KR20150005750A

KR20150005750A - 피마자 유래의 ＲｃＬＰＡＴ２９９ 유전자 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20150005750A
Application number: KR20130078274A
Authority: KR
Inventors: 김현욱; 이경렬; 김은하; 김종범; 노경희
Original assignee: 대한민국(농촌진흥청장)
Priority date: 2013-07-04
Filing date: 2013-07-04
Publication date: 2015-01-15

Abstract

본 발명은 피마자(Ricinus communis L.)로부터 분리된 RcLPAT299 유전자 및 이를 이용한 형질전환한 식물체의 리시놀레인 지방산 생산 증진에 관한 것으로, 상기 RcLPAT299 유전자로 형질전환한 형질전환 식물체의 종자에서 리시놀레인 지방산의 함량이 향상되었으므로 상기 유전자를 이용하여 다양한 식물체에서 리시놀레인 지방산의 생산을 증가시키는데 유용하게 이용할 수 있다.

Description

피마자 유래의 ＲｃＬＰＡＴ２９９ 유전자 및 이의 용도{A RcLPAT299 genes derived from Ricinus communis L. and their uses in ricinoleic fatty acid}

본 발명은 피마자로부터 분리한 RcLPAT299 유전자 및 이를 형질전환한 식물체의 리시놀레인 지방산 생산에서의 이의 용도에 관한 것이다.

식물유의 주성분은 탄소사슬 16개 또는 18개의 지방산이고, 팔미트산(palmitic acid), 스테아르산(stearic acid), 올레인산(oleic acid), 리놀레산(linoleic acid) 및 리놀렌산(linolenic acid)의 혼합물로서, 튀김이나 샐러드에 넣는 식용으로는 적합하지만, 산업용으로는 적합하지 않은 단점이 있다. 현재 전 세계 식물유의 80%는 식용으로, 나머지 20%는 산업용으로 소비되고 있으며,앞으로 식물유가 산업용으로 경제성을 갖추기 위해서는 물질이 적합하고, 가공성 좋아야 한다. 예를 들어, 윤활유로 쓰이려면 산화가 잘되지 않아야 하고, 점도가 높아야 하며, 페인트나 도료의 경우 쉽게 산화되어야 한다.

한편, 비경작 식물 종의 종자에는 수백 개의 다른 지방산이 함유되어 있는데, 이들 지방산을 일반적 식물유의 주요 구성성분인 5종류의 지방산과 구별하여 특이지방산(unusual fatty acid)이라 부른다. 이러한 특이 지방산은 산업적 이용에 적합한 적당한 탄소사슬개수, 적절한 불포화도 및 탄소에 다양한 활성을 갖는 기능기 (예: 하이드록시기(-OH), 에폭시기)에 의해 특정한 물성이 있는데, 특히 피마자의 델타 12 리시놀레인 지방산(리시놀레인산; ricinoleic acid)은 종자 지방산의 90%를 차지하며, 이를 가공하여 고품질의 윤활유, 나일론, 화장품을 포함한 넓은 범위의 상업 및 공업제품에 이용되고 있다.

아주까리(Ricinus communis L.)는 1년생 초본으로 원산지는 에티오피아를 중심으로 아프리카 중동부 지역이며, 아라비아반도, 인도 및 중국은 지역 분화종의 중심으로 알려져 있으며(Weiss, 2000; Moshkin, 1977), 이집트에서는 6000년전 부터 유지작물로서 재배되고 있다(Hatice & Michael, 2010). 전 세계 중에서 인도가 70%의 재배, 생산 및 수출을 하고 있으며, 그 뒤를 이어 중국과 브라질이 차지하고 있다(FAOSTAT, 2008). 아주까리는 독성인 2S albumin allergen 및 ricinine 등을 함유하고 있어 사료나 식량으로는 이용되지 않고 있으나(Yoon,1980), 폴리머, 윤활유, 화장품, 플라스틱, 포마드, 인쇄잉크, 인주재료 등으로 폭넓게 이용되고 있다(Brigham, 1993; Bonjean,1991). 국내에서는 한방과 민간의 의약재료로서 잎, 종자, 근부를 지혈, 통변, 부종, 타박상, 설사약 등으로 사용하고 있다(김,1992).

