CN110484525A

CN110484525A - 一种耐热n-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN110484525A
Application number: CN201910907400.3A
Authority: CN
Inventors: 赵黎明; 秦臻; 马佳菲; 邱勇隽
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2019-09-24
Filing date: 2019-09-24
Publication date: 2019-11-22
Anticipated expiration: 2039-09-24
Also published as: CN110484525B

Abstract

本发明提供了一种耐热N‑乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶及其编码基因与应用。本发明的N‑乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶是如下a)或b)或c)：a)如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列编码的蛋白质；b)如SEQ ID NO.2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；c)将如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质。本发明进一步涉及此类蛋白质在氨基葡萄糖制备中的应用。本发明还涉及与耐热N‑乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶相关的生物材料。本发明所述脱乙酰酶可催化N‑乙酰氨基葡萄糖的脱乙酰反应，应用于工业化制备氨基葡萄糖，其反应条件温和，能源消耗少，无污染物产生，具有较好的工业应用前景。

Description

一种耐热N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种耐热N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶及其编码基因与应用。

背景技术

氨基葡萄糖(C₆H₁₃NO₅)又称葡萄糖胺、葡糖胺或氨基葡糖，是葡萄糖2位的羟基被氨基取代后形成的氨基单糖。氨基葡萄糖是自然界含量最丰富的单糖之一，在于人体中多存在于关节软骨、结缔组织和细胞膜中。氨基葡萄糖也是生物体蛋白质或脂类糖基化反应中的重要前体，是形成软骨细胞的重要营养素，是健康关节软骨的天然组织成份。

氨基葡萄糖是一种重要的功能食品，也是一种辅助治疗药物，其主要可以舒缓因关节炎引起的疼痛、僵硬和肿胀；舒缓因关节炎引起的疼痛、僵硬和肿胀；润滑关节及维持关节功能。此外，氨基葡萄糖在体内可以参与肝肾解毒，发挥抗炎护肝作用，对治疗风湿性关节炎症和胃溃疡也有良好的疗效。氨基葡萄糖还有吸收自由基、抗衰老、减肥、调节内分泌等多种有益的生理作用，已广泛应用于食品、化妆品和饲料添加剂中。

氨基葡萄糖的制备方法主要有化学合成法、酸水解法、微生物发酵法和生物转化法。目前，氨基葡萄糖工业制备方法主要为甲壳素水解法和微生物发酵法。甲壳素水解法生产氨基葡萄糖主要利用酸水解甲壳素获得单糖，大量酸、碱的使用对环境造成严重污染，此外，由于甲壳素原料依赖海洋甲壳质资源，其应用受到极大制约。微生物发酵法具有诸多优点，如原料来源不受限制，无致敏性、环境污染影响较小等，是目前工业制备氨基葡萄糖的发展趋势。但由于发酵过程中微生物对氨基葡萄糖耐受性有限，发酵法生产的氨基葡萄糖一般以N-乙酰氨基葡萄糖形式存在，后续还需进一步脱乙酰得到最终的氨基葡萄糖产品。目前N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰普遍采用盐酸水解法，即使用浓盐酸高温水解N-乙酰氨基葡萄糖，脱去乙酰基后生成氨基葡萄糖。盐酸水解法生产周期较长，产生大量的废酸及副产物，对氨基葡萄糖产品质量及环保均造成负面影响。

N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶能够专一催化N-乙酰氨基葡萄糖的脱乙酰反应，其反应条件温和，操作简单，环境污染少，是最为理想的氨基葡萄糖脱乙酰制备方法。然而，由于酶稳定性，催化活性，成本等原因，目前尚无商品化专一性制备氨基葡萄糖的N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶，工业上目前也尚未大规模采用酶法脱乙酰制备氨基葡萄糖。目前已公开的N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶也多为常温酶，催化转化率不高，限制了酶法脱乙酰的应用。

