酵素(NOS)遺伝子、オクトピン(OCT)合成酵素
遺伝子のプロモーターなどが挙げられ、ターミネーター
配列としては、例えばカリフラワーモザイクウイルス由
来やノパリン合成酵素遺伝子由来のターミネーターなど
が挙げられる。但し、植物体内で機能することが知られ
ているプロモーターやターミネーターであればこれらの
ものに限定されるものではない。

【００５５】ここで、用いるプロモーターが目的遺伝子
の構成的発現を担うプロモーター(CaMV35Sプロモーター
など)で、これによって、遺伝子導入植物に生長の遅れ
や矮化が生じる場合は、目的遺伝子の一過性の発現をも
たらすようなプロモーター(例えば、rd29A遺伝子プロモ
ーターなど)を用いることができる。また、必要に応じ
てプロモーター配列と本発明の遺伝子の間に、遺伝子の
発現を増強させる機能を持つイントロン配列、例えばト
ウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ(Adh1)のイン
トロン[Genes＆ Development 1:1183-1200(1987)]を導
入することができる。

【００５６】さらに、効率的に目的の形質転換細胞を選
択するために、有効な選択マーカー遺伝子を本発明の遺
伝子と併用することが好ましい。その際に使用する選択
マーカーとしては、カナマイシン耐性遺伝子(NPTII)、
抗生物質ハイグロマイシンに対する抵抗性を植物に付与
するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ(htp)
遺伝子及びビアラホス(bialaphos)に対する抵抗性を付
与するホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ
(bar)遺伝子等から選ばれる１つ以上の遺伝子を使用す
ることができる。本発明の遺伝子及び選択マーカー遺伝
子は、単一のベクターに一緒に組み込んでも良いし、そ
れぞれ別個のベクターに組み込んだ２種類の組換えDNA
を用いてもよい。

【００５７】(2) 宿主への本発明の遺伝子の導入 本発明の形質転換体の宿主は特に限定されないが、植物
であることが好ましい。該植物は、植物培養細胞、栽培
植物の植物体全体、植物器官(例えば葉、花弁、茎、
根、根茎、種子等)、又は植物組織(例えば表皮、師部、
柔組織、木部、維管束等)のいずれであってもよい。植
物はイネ、トウモロコシ、コムギ等の単子葉植物である
ことがより好ましい。植物培養細胞、植物体、植物器官
又は植物組織を宿主とする場合、本発明のタンパク質を
コードするDNAは、採取した植物切片にベクターをアグ
ロバクテリウム感染法、パーティクルガン法又はポリエ
チレングリコール法などで導入し、植物宿主を形質転換
することができる。あるいはプロトプラストにエレクト
ロポレーション法で導入して形質転換植物を作製するこ
ともできる。

【００５８】たとえばアグロバクテリウム感染法により
シロイヌナズナに遺伝子を導入する場合、目的の遺伝子
を含むプラスミドを保有するアグロバクテリウムを植物
に感染させる工程が必須であるが、これは、バキューム
インフィルトレーション法[CR Acad. Sci. Paris, Life
Science, 316 :1194(1993)]により行うことができる。
すなわち、シロイヌナズナをバーミキュライトとパーラ
イトを等量ずつ合わせた土で生育させ、生育させたイネ
を本発明の遺伝子を含むプラスミドを含むアグロバクテ
リウムの培養液に直接浸し、これをデシケーターに入れ
バキュームポンプで65〜70mmHgになるまで吸引後、5〜1
0分間、室温に放置する。鉢をトレーに移しラップで覆
い湿度を保つ。翌日ラップを取り、植物をそのまま生育
させ種子を収穫する。

【００５９】次いで、種子を目的の遺伝子を保有する個
体を選択するために、適切な抗生物質を加えたMS寒天培
地に播種する。この培地で生育したシロイヌナズナを鉢
に移し、生育させることにより、本発明の遺伝子が導入
されたトランスジェニネック植物の種子を得ることがで
きる。一般に、導入遺伝子は宿主植物のゲノム中に同様
に導入されるが、その導入場所が異なることにより導入
遺伝子の発現が異なるポジションイフェクトと呼ばれる
現象が見られる。プローブとして導入遺伝子のDNA断片
を用いたノーザン法で検定することによって、より導入
遺伝子が強く発現している形質転換体を選抜することが
できる。

【００６０】本発明の遺伝子を導入したトランスジェニ
ック植物及びその次世代に目的の遺伝子が組み込まれて
いることの確認は、これらの細胞及び組織から常法に従
ってDNAを抽出し、公知のPCR法又はサザン分析を用いて
導入した遺伝子を検出することにより行うことができ
る。

【００６１】(3) 本発明の遺伝子の植物組織での発現レ
ベル及び発現部位の分析 本発明の遺伝子を導入したトランスジェニック植物にお
ける該遺伝子の発現レベル及び発現部位の分析は、これ
らの細胞及び組織から常法に従ってRNAを抽出し、公知
のRT-PCR法又はノーザン分析を用いて導入した遺伝子の
mRNAを検出することにより行うことができる。また、本
発明の遺伝子産物を、該遺伝子産物に対する抗体を用い
たウエスタン分析等により直接、分析することによって
も行うことができる。

【００６２】(4) 本発明の遺伝子が導入されたトランス
ジェニック植物体内における各種遺伝子のmRNAレベルの
変化 本発明の遺伝子が導入されたトランスジェニック植物体
内において、本発明の転写因子の作用により、発現レベ
ルが変化したと考えられる遺伝子はノーザンハイブリダ
イゼーションによって同定することができる。

【００６３】例えば、水耕栽培などで育てた植物に、所
定期間（例えば１〜２週間）の環境ストレスを与える。
環境ストレスとしては、低温、乾燥、塩等が挙げられ
る。例えば乾燥ストレスの負荷は、水耕栽培から植物体
を、抜き取り濾紙上で10分〜24時間乾燥させることによ
り与えることができる。低温ストレスの負荷は、15〜-4
℃に10分〜24時間保持することにより与えることができ
る。また、塩ストレスの負荷は、例えば50〜500mM NaCl
溶液に変更し、10分〜24時間保持することによって与え
ることができる。

【００６４】ストレスを与えないコントロール植物と環
境ストレスを与えた植物から全RNAを調製して電気泳動
を行い、発現をみたい遺伝子のプローブを用いてノーザ
ンハイブリダイゼーションを行えば、その発現パターン
が解析できる。

【００６５】(5) トランスジェニック植物の環境ストレ
スに対する耐性の評価 本発明の遺伝子を導入したトランスジェニック植物の環
境ストレスに対する耐性は、例えばバーミキュライト、
パーライトなどを含む土を入れた植木鉢にトランスジェ
ニック植物を植え、各種環境ストレスを負荷した場合の
生存を調べることによって評価することができる。環境
ストレスとしては、低温、乾燥、塩等が挙げられる。例
えば、乾燥ストレスに対する耐性は、2〜4週間、水を与
えずその生存を調べることにより評価することができ
る。また低温・凍結ストレスに対する耐性は、15〜-10
℃に、1〜10日間おいた後、2日〜3週間、20〜35℃で生
育させその生存率を調べることにより評価することがで
きる。また、塩ストレスは例えば100〜600mM NaClで1時
間〜７日間おいた後、1〜3週間、20〜35℃で生育させそ
の生存率を調べることにより評価することができる。

【００６６】6．植物のストレスレベルの測定 本発明の遺伝子は、低温ストレス、乾燥ストレス、塩ス
トレスにより転写が活性化されるため、本発明の遺伝子
の転写レベルを調べることにより、植物の受けている低
温・乾燥・塩などによるストレスのレベルを調べること
ができる。

【００６７】本発明の遺伝子の転写レベルは、RNAゲル
ブロット分析、定量的PCRなどにより行うことができ
る。RNAゲルブロット分析に用いるプローブは、本発明
の遺伝子及び／又は該遺伝子に隣接する特異的な配列を
含む100〜1000bpの領域を基に、公知の方法を用いて作
製することができる。また定量的PCRに用いるプライマ
ーは、本発明の遺伝子のコード領域内又はそれに隣接す
る領域の配列を基に、公知の方法を用いて調整すること
ができる。上記のプローブ又はプライマーは、本発明の
遺伝子の転写レベルを測定するためのキットとして使用
することもできる。

【００６８】7．その他 以上述べたほか、本発明のタンパク質はこれに対する抗
体を作製して利用することもできる。該抗体はポリクロ
ーナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよ
い。抗体の作製方法は、特に限定されず、公知の方法
[例えばSambrook,J et al., Molecular Cloning, Cold
Spring Harbor Laboratory Press(1989)を参照]を用い
て行うことができる。該抗体はウェスタンブロッティン
グ法や、免疫沈降法による該タンパク質の検出等に利用
することができる。

【００６９】

【実施例】以下に、本発明を実施例を示して具体的に説
明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものでは
ない。〔実施例１〕イネOsDREB遺伝子のスクリーニング 1．データベースのホモロジー検索 下記に示すDREB1A、DREB1B、DREB1C遺伝子、DREB2A、DR
EB2B遺伝子の全長のアミノ酸配列をもとに、「GenBan
k」のイネのDNAデータベースをBlastを用いてホモロジ
ー検索を行った。

【００７０】その結果、DREB1類似遺伝子としてESTで1
種類（OsDREB1B）、ゲノム配列で2種類（OsDREB1C、OsD
REB1D）、またDREB2類似遺伝子としてESTで1種類（OsDR
EB2A）の４つの遺伝子が見つかった。

【００７１】2．cDNAライブラリーの検索 (1) cDNAライブラリーの調整 イネ（日本晴）の種子を蒸留水を用いた水耕栽培で、暗
黒下、25℃、15日間培養した。この植物体を、４℃で２
時間若しくは２４時間処理、又は培養器から抜き取りろ
紙上で１０時間の乾燥処理、又は250mM NaClで１０時間
処理をした後、液体窒素で凍結した。この凍結した試料
からグアニジンチオシアネート−塩化セシウム法により
全 RNA を抽出し、Oligo(dt)-cellulose カラムを用い
て mRNAを調整した。得られた mRNA を鋳型にして、Hyb
riZAP-2.1 two-hybrid cDNA Gigapack cloning kit （S
TRATAGENE 社製）を用いて cDNA を合成し、HybriZAP-
2.1 ファージミドベクターの EcoRI-XhoI 切断部位に挿
入、クローニングした。このファージミド DNA を Giga
pack III Gold packaging extract（STRATAGENE 社製）
を用いてパッケージングした。得られた、cDNAを含むラ
ムダファージ粒子を宿主大腸菌に感染させ増幅した後、
ファージ懸濁液として回収し保存した。

【００７２】(2) プローブによる検索 １．で得られたゲノム配列 OsDREB1D の ERF/AP2 ドメ
インおよびN末端側の保存領域を含む配列をPCRにより増
幅し、プローブを作成した。このプローブを使用して
(1)で調整した cDNA ライブラリーの検索を行った。そ
の結果、新たなDREB1類似cDNA（OsDREB1A）が得られ
た。

【００７３】OsDREB1Bに相当する EST クローンはイネ
ゲノムプロジェクトより分譲を受けた。OsDREB1C およ
び OsDREB1D はゲノム配列より転写開始点および終了コ
ドンを予測して設計したプライマーを用いてPCR を行
い、タンパク質コード領域全長を増幅した。

【００７４】OsDREB2A については EST の配列をもと
に、全長 cDNA 検索用プローブを作成し、cDNA ライブ
ラリーの検索を行った。得られた cDNA クローンは不完
全長であると予測されたので、cDNA ライブラリーから
調整した DNA を鋳型に 5'RACEを行い、全長の配列を決
定した。この配列をもとに、全長遺伝子増幅用プライマ
ーを設計し、RT-PCR により全長遺伝子を得た。

【００７５】(3) 塩基配列の決定 得られたDREB類似遺伝子のcDNAは、PERKIN-ELMER社製37
7 DNAシークエンサーを用いて塩基配列の決定を行っ
た。さらにORFを解析して、全てのアミノ酸配列を決定
した。 結果：以上の結果、以下の5種類のOsDREB遺伝子の塩基
配列および対応するOsDREBタンパク質のアミノ酸配列が
同定された。全てのOsDREBタンパク質はシロイヌナズナ
由来のDREBタンパク質同様、中央部にERF/AP2 DNA結合
ドメイン、N末端に核移行シグナル、C末端に酸性のアク
ティベーションドメインと推定される領域を有していた
（図１）。

【００７６】図２及び図３にDREB類似タンパク質のアミ
ノ酸配列を種々の植物で比較し、保存性の高い配列をみ
た。白抜文字が保存性の高い領域を示す。

【００７７】なお、各OsDREBの塩基配列及びアミノ酸配
列の配列番号は以下のとおりである。 OsDREB1A：塩基配列（配列番号1）、アミノ酸配列（配列番号2） OsDREB1B：塩基配列（配列番号3）、アミノ酸配列（配列番号4） OsDREB1C：塩基配列（配列番号5）、アミノ酸配列（配列番号6） OsDREB1D：塩基配列（配列番号7）、アミノ酸配列（配列番号8） OsDREB2A：塩基配列（配列番号9）、アミノ酸配列（配列番号10）