아주까리에 대한 연구는 국내에서는 최근에 Kim et al.(2008)이 아주까리 수집종의 조지방 및 지방산 분석에서 평균 지방 함량은 44.6 ~ 49.4%이었으며, 최저 41.4%에서 최고 52.2%의 범위라고 하였다. 또한 지방산조성의 평균 함량은 파밀트산(palmtic acid)(16:0)와 스테아르산(stearic acid)(18:0)가 1% 내외이었고, ㅇ오올레산(oleic acid)(18:1) 가 4.6%, 리놀레닉산(linoleic acid)(18:2)가 5.2%, 리놀레닉 산(linoleic acid)(18:3)가 0.6% 및 리시놀레산(ricinoleic acid)(18:1-OH)가 87.3%로 리시놀레산은 아주까리의 지방산 조성에 대부분을 차지한다고 보고하였다. 그 외에 아주까리 단백질 식품화 연구(Yoon, 1980) 및 잎을 이용한 벼멸구 식물성 농약 개발(Kwon et al., 1992; Kwon et al., 1991) 등 연구결과가 보고되어 왔다. 국외에서는 최근에 아주까리를 바이오디젤 작물로서의 활용을 위한 연구가 진행되고 있으며(Wang et al., 2008; Comar et al., 2004), 아주까리의 유전자원에 대한 생육특성 및 유전적다양성의 평가도 이루어지고 있다(Gerard et al., 2008; Wang et al., 2007; Baldanzi et al., 1998; Bhardwaj et al., 1996). Rojas-Barros et al.(2005;2004)은 일반적인 아주까리 종실의 지방산 조성에 비하여 올레산 함량이 약 78%로 매우 높고, 리시놀레산 함량이 10.1~18.8%로 매우 낮은 아주까리의 돌연변이체인 OLE-1를 발굴하여 고올레/저리시놀레산 품종개발을 위한 육종소재로 이용하고 있다. 그 외에 리시놀레산의 생합성(Jameset al., 1965), 아주까리에 있어서 톡신(toxin) 단백질 리신(Ricin)에 관련된 연구(Masaru, 1979; Kreuzer, 2010), 아주까리의 지방과 지방산 합성(Da silva ramos et al., 1984)의 연구결과가 보고되어 왔다.

그러나 피마자같이 특이지방산을 생산하는 비경작 식물은 수확량이 작고, 개화가 불균일하며, 게다가 종자에 리신(ricin)이라는 독소가 있어 산업적으로 경작하기 어려운 단점을 가지고 있어서, 비경작 식물에서 특이지방산 생합성 핵산분자를 분리하여 작물에 도입하려는 생명공학적 연구 및 기법이 집중되고 있는 실정이나, 형진전환 식물에서는 특이 지방산의 생성 효율이 매우 낮다.

이에, 본 발명자들은 피마자로부터 리시놀레인 지방산을 증대시키는 유전자를 탐색하였으며, 피마자 모든 조식에서 특이적으로 발현되는 피마자 RcLPAT299 유전자를 분리하였으며, RcLPAT299 유전자의 발현을 통하여 리시놀레인 지방산 함량 증가 효과를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 리시놀레인 지방산(ricinoleic fatty acid) 생산에 이용되는 RcLPAT299(Castor bean lysophosphatidyl acyltransferase 299) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환 식물체를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공하는 것이다.

아울러, 본 발명의 또 다른 목적은 리시놀레인 지방산 생산 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 리시놀레인 지방산(ricinoleic fatty acid) 생산에 이용되는 RcLPAT299(Castor bean lysophosphatidyl acyltransferase 299) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환 식물체를 제공한다.

또한, 본 발명은

(1) 제 1항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계;

(2) 상기 벡터를 아그로박테리움을 이용하여 식물체에 형질전환하는 단계; 및

(3) 바스타 제초제를 살포하여 형질전환체를 선별하는 단계를 포함하는 형질전환 식물체 제조 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은

(1) 제 8항의 형질전환 식물체로부터 T1 종자를 수득하는 단계;

(2) 상기 단계 (1)의 T1 종자 중에 리시놀레인 지방산의 함량이 증가한 계통을 선발하는 단계;

(3) 상기 단계 (3)에서 선발한 계통을 T2 세대로 전개하는 단계;

(4) 상기 단계 (3)의 T2 종자 중에 리시놀레인 지방산의 함량이 증가한 계통을 선발하는 단계; 및

(5) 상기 단계 (4)의 T3 세대의 종자로부터 리시놀레인 지방산을 수득하는 단계를 포함하는 리시놀레인 지방산 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 피마자에서 분리한 RcLPAT299 유전자가 포함된 벡터로 형질전환된 식물체에서 하이드록시 지방산인 리시놀레인 지방산의 함량이 향상되었으므로 상기 유전자를 이용하여 다양한 식물체에서 리시놀레인 지방산의 생산을 증가시키는데 유용하게 이용할 수 있다.