目前已公开的可应用于N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰反应的特异性脱乙酰酶报道较少，仅少量微生物来源的脱乙酰酶具有类似活性，如中国专利CN107022538A公开的一种高产氨基葡萄糖的脱乙酰酶及其编码基因。发掘具有较高活性的耐热N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶基因，通过基因重组的方法，构建基因工程菌，高效异源表达N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶，探索N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶制备氨基葡萄糖的酶解工艺，具有重要的工业应用价值和潜力。

发明内容

本发明的目是提供一种耐热N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶及其编码基因与应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明的一个目的是提供一种蛋白质。

本发明提供的蛋白质，是如下a)或b)或c)的蛋白质，将其命名为TcDac，

a)如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列编码的蛋白质；

b)如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列中第1-266位所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

c)如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列中第1-266位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质。

其中，如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列中第1-266位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质，是指：与SEQID NO.2所示氨基酸序列至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％相似性，且具有脱乙酰酶活性的蛋白质。

为了使上述蛋白质便于纯化，可在SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第1-266位氨基酸残基编码的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1、标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述a)-c)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述a)-c)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID NO.1所示第1-798位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

本发明的另一个目的是提供与上述蛋白质相关的生物材料。

本发明提供的生物材料为下述B1)-B5)中的任一种：

B1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组菌或含有B2)所述表达盒的重组菌或含有B3)所述重组载体的重组菌；

B5)含有B1)所述核酸分子的细胞系或含有B2)所述表达盒的细胞系或含有B3)所述重组载体的细胞系。

其中，B1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子：

1)核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的DNA分子；

2)与1)限定的DNA序列至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％相似性且编码所述蛋白质的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；

4)利用密码子优化后获得的编码权利要求1所述蛋白质的氨基酸序列及上述1)或2)所述条件的DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

B4)中所述的重组菌是将上述蛋白质的编码基因导入宿主菌中得到的重组菌。

上述重组菌中，所述蛋白质的编码基因是通过重组载体导入宿主菌；

上述重组菌中，所述宿主菌为大肠杆菌、芽孢杆菌、毕赤酵母或黑曲霉。本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码TcDac的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有编码TcDac的核苷酸序列85％或者更高相似性的核苷酸，只要编码TcDac且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“相似性”指与天然核酸序列的序列相似性。相似性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的相似性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的相似性。

上述生物材料中，B2)所述含有B1)所述核酸分子的表达盒，即含有编码TcDac的核酸分子的表达盒(TcDac基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达TcDac的DNA，该DNA不但可包括启动TcDac转录的启动子，还可包括终止TcDac转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子；组织、器官和发育特异的启动子及诱导型启动子。

上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

本发明的另一个目的是提供上述蛋白质的新用途。

本发明提供了上述蛋白质作为脱乙酰酶的应用。

本发明还提供了上述蛋白质作为N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶的应用。

上述酶催化活性特指该蛋白质催化N-乙酰氨基葡萄糖的脱乙酰基反应，生成氨基葡萄糖产物。

本发明还提供了一种N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶的制备方法，包括如下步骤：

1)在有益于产生本发明第一个发明目的所述蛋白的条件下培养上述重组菌的宿主细胞；

2)回收该蛋白，即N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶。

本发明最后一个目的是提供一种氨基葡萄糖的制备方法。

本发明提供的氨基葡萄糖的制备方法包括如下步骤：

1)培养上述重组菌，得到N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶；

2)运用该酶处理N-乙酰氨基葡萄糖糖浆、溶液或发酵液，得到氨基葡萄糖。

上述方法中，所述糖浆、溶液或发酵液中N-乙酰氨基葡萄糖的质量分数为0.1-65％。

上述方法中，所述脱乙酰的条件为：pH 3.0-9.5，20-90℃，反应时间0.5-20小时。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明提供了一种具有N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶活性的蛋白质(在实施例中具体为重组蛋白TcDac)及其编码基因；该蛋白质作为N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶可以高效水解N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰制备氨基葡萄糖。与传统化学法相比，废酸碱排放量小，能源消耗量少，转化率高，且该酶优良的耐热性能使得其在工业应用中具有更好的稳定性。本发明提供的蛋白质具有良好的N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶酶学性质，在氨基葡萄糖制备以及食品、医药等行业中具有良好的应用价值。