【００７８】〔実施例２〕OsDREBタンパク質のDRE結合
能の解析 OsDREB1Aタンパク質及びOsDREB2Aタンパク質のDREへの
結合能を、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)と
該タンパク質との融合タンパク質を大腸菌を用いて調製
し、ゲルシフトアッセイにより調べた。

【００７９】OsDREB1A cDNAの塩基配列の69番目から545
番目の477塩基のDNA断片又はOsDREB2A cDNAの塩基配列
の334番目から822番目の489塩基のDNA断片をPCRにより
増幅した後、該増幅断片をプラスミドpGEX-4T-1（ファ
ルマシア）のEcoRI-XhoI部位に結合した。これを大腸菌
XL1-Blue MRF'に導入したのち、大腸菌を500 mlの2×YT
培地（Molecular Cloning (1982) Cold Spring Harvor
Laboratory Press）で培養して、これにプラスミドpGEX
-4T-1の持つプロモーターを活性化させる0.1 mMのイソ
プロピルβ-D-チオガラクトシドを加えOsDREB1AとGSTと
の融合タンパク質の合成を誘導した。

【００８０】タンパク質が誘導された大腸菌は18ml の
緩衝液（10mM Tris-HCl; pH 8.0, 0.1mM EDTA, 5mM MgC
l2, 400mM NaCl, 5% Glycerol, 0.1mM phenylmethylsul
fonylfluoride, 0.1mM dithiothreitol）に懸濁した
後、１％ Triton X-100と1 mMEDTAを加えた。細胞を超
音波で破壊したのち20,000g 、１時間遠心し、上清より
glutathione-Sepharose (Pharmacia製)を用いて精製し
た。融合タンパク質はDRE配列を含む³²Pでラベルした75
塩基のDNA断片（配列番号16）をプローブとして室温で2
0 min保温した。これを0.25×Tris-borate-EDTAを含む5
％ポリアクリルアミドを用いて電気泳動を120Vで90分間
行った。このゲルシフト法で解析すると遅れて泳動する
バンドが検出された。また、DRE配列に変異を加えたDNA
断片をプローブとして用いて場合はこのバンドは検出さ
れず、OsDREB1Aタンパク質およびOsDREB2Aタンパク質が
DRE配列に特異的に結合していることが明らかになった
（図４）。

【００８１】〔実施例３〕形質転換体（トランスジェニ
ック植物）の作製 (1) 植物プラスミドの構築 1）OsDREB1A遺伝子断片の作製 OsDREB1A遺伝子のcDNAの塩基配列の69番目から785番目
の717塩基のDNA断片を以下のプライマーを用いてPCR法
により増幅後、該増幅断片をベクターpBluescript SK
(-)（Stratagene社製）のBamHI切断部位に連結し、組換
えプラスミドpSKOsDREB1Aを得た。このpSKOsDREB1AをBa
mHIで切断し、OsDREB1A遺伝子を含む約700bpのDNA断片
を得た。 Forward：5'-GGGGATCCATGTGCGGGATCAAGCAGGAGATG-3'（配列番号17） Reverse：5'-GGGGATCCCTAGTAGCTCCAGAGTGGGAC-3'（配列番号18）

【００８２】2）pBE2113Not, G-ubi, G35S-ShΔの作製 一方、プロモーターDNAを持つプラスミドとしてはpBE21
13Not(Plant Cell 10:1391-1406(1998)), G-ubi, G35S-
ShΔを用いた。G-ubi, G35S- ShΔは以下のように作製
した。まずpBIGプラスミド（Nucleic Acids Research 1
8: 203(1990)）をBamHIで切断・平滑化処理した後、連
結してBamHI切断部位をつぶし、さらにHindIIIとEcoRI
で切断した。この断片とpBE2113Notプラスミドを同様に
切断して得られる約1.2kbの断片とを連結して、pBIG211
3Notプラスミドを作製した。

【００８３】つぎにpBIG2113NotをHindIIIとBamHIで切
断し、同様に切断されたrd29Aプロモーターの断片(約0.
9kb, Nature biotechnology 17: 287-291(1999))と連結
して、pBIG29APHSNotプラスミドを作製した。さらにこ
のpBIG29APHSNotプラスミドをHindIIIとSalIで切断後、
同様に切断されたトウモロコシのユビキチン遺伝子(Ubi
-1)のプロモーターの断片(約2.0kb, Plant Molecular B
iology 18: 675-689(1992))又はp35S-shΔ-stopのCaMV
35Sプロモーターとトウモロコシのスクロースシンター
ゼ遺伝子（Sh1）のイントロンの一部を含んだ断片(約1.
6kb, ProceedingNational Academy of Science USA 96:
15348-15353(1999))と連結してG-ubiプラスミド又はG3
5S- ShΔプラスミドを作製した。前記pBE2113Not, G-ub
i及びG35S- ShΔ はそれぞれBamHIで切断した後、上記O
sDREB1A遺伝子断片とligation high（東洋紡社製）を用
いて連結し、得られた連結物により大腸菌DH5αを形質
転換した。形質転換体を培養後、該培養物からプラスミ
ドpBE35S:OsDREB1A, G-ubi:OsDREB1A及びG35S- ShΔ:Os
DREB1Aをそれぞれ精製した。次いで、これらの塩基配列
を決定し、OsDREB1A遺伝子がセンス方向に結合したもの
を選抜した。

【００８４】3）アグロバクテリウムへの導入 上記のプラスミドpBE35S:OsDREB1Aを持つ大腸菌DH5αと
ヘルパープラスミドpRK2013を持つ大腸菌HB101及びアグ
ロバクテリウムC58を共に、LB寒天培地を用いて28℃で2
4時間混合培養した。生成したコロニーを掻き取り、1ml
のLB培地に懸濁した。この懸濁液10μlをリファンピシ
リン100mg/l、及びカナマイシン20mg/lを含むLB寒天培
地に塗布し、28℃で2日間培養して、接合体アグロバク
テリウムC58(pBE35S:OsDREB1A)を得た。一方上記のプラ
スミドG-ubi:OsDREB1AとG35S- ShΔ:OsDREB1Aのプラス
ミドを、培養後10% glycerolで洗浄したアグロバクテリ
ウムEHA105にエレクトロポレーション法によって導入
し、アグロバクテリウムEHA105(G-ubi:OsDREB1A)とアグ
ロバクテリウムEHA105(G35S- ShΔ:OsDREB1A)をそれぞ
れ得た。

【００８５】(2)アグロバクテリウム感染法によるシロ
イヌナズナへの遺伝子導入 上記接合体をリファンピシリン100mg/l, 及びカナマイ
シン20 mg/lを含むLB培地 (10 ml)中28℃で24時間培養
した。つぎにこの培養液を500 mlのLB培地に添加して24
時間培養した。さらに、前記培養液を遠心して培地を除
き、500mlの感染用緩衝液(1リットル当たり：ムラシゲ
・スクーグ培地用混合塩類(日本製薬社製)2.3g、Gambor
g's vitamin solution 1ml、スクロース 50g、L-77(日
本ユニカー社製) 200μl、6-ベンジルアミノプリン10μ
g)に懸濁した。

【００８６】一方、4から5本のシロイヌナズナをバーミ
キュライトとパーライトを等量ずつ合わせた土を入れた
９cmの植木鉢で６週間育てた。前記アグロバクテリウム
C58(pBI35S:OsDREB1A)のアグロバクテリウム懸濁液に、
直接上記のシロイヌナズナを浸して、これをデシケータ
ーに入れバキュームポンプで650mmHgになるまで吸引
後、そのまま10分放置した。鉢をトレーに移しラップで
覆い湿度を保った。次の日ラップを取り、植物をそのま
ま生育させ種子を得た。種子は次亜塩素酸ナトリウム水
溶液で滅菌後、選択用のMS培地にバンコマイシン100mg/
l、カナマイシン30mg/lを加えた寒天培地に蒔いた。こ
の培地で生育したシロイヌナズナを鉢に移し形質転換植
物体の種子を得た。

【００８７】(3)アグロバクテリウム感染法によるイネ
への遺伝子導入 イネの種子を70%エタノールで1分浸漬し、さらに2%次亜
塩素酸ナトリウムに１時間浸漬することにより滅菌し、
次いで滅菌水により水洗後、N6D固形培地(1リットル当
たり: CHU[N₆] Basal Salt Mixture(Sigma社製) 3.98
g、スクロース 30g、ミオイノシトール 100mg、カザミ
ノ酸 300mg、L-プロリン 2878mg、グリシン2mg、ニコチ
ン酸 0.5mg、ピリドキシン塩酸 0.5mg、チアミン塩酸 1
mg、2,4-D2mg、ゲルライト 4g、pH 5.8)のプレートに9
粒ずつ播種し、24日間培養してカルスを誘導した。形成
された種子約20粒分のカルスを、新たなN6D固形培地に
移植し、さらに3日間培養した。

【００８８】一方アグロバクテリウムEHA105(G-ubi:OsD
REB1A)とアグロバクテリウムEHA105(G35S- ShD:OsDREB1
A)を5mlのリファンピシリン100mg/l、及びカナマイシン
20mg/lを含むYEP培地(1リットル当たり: Bacto peptone
10g、Bacto yeast extract10g、NaCl 5g、MgCl₂・6H₂O
406mg、pH 7.2)で28℃で24時間培養した。このアグロバ
クテリウムを20mg/lのアセトシリンゴンを含むAAM培地
(1リットル当たり: MnSO₄・5H₂O 10mg、H₃BO₃ 3mg、ZnSO
₄・7H₂O 2mg、Na₂MoO₄・2H₂O 250μg、CuSO₄・5H ₂O 25μ
g、CoCl₂・6H₂O 25μg、KI 750μg、CaCl₂・2H₂O 150mg、
MgSO₄・7H₂O 250mg、Fe-EDTA 40mg、NaH₂PO₄・2H₂O 150m
g、ニコチン酸 1mg、チアミン塩酸10mg、ピリドキシン
塩酸 1mg、ミオイノシトール 100mg、L-アルギニン 17
6.7mg、グリシン 7.5mg、L-グルタミン 900mg、アスパ
ラギン酸 300mg、KCl 3g、pH 5.2)でO.D.₆₆₀が0.1にな
るようにうすめ、20mlのアグロバクテリウム懸濁液を作
製した。

【００８９】つぎに、前述の3日間培養したカルスにア
グロバクテリウム懸濁液を加え、1分間混合した。その
後このカルスを滅菌したペーパータオルに置き、余分な
アグロバクテリウム懸濁液を除去した後、滅菌した濾紙
を敷いた2N6-AS固形培地(1リットル当たり: CHU[N₆] Ba
sal Salt Mixture 3.98g、スクロース 30g、グルコース
10g、ミオイノシトール 100mg、カザミノ酸 300mg、グ
リシン 2mg、ニコチン酸0.5mg、ピリドキシン塩酸 0.5m
g、チアミン塩酸 1mg、2,4-D 2mg、アセトシリンゴン 1
0mg、ゲルライト 4g、pH 5.2)の上で25℃ 3日間、暗黒
下で培養した。3日間の培養後、カルベニシリン500mg/l
を含む3%スクロース水溶液で白濁しなくなるまで十分に
洗浄し、カルベニシリン500mg/l及びハイグロマイシン1
0mg/lを含んだN6D固形培地上で1週間培養した。その後
カルベニシリン500mg/l及びハイグロマイシン50mg/lを
含んだN6D固形培地に移植して、18日間培養した。さら
にこのカルスを再分化培地(1リットル当たり:ムラシゲ
・スクーグ培地用混合塩類(日本製薬社製) 4.6g、スク
ロース 30g、ソルビトール 30g、カザミノ酸 2g、ミオ
イノシトール 100mg、グリシン 2mg、ニコチン酸 0.5m
g、ピリドキシン塩酸 0.5mg、チアミン塩酸 0.1mg、NAA
0.2mg、カイネチン 2mg、カルベニシリン250mg、ハイ
グロマイシン50mg、アガロース 8g、pH 5.8)に移植し
た。1週間ごとに新しい培地に移植し直し、再分化して
芽が1cm程度に生長したものはホルモンフリー培地(1リ
ットル当たり:ムラシゲ・スクーグ培地用混合塩類(日本
製薬社製) 4.6g、スクロース 30g、グリシン 2mg、ニコ
チン酸 0.5mg、ピリドキシン塩酸 0.5mg、チアミン塩酸
0.1mg、ハイグロマイシン50mg、ゲルライト 2.5g、pH
5.8)に移植した。ホルモンフリー培地上で8cm程度に生
長した植物体を合成粒状培土ボンソル1号（住友化学社
製）を入れた植木鉢に移し、形質転換植物体の種子を得
た。