도 1은 분리된 피마자 RcLPAT299 유전자가 코딩하는 단백질의 아미노산 서열과 기존에 LPAT 기능이 있는 것으로 밝혀진 애기장대 AtLPAT2 단백질간의 아미노산 서열 비교한 결과를 나타낸 도이다;
RcLPAT299는 애기장대 AtLPAT2와 20.9%의 낮은 상동성을 보이고, 상동성 부분은 회색으로 표시되어 있다.
도 2는 피마자 ACTIN2 (RcACT2) 유전자의 발현을 대조구로 하여, 피마자 RcLPAT299 유전자의 피마자 조직별 발현 RT-PCR 분석을 나타낸 도이다;
L(잎), St(줄기), UF(꽃전체), FF(암꽃), MF(수꽃), S(종자), Sd(유묘) 및 R(뿌리) 조직별 발현을 나타낸다.
도 3a는 RcLPAT299 유전자 및 GUS 유전자를 함유한 대장균 형질전환용 재조합 벡터를 나타내는 모식도이다;
T7P는 T7 프로모터, 6His가 RcLPAT299와 GUS의 N-terminal에 결합됨, T7T는 T7 터미네이터, Amp^R는 앰피실린 저항성 유전자.
도 3b는 pDEST-RcLPAT299와 pDEST-GUS가 벡터가 형질전환된 LPAT 돌연변이 JC201 대장균의 생장을 비교 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3c는 JC201 대장균에서 RcLPAT299 단백질을 검출한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 피마자 Phaseolin-RcLPAT299 종자 특이적 발현 식물벡터 구조에 나타낸 도이다;
LB:좌측 경계(left border), RB:우측 경계(right border), bar: 제초제 포스피토트리신(phosphinothricin) 저항성 유전자, T35S: CaMV 35 유전자의 터미네이터(terminator) 및 SpR: 스펙티노마이신(spectinomycin) 저항성 유전자.
도 5는 CL37 애기장대 종자와 CL37에 RcLPA299 유전자가 형질전환된 T3 종자 내의 지방산 퍼센트을 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 리시놀레인 지방산(ricinoleic fatty acid) 생산에 이용되는 RcLPAT299(Castor bean lysophosphatidyl acyltransferase 299) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

상기 유전자는 피마자(Ricinus communis L.)로부터 분리된 것이 바람직하나. 이에 한정되지 않는다.

상기 유전자는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 암호화하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

상기 리시놀레인 지방산은 상기 리시놀레인 지방산은 탄소의 9번째 위치에 이중결합과 12번째 위치에 하이드록시(OH)기를 함유한 12-하이드록시-9-옥테노산(12-hydroxy-9-octenoic acid)인 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.

상기 재조합 벡터는 리시놀레인 지방산 증진용인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 재조합 벡터는 제초제 저항성 Bar 유전자가 포함되고 RcLPAT299 유전자가 종자 특이 Phaseoline 프로모터 아래 위치하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 RcLPAT299 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터는 바람직하게는 도 4에 기재된 Phaseoline-RcLPAT299 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "발현 벡터"는 흔히 "재조합 벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "재조합 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 재조합 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예: λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신, 테트라사이클린 및 바스타(BASTA) 제초제에 대한 내성 유전자가 있다.

본 발명에서는 바스타(BASTA)에 저항성을 갖는 피마자 유래의 RcLPAT299 유전자가 형질전환된 식물체를 선발하였다.

