CN107619828A - 玉米盐胁迫响应miRNA MiR164及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物抗逆领域，具体涉及玉米盐胁迫响应miRNA MiR164及其应用，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。根据本发明的玉米盐胁迫响应miRNA在盐胁迫下，zma‑miR164下调表达，促使其靶基因GRMZM2G114850(NAC转录因子家族蛋白，NAM、ATAF、CUC)和GRMZM2G008819都表现出了显著的表达上调；NAC转录因子通过调控下游基因的表达模式来响应盐渍胁迫。

Description

玉米盐胁迫响应miRNA MiR164及其应用

技术领域

本发明涉及植物抗逆领域，具体涉及玉米盐胁迫响应miRNA MiR164及其应用。

背景技术

miRNA功能多样，盐胁迫、干旱胁迫以及ABA都能诱导miR417的上调表达，有趣的是，过表达miR417的拟南芥，在盐胁迫下的种子萌发率反而会降低。在盐渍和干旱胁迫下，拟南芥miR395家族的两个成员miR395c和miR395e，前者负调控拟南芥种子的萌发，而后者则起正调控作用。同一种miRNA在不同的逆境下对植物的调控模式也有所不同，如过表达miR402，盐胁迫下，不仅能使拟南芥种子萌发加速还能加快幼苗生长，然而在低温或干旱胁迫下，只能促进种子萌发，不能促进幼苗的生长。水稻osa-MIR396c是耐盐响应的负调控因子。盐胁迫下，水稻osa-MIR396家族成员中只有osa-MIR396c发生下调表达，而其他成员则没有变化。过表达osa-MIR396c，水稻的耐盐性大幅下降。过表达osa-MIR393能够负调控水稻的耐盐性。osa-MIR393和osa-MIR393b都属于水稻miR393家族，在盐胁迫下，前者表达水平改变而后者表达水平无明显变化。

玉米是世界上最重要的多用型农作物，miRNA在植物耐盐过程中发挥着重要的作用，因此，鉴定玉米中盐胁迫响应的miRNA及其靶基因，阐明两者之间互作参与的盐胁迫响应的生理基础，将为玉米盐胁迫适应性遗传品质改良奠定理论基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种玉米盐胁迫响应miRNA。

本发明的再一目的是提供上述玉米盐胁迫响应miRNA的应用。

根据本法的具体实施方式，本发明以玉米耐盐自交系LH196为材料，运用小RNA深度测序及降解组测序技术，发现了玉米中一系列参与盐胁迫响应的miRNA及其靶基因。从表达差异显著的新的盐胁迫响应的miRNAs中鉴定出玉米盐胁迫响应MiR164家族新成员，为novel_mir-36，提出了玉米miR164。

根据本发明的玉米盐胁迫响应miRNA，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示：

TGGAGAAGCAGGACACGTGAG

本发明还提供了上述玉米盐胁迫响应miRNA在提高植物耐盐性方面的应用。

根据本发明的玉米盐胁迫响应miRNA在盐胁迫下，zma-miR164下调表达，促使其靶基因GRMZM2G114850(NAC转录因子家族蛋白，NAM、ATAF、CUC)和GRMZM2G008819都表现出了显著的表达上调；NAC转录因子通过调控下游基因的表达模式来响应盐渍胁迫。

附图说明

图1显示图RT-qPCR验证zma-miR164a与其两个靶基因之间的调控关系，其中，**：P<0.01(t测验)，表示与对照相比差异极显著；*：P<0.05(t测验)，表示与对照相比差异显著。

图2显示5盐胁迫下三组拟南芥的表型差异，WT(野生型)、MIR(过表达zma-miR164a)、MIM(zma-MIM164a)。

具体实施方式

实施例1

一、盐胁迫玉米幼苗

选择200mM、250mM NaCl溶液处理玉米幼苗，以0mM NaCl溶液作为对照。在对玉米盐胁迫响应miRNA进行研究之前，必须确定合适盐胁迫处理材料及浓度，并且在不同程度的盐胁迫下，获得具有明显差异的表型数据是准确鉴定玉米盐胁迫响应miRNA的基础，也是至关重要的一步。经过大量的实验摸索，最后确定200mM以上的NaCl溶液才具有研究价值。因此，在3种浓度NaCl溶液处理下，根据玉米自交系LH196幼苗表型的鉴定结果及相关数据统计，最终确定把表型鉴定的盐胁迫浓度定为200mM和250mM，且把250mM NaCl溶液处理的玉米幼苗作为后续工作的实验材料。

将处理第10天的幼苗取出水培装置，用吸水纸吸干根部水分，将植株从形态学最上端的气生根处切断，植株分为根(R)和茎叶(S)两部分。对照组和处理组各随机取9株分别测量并记录株高、根长、鲜重、干重。将对照组和250mM NaCl溶液处理组幼苗各随机选取4株，计算各植株的相对花青苷含量。

玉米幼苗在NaCl溶液处理下出现了明显的盐胁迫表型，叶片枯黄萎蔫，气生根增多，根的分支增多，根部变细。玉米自交系LH196在0mM对照与200mM、250mM NaCl溶液处理10天后除外表形态学上的差异外，其生物量根冠比等也有显著的差异，在盐处理和对照中，地上部鲜重(FWS)、根鲜重(FWR)、鲜重根冠比(R/S(FW))、地上部干重(DWS)、根干重(DWR)和干重根冠比(R/S(DW))的差异显著水平。在200mM、250mM NaCl溶液处理下，玉米自交系LH196幼苗的各部分生物量皆显著降低，但鲜重根冠比都显著上升且上升幅度很大。200mM处理组的干重根冠比与对照相比没有显著变化，但250mM处理组的干重根冠比出现了显著上升。