【００９０】〔実施例４〕イネのプロトプラストを用い
た転写活性化機構の検討 図5に示すように、OsDREB1A cDNA、OsDREB2A cDNA、DRE
B1A cDNA、DREB2A cDNAをCaMV35Sプロモーターとトウモ
ロコシのシュクロースシンセターゼのイントロン配列の
下流に配置して、pBI221プラスミド(Clonetech社製)に
連結し、エフェクタープラスミドを構築した。一方、-6
1rd29A最小プロモーターとGUSの上流に、rd-29Aプロモ
ーターのDREを含む75bp DNA断片を2回繰り返し配置し
た、レポータープラスミドを構築した。

【００９１】次いでこの2種のプラスミドをイネのプロ
トプラストに導入した後、GUS活性を4-methylumbellife
ryl-β-D-glucuronide の分解による蛍光強度の変化に
より測定した。各実験の導入効率の基準として、CaMV35
Sプロモーター-LUC融合遺伝子も、同時に導入した。そ
の結果、OsDREB1A 、OsDREB2A遺伝子は、DREを介して転
写を活性化することが示された。

【００９２】〔実施例５〕形質転換体におけるOsDREB遺
伝子の発現解析 (1)非形質転換体におけるOsDREB遺伝子の発現解析 野生イネにおけるOsDREB1A, OsDREB1B, OsDREB1C, OsDR
EB2A遺伝子の発現特性をノーザンハイブリダイゼーショ
ンにより解析した。水耕栽培にて25℃で昼16時間夜8時
間の日照条件で17日間イネを栽培した。この植物体にア
ブシジン酸、乾燥、低温、塩(NaCl)、障害、水の各スト
レスを与えた。各ストレスを付与したイネは、それぞれ
0, 10, 20, 40, 60分, 2, 5, 10, 24時間ごとにサンプ
リングした。

【００９３】なお、各ストレスは次のようにして付与し
た。アブシジン酸ストレスは、100μM ABAを含む溶液に
浸した。乾燥ストレスは濾紙上において乾かした。低温
ストレスは4℃に冷やしたインキュベーターに移した。
塩(NaCl)ストレスは250mM NaClを含む水溶液に浸した。
障害ストレスは8-10cmの高さの葉に切れ込みを入れた。
水ストレスは純水に浸した。ストレスを与えないコント
ロール植物と上記ストレス負荷植物から全RNAを調製し
て、電気泳動を行いノーザン法で各遺伝子の発現を見
た。結果を図６に示す。

【００９４】この結果、OsDREB1A及びOsDREB1B遺伝子
は、主に低温ストレスにより発現が誘導された。一方、
OsDREB2Aは主に乾燥、塩ストレスにより発現が誘導され
た。また、OsDREB1Cは恒常的に遺伝子発現が確認され
た。

【００９５】(2)形質転換シロイヌナズナにおけるOsDRE
B遺伝子の発現解析 実施例３と同様にしてシロイヌナズナにOsDREB1A, OsDR
EB1D, OsDREB2A遺伝子を導入した形質転換体を作製し
た。そして、形質転換体の導入遺伝子OsDREB1A,OsDREB1
D, OsDREB2Aと導入遺伝子が発現を変化させたと考えら
れる遺伝子のmRNAレベルをノーザン分析により調べた。
すなわち、rd29A遺伝子、cor15a遺伝子、kin1遺伝子、e
rd10遺伝子の部分断片をプローブ（rd29A：配列番号1
9、cor15a：配列番号20、kin1：配列番号21、erd10：配
列番号22）として、そのmRNAレベルを解析した。解析に
は前記形質転換体のほかに、コントロールとしてDREB類
似遺伝子を含まないpBI121プラスミド(Clontech社製)を
導入した形質転換シロイヌナズナを用いて遺伝子の発現
を比較した。

【００９６】3週間GM寒天培地で育てた約1gの植物に乾
燥及び低温ストレスを与えた。乾燥ストレスについては
寒天培地から抜き取り、シャーレ上で5時間乾燥させ
た。低温ストレスについては植物体を4℃に5時間保温し
た。ストレスを与えないコントロールの植物と上記乾燥
と低温ストレスを与えた植物から全RNAを調製して、電
気泳動を行い、ノーザン法で各遺伝子の発現を見た。

【００９７】一般に、形質転換体においては遺伝子は同
様にゲノムに導入されるが、その導入場所が異なるため
に導入遺伝子の発現に差違を生じる「ポジションイフェ
クト」と呼ばれる現象が見られる。本試験はプローブと
して導入遺伝子のDNA断片を用い、ノーザン法で検定す
ることによって、導入遺伝子が強く発現している形質転
換体を選抜した。また、プローブとして上記のストレス
耐性に関与している可能性のある遺伝子のDNA断片を用
い、OsDREB1Aを導入することでmRNAレベルが変化した遺
伝子を同定した。結果を図７に示す。

【００９８】この結果、プロモーター中にGCCGACを持つ
遺伝子が、ACCGAGを持つ遺伝子よりも強く誘導されてい
ることがわかった。単子葉植物のストレス体制遺伝子群
にはDRE配列としてGCCGACを持つものがACCGAGを持つも
のよりも多く存在する。したがって、OsDREB遺伝子は単
子葉植物において、DREB遺伝子よりも効率よくストレス
耐性遺伝子を発現させることが示唆された。

【００９９】(3)形質転換イネにおけるOsDREB遺伝子の
発現解析 実施例３と同様にしてイネにOsDREB1A,OsDREB1B及びシ
ロイヌナズナのDREB1C遺伝子を導入した形質転換体を作
製した。そして、形質転換体の導入遺伝子OsDREB1A, Os
DREB1B及びシロイヌナズナのDREB1Cと導入遺伝子が発現
を変化させたと考えられる遺伝子のmRNAレベルをノーザ
ン分析により調べた。すなわち、OsDREB1A遺伝子、OsDR
EB1B遺伝子、DREB1C遺伝子、lip9遺伝子、Wsi724遺伝
子、salT遺伝子の部分断片をプローブ（OsDREB1A：配列
番号23、OsDREB1B：配列番号24、DREB1C：配列番号25、
lip9：配列番号26、Wsi724：配列番号27、salT：配列番
号28）としてmRNAの発現レベルを解析した。解析には前
記形質転換体の外に、コントロールとしてDREB類似遺伝
子を含まないG-ubiを導入した形質転換イネを用いて遺
伝子の発現を比較することで検定した。

【０１００】5日間30mg/mlハイグロマイシンを含む0.1%
ベンーレート溶液中で選抜した後、ボンソル1号の入っ
た鉢に植え替えて、12日間育てた約2gの植物に塩(NaCl)
及び低温ストレスを与えた。塩ストレスについては、植
物体を土から抜き取り、試験管内で250mM NaClに5時間
浸した。低温ストレスについては植物体を4℃に5時間保
温した。ストレスを与えないコントロールの植物と上記
塩と低温ストレスを与えた植物から全RNAを調製して、
電気泳動を行い、(2)と同様にノーザン法で各遺伝子の
発現を見た。結果を図８に示す。

【０１０１】この結果、OsDREB1A, OsDREB1B, DREB1C遺
伝子を導入された形質転換イネでは、プロモーター領域
にDRE配列を持つlip9遺伝子の発現は誘導されたが、プ
ロモーター領域にDRE配列を持たないsalT遺伝子の発現
は誘導されなかった。また、プロモーター領域の配列は
同定されていないがそのストレス時の発現パターン（乾
燥、塩、低温誘導性で、低温による誘導性が乾燥、塩に
比べて遅い）からOsDREBのターゲットになっていると予
想されていたWsi724遺伝子の発現も、これら形質転換体
で誘導された。

【０１０２】〔実施例６〕シロイヌナズナのストレス耐
性に対する影響 実施例３と同様にして、シロイヌナズナにOsDREB1A、DR
EB1A遺伝子を導入した形質転換体を作製した。さらにコ
ントロールとしてDREB類似遺伝子を含まないpBI121で形
質転換したシロイヌナズナを作製した。なお、各耐性実
験は以下の条件で実施した。

【０１０３】(1) NaCl耐性 NaCl耐性については、3週間GM培地で育てたシロイヌナ
ズナを600mM NaCl水溶液に2時間浸し、洗浄後プロフェ
ッショナル培土を入れた植木鉢に植え換え、3週間栽培
後、その生存を調べた。 (2) 乾燥耐性 乾燥耐性実験については、3週間GM培地で育てたシロイ
ヌナズナをバーミキュライトとパーライトを等量ずつ合
わせた土を入れた植木鉢に植え換え、1週間栽培後給水
を止め、2週間栽培後、その生存を調べた。 (3) 凍結耐性 凍結耐性については、3週間GM培地で育てたシロイヌナ
ズナをプロフェッショナル培土を入れた植木鉢に植え換
え、1週間栽培後-6℃に36時間置いた後、22℃で5日間栽
培後、その生存を調べた。

【０１０４】塩ストレス耐性実験では、生存率はコント
ロールで12%、OsDREB1A導入植物では55%または65%だっ
た。また、DREB1A導入植物では35S:DREB1Aで68%、29A:D
REB1Aでは90%で、OsDREB遺伝子は双子葉植物において
も、ストレス耐性を向上させる機能を有することがわか
った（図９）。

【０１０５】

【発明の効果】本発明は、単子葉植物由来のストレス耐
性転写因子および該転写因子をコードする遺伝子が提供
される。本発明の遺伝子を用いれば、より効率的に単子
葉植物である穀物類にストレス耐性を付与することがで
きる。