상기 식물체는 RcLPAT299 유전자 발현에 의해 종자 내의 리시놀레인 지방산 함량이 증가한 것이 바람직하며, T1 종자가 더욱 바람직하고, T2 종자가 보다 바람직하며, T3 종자가 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 식물체는 애기장대 또는 유지식물(vegetable oil plant)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 유지식물은 씨나 열매에서 기름을 얻는 식물이 바람직하며, 참깨, 유채, 해바라기, 아주까지, 땅콩, 콩, 코코야자, 기름야자 및 호호바로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

본 발명에 따른 상기 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 대두, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수로 이루어진 군에서 선택된 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근으로 이루어진 군에서 선택된 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채로 이루어진 군에서 선택된 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나로 이루어진 군에서 선택된 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립으로 이루어진 군에서 선택된 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스로 이루어진 군에서 선택된 사료작물류일 수 있다.

또한, 본 발명은

아울러, 본 발명은 (1) 제 8항의 형질전환 식물체로부터 T1 종자를 수득하는 단계;

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 LPAT (Lysophosphatidyl acyltransferase)기능을 하는 RcLPAT299 유전자를 피마자에서 분리하였고, 피마자의 RcLPAT299를 종자 특이 유전자인 Phaseolin의 프로모터와 결합 후 종자에서 리시놀레인 지방산을 최대 13.4% 생산하는 CL37 애기장대 식물체에 형질전환시켜 리시놀레인 지방산을 최대 18.2%까지 증진시켰으며, 특히 하이드록시 지방산 중 리시놀레인 지방산 (18:1-OH)을 특이적으로 생산 증진시켰다. 이는 FAH12 유전자만을 단독으로 사용했을 때의 기존의 한계수준의 리시놀레인 지방산 생산량에서 35.8% 더욱 증진된 것을 확인하였다(표 2, 도 4 및 도 5 참조).

따라서 본 발명의 피마자 유래의 RcLPAT299 유전자가 포함된 벡터로 형질전환된 식물체가 세대증진을 하면서 종자에서 리시놀레인 지방산의 함량이 유의적으로 향상되었으므로, 상기 유전자를 이용하여 다양한 식물체에서 리시놀레인 지방산의 생산을 증가시키는데 유용하게 이용할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 1> 피마자에서 LPAT299 유전자 분리

본 발명자들은, 피마자(Ricinus communis L.)로부터 분리한 RNA로부터 상보적인 DNA를 합성한 후 RcLPAT299 유전자에 특이적인 프라이머 염기서열을 이용하여 LPAT299 유전자를 분리하였다.

구체적으로, 피마자의 잎과 종자로부터 분리한 RNA로부터 PrimeScript^TM 1st strand cDNA Synthesis Kit (TakaRa, Japan)를 사용하여 잎과 종자에서 발현되는 모든 RNA에 대한 상보적 DNA를 합성한 후 RcLPAT299 유전자에 특이적인 프라이머를 하기 표 1에서와 같이 제작하여 이를 이용하여 KOD+ polymerase (Toyobo, Japan)를 사용하여 PCR (polymerase chain reaction)을 수행하여 RcLPAT299 cDNA를 합성하였다. 합성한 RcLPAT299 cDNA를 pENTR/D-Topo (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)벡터에 클로닝하여 pENTR-LPAT299 벡터를 제작하였다. 클로닝한 RcLPAT299의 핵산 염기서열을 결정하였다.

그 결과, RcLPAT299 cDNA 유전자의 핵산 염기서열은 총 900 bp로 구성되어 있었으며(서열번호 1), 299개의 아미노산으로 구성된 34 kDa 분자량의 단백질 정보로 구성되었다(서열번호 2). RcLPAT299 유전자가 코딩하는 단백질과 LPAT (Lysophosphatidyl acyltransferase) 기능이 확인된 애기장대 LPAT2 (Kim et al., Plant Cell 17: 1073-1089, 2005)와 단백질 서열간 상동성 분석을 한 결과 20.9%의 매우 낮은 상동성을 보여 LPAT 효소 기능이 있는지 단백질 서열만으론 추론할 수 없었다(도 1). 분리한 RcLPAT299 유전자를 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 BlastP에 의한 단백질 상동성 결과 NCBI에 등록되어 있는 XP_002522947의 단백질 서열과 동일하였다. 이 단백질은 1-acyl-sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase로 추정되었으나 그 기능은 전혀 보고되지 않았다.