附图说明

图1显示了重组TcDac经Ni-IDA亲和层析纯化的纯化图。

其中，泳道M代表低分子量标准蛋白，泳道1代表粗酶液，泳道2代表经Ni-IDA亲和层析后的目的蛋白。

图2显示了TcDac对N-乙酰氨基葡萄糖的脱乙酰基活性。反应时间为6小时，图中显示反应液底物N-乙酰氨基葡萄糖能大部分被脱乙酰基转化为氨基葡萄糖产物。图中GlcNAc代表N-乙酰氨基葡萄糖，GlcN代表氨基葡萄糖。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明通过基因组数据库发掘的方法分析了一批基因组序列，候选了一批在生物信息学上被预测为假定脱乙酰酶或具有潜在脱乙酰酶活性的未验证功能基因序列。所述的挖掘方法具体为，以文献中公开的几丁质脱乙酰酶基因为模板探针，在NCBI数据库中进行Blast-P搜索，筛选出与已知序列同源性在30-90％的潜在序列，并进一步进行结构域分析及蛋白家族分类分析，确定候选序列。

下面通过具体实施例结合附图对本发明的方法做进一步说明。以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

实施例1、基因TcDac的获得及表达载体构建

依据上述方法，从基因数据库中筛选得到候选基因。

将SEQ ID NO.1中第1-798位所示的一个候选基因命名为基因TcDac，将该基因所编码的蛋白命名为蛋白TcDac，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

依据SEQ ID NO.1所示DNA序列信息，人工合成目的基因。

设计上游引物TcDac-up1(5’-ATGTTTGAGGATGTGAACG-3’)和下游引物TcDac-down1(5’-AATCAGCTCCGCGAAG-3’，)，PCR扩增得到目的DNA片段。PCR扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，循环30次；最后72℃后延伸10min。PCR产物经过1％琼脂糖凝胶电泳回收并测序验证。

本发明还涉及包含编码目的蛋白TcDac的核苷酸、启动子以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。多个核苷酸和控制序列可连接在一起产生重组表达载体，其包括一个或多个便利的限制位点以允许编码该多肽的多核苷酸在这些位点处的插入或取代。可替代地，多核苷酸可通过将该多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中来表达。在产生该表达载体时，该编码序列位于该载体中，这样使得该编码序列与该用于表达的适当控制序列有效地连接。

重组表达载体可以是可方便地经受重组DNA程序并且引起多核苷酸表达的任何载体(如质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相溶性。该载体可以是线装或环装质粒。载体优选含有一个或多个允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的选择性标记。选择性标记是一种基因，其产物提供了抗生素抗性或病毒抗性、重金属抗性、对营养缺陷型的原养性等。

在一个实施例中，本发明选取的表达载体为pET-28a(+),设计上下游引物分别为TcDac-up(5’-ATTGGGAATTCCATATGATGTTTGAGGATGTGAACG-3’，下划线示Nde Ⅰ酶切位点)和下游引物TcDac-down(5’-ATTCCGCTCGAGTTAAATCAGCTCCGCGAAG-3’，下划线示XhoⅠ酶切位点)，PCR扩增得到目的DNA片段。PCR扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次；最后72℃后延伸10min。PCR产物经过1％琼脂糖凝胶电泳回收并测序验证。

PCR产物经过1％琼脂糖凝胶电泳回收，以NdeⅠ和XhoⅠ双酶切。将该双酶切后的产物与经相同双酶切过的原核表达载体pET-28a(+)(美国Novagen公司，产品编号：69864-3)片段以T4 DNA连接酶进行连接，得到重组质粒，并将其转化至宿主大肠杆菌DH5α。挑选菌落PCR(PCR所用的引物和扩增条件与本段前述PCR的相同)验证为阳性的转化子测序。