【０１０６】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Japan International Research Center for Agricultural Sciences <120> Genes Encoding Plant Transcription Factors <130> P02-0902 <150> JP 2001-358268 <151> 2001-11-22 <160> 28 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 927 <212> DNA <213> Oryza sativa <220> <221> CDS <222> (69)..(782) <400> 1 cacactcgag cagagcaaat acagttcagg aatcaggagc aagcagaaac acacacacaa 60 atccgaag atg tgc ggg atc aag cag gag atg agc ggc gag tcg tcg ggg 110 Met Cys Gly Ile Lys Gln Glu Met Ser Gly Glu Ser Ser Gly 1 5 10 tcg ccg tgc agc tcg gcg tcg gcg gag cgg cag cac cag acg gtg tgg 158 Ser Pro Cys Ser Ser Ala Ser Ala Glu Arg Gln His Gln Thr Val Trp 15 20 25 30 acg gcg ccg ccg aag agg ccg gcg ggg cgg acc aag ttc agg gag acg 206 Thr Ala Pro Pro Lys Arg Pro Ala Gly Arg Thr Lys Phe Arg Glu Thr 35 40 45 agg cac ccg gtg ttc cgc ggc gtg cgg cgg agg ggc aat gcc ggg agg 254 Arg His Pro Val Phe Arg Gly Val Arg Arg Arg Gly Asn Ala Gly Arg 50 55 60 tgg gtg tgc gag gtg cgg gtg ccc ggg cgg cgc ggc tgc agg ctc tgg 302 Trp Val Cys Glu Val Arg Val Pro Gly Arg Arg Gly Cys Arg Leu Trp 65 70 75 ctc ggc acg ttc gac acc gcc gag ggc gcg gcg cgc gcg cac gac gcc 350 Leu Gly Thr Phe Asp Thr Ala Glu Gly Ala Ala Arg Ala His Asp Ala 80 85 90 gcc atg ctc gcc atc aac gcc ggc ggc ggc ggc ggc ggg gga gca tgc 398 Ala Met Leu Ala Ile Asn Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Cys 95 100 105 110 tgc ctc aac ttc gcc gac tcc gcg tgg ctc ctc gcc gtg ccg cgc tcc 446 Cys Leu Asn Phe Ala Asp Ser Ala Trp Leu Leu Ala Val Pro Arg Ser 115 120 125 tac cgc acc ctt cgc cga cgt ccg cca cgc cgt gcc gag gcc gtc gag 494 Tyr Arg Thr Leu Arg Arg Arg Pro Pro Arg Arg Ala Glu Ala Val Glu 130 135 140 gac ttc ttc cgg cgc cgc ctc gcc gac gac gcg ctg tcc gcc acg tcg 542 Asp Phe Phe Arg Arg Arg Leu Ala Asp Asp Ala Leu Ser Ala Thr Ser 145 150 155 tcg tcc tcg acg acg ccg tcc acc cca cgc acc gac gac gac gag gag 590 Ser Ser Ser Thr Thr Pro Ser Thr Pro Arg Thr Asp Asp Asp Glu Glu 160 165 170 tcc gcc gcc acc gac ggc gac gag tcc tcc tcc ccg gcc agc gac ctg 638 Ser Ala Ala Thr Asp Gly Asp Glu Ser Ser Ser Pro Ala Ser Asp Leu 175 180 185 190 gcg ttc gaa ctg gac gtc ctg agt gac atg ggc tgg gac ctg tac tac 686 Ala Phe Glu Leu Asp Val Leu Ser Asp Met Gly Trp Asp Leu Tyr Tyr 195 200 205 gcg agc ttg gcg cag ggg atg ctc atg gag cca cca tcg gcg gcg ctc 734 Ala Ser Leu Ala Gln Gly Met Leu Met Glu Pro Pro Ser Ala Ala Leu 210 215 220 ggc gac gac ggt gac gcc atc ctc gcc gac gtc cca ctc tgg agc tac 782 Gly Asp Asp Gly Asp Ala Ile Leu Ala Asp Val Pro Leu Trp Ser Tyr 225 230 235 tagagctcaa tcaactgtac aattttgcct cttttttctc tcttttctgg cttccgatgc 842 caaaattttg gtactgtacg gacactactt tcggtaatgt gatggaacaa gttgcaaaac 902 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 927 <210> 2 <211> 238 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 2 Met Cys Gly Ile Lys Gln Glu Met Ser Gly Glu Ser Ser Gly Ser Pro 1 5 10 15 Cys Ser Ser Ala Ser Ala Glu Arg Gln His Gln Thr Val Trp Thr Ala 20 25 30 Pro Pro Lys Arg Pro Ala Gly Arg Thr Lys Phe Arg Glu Thr Arg His 35 40 45 Pro Val Phe Arg Gly Val Arg Arg Arg Gly Asn Ala Gly Arg Trp Val 50 55 60 Cys Glu Val Arg Val Pro Gly Arg Arg Gly Cys Arg Leu Trp Leu Gly 65 70 75 80 Thr Phe Asp Thr Ala Glu Gly Ala Ala Arg Ala His Asp Ala Ala Met 85 90 95 Leu Ala Ile Asn Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Cys Cys Leu 100 105 110 Asn Phe Ala Asp Ser Ala Trp Leu Leu Ala Val Pro Arg Ser Tyr Arg 115 120 125 Thr Leu Arg Arg Arg Pro Pro Arg Arg Ala Glu Ala Val Glu Asp Phe 130 135 140 Phe Arg Arg Arg Leu Ala Asp Asp Ala Leu Ser Ala Thr Ser Ser Ser 145 150 155 160 Ser Thr Thr Pro Ser Thr Pro Arg Thr Asp Asp Asp Glu Glu Ser Ala 165 170 175 Ala Thr Asp Gly Asp Glu Ser Ser Ser Pro Ala Ser Asp Leu Ala Phe 180 185 190 Glu Leu Asp Val Leu Ser Asp Met Gly Trp Asp Leu Tyr Tyr Ala Ser 195 200 205 Leu Ala Gln Gly Met Leu Met Glu Pro Pro Ser Ala Ala Leu Gly Asp 210 215 220 Asp Gly Asp Ala Ile Leu Ala Asp Val Pro Leu Trp Ser Tyr 225 230 235 <210> 3 <211> 905 <212> DNA <213> Oryza sativa <220> <221> CDS <222> (16)..(669) <400> 3 cagagagagt catcc atg gag gtg gag gag gcg gcg tac agg acg gtg tgg 51 Met Glu Val Glu Glu Ala Ala Tyr Arg Thr Val Trp 1 5 10 tcg gag ccg ccg aag agg ccg gcg gga agg acc aag ttc agg gag acg 99 Ser Glu Pro Pro Lys Arg Pro Ala Gly Arg Thr Lys Phe Arg Glu Thr 15 20 25 agg cac ccg gtg tac cgc ggc gtg cgg cgg cgc ggg ggg cgg ccg ggc 147 Arg His Pro Val Tyr Arg Gly Val Arg Arg Arg Gly Gly Arg Pro Gly 30 35 40 gcg gcg ggg agg tgg gtg tgc gag gtg cgg gtg ccc ggg gcg cgc ggc 195 Ala Ala Gly Arg Trp Val Cys Glu Val Arg Val Pro Gly Ala Arg Gly 45 50 55 60 tcc agg ctg tgg ctc ggc acg ttc gcc acc gcc gag gcg gcg gcg cgc 243 Ser Arg Leu Trp Leu Gly Thr Phe Ala Thr Ala Glu Ala Ala Ala Arg 65 70 75 gcg cac gac gcc gcc gcg ctg gcg ctc cgc ggc agg gcc gcc tgc ctc 291 Ala His Asp Ala Ala Ala Leu Ala Leu Arg Gly Arg Ala Ala Cys Leu 80 85 90 aac ttc gcc gac tcc gcg tgg cgg atg ccg ccc gtc ccc gcg tcc gcc 339 Asn Phe Ala Asp Ser Ala Trp Arg Met Pro Pro Val Pro Ala Ser Ala 95 100 105 gcg ctc gcc ggc gcg agg ggg gtc agg gac gcc gtc gcc gtg gcc gtc 387 Ala Leu Ala Gly Ala Arg Gly Val Arg Asp Ala Val Ala Val Ala Val 110 115 120 gag gcg ttc cag cgc cag tcg gcc gcg ccg tcg tct ccg gcg gag acc 435 Glu Ala Phe Gln Arg Gln Ser Ala Ala Pro Ser Ser Pro Ala Glu Thr 125 130 135 140 ttc gcc aac gat ggc gac gaa gaa gaa gac aac aag gac gtg ttg ccg 483 Phe Ala Asn Asp Gly Asp Glu Glu Glu Asp Asn Lys Asp Val Leu Pro 145 150 155 gtg gcg gcg gcg gag gtg ttc gac gcg ggg gcg ttc gag ctc gac gac 531 Val Ala Ala Ala Glu Val Phe Asp Ala Gly Ala Phe Glu Leu Asp Asp 160 165 170 ggg ttc agg ttc ggc ggg atg gac gcc ggg tcg tac tac gcg agc ttg 579 Gly Phe Arg Phe Gly Gly Met Asp Ala Gly Ser Tyr Tyr Ala Ser Leu 175 180 185 gcg cag ggg ctg ctc gtc gag ccg ccg gcc gcc gga gcg tgg tgg gag 627 Ala Gln Gly Leu Leu Val Glu Pro Pro Ala Ala Gly Ala Trp Trp Glu 190 195 200 gac ggc gag ctc gcc ggc tcc gac atg ccg ctc tgg agc tac 669 Asp Gly Glu Leu Ala Gly Ser Asp Met Pro Leu Trp Ser Tyr 205 210 215 taatcaaaat ctcgcactga aaagtgtgga caaattttga ttctccagaa attgggggaa 729 aaaagagaac agagtattgg tgaatttaga acagagtagg caatgagact gaggatgaat 789 ggcaattttt gtaattttgg aatgtgccag atttctccct ccttttgtga ttccatctga 849 ttttgaatgt gcagtcaatg aattcctgta aatttacttc tcctctccaa aaaaaa 905 <210> 4 <211> 218 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 4 Met Glu Val Glu Glu Ala Ala Tyr Arg Thr Val Trp Ser Glu Pro Pro 1 5 10 15 Lys Arg Pro Ala Gly Arg Thr Lys Phe Arg Glu Thr Arg His Pro Val 20 25 30 Tyr Arg Gly Val Arg Arg Arg Gly Gly Arg Pro Gly Ala Ala Gly Arg 35 40 45 Trp Val Cys Glu Val Arg Val Pro Gly Ala Arg Gly Ser Arg Leu Trp 50 55 60 Leu Gly Thr Phe Ala Thr Ala Glu Ala Ala Ala Arg Ala His Asp Ala 65 70 75 80 Ala Ala Leu Ala Leu Arg Gly Arg Ala Ala Cys Leu Asn Phe Ala Asp 85 90 95 Ser Ala Trp Arg Met Pro Pro Val Pro Ala Ser Ala Ala Leu Ala Gly 100 105 110 Ala Arg Gly Val Arg Asp Ala Val Ala Val Ala Val Glu Ala Phe Gln 115 120 125 Arg Gln Ser Ala Ala Pro Ser Ser Pro Ala Glu Thr Phe Ala Asn Asp 130 135 140 Gly Asp Glu Glu Glu Asp Asn Lys Asp Val Leu Pro Val Ala Ala Ala 145 150 155 160 Glu Val Phe Asp Ala Gly Ala Phe Glu Leu Asp Asp Gly Phe Arg Phe 165 170 175 Gly Gly Met Asp Ala Gly Ser Tyr Tyr Ala Ser Leu Ala Gln Gly Leu 180 185 190 Leu Val Glu Pro Pro Ala Ala Gly Ala Trp Trp Glu Asp Gly Glu Leu 195 200 205 Ala Gly Ser Asp Met Pro Leu Trp Ser Tyr 210 215 <210> 5 <211> 645 <212> DNA <213> Oryza sativa <220> <221> CDS <222> (1)..(642) <400> 5 atg gag tac tac gag cag gag gag tac gcg acg gtg acg tcg gcg ccg 48 Met Glu Tyr Tyr Glu Gln Glu Glu Tyr Ala Thr Val Thr Ser Ala Pro 1 5 10 15 ccg aag cgg ccg gcg ggg agg acc aag ttc agg gag acg agg cac ccg 96 Pro Lys Arg Pro Ala Gly Arg Thr Lys Phe Arg Glu Thr Arg His Pro 20 25 30 gtg tac cgc ggc gtg cgg cgg cgg ggg ccc gcg ggg cgg tgg gtg tgc 144 Val Tyr Arg Gly Val Arg Arg Arg Gly Pro Ala Gly Arg Trp Val Cys 35 40 45 gag gtc agg gag ccc aac aag aag tcc cgc atc tgg ctc ggc acc ttc 192 Glu Val Arg Glu Pro Asn Lys Lys Ser Arg Ile Trp Leu Gly Thr Phe 50 55 60 gcc acc gcc gag gcc gcc gcg cgc gcc cac gac gtc gcc gcg ctc gcc 240 Ala Thr Ala Glu Ala Ala Ala Arg Ala His Asp Val Ala Ala Leu Ala 65 70 75 80 ctc cgc ggc cgc ggc gcg tgc ctc aac ttc gcc gac tcg gcc cgc ctc 288 Leu Arg Gly Arg Gly Ala Cys Leu Asn Phe Ala Asp Ser Ala Arg Leu 85 90 95 ctc cgc gtc gac ccg gcc acc ctc gcc acc ccc gac gac atc cgc cgc 336 Leu Arg Val Asp Pro Ala Thr Leu Ala Thr Pro Asp Asp Ile Arg Arg 100 105 110 gcc gcc atc gag ctc gcc gag tca tgc ccg cac gac gcc gcc gcc gcc 384 Ala Ala Ile Glu Leu Ala Glu Ser Cys Pro His Asp Ala Ala Ala Ala 115 120 125 gcc gcc tcc agc tcc gcc gcc gcc gtc gag gcc tcc gcc gcc gcc gcg 432 Ala Ala Ser Ser Ser Ala Ala Ala Val Glu Ala Ser Ala Ala Ala Ala 130 135 140 ccc gcc atg atg atg cag tac cag gac gac atg gcg gcg acg ccg tcc 480 Pro Ala Met Met Met Gln Tyr Gln Asp Asp Met Ala Ala Thr Pro Ser 145 150 155 160 agc tac gac tac gcg tac tac ggc aac atg gac ttc gac cag ccg tcc 528 Ser Tyr Asp Tyr Ala Tyr Tyr Gly Asn Met Asp Phe Asp Gln Pro Ser 165 170 175 tac tac tac gac ggg atg ggc ggc ggc ggc gag tac cag agc tgg cag 576 Tyr Tyr Tyr Asp Gly Met Gly Gly Gly Gly Glu Tyr Gln Ser Trp Gln 180 185 190 atg gac ggc gac gac gat ggt ggc gcc ggc ggc tac ggc ggc ggc gac 624 Met Asp Gly Asp Asp Asp Gly Gly Ala Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Asp 195 200 205 gtc aca ctc tgg agc tac tga 645 Val Thr Leu Trp Ser Tyr 210 <210> 6 <211> 214 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 6 Met Glu Tyr Tyr Glu Gln Glu Glu Tyr Ala Thr Val Thr Ser Ala Pro 1 5 10 15 Pro Lys Arg Pro Ala Gly Arg Thr Lys Phe Arg Glu Thr Arg His Pro 20 25 30 Val Tyr Arg Gly Val Arg Arg Arg Gly Pro Ala Gly Arg Trp Val Cys 35 40 45 Glu Val Arg Glu Pro Asn Lys Lys Ser Arg Ile Trp Leu Gly Thr Phe 50 55 60 Ala Thr Ala Glu Ala Ala Ala Arg Ala His Asp Val Ala Ala Leu Ala 65 70 75 80 Leu Arg Gly Arg Gly Ala Cys Leu Asn Phe Ala Asp Ser Ala Arg Leu 85 90 95 Leu Arg Val Asp Pro Ala Thr Leu Ala Thr Pro Asp Asp Ile Arg Arg 100 105 110 Ala Ala Ile Glu Leu Ala Glu Ser Cys Pro His Asp Ala Ala Ala Ala 115 120 125 Ala Ala Ser Ser Ser Ala Ala Ala Val Glu Ala Ser Ala Ala Ala Ala 130 135 140 Pro Ala Met Met Met Gln Tyr Gln Asp Asp Met Ala Ala Thr Pro Ser 145 150 155 160 Ser Tyr Asp Tyr Ala Tyr Tyr Gly Asn Met Asp Phe Asp Gln Pro Ser 165 170 175 Tyr Tyr Tyr Asp Gly Met Gly Gly Gly Gly Glu Tyr Gln Ser Trp Gln 180 185 190 Met Asp Gly Asp Asp Asp Gly Gly Ala Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Asp 195 200 205 Val Thr Leu Trp Ser Tyr 210 <210> 7 <211> 762 <212> DNA <213> Oryza sativa <220> <221> CDS <222> (1)..