250mM NaCl溶液处理后，玉米自交系LH196幼苗的茎干花青苷相对含量也有显著上升，约提高了1.5倍，表明茎干花青苷相对含量可以作为玉米幼苗受盐胁迫程度的判断指标，同时也表明花青苷可能参与玉米盐胁迫响应及高盐环境适应性调节。

二、鉴定盐胁迫响应新miRNA

提取玉米幼苗叶片及根总RNA，为了鉴定盐胁迫响应新miRNA，分别构建了4个不同的玉米自交系LH196小RNA库并进行测序，形成了2组对比，分别是对照(0mM NaCl溶液)和盐处理(250mM NaCl溶液)的叶和对照(0mM NaCl溶液)和盐处理(250mM NaCl溶液)的根。测序一共产生了超过49million的raw reads，有超过48million的原始reads长度在18-30nt，其中单一的sRNAs序列超过了16million，有超过57％的单一clean reads能够与玉米基因组序列(B73RefGen_v2)匹配。在构建了4个玉米自交系LH196的小RNA库的同时，还构建了4个降解组库并进行测序，这些降解组库和4个小RNA库一一对应，分别为对照叶(0mM NaCl溶液)和盐处理叶(250mM NaCl溶液)，对照根(0mM NaCl溶液)和盐处理根(250mM NaCl溶液)。结果共得到了超过51million的raw reads，其中单一的sRNAs序列超过了16.7million，这些序列中99.5％长度为20和21nt，其中70％的单一clean reads能与玉米基因组(B73RefGen_v2)匹配。

根据差异表达倍数大于2.0的标准，从4个小RNA库中共鉴定出了37个新的盐胁迫响应miRNAs，其中叶片中26个，有11个上调表达，15个下调表达；根中26个，14个上调表达，12个下调表达；根和叶共有15个，2个同时表达上调，4个同时表达下调，2个在叶中表达上调，而在根中表达下调，余下的7个在叶中表达上调，而在根中表达下调。

从表达差异显著的新的盐胁迫响应的miRNAs中鉴定玉米盐胁迫响应MiR164成员，为novel_mir-36。

三、miRNA及其靶基因的调控关系验证

为了能够准确估计miRNA对其靶基因的调控作用，分别在miRNA切割位点的两侧设计正向及反向引物。玉米微管5号蛋白(Zea mays alpha-tubulin 5)被选为内参(IR)基因。引物信息见表1。

表1miRNA RT-qPCR验证引物

以玉米微管5号蛋白作为内参，采用qRT–PCR方法对新的盐胁迫响应的miRNA mir-36、的靶基因进行相对表达量检测，mir-36在叶中表达上调，而在根中表达下调。

四、玉米miR164参与盐胁迫响应的调节机制

构建pCAM-35S::zma-MIR164a过表达载体，将载体导入农杆菌，转化野生型拟南芥。盐胁迫下，zma-miR164a的差异表达结果见表2。利用RT-qPCR方法验证zma-miR164a与其两个靶基因之间的调控关系(图1)，从图中可看出，盐胁迫下的玉米叶片中，miR164a发生表达下调达到极显著水平，由于miR164a的负调控模式，其靶基因GRMZM2G114850和靶基因GRMZM2G008819都表现出了显著的表达上调现象。

表2玉米幼苗中不同处理下的mir_36表达情况

注：**在0.01水平上显著

图2显示了盐处理后各组拟南芥的变化，野生型拟南芥(Col-0)和zma-miR164a过表达的拟南芥都表现出了很强的盐胁迫表型，叶片黑紫，表皮组织加厚，叶片早衰、萎蔫等，而pCAM-35S::zma-MIM164a转基因的拟南芥植株，则呈现出较强的盐渍耐受性，只出现轻微的盐胁迫表型，如老叶片失绿和轻微早衰。

根据本实施例的结果显示，miR164的靶基因主要是NAC家族成员，这些转录因子在胁迫下，受miR164的负调控，从而改变表达模式来适应胁迫环境。过表达miR164a和靶标模拟来验证miR164a盐胁迫的响应模式。玉米miR164在响应盐胁迫时存在的内在调控途径为，盐胁迫下，zma-miR164下调表达，促使其靶基因GRMZM2G114850(NAC转录因子家族蛋白，NAM、ATAF、CUC)和GRMZM2G008819(电子载体)都表现出了显著的表达上调现象，NAC转录因子是植物特有的一个转录因子家族，通过调控下游基因(盐胁迫响应相关基因)的表达模式，从而使玉米能够更好的适应盐渍胁迫以及其他多种胁迫。

序列表

<110> 南通大学

<120> 玉米盐胁迫响应miRNA MiR164及其应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 1

tggagaagca ggacacgtga g 21

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 2

gccgttgccg aggtgttc 18

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 3

gtccttctca agagcagcca agt 23

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 4

tagcagcaat ccaggctttt 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 5

gcatgtatat ggcacacacc a 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 6

ggtagcgtcc agaaccagaa 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 7

ttgatgtcag gccagagttg 20

Claims (4)

1.玉米盐胁迫响应miRNA，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.包含权利要求1所述玉米盐胁迫响应miRNA的重组载体。

3.包含权利要求1所述玉米盐胁迫响应miRNA的重组细胞。

4.如权利要求1所述的玉米盐胁迫响应miRNA在提高植物耐盐性方面的应用。