测序结果表明：重组质粒为在载体pET-28a(+)的NdeⅠ和XhoⅠ位点间插入了SEQ IDNO.1中第1-798位所示的DNA片段。

实施例2、重组N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶(TcDac)的表达和纯化

本发明还涉及用于表达TcDac的重组宿主细胞的构建，其包含本发明所述的编码TcDac的核苷酸。宿主细胞可为在本发明的蛋白质重组生产中有用的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。

原核宿主细胞可为任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌，包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、乳酸菌属、链霉菌属、葡萄球菌属、大肠杆菌、假单胞菌属、类芽孢杆菌属。

真核宿主细胞可为哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞，包括但不限于：丝状真菌(曲霉、毛霉、根霉、青霉等)、酵母(毕赤酵母、假丝酵母、汉逊酵母等)。

在一个实施例中，本发明选取的表达宿主细胞为大肠杆菌。将实施例1中的重组质粒转化表达至宿主大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌，并将其接种至300mL的LB液体培养基(含50μg mL^-1卡那霉素)，在37℃，200rpm条件下培养至OD₆₀₀在0.6-0.8之间，加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)至终浓度为1mM，30℃诱导过夜。离心收集菌体后，将菌体按照1:10(v/v)的比例，用缓冲液A(20mM Tris-Hcl冲液，0.5M NaCl，20mM咪唑,pH 7.9)重悬浮，然后于冰水浴中超声破碎(200W，超声2s，间歇3s，120次)，再离心收集上清液即为粗酶液，粗酶液中含有重组蛋白TcDac，即N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶(TcDac)。

基于pET28-a(+)质粒中有编码His-Tag标签蛋白的序列，使用琼脂糖Ni-IDA亲和柱纯化重组蛋白TcDac(即在SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的N端连接了His-Tag标签序列(HHHHHH)的重组蛋白)。具体纯化步骤如下：

将粗酶液上样于Ni-IDA柱进行纯化。纯化的具体步骤为(流速为1mL min^-1)：先用缓冲液A(20mM Tris-Hcl冲液，0.5M NaCl，20mM咪唑，pH 7.9)洗脱至OD₂₈₀小于0.05，然后用缓冲液B(20mM Tris-Hcl冲液，0.5M NaCl，50mM咪唑，pH 7.9)洗脱至OD₂₈₀小于0.05，最后用缓冲液C(20mM Tris-Hcl冲液，0.5M NaCl，200mM咪唑，pH 7.9)洗脱。收集缓冲液C洗脱部分，得到纯化的重组N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶(TcDac)的溶液。

经SDS-PAGE检测蛋白纯度(图1)。结果显示重组蛋白经Ni-IDA亲和柱一步纯化可得电泳纯蛋白，分子量大小约为30kDa。

实施例3、N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶(TcDac)的毕赤酵母表达体系构建及高密度发酵获得重组蛋白

1、酵母表达体系构建

设计上游引物TcDac-EcoRI(5’-ATTCCGGAATTCATGTTTGAGGATGTGAACG-3’，下划线示EcoRI酶切位点)和下游引物TcDac-NotI(5’-ATAAGAATGCGGCCGC TTAAATCAGCTCCGCGAAG-3’，下划线示NotI酶切位点)，并以上述实施例1获得的DNA片段为模板，PCR扩增编码成熟蛋白的氨基酸序列。扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次；最后72℃后延伸5min。产物经过1％琼脂糖凝胶电泳回收，以EcoRI和NotI双酶切。将酶切后的产物同被相同酶切过的表达载体pPIC9K以T4 DNA连接酶进行连接，转化克隆宿主大肠杆菌DH5α。挑选菌落PCR验证为阳性的转化子测序。