(759) <400> 7 atg gag aag aac acc gcc gcc agc ggg caa ttg atg acc tcc tcc gcg 48 Met Glu Lys Asn Thr Ala Ala Ser Gly Gln Leu Met Thr Ser Ser Ala 1 5 10 15 gag gcg acg ccg tcg tcg ccg aag cgg ccg gcg ggg cga acc aag ttc 96 Glu Ala Thr Pro Ser Ser Pro Lys Arg Pro Ala Gly Arg Thr Lys Phe 20 25 30 cag gag acg agg cac cta gtg ttc cgt ggg gtg cga tgg cgt ggg tgc 144 Gln Glu Thr Arg His Leu Val Phe Arg Gly Val Arg Trp Arg Gly Cys 35 40 45 gcg ggg cgg tgg gtg tgc aag gtg cgt gtc ccg ggc agc cgc ggt gac 192 Ala Gly Arg Trp Val Cys Lys Val Arg Val Pro Gly Ser Arg Gly Asp 50 55 60 cgt ttc tgg ata ggc acg tct gac acc gcc gag gag acc gcg cgc acg 240 Arg Phe Trp Ile Gly Thr Ser Asp Thr Ala Glu Glu Thr Ala Arg Thr 65 70 75 80 cac gac gcc gcc atg ctc gcc ttg tgc ggg gcc tcc gcc agc ctc aac 288 His Asp Ala Ala Met Leu Ala Leu Cys Gly Ala Ser Ala Ser Leu Asn 85 90 95 ttc gcc gac tct gcc tgg ctg ctc cac gtc ccg cgc gcc ccc gtc gtc 336 Phe Ala Asp Ser Ala Trp Leu Leu His Val Pro Arg Ala Pro Val Val 100 105 110 tcc gga ctc cgg cca cca gct gcc cga tgt gca acg cgc tgc ctg caa 384 Ser Gly Leu Arg Pro Pro Ala Ala Arg Cys Ala Thr Arg Cys Leu Gln 115 120 125 ggc cat cgc cga gtt cca gcg ccg ggc cgg ggg agc acc gcc act gcc 432 Gly His Arg Arg Val Pro Ala Pro Gly Arg Gly Ser Thr Ala Thr Ala 130 135 140 act gcc acc tcc ggc gat gct gca tcg acc gct cct ccg tcg gca ccc 480 Thr Ala Thr Ser Gly Asp Ala Ala Ser Thr Ala Pro Pro Ser Ala Pro 145 150 155 160 gtt ctg tca gcc aaa caa tgc gaa ttc atc ttt ctt tct tca cta gat 528 Val Leu Ser Ala Lys Gln Cys Glu Phe Ile Phe Leu Ser Ser Leu Asp 165 170 175 tgt tgg atg tta atg tca aag ctt atc agc agt agc aga gca aaa gga 576 Cys Trp Met Leu Met Ser Lys Leu Ile Ser Ser Ser Arg Ala Lys Gly 180 185 190 tcg ttg tgc ctg cga aaa aat ccc att tca ttt tgc atg gtt aca aat 624 Ser Leu Cys Leu Arg Lys Asn Pro Ile Ser Phe Cys Met Val Thr Asn 195 200 205 tct tac act gct ctt ttg ctc gaa tac att ata ttg cag atg aat tca 672 Ser Tyr Thr Ala Leu Leu Leu Glu Tyr Ile Ile Leu Gln Met Asn Ser 210 215 220 atg atc gtt tta atc cac gaa tta tca aaa tat caa gtc ttt ctg cta 720 Met Ile Val Leu Ile His Glu Leu Ser Lys Tyr Gln Val Phe Leu Leu 225 230 235 240 cta acc atg ata aca cac cac ctt ttt caa tgg agg agg tag 762 Leu Thr Met Ile Thr His His Leu Phe Gln Trp Arg Arg 245 250 <210> 8 <211> 253 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 8 Met Glu Lys Asn Thr Ala Ala Ser Gly Gln Leu Met Thr Ser Ser Ala 1 5 10 15 Glu Ala Thr Pro Ser Ser Pro Lys Arg Pro Ala Gly Arg Thr Lys Phe 20 25 30 Gln Glu Thr Arg His Leu Val Phe Arg Gly Val Arg Trp Arg Gly 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1393 <212> DNA <213> Oryza sativa <220> <221> CDS <222> (334)..(1155) <400> 9 gctggatgag ccagcagccg cccccgcccg cggttgcttc ccctccccac cacgtcaaaa 60 cccaacccca accatgatgc tcctgcgcca ccaccaccac ccccacagcg gcgccgccac 120 caccagcagc agctgcagcg gcggcggcgg ctgttagaga ggagggcaca caccaccacc 180 gacaccgaca cgctcgccat gccaccaagc gaggcggcgg cgtgaggcga cgcagatctg 240 aacggaggag gaataggaag aagggaggag gaggggaggg agaggagttg gaagagttgg 300 aggaggagga gatctctttc ttgttcccgc tcg atg gag cgg ggg gag ggg agg 354 Met Glu Arg Gly Glu Gly Arg 1 5 agg gga gat tgc tcc gtg caa gtg agg aag aag aga acg cga agg aaa 402 Arg Gly Asp Cys Ser Val Gln Val Arg Lys Lys Arg Thr Arg Arg Lys 10 15 20 agc gat ggc cct gat tca atc gct gaa acc atc aag tgg tgg aag gag 450 Ser Asp Gly Pro Asp Ser Ile Ala Glu Thr Ile Lys Trp Trp Lys Glu 25 30 35 caa aac cag aag ctc cag gag gag aat agc tcc agg aaa gcg cca gcc 498 Gln Asn Gln Lys Leu Gln Glu Glu Asn Ser Ser Arg Lys Ala Pro Ala 40 45 50 55 aag ggg tcc aag aaa ggg tgc atg gct ggg aaa gga ggt ccg gaa aat 546 Lys Gly Ser Lys Lys Gly Cys Met Ala Gly Lys Gly Gly Pro Glu Asn 60 65 70 tca aat tgt gct tac cgc ggt gtc agg caa cgg aca tgg ggt aag tgg 594 Ser Asn Cys Ala Tyr Arg Gly Val Arg Gln Arg Thr Trp Gly Lys Trp 75 80 85 gtg gct gag atc cgt gaa cca aac cgt gga agg cgc cta tgg cta gga 642 Val Ala Glu Ile Arg Glu Pro Asn Arg Gly Arg Arg Leu Trp Leu Gly 90 95 100 tca ttt cct act gcg ctg gag gct gcg cat gca tac gat gag gcg gca 690 Ser Phe Pro Thr Ala Leu Glu Ala Ala His Ala Tyr Asp Glu Ala Ala 105 110 115 agg gca atg tat ggt ccc aca gca cgt gtc aat ttt gca gat aat tcc 738 Arg Ala Met Tyr Gly Pro Thr Ala Arg Val Asn Phe Ala Asp Asn Ser 120 125 130 135 aca gat gcc aac tct ggc tgc aca tca gca cct tca ttg atg atg tct 786 Thr Asp Ala Asn Ser Gly Cys Thr Ser Ala Pro Ser Leu Met Met Ser 140 145 150 aat ggg ccg gcc act ata cct tct gat gag aag gat gag ctg gaa tct 834 Asn Gly Pro Ala Thr Ile Pro Ser Asp Glu Lys Asp Glu Leu Glu Ser 155 160 165 cct cct ttc atc gtg gct aat ggg cca gct gtg ttg tat cag cct gat 882 Pro Pro Phe Ile Val Ala Asn Gly Pro Ala Val Leu Tyr Gln Pro Asp 170 175 180 aag aag gat gtg ttg gaa cgt gta gtc cct gag gtg cag gat gtt aaa 930 Lys Lys Asp Val Leu Glu Arg Val Val Pro Glu Val Gln Asp Val Lys 185 190 195 aca gaa ggg agc aat ggc ttg aaa cgt gtt tgt cag gag cgg aag aat 978 Thr Glu Gly Ser Asn Gly Leu Lys Arg Val Cys Gln Glu Arg Lys Asn 200 205 210 215 atg gag gta tgt gaa tca gaa ggg atc gtt tta cac aaa gaa gtg aac 1026 Met Glu Val Cys Glu Ser Glu Gly Ile Val Leu His Lys Glu Val Asn 220 225 230 ata agt tat gat tat ttc aat gtc cat gaa gtt gtt gag atg ata att 1074 Ile Ser Tyr Asp Tyr Phe Asn Val His Glu Val Val Glu Met Ile Ile 235 240 245 gtt gaa tta agt gct gat cag aaa acg gaa gta cat gaa gag tac caa 1122 Val Glu Leu Ser Ala Asp Gln Lys Thr Glu Val His Glu Glu Tyr Gln 250 255 260 gag gga gat gat ggg ttt agc ctt ttc tcc tat tagagtagta gtcatgctgc 1175 Glu Gly Asp Asp Gly Phe Ser Leu Phe Ser Tyr 265 270 gggtcaatag gaatatttca ttctagctgc taggggatac ttcaaatatc tgcaacctga 1235 agctttgtag tcatttacgg ttttcgtctt actgggtaat agctttatat atactataag 1295 ccaactggta caagaagttg tactgtgtgt tgagtgcact gtggtaaaaa tgaatctata 1355 tttaatgagc ttactctgtc aaaaaaaaaa aaaaaaaa 1393 <210> 10 <211> 274 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 10 Met Glu Arg Gly Glu Gly Arg Arg Gly Asp Cys Ser Val Gln Val Arg 1 5 10 15 Lys Lys Arg Thr Arg Arg Lys Ser Asp Gly Pro Asp Ser Ile Ala Glu 20 25 30 Thr Ile Lys Trp Trp Lys Glu Gln Asn Gln Lys Leu Gln Glu Glu Asn 35 40 45 Ser Ser Arg Lys Ala Pro Ala Lys Gly Ser Lys Lys Gly Cys Met Ala 50 55 60 Gly Lys Gly Gly Pro Glu Asn Ser Asn Cys Ala Tyr Arg Gly Val Arg 65 70 75 80 Gln Arg Thr Trp Gly Lys Trp Val Ala Glu Ile Arg Glu Pro Asn Arg 85 90 95 Gly Arg Arg Leu Trp Leu Gly Ser Phe Pro Thr Ala Leu Glu Ala Ala 100 105 110 His Ala Tyr Asp Glu Ala Ala Arg Ala Met Tyr Gly Pro Thr Ala Arg 115 120 125 Val Asn Phe Ala Asp Asn Ser Thr Asp Ala Asn Ser Gly Cys Thr Ser 130 135 140 Ala Pro Ser Leu Met Met Ser Asn Gly Pro Ala Thr Ile Pro Ser Asp 145 150 155 160 Glu Lys Asp Glu Leu Glu Ser Pro Pro Phe Ile Val Ala Asn Gly Pro 165 170 175 Ala Val Leu Tyr Gln Pro Asp Lys Lys Asp Val Leu Glu Arg Val Val 180 185 190 Pro Glu Val Gln Asp Val Lys Thr Glu Gly Ser Asn Gly Leu Lys Arg 195 200 205 Val Cys Gln Glu Arg Lys Asn Met Glu Val Cys Glu Ser Glu Gly Ile 210 215 220 Val Leu His Lys Glu Val Asn Ile Ser Tyr Asp Tyr Phe Asn Val His 225 230 235 240 Glu Val Val Glu Met Ile Ile Val Glu Leu Ser Ala Asp Gln Lys Thr 245 250 255 Glu Val His Glu Glu Tyr Gln Glu Gly Asp Asp Gly Phe Ser Leu Phe 260 265 270 Ser Tyr <210> 11 <211> 933 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> CDS <222> (119)..(766) <400> 11 cctgaactag aacagaaaga gagagaaact attatttcag caaaccatac caacaaaaaa 60 gacagagatc ttttagttac cttatccagt ttcttgaaac agagtactct tctgatca 118 atg aac tca ttt tct gct ttt tct gaa atg ttt ggc tcc gat tac gag 166 Met Asn Ser Phe Ser Ala Phe Ser Glu Met Phe Gly Ser Asp Tyr Glu 1 5 10 15 tct tcg gtt tcc tca ggc ggt gat tat att ccg acg ctt gcg agc agc 214 Ser Ser Val Ser Ser Gly Gly Asp Tyr Ile Pro Thr Leu Ala Ser Ser 20 25 30 tgc ccc aag aaa ccg gcg ggt cgt aag aag ttt cgt gag act cgt cac 262 Cys Pro Lys Lys Pro Ala Gly Arg Lys Lys Phe Arg Glu Thr Arg His 35 40 45 cca ata tac aga gga gtt cgt cgg aga aac tcc ggt aag tgg gtt tgt 310 Pro Ile Tyr Arg Gly Val Arg Arg Arg Asn Ser Gly Lys Trp Val Cys 50 55 60 gag gtt aga gaa cca aac aag aaa aca agg att tgg ctc gga aca ttt 358 Glu Val Arg Glu Pro Asn Lys Lys Thr Arg Ile Trp Leu Gly Thr Phe 65 70 75 80 caa acc gct gag atg gca gct cga gct cac gac gtt gcc gct tta gcc 406 Gln Thr Ala Glu Met Ala Ala Arg Ala His Asp Val Ala Ala Leu Ala 85 90 95 ctt cgt ggc cga tca gcc tgt ctc aat ttc gct gac tcg gct tgg aga 454 Leu Arg Gly Arg Ser Ala Cys Leu Asn Phe Ala Asp Ser Ala Trp Arg 100 105 110 ctc cga atc ccg gaa tca act tgc gct aag gac atc caa aag gcg gcg 502 Leu Arg Ile Pro Glu Ser Thr Cys Ala Lys Asp Ile Gln Lys Ala Ala 115 120 125 gct gaa gct gcg ttg gcg ttt cag gat gag atg tgt gat gcg acg acg 550 Ala Glu Ala Ala Leu Ala Phe Gln Asp Glu Met Cys Asp Ala Thr Thr 130 135 140 gat cat ggc ttc gac atg gag gag acg ttg gtg gag gct att tac acg 598 Asp His Gly Phe Asp Met Glu Glu Thr Leu Val Glu Ala Ile Tyr Thr 145 150 155 160 gcg gaa cag agc gaa aat gcg ttt tat atg cac gat gag gcg atg ttt 646 Ala Glu Gln Ser Glu Asn Ala Phe Tyr Met His Asp Glu Ala Met Phe 165 170 175 gag atg ccg agt ttg ttg gct aat atg gca gaa ggg atg ctt ttg ccg 694 Glu Met Pro Ser Leu Leu Ala Asn Met Ala Glu Gly Met Leu Leu Pro 180 185 190 ctt ccg tcc gta cag tgg aat cat aat cat gaa gtc gac ggc gat gat 742 Leu Pro Ser Val Gln Trp Asn His Asn His Glu Val Asp Gly Asp Asp 195 200 205 gac gac gta tcg tta tgg agt tat taaaactcag attattattt ccatttttag 796 Asp Asp Val Ser Leu Trp Ser Tyr 210 215 tacgatactt tttattttat tattattttt agatcctttt ttagaatgga atcttcatta 856 tgtttgtaaa actgagaaac gagtgtaaat taaattgatt cagtttcagt ataaaaaaaa 916 aaaaaaaaaa aaaaaaa 933 <210> 12 <211> 1437 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> CDS <222> (167)..