JP5709222B2 - セルラーゼ酵素及びその製法 - Google Patents
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Description
本発明は、要約すると、以下の特徴を含む。
本発明は、第1の態様において、配列番号79に示される塩基配列又は該塩基配列と90%以上の同一性を有する塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を含むセルラーゼ酵素又はその処理物を提供する。
本発明の別の実施形態によれば、上記セルラーゼ酵素は、エンドグルカナーゼである。
本発明は、第2の態様において、上記定義のセルラーゼ酵素をコードするDNAを提供する。
本発明は、第3の態様において、上記定義の1つ又は複数のDNAを含むベクターを提供する。
本発明の実施形態によれば、上記ベクターは、上記DNAの発現を制御するプロモーターをさらに含む。
本発明の実施形態によれば、上記形質転換細胞は、麹菌である。
本発明の別の実施形態によれば、上記麹菌はアスペルギルス・オリゼである。
本明細書中で使用する、本発明に関わる用語は、以下の意味を包含する。
本明細書中で使用する「腸内共生原生生物」なる用語は、ヤマトシロアリ、オオシロアリ、コウシュンシロアリ、ムカシシロアリ又はキゴキブリの腸管内に共生する原生動物を指す。
本発明のセルラーゼの供給源として使用された昆虫は、下等シロアリであるヤマトシロアリ、オオシロアリ、コウシュンシロアリ及びムカシシロアリ、並びにそれらの祖先にあたるキゴキブリである。これらの昆虫は、腐朽した倒木、枯れ枝などの木質を食べるが、共生する原生生物群がもつセルラーゼ分解活性のために木質は糖化され栄養源となる。原生生物群がもつ加水分解酵素の大部分が糖質加水分解酵素(glycosyl hydrolase)であるために、該生物群から得られる酵素は木質バイオマスの糖化に有用であることが大いに期待できる。
先ず、上記の各昆虫の腸管を取り出し、破砕し、100×g程度の低速遠心で原生生物画分を得る。得られた画分から全RNAを定法に従い単離し、オリゴdT結合カラムを用いてmRNAを得、ついでmRNAから、オリゴdTプライマー及び逆転写酵素を用いてRNA−DNAハイブリッド分子を合成したのち、RNaseによりRNA鎖にニックを導入し、DNAポリメラーゼによりニックを開始点としてDNA合成を行い、RNA断片をDNA断片に置き換え、DNAリガーゼでニックを塞いで二本鎖cDNAを合成する。このようにして得られたcDNA分子はついで、ターミナルトランスフェラーゼで末端伸長するか、或いはcDNA分子の末端に制限酵素部位を結合したのち、プラスミド、ファージなどのベクターに挿入し、大腸菌などの細菌に形質転換によりベクターを導入して増幅し、これによってcDNAライブラリーを得る。
エンドグルカナーゼ(EC 3.2.1.4)は、セルロース等のβ−1,4-グルコシド結合をエンド型で、すなわち分子内部から切断する加水分解酵素である。
配列番号1〜140のうち、CBH活性をコードする配列は、配列番号44〜77であり、その他の配列は、EG活性をコードしている。
上記1に記載の方法でクローニングされかつ配列決定された、配列番号1〜140によって表わされる塩基配列を含むセルラーゼ酵素をコードするDNA、或いは該塩基配列の各々と80%以上、又は85%以上、好ましくは90%以上の配列同一性を有する塩基配列を含むセルラーゼ酵素をコードするDNAは、発現用ベクターに挿入し、これを用いて、コンピテント細胞に形質転換又はトランスフェクションすることによって、形質転換細胞を得ることができる。
本発明のセルラーゼをコードするDNAを発現可能にしたベクターで形質転換された宿主細胞は、適当な培養培地中で培養され、該DNAを発現しセルラーゼを産生することができる。
麹菌を宿主とする培養では、例えば、500mlのエルレンマイヤーフラスコに100mlのマルトースまたはデキストリンの入った栄養培地を加え、ここへ構築した麹菌株を植菌する。これを30℃で4日間培養することによって発現タンパク質を誘導し培地中に放出させることができる。