毕赤酵母GS115(购自Invitrogen公司)感受态按照毕赤酵母使用说明(Invitrogen公司)所述方法制备。用限制性内切酶SalI线性化上述重组pPIC9K载体，并调整浓度到1ug/uL。取80uL酵母感受态细胞，与10uL线性化的质粒混匀，置于预冷的0.2cm的电击杯中(Bio-rad公司)，电击转化。电击后，迅速加入1.0mL预冷的1M山梨醇水溶液，涂布于营养缺陷筛选板上，培养3-4天，用无菌水收集菌体。将收集的菌体适当稀释后涂布不同浓度G418筛选板上，G418的浓度分别为1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL、8mg/mL，分别挑选不同G418浓度下生长良好的单菌落，进行摇瓶复筛。按照下述方法选择表达量高的菌株：

挑选毕赤酵母转化子单菌落，接种于25mL BMGY培养基，30℃，200rpm振荡培养至OD600 nm为12左右，离心收集菌体，转接到装有100mL改进的BMMY培养基的500mL三角瓶中，使OD600 nm达到8，相同培养条件培养，每24h补加甲醇至终浓度1％，诱导5d。筛选得到产酶量最高的毕赤酵母菌株，然后进行发酵罐高密度发酵验证。

2、重组N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶(TcDac)的高密度发酵

种子培养：将上述获得的重组毕赤酵母菌株接种到装有100mL BMGY培养基的500mL三角瓶中，在30℃、200转振荡培养24h以上，得到OD600 nm约为3.0的种子液。

基础培养：接种到5L发酵罐中(装有2L BMGY培养基，该培养基溶剂是水，溶质是如下终浓度的物质：质量百分浓度为1％的酵母提取物，质量百分浓度为2％的蛋白胨，100mmol/L pH 6.0磷酸缓冲液，质量百分浓度为1.34％的YNB，质量百分浓度为4×10^-5％生物素，和体积百分比1％的甘油)。过程中温度为30℃，用氨水和磷酸调节pH至5.0，通过调节转速和空气流量控制溶氧大于20％(相对值，本发明以发酵条件30℃，pH 5.0，转速700rpm确定为100％，以饱和亚硫酸钠溶液溶氧为0)。待甘油消耗完全(溶氧DO值迅速上升)，进入流加甘油阶段。

流加甘油阶段：甘油(50％W/V即500g/L甘油水溶液)流速为30mL/h/L起始发酵液，流加4h。待甘油消耗完全后，停止流加，进入甲醇流加阶段；其中该阶段温度为30℃、pH为5.0、溶氧大于20％。

甲醇流加阶段：温度为30℃，将pH调整到6.0，控制甲醇流速约为6mL/h/L起始发酵液，流加直至发酵结束，同时保持溶氧在20％以上(如不能使溶氧保持在20％以上，适当减小流加速度)。酶活在第7天达到最大，同时发酵液中的蛋白含量达到4.5mg/mL。

实施例4、重组N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶的酶学性质检测

重组N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶的活性检测采用HPLC法。具体步骤如下：反应条件：在1.5mL离心管中加入240μL的50mM pH 7.0磷酸盐缓冲液和30μL的200g L^-1N-乙酰氨基葡萄糖溶液，置于70℃水浴锅中预热2min，每个温度做三个平行，加入30μL的适当稀释的酶液，精确反应10min后，加入30μL的20％三氯乙酸(TCA)溶液，冰浴30min，加入10μL的20％NaCO₃溶液，10000rpm离心1min，除去沉淀蛋白。反应液经0.22μm的滤膜过滤后，采用高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)检测反应液中生成的氨基葡萄糖含量。酶活力单位(1U)定义为：在上述反应条件下，每分钟生成1μmol的氨基葡萄糖所需的酶量。

氨基葡萄糖含量测定的高效液相色谱法条件：采用蒸发光散射检测器，检测器温度为40℃，柱温30℃；色谱柱型号为Shodex NH₂P-50 4E(4.6×250mm)；流动相A相为水相，B相为乙腈；洗脱条件为0～15min 75％B，15～30min 75％-50％B，30～35min 50％-75％B，35～40min 75％B；流速：1.0mL/min；进样量为10μL。采用N-乙酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖作为标准品定量反应底物及产物。