(1171) <400> 12 gctgtctgat aaaaagaaga ggaaaactcg aaaaagctac acacaagaag aagaagaaaa 60 gatacgagca agaagactaa acacgaaagc gatttatcaa ctcgaaggaa gagactttga 120 ttttcaaatt tcgtccccta tagattgtgt tgtttctggg aaggag atg gca gtt 175 Met Ala Val 1 tat gat cag agt gga gat aga aac aga aca caa att gat aca tcg agg 223 Tyr Asp Gln Ser Gly Asp Arg Asn Arg Thr Gln Ile Asp Thr Ser Arg 5 10 15 aaa agg aaa tct aga agt aga ggt gac ggt act act gtg gct gag aga 271 Lys Arg Lys Ser Arg Ser Arg Gly Asp Gly Thr Thr Val Ala Glu Arg 20 25 30 35 tta aag aga tgg aaa gag tat aac gag acc gta gaa gaa gtt tct acc 319 Leu Lys Arg Trp Lys Glu Tyr Asn Glu Thr Val Glu Glu Val Ser Thr 40 45 50 aag aag agg aaa gta cct gcg aaa ggg tcg aag aag ggt tgt atg aaa 367 Lys Lys Arg Lys Val Pro Ala Lys Gly Ser Lys Lys Gly Cys Met Lys 55 60 65 ggt aaa gga gga cca gag aat agc cga tgt agt ttc aga gga gtt agg 415 Gly Lys Gly Gly Pro Glu Asn Ser Arg Cys Ser Phe Arg Gly Val Arg 70 75 80 caa agg att tgg ggt aaa tgg gtt gct gag atc aga gag cct aat cga 463 Gln Arg Ile Trp Gly Lys Trp Val Ala Glu Ile Arg Glu Pro Asn Arg 85 90 95 ggt agc agg ctt tgg ctt ggt act ttc cct act gct caa gaa gct gct 511 Gly Ser Arg Leu Trp Leu Gly Thr Phe Pro Thr Ala Gln Glu Ala Ala 100 105 110 115 tct gct tat gat gag gct gct aaa gct atg tat ggt cct ttg gct cgt 559 Ser Ala Tyr Asp Glu Ala Ala Lys Ala Met Tyr Gly Pro Leu Ala Arg 120 125 130 ctt aat ttc cct cgg tct gat gcg tct gag gtt acg agt acc tca agt 607 Leu Asn Phe Pro Arg Ser Asp Ala Ser Glu Val Thr Ser Thr Ser Ser 135 140 145 cag tct gag gtg tgt act gtt gag act cct ggt tgt gtt cat gtg aaa 655 Gln Ser Glu Val Cys Thr Val Glu Thr Pro Gly Cys Val His Val Lys 150 155 160 aca gag gat cca gat tgt gaa tct aaa ccc ttc tcc ggt gga gtg gag 703 Thr Glu Asp Pro Asp Cys Glu Ser Lys Pro Phe Ser Gly Gly Val Glu 165 170 175 ccg atg tat tgt ctg gag aat ggt gcg gaa gag atg aag aga ggt gtt 751 Pro Met Tyr Cys Leu Glu Asn Gly Ala Glu Glu Met Lys Arg Gly Val 180 185 190 195 aaa gcg gat aag cat tgg ctg agc gag ttt gaa cat aac tat tgg agt 799 Lys Ala Asp Lys His Trp Leu Ser Glu Phe Glu His Asn Tyr Trp Ser 200 205 210 gat att ctg aaa gag aaa gag aaa cag aag gag caa ggg att gta gaa 847 Asp Ile Leu Lys Glu Lys Glu Lys Gln Lys Glu Gln Gly Ile Val Glu 215 220 225 acc tgt cag caa caa cag cag gat tcg cta tct gtt gca gac tat ggt 895 Thr Cys Gln Gln Gln Gln Gln Asp Ser Leu Ser Val Ala Asp Tyr Gly 230 235 240 tgg ccc aat gat gtg gat cag agt cac ttg gat tct tca gac atg ttt 943 Trp Pro Asn Asp Val Asp Gln Ser His Leu Asp Ser Ser Asp Met Phe 245 250 255 gat gtc gat gag ctt cta cgt gac cta aat ggc gac gat gtg ttt gca 991 Asp Val Asp Glu Leu Leu Arg Asp Leu Asn Gly Asp Asp Val Phe Ala 260 265 270 275 ggc tta aat cag gac cgg tac ccg ggg aac agt gtt gcc aac ggt tca 1039 Gly Leu Asn Gln Asp Arg Tyr Pro Gly Asn Ser Val Ala Asn Gly Ser 280 285 290 tac agg ccc gag agt caa caa agt ggt ttt gat ccg cta caa agc ctc 1087 Tyr Arg Pro Glu Ser Gln Gln Ser Gly Phe Asp Pro Leu Gln Ser Leu 295 300 305 aac tac gga ata cct ccg ttt cag ctc gag gga aag gat ggt aat gga 1135 Asn Tyr Gly Ile Pro Pro Phe Gln Leu Glu Gly Lys Asp Gly Asn Gly 310 315 320 ttc ttc gac gac ttg agt tac ttg gat ctg gag aac taaacaaaac 1181 Phe Phe Asp Asp Leu Ser Tyr Leu Asp Leu Glu Asn 325 330 335 aatatgaagc tttttggatt tgatatttgc cttaatccca caacgactgt tgattctcta 1241 tccgagtttt agtgatatag agaactacag aacacgtttt ttcttgttat aaaggtgaac 1301 tgtatatatc gaaacagtga tatgacaata gagaagacaa ctatagtttg ttagtctgct 1361 tctcttaagt tgttctttag atatgtttta tgttttgtaa caacaggaat gaataataca 1421 cacttgtaaa aaaaaa 1437 <210> 13 <211> 937 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> CDS <222> (164)..(802) <400> 13 cttgaaaaag aatctacctg aaaagaaaaa aaagagagag agatataaat agctttacca 60 agacagatat actatctttt attaatccaa aaagactgag aactctagta actacgtact 120 acttaaacct tatccagttt cttgaaacag agtactctga tca atg aac tca ttt 175 Met Asn Ser Phe 1 tca gct ttt tct gaa atg ttt ggc tcc gat tac gag cct caa ggc gga 223 Ser Ala Phe Ser Glu Met Phe Gly Ser Asp Tyr Glu Pro Gln Gly Gly 5 10 15 20 gat tat tgt ccg acg ttg gcc acg agt tgt ccg aag aaa ccg gcg ggc 271 Asp Tyr Cys Pro Thr Leu Ala Thr Ser Cys Pro Lys Lys Pro Ala Gly 25 30 35 cgt aag aag ttt cgt gag act cgt cac cca att tac aga gga gtt cgt 319 Arg Lys Lys Phe Arg Glu Thr Arg His Pro Ile Tyr Arg Gly Val Arg 40 45 50 caa aga aac tcc ggt aag tgg gtt tct gaa gtg aga gag cca aac aag 367 Gln Arg Asn Ser Gly Lys Trp Val Ser Glu Val Arg Glu Pro Asn Lys 55 60 65 aaa acc agg att tgg ctc ggg act ttc caa acc gct gag atg gca gct 415 Lys Thr Arg Ile Trp Leu Gly Thr Phe Gln Thr Ala Glu Met Ala Ala 70 75 80 cgt gct cac gac gtc gct gca tta gcc ctc cgt ggc cga tca gca tgt 463 Arg Ala His Asp Val Ala Ala Leu Ala Leu Arg Gly Arg Ser Ala Cys 85 90 95 100 ctc aac ttc gct gac tcg gct tgg cgg cta cga atc ccg gag tca aca 511 Leu Asn Phe Ala Asp Ser Ala Trp Arg Leu Arg Ile Pro Glu Ser Thr 105 110 115 tgc gcc aag gat atc caa aaa gcg gct gct gaa gcg gcg ttg gct ttt 559 Cys Ala Lys Asp Ile Gln Lys Ala Ala Ala Glu Ala Ala Leu Ala Phe 120 125 130 caa gat gag acg tgt gat acg acg acc acg aat cat ggc ctg gac atg 607 Gln Asp Glu Thr Cys Asp Thr Thr Thr Thr Asn His Gly Leu Asp Met 135 140 145 gag gag acg atg gtg gaa gct att tat aca ccg gaa cag agc gaa ggt 655 Glu Glu Thr Met Val Glu Ala Ile Tyr Thr Pro Glu Gln Ser Glu Gly 150 155 160 gcg ttt tat atg gat gag gag aca atg ttt ggg atg ccg act ttg ttg 703 Ala Phe Tyr Met Asp Glu Glu Thr Met Phe Gly Met Pro Thr Leu Leu 165 170 175 180 gat aat atg gct gaa ggc atg ctt tta ccg ccg ccg tct gtt caa tgg 751 Asp Asn Met Ala Glu Gly Met Leu Leu Pro Pro Pro Ser Val Gln Trp 185 190 195 aat cat aat tat gac ggc gaa gga gat ggt gac gtg tcg ctt tgg agt 799 Asn His Asn Tyr Asp Gly Glu Gly Asp Gly Asp Val Ser Leu Trp Ser 200 205 210 tac taatattcga tagtcgtttc catttttgta ctatagtttg aaaatattct 852 Tyr agttcctttt tttagaatgg ttccttcatt ttattttatt ttattgttgt agaaacgagt 912 ggaaaataat tcaatacaaa aaaaa 937 <210> 14 <211> 944 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> CDS <222> (135)..(782) <400> 14 cctgaattag aaaagaaaga tagatagaga aataaatatt ttatcatacc atacaaaaaa 60 agacagagat cttctactta ctctactctc ataaacctta tccagtttct tgaaacagag 120 tactcttctg atca atg aac tca ttt tct gcc ttt tct gaa atg ttt ggc 170 Met Asn Ser Phe Ser Ala Phe Ser Glu Met Phe Gly 1 5 10 tcc gat tac gag tct ccg gtt tcc tca ggc ggt gat tac agt ccg aag 218 Ser Asp Tyr Glu Ser Pro Val Ser Ser Gly Gly Asp Tyr Ser Pro Lys 15 20 25 ctt gcc acg agc tgc ccc aag aaa cca gcg gga agg aag aag ttt cgt 266 Leu Ala Thr Ser Cys Pro Lys Lys Pro Ala Gly Arg Lys Lys Phe Arg 30 35 40 gag act cgt cac cca att tac aga gga gtt cgt caa aga aac tcc ggt 314 Glu Thr Arg His Pro Ile Tyr Arg Gly Val Arg Gln Arg Asn Ser Gly 45 50 55 60 aag tgg gtg tgt gag ttg aga gag cca aac aag aaa acg agg att tgg 362 Lys Trp Val Cys Glu Leu Arg Glu Pro Asn Lys Lys Thr Arg Ile Trp 65 70 75 ctc ggg act ttc caa acc gct gag atg gca gct cgt gct cac gac gtc 410 Leu Gly Thr Phe Gln Thr Ala Glu Met Ala Ala Arg Ala His Asp Val 80 85 90 gcc gcc ata gct ctc cgt ggc aga tct gcc tgt ctc aat ttc gct gac 458 Ala Ala Ile Ala Leu Arg Gly Arg Ser Ala Cys Leu Asn Phe Ala Asp 95 100 105 tcg gct tgg cgg cta cga atc ccg gaa tca acc tgt gcc aag gaa atc 506 Ser Ala Trp Arg Leu Arg Ile Pro Glu Ser Thr Cys Ala Lys Glu Ile 110 115 120 caa aag gcg gcg gct gaa gcc gcg ttg aat ttt caa gat gag atg tgt 554 Gln Lys Ala Ala Ala Glu Ala Ala Leu Asn Phe Gln Asp Glu Met Cys 125 130 135 140 cat atg acg acg gat gct cat ggt ctt gac atg gag gag acc ttg gtg 602 His Met Thr Thr Asp Ala His Gly Leu Asp Met Glu Glu Thr Leu Val 145 150 155 gag gct att tat acg ccg gaa cag agc caa gat gcg ttt tat atg gat 650 Glu Ala Ile Tyr Thr Pro Glu Gln Ser Gln Asp Ala Phe Tyr Met Asp 160 165 170 gaa gag gcg atg ttg ggg atg tct agt ttg ttg gat aac atg gcc gaa 698 Glu Glu Ala Met Leu Gly Met Ser Ser Leu Leu Asp Asn Met Ala Glu 175 180 185 ggg atg ctt tta ccg tcg ccg tcg gtt caa tgg aac tat aat ttt gat 746 Gly Met Leu Leu Pro Ser Pro Ser Val Gln Trp Asn Tyr Asn Phe Asp 190 195 200 gtc gag gga gat gat gac gtg tcc tta tgg agc tat taaaattcga 792 Val Glu Gly Asp Asp Asp Val Ser Leu Trp Ser Tyr 205 210 215 tttttatttc catttttggt attatagctt tttatacatt tgatcctttt ttagaatgga 852 tcttcttctt tttttggttg tgagaaacga atgtaaatgg taaaagttgt tgtcaaatgc 912 aaatgttttt gagtgcagaa tatataatct tt 944 <210> 15 <211> 1420 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> CDS <222> (183)..