서열번호	서열 명칭	서열 (5'->3')
3	RcLPAT299 정방향 프라이머	5'-CACCATGGAAAGCACTGGAGGT-3'
4	RcLPAT299 역방향 프라이머	5'-CTAACTTAGAGGCCTTTGAGACTCTGGA-3'

< 실시예 2> 피마자에서 분리한 Rc LPAT299 유전자 발현 분석

본 발명자들은, 피마자에서 분리한 RcLPAT299 유전자를 피마자에서의 조직별 발현 분석을 RT-PCR (Reverse transcriptase-polymerase chain reaction) 방법으로 수행하였다.

구체적으로, 피마자의 잎, 줄기, 꽃, 암꽃, 수꽃, 종자, 유묘, 뿌리의 RNA를 분리한 후 RcLPAT299 유전자 특이 프라이머를 제작하여 RT-PCR에 사용하여 조직별 발현 양상을 분석하였으며, 프라이머 서열을 상기 표 1에 나타내었다.

그 결과, RcLPAT299 유전자는 모든 조직에서 발현되었다. 또한, 발현 정도도 뿌리를 제외하고는 매우 강하게 발현되었다(도 2). 정확한 발현 분석 증명을 위해 피마자 모든 조직에서 발현되는 액틴 유전자 RcACT2 유전자 발현 분석을 대조구로 사용하였다.

< 실시예 3> 피마자에서 분리한 LPAT299 유전자 효소기능 분석

<3-1> RcLPAT299 유전자 발현 벡터제조

본 발명자들은, 피마자에서 분리한 LPAT299가 LPAT 효소기능을 하는지 검정하기 위하여 피마자 RcLPAT299 유전자 발현 벡터제조를 제조하였다.

구체적으로, 피마자 RcLPAT299 유전자가 대장균에서 발현될 수 있게 T7 프로모터가 포함된 대장균 발현 벡터 pDEST17 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 RcLPAT299를 클로닝 하여 pDEST-RcLPAT299를 제작하였다(도 3a). 또한, 대장균 발현 실험의 대조구로 GUS 유전자를 동일한 pDEST 벡터에 클로닝하여 pDEST-GUS 발현벡터를 제작하였다(도 3a).

<3-2> RcLPAT299 유전자 형질전환 및 효소기능 분석

본 발명자들은, 피마자 RcLPAT299가 LPAT 효소의 기능이 있는지 확인하고자 RcLPAT299 유전자를 포함한 플라스미드를 형질전환하였다.

구체적으로, 피마자 RcLPAT299가 LPAT 효소의 기능이 있는지 확인하고자 RcLPAT299 유전자를 포함한 pDEST-RcLPAT299 플라스미드를 대장균 JC201에 형질전환하였다. 또한, 대조구 유전자로 GUS를 사용하여 대장균 JC201에 형질전환하였다. 대조구 유전자 GUS와 RcLPAT299 유전자가 도입된 대장균 JC201을 선발하여 30℃ 와 42℃에서 배양하여 시간에 따라 그 생장을 흡광도 600 nm(OD 600)에서 비교하였다.

그 결과, GUS 유전자가 도입된 JC201 대장균은 30℃에서는 OD 0.4의 최대 성장을 보이며 정상적으로 생장하였으나 42℃에서는 OD 0.05 이하를 보이며 생장하지 못했다. 하지만 피마자 RcLPAT299 유전자가 도입된 JC201는 30℃ 뿐만 아니라 JC201 대장균의 치사온도인 42℃에서도 OD 6 이상의 정상 생장하였다. 이는 RcLPAT299가 LPAT의 효소기능을 하여 42℃에서도 JC201 대장균을 정상 생장함을 확인하였다(도 3b).

<3-3> 피마자 RcLPAT299 단백질 유래 분석

본 발명자들은, RcLPAT299 도입에 의해 JC201 대장균이 42℃에서 치사 되지 않고 생장이 회복된 것이 RcLPAT299 단백질 발현에 의해 유래된 것인지 확인하고자 RcLPAT299 단백질을 검출하였다.

구체적으로, JC201 대장균으로부터 모든 단백질을 분리하고, 단백질 전기영동하였다. 전기영동한 단백질을 PVDF 멤브레인(membrane)에 transfer한 후, His-tag 항체를 이용하여 His-tag와 결합된 RcLPAT299 단백질을 웨스턴 블랏(western blot)으로 분석을 하였다.