重组N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶最适反应温度检测：

在1.5mL离心管中加入240μL的50mM pH 7.0磷酸盐缓冲液和30μL的200g L^-1N-乙酰氨基葡萄糖溶液，置于不同温度(30-95℃)的水浴锅中预热2min，每个温度做三个平行，加入30μL适当稀释的酶液，精确反应10min后，加入30μL的20％三氯乙酸(TCA)溶液，冰浴30min，加入10μL的20％NaCO₃溶液，10000rpm离心1min，除去沉淀蛋白。反应液经0.22μm的滤膜过滤后，采用高效液相色谱法检测反应液中生成的氨基葡萄糖含量，反应条件同上。

实验结果显示，大肠杆菌表达的重组N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶(TcDac)的最适反应温度为70℃，在pH7.0，70℃的反应条件下比活力为372U/mg。

实施例5、重组N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶(TcDac)在酶法制备氨基葡萄糖中的应用

重组N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶(TcDac)水解N-乙酰氨基葡萄糖反应条件：pH7.0，60℃，底物浓度5％，加酶量0.5mg/L，水解时间6h。水解液体积5L，搅拌转速80-120rpm/min。每隔30min取样，样品冰浴终止反应后，待进一步分析检测。

薄层层析法(thin layer chromatography，TLC)监测水解产物

采用Kieselgel 60硅胶板(Merck)分析水解产物，展层液为异丙醇：氨水：水(15:7.5:1，v/v/v)。样品点样1μL于硅胶板点样点，将硅胶板用展层剂展开，吹干后在其表面均匀用显色剂大茴香醛：乙醇：浓硫酸：乙酸(5:90:5:1,v/v/v/v)溶液浸湿，然后在130℃烘箱中烘烤5min显色。

实验结果显示，TcDac能够催化N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰反应生成氨基葡萄糖，经过6小时的水解，底物中的N-乙酰氨基葡萄糖几乎被完全脱乙酰为氨基葡萄糖(图2)。

在制备氨基葡萄糖的另一个实施例中，重组N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶(TcDac)水解N-乙酰氨基葡萄糖反应条件：pH 7.0，50℃，底物浓度7-10％，加酶量0.5mg/L，水解时间8h。水解液体积5L，搅拌转速80-120rpm/min。

氨基葡萄糖转化率测定采用高效液相色谱法：采用蒸发光散射检测器，检测器温度为40℃，柱温30℃；色谱柱型号为Shodex NH₂P-50 4E(4.6×250mm)；流动相A相为水相，B相为乙腈；洗脱条件为0～15min 75％B，15～30min 75％-50％B，30～35min 50％-75％B，35～40min 75％B；流速：1.0mL/min；进样量为10μL。采用N-乙酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖作为标准品定量反应底物及产物。

实验结果显示在上述反应条件下N-乙酰氨基葡萄糖转化生成氨基葡萄糖的转化率达到82.5％。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华东理工大学

<120> 一种耐热N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶及其编码基因与应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 798