(1172) <400> 15 gagacgctag aaagaacgcg aaagcttgcg aagaagattt gcttttgatc gacttaacac 60 gaacaacaaa caacatctgc gtgataaaga agagattttt gcctaaataa agaagagatt 120 cgactctaat cctggagtta tcattcacga tagattctta gattgcgact ataaagaaga 180 ag atg gct gta tat gaa caa acc gga acc gag cag ccg aag aaa agg 227 Met Ala Val Tyr Glu Gln Thr Gly Thr Glu Gln Pro Lys Lys Arg 1 5 10 15 aaa tct agg gct cga gca ggt ggt tta acg gtg gct gat agg cta aag 275 Lys Ser Arg Ala Arg Ala Gly Gly Leu Thr Val Ala Asp Arg Leu Lys 20 25 30 aag tgg aaa gag tac aac gag att gtt gaa gct tcg gct gtt aaa gaa 323 Lys Trp Lys Glu Tyr Asn Glu Ile Val Glu Ala Ser Ala Val Lys Glu 35 40 45 gga gag aaa ccg aaa cgc aaa gtt cct gcg aaa ggg tcg aag aaa ggt 371 Gly Glu Lys Pro Lys Arg Lys Val Pro Ala Lys Gly Ser Lys Lys Gly 50 55 60 tgt atg aag ggt aaa gga gga cca gat aat tct cac tgt agt ttt aga 419 Cys Met Lys Gly Lys Gly Gly Pro Asp Asn Ser His Cys Ser Phe Arg 65 70 75 gga gtt aga caa agg att tgg ggt aaa tgg gtt gca gag att cga gaa 467 Gly Val Arg Gln Arg Ile Trp Gly Lys Trp Val Ala Glu Ile Arg Glu 80 85 90 95 ccg aaa ata gga act aga ctt tgg ctt ggt act ttt cct acc gcg gaa 515 Pro Lys Ile Gly Thr Arg Leu Trp Leu Gly Thr Phe Pro Thr Ala Glu 100 105 110 aaa gct gct tcc gct tat gat gaa gcg gct acc gct atg tac ggt tca 563 Lys Ala Ala Ser Ala Tyr Asp Glu Ala Ala Thr Ala Met Tyr Gly Ser 115 120 125 ttg gct cgt ctt aac ttc cct cag tct gtt ggg tct gag ttt act agt 611 Leu Ala Arg Leu Asn Phe Pro Gln Ser Val Gly Ser Glu Phe Thr Ser 130 135 140 acg tct agt caa tct gag gtg tgt acg gtt gaa aat aag gcg gtt gtt 659 Thr Ser Ser Gln Ser Glu Val Cys Thr Val Glu Asn Lys Ala Val Val 145 150 155 tgt ggt gat gtt tgt gtg aag cat gaa gat act gat tgt gaa tct aat 707 Cys Gly Asp Val Cys Val Lys His Glu Asp Thr Asp Cys Glu Ser Asn 160 165 170 175 cca ttt agt cag att tta gat gtt aga gaa gag tct tgt gga acc agg 755 Pro Phe Ser Gln Ile Leu Asp Val Arg Glu Glu Ser Cys Gly Thr Arg 180 185 190 ccg gac agt tgc acg gtt gga cat caa gat atg aat tct tcg ctg aat 803 Pro Asp Ser Cys Thr Val Gly His Gln Asp Met Asn Ser Ser Leu Asn 195 200 205 tac gat ttg ctg tta gag ttt gag cag cag tat tgg ggc caa gtt ttg 851 Tyr Asp Leu Leu Leu Glu Phe Glu Gln Gln Tyr Trp Gly Gln Val Leu 210 215 220 cag gag aaa gag aaa ccg aag cag gaa gaa gag gag ata cag caa cag 899 Gln Glu Lys Glu Lys Pro Lys Gln Glu Glu Glu Glu Ile Gln Gln Gln 225 230 235 caa cag gaa cag caa cag caa cag ctg caa ccg gat ttg ctt act gtt 947 Gln Gln Glu Gln Gln Gln Gln Gln Leu Gln Pro Asp Leu Leu Thr Val 240 245 250 255 gca gat tac ggt tgg cct tgg tct aat gat att gta aat gat cag act 995 Ala Asp Tyr Gly Trp Pro Trp Ser Asn Asp Ile Val Asn Asp Gln Thr 260 265 270 tct tgg gat cct aat gag tgc ttt gat att aat gaa ctc ctt gga gat 1043 Ser Trp Asp Pro Asn Glu Cys Phe Asp Ile Asn Glu Leu Leu Gly Asp 275 280 285 ttg aat gaa cct ggt ccc cat cag agc caa gac caa aac cac gta aat 1091 Leu Asn Glu Pro Gly Pro His Gln Ser Gln Asp Gln Asn His Val Asn 290 295 300 tct ggt agt tat gat ttg cat ccg ctt cat ctc gag cca cac gat ggt 1139 Ser Gly Ser Tyr Asp Leu His Pro Leu His Leu Glu Pro His Asp Gly 305 310 315 cac gag ttc aat ggt ttg agt tct ctg gat att tgagagttct gaggcaatgg 1192 His Glu Phe Asn Gly Leu Ser Ser Leu Asp Ile 320 325 330 tcctacaaga ctacaacata atctttggat tgatcatagg agaaacaaga aataggtgtt 1252 aatgatctga ttcacaatga aaaaatattt aataactcta tagtttttgt tctttccttg 1312 gatcatgaac tgttgcttct catctattga gttaatatag cgaatagcag agtttctctc 1372 tttcttctct ttgtagaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 1420 <210> 16 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:probe <400> 16 acatcagttt gaaagaaaag ggaaaaaaag aaaaaataaa taaaagatat actaccgaca 60 tgagttccaa aaagc 75 <210> 17 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 17 ggggatccat gtgcgggatc aagcaggaga tg 32 <210> 18 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 18 ggggatccct agtagctcca gagtgggac 29 <210> 19 <211> 281 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:probe for rd29a gene <400> 19 gatctctacc gagaaggcag catcggagga gggtgaggcg gtggaagagg aagtgaaagg 60 aggaggagga atggttggga ggattaaagg atggttcggt ggtggtgcga ctgatgaggt 120 gaagccagaa tcgccacatt ctgttgaaga ggctccaaaa tcatctggct ggtttggtgg 180 tggtgcgacg gaggaggtga agccaaaatc gcctcattcc gttgaagagt ctccacaatc 240 acttggctcc actgttgttc cggtgcagaa ggagctttaa g 281 <210> 20 <211> 690 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:probe for cor15a gene <400> 20 aaaaactcct cctttcattt ccaaacaaaa acttcttttt attctcacat cttaaagatc 60 tctctcatgg cgatgtcttt ctcaggagct gttctcactg gtatggcttc ttctttccac 120 agcggagcca agcagagcag cttcggcgct gtcagagtca gccagaaaac tcagttcgtc 180 gtcgtttctc aacgcaagaa gtcgttgatc tacgccgcta aaggtgacgg caacatcctc 240 gatgacctca acgaggccac aaagaaagct tcagatttcg tgacggataa aacaaaagag 300 gcattagcag atggtgagaa agcgaaagac tacgttgttg aaaaaaacag tgaaaccgca 360 gatacattgg gtaaagaagc tgagaaagct gcggcgtatg tggaggagaa aggaaaagaa 420 gccgcaaaca aggcggcaga gttcgcggag ggtaaagcag gagaggctaa ggatgccaca 480 aagtaggatc ttacctaatc agttaatttc aagcacttaa actcgtagat atattgatcc 540 atatcctctc tcttcatgtt taatagtact tacaataaga tgagtccgtt gtaatttcta 600 ttaatttcac atcgcaactg aaataagata tggtatccac agtcaccgtc acattcttta 660 atgttttgca aaatattcaa tagacaaatt 690 <210> 21 <211> 301 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:probe for kin1 gene <400> 21 atcatcacta accaaaacac acttcaaaaa cgattttaca agaaataaat atctgaaaaa 60 atgtcagaga ccaacaagaa tgccttccaa gccggtcaga ccgctggcaa agctgaggag 120 aagagcaatg ttctgctgga caaggccaag gatgctgcag ctggtgctgg agctggagca 180 caacaggcgg gaaagagtgt atcggatgcg gcagcgggag gtgttaactt cgtgaaggac 240 aagaccggcc tgaacaagta gcgattcggg tcaaatttgg gagttataat ttcccttttc 300 t 301 <210> 22 <211> 1024 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:probe for erd10 gene <400> 22 ctcaaagctc aaatcgaaat ttctagtttc tctttatcat tcacgctaag tgttcaatcg 60 aatcaagatt aagtatggca gaagagtaca agaacaccgt tccagagcag gagaccccta 120 aggttgcaac agaggaatca tcggcgccag agattaagga gcggggaatg ttcgatttct 180 tgaagaaaaa ggaggaagtt aaacctcaag aaacgacgac tctcgcgtct gagtttgagc 240 acaagactca gatctctgaa ccagagtcgt ttgtggccaa gcacgaagaa gaggaacata 300 agcctactct tctcgagcag cttcaccaga agcacgagga ggaagaagaa aacaagccaa 360 gtctcctcga caaactccac cgatccaaca gctcttcttc ctcttcgagt gatgaagaag 420 gtgaagacgg tgagaagaag aagaaggaga aaaagaagaa gattgttgaa ggagatcatg 480 tgaaaacagt ggaagaagag aatcaaggag taatggacag gattaaggag aagtttccac 540 tcggagagaa accagggggt gatgatgtac cagtcgtcac caccatgcca gcaccacatt 600 cggtagagga tcacaaacca gaggaagaag agaagaaagg gtttatggat aagatcaagg 660 agaagcttcc aggccacagc aagaaaccag aggattcaca agtcgtcaac accacaccgc 720 tggttgaaac agcaacaccg attgctgaca tcccggagga gaagaaggga tttatggaca 780 agatcaaaga gaagcttcca ggttatcacg ccaagaccac tggagaggaa gagaagaaag 840 aaaaagtgtc tgattaagag aaaaatatga taagagtgaa taataatgat gtgggagtgg 900 gacttatgtt gttttttgtt ttttgttgat cattgtctct tttattttgt ctttctagct 960 gttctccaag tttgtgttta gagttagatc atttgtgtct aaaatctata aaattatttt 1020 atct 1024 <210> 23 <211> 359 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:probe for OsDREB1A gene <400> 23 ctcctcgccg tgccgcgctc ctaccgcacc ctcgccgacg tccgccacgc cgtcgccgag 60 gccgtcgagg acttcttccg gcgccgcctc gccgacgacg cgctgtccgc cacgtcgtcg 120 tcctcgacga cgccgtccac cccacgcacc gacgacgacg aggagtccgc cgccaccgac 180 ggcgacgagt cctcctcccc ggccagcgac ctggcgttcg aactggacgt cctgagtgac 240 atgggctggg acctgtacta cgcgagcttg gcgcagggga tgctcatgga gccaccatcg 300 gcggcgctcg gcgacgacgg tgacgccatc ctcgccgacg tcccactctg gagctacta 359 <210> 24 <211> 389 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:probe for OsDREB1B gene <400> 24 cttgcctcaa cttcgccgac ttcgcgtggc ggatgccgcc cgtccccgcg tccgccgcgc 60 tcgccggcgc gaggggggtc agggacgccg tcgccgtggc cgtcgaggcg ttccagcgcc 120 agtcggccgc gccgtcgtct ccggcggaga ccttcgccaa cgatggcgac gaagaagaag 180 acaacaagga cgtgttgccg gtggcggcgg cggaggtgtt cgacgcgggg gcgttcgagc 240 tcgacgacgg gttcaggttc ggcgggatgg acgccgggtc gtactacgcg agcttggcgc 300 aggggctgct cgtcgagccg ccggccgccg gagcgtggtg ggaggacggc gagctcgccg 360 gctccgacat gccgctctgg agctactaa 389 <210> 25 <211> 944 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:probe for DREB1C gene <400> 25 cctgaattag aaaagaaaga tagatagaga aataaatatt ttatcatacc atacaaaaaa 60 agacagagat cttctactta ctctactctc ataaacctta tccagtttct tgaaacagag 120 tactcttctg atcaatgaac tcattttctg ccttttctga aatgtttggc tccgattacg 180 agtctccggt ttcctcaggc ggtgattaca gtccgaagct tgccacgagc tgccccaaga 240 aaccagcggg aaggaagaag tttcgtgaga ctcgtcaccc aatttacaga ggagttcgtc 300 aaagaaactc cggtaagtgg gtgtgtgagt tgagagagcc aaacaagaaa acgaggattt 360 ggctcgggac tttccaaacc gctgagatgg cagctcgtgc tcacgacgtc gccgccatag 420 ctctccgtgg cagatctgcc tgtctcaatt tcgctgactc ggcttggcgg ctacgaatcc 480 cggaatcaac ctgtgccaag gaaatccaaa aggcggcggc tgaagccgcg ttgaattttc 540 aagatgagat gtgtcatatg acgacggatg ctcatggtct tgacatggag gagaccttgg 600 tggaggctat ttatacgccg gaacagagcc aagatgcgtt ttatatggat gaagaggcga 660 tgttggggat gtctagtttg ttggataaca tggccgaagg gatgctttta ccgtcgccgt 720 cggttcaatg gaactataat tttgatgtcg agggagatga tgacgtgtcc ttatggagct 780 attaaaattc gatttttatt tccatttttg gtattatagc tttttataca tttgatcctt 840 ttttagaatg gatcttcttc tttttttggt tgtgagaaac gaatgtaaat ggtaaaagtt 900 gttgtcaaat gcaaatgttt ttgagtgcag aatatataat cttt 944 <210> 26 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:probe for lip9 gene <400> 26 agagctcgtc acagctcaaa caagtcaaga gcgaatagtt cttgctgatc tgttgtttga 60 ttactttagt tctcgagagg ctttagctga atccatcgat cgatcatgga ggatgagagg 120 aacacggaga gccaccaggg tggcgaggct gcagagcagg tggaggtgaa ggacaggggc 180 ctcttcgaca acctccttgg caggaagaag gacgatcagc cggaggagaa gaagcatgag 240 gaggagcttg tcaccggcat ggagaaggtc tccgtggaag agccaaagaa ggaggagcac 300 cacgccgagg gcgagaagaa ggagagcctc ctctccaagc tgcaccgatc cagctccagc 360 tccagctcgt cgagtgatga ggaagaggag gtgatcgatg acaacggcga ggtggtcaag 420 aggaagaaga agaaggggct caaggagaag atcaaggaga agctgcccgg ccacaaggac 480 catgccggtg agcatgctcc tccgcccgcg gcgacgggct tcccgcgccg gctccgctgc 540 atccgtggtg acggccgcgc ccacgccanc tcctgctccc gtggtgactc acggcgatca 600 ccaccacgac acccgccgtc cccgtggana aagatcgagg gtgatcacgc cnagacggag 660 gcgaccctgc cacgtgcccc cgaggaggan aanaaagggc tttctcgaca agatcaagga 720 <210> 27 <211> 353 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:probe for Wsi724 gene <400> 27 gctagcagag tagcaatcca ttccgatcca tcaaatttct cttgagaccg tagagagaga 60 gagaggcgcc aaccatggcc ggcatcatcc acaagatcga ggagaagctc cacatgggcg 120 gaggcgagca caagaaggaa gacgagcaca agaaggaggg ggagcaccac aagaaggacg 180 gggagcacaa ggaaggcgtg gtggagaaga tcaaggacaa gatcaccggc gaccacggcg 240 acggcggcga gcacaaggag aagaaggaca agaagaagaa gaaggagaag aagcacggcg 300 aggagggcca ccaccacgac ggccacagca gcagcagcag cgacagcgac tgg 353 <210> 28 <211> 413 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:probe for salT gene <400> 28 gctagcagag atgacgctgg tgaagattgg tccgtggggc ggaaatggag ggtcagctca 60 ggacatcagt gtgccaccca agaagctgtt aggcgtgaca atctacagct cagatgcaat 120 cagatccatt gccttcaact acatcggtgt ggatggacag gaatatgcca ttggtccatg 180 gggtgggggc gaaggcacct ctacagagat taaactgggc tcctctgagc agatcaagga 240 gatttctgga acccatggcc cagtctatga tctggctgac attgtcacct atcttaagat 300 tgtgacaaag tgctaataat acatacgagg ctggagtccc aaatggaaag gaattcagca 360 ttccacttgc aagactctgg cctgtcgttg gatctttgga aggtctggaa cgc 413