그 결과, 34.2 kDa의 His-RcLPAT299 단백질이 형질전환된 JC201 대장균에서 발현함을 확인하였다(도 3c).

< 실시예 4> RcLPAT299 종자특이 발현 식물 벡터 제작

피마자 RcLPAT299 종자특이 발현 식물 벡터 제작하기 위하여 종자 특이 파세올린(Phaseolin) 프로모터 조절하에 RcLPAT299 유전자가 발현되는 식물 재조합 발현 벡터를 제작하였다.

구체적으로, 피마자 RcLPAT299 유전자를 삽입 작성한 pENTR-RcLPAT299 벡터와 VIB-Ghent 대학에서 구입한 식물발현벡터인 pB2GW7(10.8kb) (Karimi et al., Trend Plant Sci. 7: 193-195, 2002)의 35S 프로모터를 종자 특이 파세올린 프로모터 (Chandrasekharan et al. Plant J. 33:853-866, 2002)로 대치하여 작성한 pPhaseolin-gateway와 LR clonase 반응을 하여, 파세올린 프로모터 조절하에 RcLPAT299 유전자가 발현되는 식물 재조합 발현 벡터 Phaseolin-RcLPAT299를 제작하였다(도 4).

상기에서 제작된 식물발현벡터를 아그로박테리움 GV3101 (Komcz and Schell. Mol. Gen. Genet. 204:383-396. 1986)에 형질전환한 후, 아그로박테리움을 애기장대 식물 형질전환에 사용하였다(Clough and Bent, Plant J. 16:735-743, 1998).

< 실시예 5> RcLPAT299 유전자 발현에 의한 리시놀레인 지방산 증진 분석

피마자 RcLPAT299 유전자의 종자 특이적 발현에 의한 리시놀레인 지방산의 증진을 분석하기 위하여 피마자 RcLPAT299 유전자가 형질전환된 애기장대에서 리시놀레인 지방산을 분석하였다.

구체적으로, RcLPAT299 유전자가 포함된 아그로박테리움을 종자에서 리시놀레인 지방산을 17% 생산하는 CL37 애기장대 (Lu et al., Plant J. 45:847-856, 2006; Kumar et al., Plant J. 48:920-930, 2007)의 꽃에 접종하였다. 다음 세대 종자를 수확하여 발아시킨 후 제초제(BASTA)에 저항성을 갖는 피마자 RcLPAT299 유전자가 형질전환된 T1 애기장대를 선발하였다. T1 형질전환체 식물체로부터 얻은 T2 종자를 얻었다. 형질전환시킨 RcLPAT299 유전자가 T2 세대에서 분리되기 때문에 제초제에 저항성을 보이는 T2 세대 식물체 5 개체를 선발하고 그로부터 얻은 T3 종자를 얻었다. 상기 T3 종자의 지방산을 가스크로마토그래피 (Gas Chromotography:GC) 분석하여 리시놀레인 지방산 함량을 조사하였다.

그 결과, CL37 종자의 하이드록시 지방산은 기존에 보고와 동일하게 17%의 생산을 보였으나 CL37에 RcLPAT299가 형질전환체 종자에서는 CL37의 하이드록시 지방산 (18:1-OH+18:2-OH)보다 높은 최소 19%에서 최대 21% 생산성을 보였다. 특히, RcLPAT229의 도입은 하이드록시 지방산중에서도 리시놀레인 지방산(Ricinoleic acid: 18:1-OH)의 생산량을 특이적으로 증가시켰다(표 2).

또한, CL37 종자는 리시놀레인 지방산(18:1-OH)이 13.4%이나 RcLPAT299의 형질전환체에서는 최소 16.1%에서 최대 18.2%까지 생산 증진을 보였다. 그 반면 또 다른 하이드록시 지방산인 댄시폴릭 지방산 (Densipolic acid:18:2-OH)의 생산량은 대조구 CL37의 3.2% 보다 약간적거나 비슷한 양을 나타내어 변화를 주지 않았다. 상기 결과는 RcLPAT299가 리시놀레인 지방산을 특이적으로 종자오일에 축적하는 효과가 있으며 리시놀레인 지방산 합성 유전자인 FAH12를 단독으로 사용했을 때 보다 최소 20.1%에서 최대 35.8%의 리시놀레인 지방산 생산 증진 효과가 있음을 확인하였다(도 5).