<212> DNA

<213> Thermococcus celericrescens

<400> 1

atgtttgagg atgtgaacga ttttgaggat gccctggaaa agctcctcaa agagcttgaa 60

ttcgacctct cgaatccatt tgaggaagtc gaaaaggttc tgtgcatcga accccacccg 120

gacgactgcg tcataggcct ggggggcacg ataaagaagc tgacggatgc gggcgtggag 180

gtcgtttacg tctgcatgac cgacggctca atgggaactc ttgacgacga cctgagctcc 240

cacgagcttg ccatcgtgag aaagcgcgag gaggaagaga gtgcgaggat gctcggcgtc 300

aaaaggataa tctggcttga ctaccgggac accgagcttc cctacacgag ggaggccaga 360

aaagacttag taaagataat ccgcgccgag aagccggacg cggttctcgc ccccgacccc 420

tggctcccct acgaggcaca tccggaccac agaagggcgg gcttcctggc cctcgacgcc 480

gtggccttct ctcagcttcc caacttcgca agcaccgacg tggcggccgg cctggaaccc 540

caccaggtcg aggtcttcgg cttctactac acggcgaagc ccaactactt cgtggacata 600

accgacgtca tggagctcaa gctgagggcg atacgggccc acagaagcca gttcaccgat 660

gacgtttggg agaaatggga gcccttcctg agaacggtgg cactctacta cggtaaaaaa 720

gcgggagtga agtacgccga ggggctgcgc ttcatgccgg gcatgttcct gcacataacg 780

cccttcgcgg agctgatt 798

<210> 2

<211> 266

<212> PRT

<213> Thermococcus celericrescens

<400> 2

Met Phe Glu Asp Val Asn Asp Phe Glu Asp Ala Leu Glu Lys Leu Leu

1 5 10 15

Lys Glu Leu Glu Phe Asp Leu Ser Asn Pro Phe Glu Glu Val Glu Lys

20 25 30

Val Leu Cys Ile Glu Pro His Pro Asp Asp Cys Val Ile Gly Leu Gly

35 40 45

Gly Thr Ile Lys Lys Leu Thr Asp Ala Gly Val Glu Val Val Tyr Val

50 55 60

Cys Met Thr Asp Gly Ser Met Gly Thr Leu Asp Asp Asp Leu Ser Ser

65 70 75 80

His Glu Leu Ala Ile Val Arg Lys Arg Glu Glu Glu Glu Ser Ala Arg

85 90 95

Met Leu Gly Val Lys Arg Ile Ile Trp Leu Asp Tyr Arg Asp Thr Glu

100 105 110

Leu Pro Tyr Thr Arg Glu Ala Arg Lys Asp Leu Val Lys Ile Ile Arg

115 120 125

Ala Glu Lys Pro Asp Ala Val Leu Ala Pro Asp Pro Trp Leu Pro Tyr

130 135 140

Glu Ala His Pro Asp His Arg Arg Ala Gly Phe Leu Ala Leu Asp Ala

145 150 155 160

Val Ala Phe Ser Gln Leu Pro Asn Phe Ala Ser Thr Asp Val Ala Ala

165 170 175

Gly Leu Glu Pro His Gln Val Glu Val Phe Gly Phe Tyr Tyr Thr Ala

180 185 190

Lys Pro Asn Tyr Phe Val Asp Ile Thr Asp Val Met Glu Leu Lys Leu

195 200 205

Arg Ala Ile Arg Ala His Arg Ser Gln Phe Thr Asp Asp Val Trp Glu

210 215 220

Lys Trp Glu Pro Phe Leu Arg Thr Val Ala Leu Tyr Tyr Gly Lys Lys

225 230 235 240

Ala Gly Val Lys Tyr Ala Glu Gly Leu Arg Phe Met Pro Gly Met Phe

245 250 255

Leu His Ile Thr Pro Phe Ala Glu Leu Ile

260 265

Claims

1.一种蛋白质，其特征在于，是如下a)或b)或c)的蛋白质：

a)如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列编码的蛋白质；

2.根据权利要求1所述一种蛋白质，其特征在于，如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列中第1-266位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质，是指：

与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％相似性，且具有脱乙酰酶活性的蛋白质。

3.与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料，其特征在于，为下述B1)-B5)中的任一种：

B1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

4.根据权利要求3所述生物材料，其特征在于，B1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子：

1)核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的DNA分子；

2)与1)限定的DNA序列至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％相似性的DNA分子；

4)利用密码子优化后获得的编码权利要求1所述蛋白质氨基酸序列的DNA分子。

5.权利要求1所述蛋白质作为脱乙酰酶的应用。

6.权利要求1所述蛋白质作为N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶的应用。

7.一种N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)在有益于产生如权利要求1所述蛋白质的条件下培养权利要求3中所述重组菌的宿主细胞；

2)回收蛋白，即为N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶。

8.一种生产氨基葡萄糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：用权利要求1所述的蛋白质水解N-乙酰氨基葡萄糖，得到氨基葡萄糖。