【０１０７】

【配列表フリーテキスト】

配列番号16：プローブ 配列番号17：プライマー 配列番号18：プライマー 配列番号19：rd29a用プローブ 配列番号20：cor15a用プローブ 配列番号21：kin1用プローブ 配列番号22：erd10用プローブ 配列番号23：OsDREB1A用プローブ 配列番号24：OsDREB1B用プローブ 配列番号25：DREB1C用プローブ 配列番号26：lip9用プローブ 配列番号27：Wsi724用プローブ 配列番号28：salT用プローブ

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、OsDREBタンパク質の構造を示す。（A:
OsDREB1、B:OsDREB2）

【図２】図２は、DREB１類似タンパク質のアミノ酸配列
を示す。（OsDREB1A,OsDREB1B,OsDREB1C,OsDREB1D;イ
ネ、BCBF3;オオムギ、DREB1A;シロイヌナズナ、ACRE111
B;タバコ）

【図３】図３は、DREB2類似タンパク質のアミノ酸配列
を示す。（OsDREB2A;イネ、DREB2A;シロイヌナズナ、OR
CA1;ニチニチソウ）

【図４】図４は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。

【図５】図５（A）は、トランスアクチベーションに用
いたプラスミドの構造を示す。また、図５（B）は、ト
ランスアクチベーションによる導入効率の比（GUS/LU
C）を示す。

【図６】図６は、ノーザン法によるOsDREB遺伝子の発現
解析結果を示す。

【図７】図７は、遺伝子組換えシロイヌナズナにおける
ストレス耐性遺伝子の発現解析結果を示す。

【図８】図８は、遺伝子組換えイネにおけるストレス耐
性遺伝子の発現解析結果を示す。

【図９】図９は、OsDREB1A及びDREB1Aを導入した組換え
植物体（シロイヌナズナ）の塩ストレス耐性を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ ４Ｈ０４５ (72)発明者 伊藤 裕介 茨城県つくば市上横場字石居1894−８ 中 村ハイツ102 (72)発明者 佐久間 洋 茨城県つくば市観音台１丁目34−７ シャ イン大塚202 Ｆターム(参考） 2B030 AD04 CA15 CA17 CA19 4B024 AA08 BA80 CA01 DA01 GA11 GA17 HA12 HA20 4B063 QA05 QQ04 QQ53 QR32 QR55 QS34 QX01 4B064 AG01 CA19 CC24 DA11 4B065 AA89X AA89Y AB01 AC03 AC08 AC20 BA02 CA24 CA53 4H045 AA10 AA20 BA09 CA31 EA05 FA74

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の(a)又は(b)のDNAを含む遺伝子。 (a) 配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７
   又は配列番号９で表される塩基配列からなるDNA (b) 配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７
   又は配列番号９で表される塩基配列からなるDNAに相補
   的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下
   でハイブリダイズし、かつストレス応答性エレメント下
   流の遺伝子の転写を制御するタンパク質をコードするDN
   A
2. 【請求項２】以下の(c)又は(d)のタンパク質をコードす
   る遺伝子。 (c) 配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８
   又は配列番号10で表されるアミノ酸配列からなるタンパ
   ク質 (d) 配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８
   又は配列番号10で表されるアミノ酸配列において１若し
   くは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたア
   ミノ酸配列からなり、かつストレス応答性エレメント下
   流の遺伝子の転写を制御するタンパク質
3. 【請求項３】 前記ストレスが乾燥ストレス、低温スト
   レス又は塩ストレスである請求項１又は２記載の遺伝
   子。
4. 【請求項４】 以下の(c)又は(d)の組換えタンパク質。 (c) 配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８
   又は配列番号10で表されるアミノ酸配列からなるタンパ
   ク質 (d) 配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８
   又は配列番号10で表されるアミノ酸配列において１若し
   くは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたア
   ミノ酸配列からなり、かつストレス応答性エレメント下
   流の遺伝子の転写を制御するタンパク質
5. 【請求項５】 前記ストレスが乾燥ストレス、低温スト
   レス又は塩ストレスである請求項４記載のタンパク質。
6. 【請求項６】 請求項１〜３のいずれか1項記載の遺伝
   子を含有する、組換えベクター。
7. 【請求項７】 請求項６記載の組換えベクターを含む形
   質転換体。
8. 【請求項８】 宿主が植物である、請求項７記載の形質
   転換体。
9. 【請求項９】 宿主が単子葉植物である、請求項７記載
   の形質転換体。
10. 【請求項１０】 請求項８又は９記載の形質転換体を培
    地に培養し、得られる培養物からストレス応答性エレメ
    ント下流の遺伝子の転写を制御するタンパク質を採取す
    ることを特徴とする、該タンパク質の製造方法。
11. 【請求項１１】 請求項１〜３のいずれか1項記載の遺
    伝子の植物体内における転写レベルを測定することを特
    徴とする、植物のストレスレベルの測定方法。
12. 【請求項１２】 請求項１〜３のいずれか1項記載の遺
    伝子を植物に導入することにより、該植物のストレス耐
    性を向上させる方法。