エンドグルカナーゼについては、以下の方法で測定を行うことができる。タンパク標品10μlに1%カルボキシメチルセルロース(0.1M酢酸NaバッファpH6.0に溶解)250μlを加え、室温で1時間反応を行なう。生成した還元糖を測定するために、反応液260μl中100μlにテトラゾリウムブルー試薬1mlを加え、沸騰水中で10分反応させた後、冷却して分光光度計(O.D.660)で吸光値を測定する(Jue,C.K. and Lipke,P.N. "Determination of reducing sugars in the nanomole range with tetrazolium blue", J Biochem Biophys Methods, 11, 109−115(1985))。
<実施例1>mRNAの単離
ヤマトシロアリ・オオシロアリ・コウシュンシロアリ・ムカシシロアリ・キゴキブリ腸管を摘出し、それぞれSolution U(Trager 1934,Biological Bulletin,Vol66:182−190)中で破砕し、100ミクロンナイロンメッシュで濾過した。得られた懸濁液を100×g、3分間ゆるやかに遠心することによって原生生物画分を得た。更にSolution Uで3回洗浄し、RNA抽出のための原生生物画分を得た。mRNAの単離はOligo−dT30<SuperTM>(日本ロシュ)を用いて指示書通りに行い、各宿主シロアリ由来の原生生物群よりmRNAを得た。
各シロアリ共生原生生物群より調製したmRNAを2〜3μg用いて、cDNAライブラリーの構築を行った。ライブラリー構築はヤマトシロアリに関してはPieroらの方法によって行い(Carninci,P & Hayashizaki,Y 1999,Methods Enzymol 303:19−44)、その他のシロアリ由来のものに関しては菅野らの方法によって行った(Maruyama,K.and S.Sugano 1994,Gene138(1−2):171−174)。ヤマトシロアリのcDNAライブラリーに関してはSOLR株大腸菌とExAssistヘルパーファージ(Novagen)を用いて指示書通りにプラスミドへのサブクローニングを行った。
得られた大腸菌クローンはLB培地中で培養し、マルチスクリーンFB(日本ミリポア)を用いて指示書通りに精製した。精製したプラスミドDNAを用いて、ヤマトシロアリ、オオシロアリ、コウシュンシロアリ、ムカシシロアリ、キゴキブリそれぞれの共生原生生物群由来のライブラリークローンをそれぞれ917、920、1056、1023、921クローンずつ、Big dye terminator cycle sequencing kitv3.1および自動シーケンサABI3700、3100または3130(Applied Biosystems)を用いて定法通りに配列決定した。配列決定にはM4プライマー(配列番号141:5’−GTT TTC CCA GTC ACG AC−3’)を用いて、5’末端のsingle pass sequenceを決定した。得られた配列はFASTXにより公共データベースに蓄積されている既知配列に対するホモロジー解析を行い(DNA database Japan)、アノテーションを行った。得られたアノテーションの中からセルラーゼに相当するものを選択した。
得られたセルラーゼ遺伝子ホモログのうち、糖質加水分解酵素ファミリー7のエンドグルカナーゼに相当するものを選択し、部分配列の系統解析によって共通祖先を共有すると考えられる配列(相同性=アミノ酸配列で80%程度以上)について、GHF5については全43クローン(配列番号1〜43)、GHF7CBHについては全34クローン(配列番号44〜77)、GHF7EGについては全38クローン(配列番号78〜115)、GHF45については全25クローン(配列番号116〜140)の全長配列を決定した。