대조구 CL37 과 CL37 에 LPAT299 유전자가 형질전환된 T3 종자의 지방산 분석

	지방산 조성의 평균(mol%) n=3									HFAs의 합 (18:1OH+ 18:2-OH)	리시놀레인 지방산의 증가률(%) (18:1-OH)	HFAs의 증가률(%)
	16:0	18:0	18:1	18:2	18:3	20:0	20:1	18:1-OH	18:2-OH	HFAs의 합 (18:1OH+ 18:2-OH)	리시놀레인 지방산의 증가률(%) (18:1-OH)	HFAs의 증가률(%)
CL37	14.6	7.2	34.3	20.4	5.5	0.9	0.4	13.4	3.2	16.6	0.0	0.0
CL37+RcLPAT299 (T3 of 2-1)	17.5	6.8	22.6	24.9	6.6	1.1	0.6	16.8	3.1	19.9	25.4	19.9
CL37+RcLPAT299 (T3 of 2-2)	17.1	6.6	27.5	22.3	5.6	1.0	0.6	16.1	3.2	19.3	20.1	16.3
CL37+RcLPAT299 (T3 of 2-3)	16.4	6.6	27.5	21.5	6.1	1.0	0.3	17.7	2.8	20.5	32.1	23.5
CL37+RcLPAT299 (T3 of 2-4)	17.7	7.1	26.8	20.6	5.5	1.0	0.9	17.7	2.5	20.2	32.1	21.7
CL37+RcLPAT299 (T3 of 6-1)	16.7	6.4	25.9	21.9	6.2	1.0	0.6	18.2	3.0	21.2	35.8	21.7

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> A RcLPAT299 genes derived from Ricinus communis L. and their uses in ricinoleic fatty acid <130> P130456 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 900 <212> DNA <213> RcLPAT299 cDNA <400> 1 atggaaagca ctggaggtgg ttcttttatg aggaatagga gactggagag ttttcttaac 60 acagactcca gcacaaatgt gaatgaaacc tcaagaaaat tggtgaggaa agaagtggaa 120 caaaggccta acaatgatgt ttatgttgat gatgatggtt ggatttctgg attgatatct 180 tgggtgagga ttgttgtgtg ttttgtgtca atgatgatta ctacatttat ctgggcttca 240 ctcatgctct tgctcttgcc atggccttat gagaggatta ggcaaggaaa tatttatgga 300 catgtcactg gtagaatttt gatgtggatc ttagggaatc ctctaaagat cgaaggcgtt 360 gaattctcaa atgagaaggc catttatatc agtaatcatt catctcctat agacattttc 420 cttataatgt ggttgacgcc cactggcaca gttggggttg caaagaagga gattatatgg 480 tacccactat ttggacagct ttatgtactg gccaaccatc ttcgaattga tcgctccaat 540 ccagctgctg caattcaatc catgaaagag gtagcgtgtg ctgttatcaa gaacaaccta 600 tcgttaatca tttttccaga gggcaccagg tcgaaaagtg gaagattact cccctttaaa 660 aagggttttg ttcatttagc attgcaaaca cgtcttccaa tagttccaat cgttctgacg 720 ggtacccatc gagcatggag gaaggacagt ttgcatgttc ggcctgcacc cataaatgtc 780 aagtatctcc gtccaataaa aactgataat tggacagatg acaaaattga tgactacgta 840 aaattgctac atgacatgta tgttgaaaac cttccagagt ctcaaaggcc tctaagttag 900 900 <210> 2 <211> 299 <212> PRT <213> RcLPAT299 amino acid <400> 2 Met Glu Ser Thr Gly Gly Gly Ser Phe Met Arg Asn Arg Arg Leu Glu 1 5 10 15 Ser Phe Leu Asn Thr Asp Ser Ser Thr Asn Val Asn Glu Thr Ser Arg 20 25 30 Lys Leu Val Arg Lys Glu Val Glu Gln Arg Pro Asn Asn Asp Val Tyr 35 40 45 Val Asp Asp Asp Gly Trp Ile Ser Gly Leu Ile Ser Trp Val Arg Ile 50 55 60 Val Val Cys Phe Val Ser Met Met Ile Thr Thr Phe Ile Trp Ala Ser 65 70 75 80 Leu Met Leu Leu Leu Leu Pro Trp Pro Tyr Glu Arg Ile Arg Gln Gly 85 90 95 Asn Ile Tyr Gly His Val Thr Gly Arg Ile Leu Met Trp Ile Leu Gly 100 105 110 Asn Pro Leu Lys Ile Glu Gly Val Glu Phe Ser Asn Glu Lys Ala Ile 115 120 125 Tyr Ile Ser Asn His Ser Ser Pro Ile Asp Ile Phe Leu Ile Met Trp 130 135 140 Leu Thr Pro Thr Gly Thr Val Gly Val Ala Lys Lys Glu Ile Ile Trp 145 150 155 160 Tyr Pro Leu Phe Gly Gln Leu Tyr Val Leu Ala Asn His Leu Arg Ile 165 170 175 Asp Arg Ser Asn Pro Ala Ala Ala Ile Gln Ser Met Lys Glu Val Ala 180 185 190 Cys Ala Val Ile Lys Asn Asn Leu Ser Leu Ile Ile Phe Pro Glu Gly 195 200 205 Thr Arg Ser Lys Ser Gly Arg Leu Leu Pro Phe Lys Lys Gly Phe Val 210 215 220 His Leu Ala Leu Gln Thr Arg Leu Pro Ile Val Pro Ile Val Leu Thr 225 230 235 240 Gly Thr His Arg Ala Trp Arg Lys Asp Ser Leu His Val Arg Pro Ala 245 250 255 Pro Ile Asn Val Lys Tyr Leu Arg Pro Ile Lys Thr Asp Asn Trp Thr 260 265 270 Asp Asp Lys Ile Asp Asp Tyr Val Lys Leu Leu His Asp Met Tyr Val 275 280 285 Glu Asn Leu Pro Glu Ser Gln Arg Pro Leu Ser 290 295 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RcLPAT299 forward primer <400> 3 caccatggaa agcactggag gt 22 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RcLPAT299 reverse primer <400> 4 ctaacttaga ggcctttgag actctgga 28