セルラーゼ遺伝子を含むプラスミドから、N末端シグナル配列をコードする領域を除いた部分をPCRにより増幅し、α-アミラーゼプロモーターおよび構造遺伝子の下流にin−frameになるように連結した。その際、連結部分には融合タンパク質切断のためのKRGGG配列を挿入した。作製したプラスミドを麹菌プロテアーゼ二重破壊株NS−tApE(niaD− sC− ΔtppA ΔpepE)(根本 崇、渡辺 泰祐、丸山 潤一、有岡 学、北本 勝ひこ、「麹菌のプロテアーゼ遺伝子2重破壊株によるキモシンの生産」日本生物工学会講演要旨集(日本)、p131、(2006))に形質転換し、セルラーゼ生産株を取得した。得られた麹菌の培養上清を硫安沈殿法(80%飽和硫安)により濃縮後、HiTrapDesaltingおよびHiTrapDEAE(GE health care)を指示書に従って用いて精製した。HiTrapDEAEによる精製には50mM Tris−HCl(pH8.0)バッファを用い、NaClによって0mMから500mMまでのグラジエントをかけることによってタンパク質の分離を試みたところ、130mM付近のフラクションにSDS−PAGE上で分子量約45kDaの単一バンドとして観測されるセルラーゼ活性のある精製タンパクを得た(図2)。エドマン分解法によるアミノ末端配列の解析の結果、精製された酵素は麹菌に導入した発現プラスミドに由来することが確かめられた。
実施例5とは異なるセルラーゼ遺伝子を含むプラスミドから、N末端シグナル配列をコードする領域を除いた部分をPCRにより増幅し、α-アミラーゼプロモーターおよび構造遺伝子の下流にin−frameになるように連結した。その際、連結部分には融合タンパク質切断のためのKRGGG配列を挿入した。作製したプラスミドを麹菌プロテアーゼ二重破壊株NS−tApE(niaD− sC− ΔtppA ΔpepE)(根本 崇、渡辺 泰祐、丸山 潤一、有岡 学、北本 勝ひこ、「麹菌のプロテアーゼ遺伝子2重破壊株によるキモシンの生産」日本生物工学会講演要旨集(日本)、p131、(2006))に形質転換し、セルラーゼ生産株を取得した。得られた麹菌の培養上清を硫安沈殿法(80%飽和硫安)により濃縮後、HiTrapDesaltingおよびHiTrap Phenyl sepharose FF(GE health care)を指示書に従って用いて精製した。HiTrapPhenyl sepharose FFによる精製には50mM 酢酸ナトリウム(pH6.0)バッファを用い、硫安によって1.7Mから0Mまでのグラジエント(濃度勾配)をかけることによってタンパク質の分離を試みたところ、0.35M付近の画分に顕著なセルラーゼ活性のあるタンパク質画分を得た(図6)。このタンパク質についてセロオリゴ糖を37℃、2時間加水分解したとき、最終生産物としてグルコースとセロビオースを主要な反応生成物として生成し、セロビオースをさらに分解する活性はほとんどなかった(図7)。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
Claims (9)
- 配列番号79に示される塩基配列又は該塩基配列と90%以上の同一性を有する塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を含むセルラーゼ酵素又はその処理物であって、該処理物が、酵素の抽出物、凍結乾燥物、部分もしくは完全精製物、もしくは固定化物である、前記酵素又はその処理物。
- セルラーゼ酵素がエンドグルカナーゼである、請求項1に記載の酵素又はその処理物。
- 請求項1に記載のセルラーゼ酵素をコードするDNA。
- 請求項3に記載のDNAを含むベクター。
- DNAの発現を制御するプロモーターをさらに含む、請求項4に記載のベクター。
- 請求項4又は5に記載のベクターを含む形質転換細胞。
- 麹菌である、請求項6に記載の形質転換細胞。
- 麹菌がアスペルギルス・オリゼである、請求項7に記載の形質転換細胞。
- 請求項6〜8のいずれか1項に記載の形質転換細胞を培地にて培養し、該細胞又は該培地から請求項1に記載のセルラーゼ酵素蛋白質を単一又は混合物形態で回収することを含む、セルラーゼ酵素の製造方法。
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