Claims

서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 리시놀레인 지방산(ricinoleic fatty acid) 생산에 이용되는 RcLPAT299(Castor bean lysophosphatidyl acyltransferase 299) 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
제 1항에 있어서, 상기 유전자는 피마자(Ricinus communis L.)로부터 분리된 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제 1항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 암호화하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제 1항에 있어서, 상기 리시놀레인 지방산은 탄소의 9번째 위치에 이중결합과 12번째 위치에 하이드록시(OH)기를 함유한 12-하이드록시-9-옥테노산(12-hydroxy-9-octenoic acid)인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제 1항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 리시놀레인 지방산 증진용인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제 1항의 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환 식물체.
제 6항에 있어서, 상기 식물체는 LPAT299 유전자 발현에 의해 리시놀레인 지방산의 함량이 증가한 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
제 6항에 있어서, 상기 식물체는 애기장대 또는 유지식물(vegetable oil plant)인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
제 6항에 있어서, 상기 유지식물은 참깨, 유채, 해바라기, 아주까리, 땅콩, 콩, 코코야자, 기름야자, 올리브, 대두, 옥수수 및 호호바로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
(1) 제 1항의 재조합 벡터를 제조하는 단계;
(2) 상기 벡터를 아그로박테리움을 이용하여 식물체에 형질전환하는 단계; 및
(3) 바스타(BASTA) 제초제를 살포하여 형질전환체를 선별하는 단계를 포함하는 형질전환 식물체 제조 방법.
(1) 제 8항의 형질전환 식물체로부터 T1 종자를 수득하는 단계;
(2) 상기 단계 (1)의 T1 종자 중에 리시놀레인 지방산의 함량이 증가한 계통을 선발하는 단계;
(3) 상기 단계 (3)에서 선발한 계통을 T2 세대로 전개하는 단계;
(4) 상기 단계 (3)의 T2 종자 중에 리시놀레인 지방산의 함량이 증가한 계통을 선발하는 단계; 및
(5) 상기 단계 (4)의 T3 세대의 종자로부터 리시놀레인 지방산을 수득하는 단계를 포함하는 리시놀레인 지방산 생산 방법.