KR102377369B1

KR102377369B1 - 식물의 과색, 과향 및 뿌리 발달 증진 방법

Info

Publication number: KR102377369B1
Application number: KR1020190156482A
Authority: KR
Inventors: 이제민; 유희주
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2019-11-29
Filing date: 2019-11-29
Publication date: 2022-03-23
Also published as: KR20210067151A

Abstract

본 발명은 토마토 야생종에서 분리한 ShCCD4b(Solanum habrochaites carotenoid cleavage dioxygenase 4)를 이용한　식물의 과색, 과향 및 뿌리 발달 증진 방법에 관한 것으로, 본 발명의 야생종 토마토 유래 ShCCD4b(Solanum habrochaites carotenoid cleavage dioxygenase 4)는 식물체에 과발현시키면 과색의 변화되고 과향이 증가되어 식물의 심미적, 영양학적 가치를 향상시킬 뿐만 아니라 뿌리의 길이도 신장되므로 식물의 생육 및 발달 향상에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

식물의 과색, 과향 및 뿌리 발달 증진 방법{Method for increasing color, Aroma and root development in plant}

본 발명은 토마토 야생종에서 분리한 ShCCD4b(Solanum habrochaites carotenoid cleavage dioxygenase 4)를 이용한　식물의 과색, 과향 및 뿌리 발달 증진 방법에 관한 것이다.

토마토는 과실 생물학, 생물공학 연구를 위한 대표적인 모델작물로써 특히 카로티노이드 생합성 연구에 많이 이용되어왔다. 카로티노이드는 식물에서 과도한 광 아래서 광산화 손상등을 방지하는 등 중요한 기능을 하는 물질이며 과실, 잎, 꽃 등의 식물 조직의 색소 물질이다. 또한 카로티노이드는 중요 영양소로써 사람이 섭취할 시 항산화, 암 예방 등의 역할을 한다.

카로티노이드는 아포카로티노이드의 전구물질로써, 카로티노이드로부터 합성되는 아포카로티노이드는 동물과 식물에서 중요한 기능을 한다. 동물에서 가장 중요한 아포카로티노이드는 비타민 A로써 로돕신의 발색단의 기능을 갖는다. β-이오논(β-ionone)은 여러 암세포에서 항암 작용을 하는 것으로 보고되었다. 식물의 가장 대표적인 아포카로티노이드는 식물 호르몬인 ABA와 스트리고락톤(strigolactone)이다. 이 호르몬들은 초장, 측지 발달 등과 같은 식물 생장 그리고 내건성과 같은 스트레스 반응과 관련되어있다. 스트리고락톤은 측지 발달을 억제하고 식물의 아키텍처(architecture)를 구성하는 데 관여한다. β-cyclocitral은 과도한 빛에 대한 해독 작용을 촉진시키는데 관련이 있다. 또한 주근과 측근의 생장을 증가시키는 데에 관여한다. 분자량이 작은 휘발성 아포카로티노이드들은 꽃과 과실의 향기와 관련이 있다. Geranylacetone, 6-methyl-5-hepten-2-one(MHO), β-이오논 및 β-다마스케온(β-damascenone)과 같은 향기성 아포카로티노이드들은 fruty/floral 향기로 구분되며 단맛을 수용하는 데에도 관련이 있다.

아포카로티노이드는 효소적대사와 비효소적대사에 의해 생산된다. 비효소적대사경로는 일중항산소의 (¹O₂) 부착(cleaving) 반응에 의해 카로티노이드로부터 합성되는 것이다. 효소적대사에서 여러 효소들(oxygenase, peroxidase, lipoxygenase 등)은 아포카로티노이드 합성을 위해 카로티노이드를 기질로 사용한다. 식물에서 많은 아포카로티노이드들은 CCD(carotenoid cleavage dioxygenase)에 의해서 카로티노이드의 특정한 이중결합을 끊음으로써 합성된다. CCD는 전구물질 및 부착 부위(cleavage site)에 따라서 크게 두 그룹으로 나뉜다. 첫 번째 그룹은 9-cis-epoxy-carotenoid를 전구물질로 하여 C11'-C12' 이중결합 사이를 절단하는 9-cis-epoxy-carotenoid cleavage dioxygenase(NCED)이다. 이들은 ABA의 전구물질인 잔톡신(xanthoxin)을 생산한다. 두 번째 그룹은 다양한 기질과 절단 부위를 갖는 CCD이다. CCD1은 phytoene, all-trans-lycopene, β-carotene 그리고 zeaxanthin의 C5-C6 (C5-C6', C7-C8 (C7'-C8') 그리고 C9-C10 (C9'-C10' 이중결합을 끊음으로써 여러 식물에서 다양한 향기성 아포카로티노이드를 생산한다. CCD2는 Crocus sativus 특이적 효소로써 제아잔틴의 C7'-C8' 이중결합을 끊음으로써 암술의 착색과 관련된 물질인 크로세틴 디알데히드(crocetin dialdehyde)를 생산한다. CCD7과 CCD8은 스트리고락톤 합성과 관련이 있다. 우선 all-trans-β-카로틴이 DWARF27에 의해 9-cis-β-카로틴으로 전환되어 CCD7에 의해 C9'-C10' 이중결합이 끊어짐으로써 β-이온논과 9-cis-β-apo-10'-carotenal을 생산한다. 그리고 9-cis-β-apo-10'-carotenal는 CCD8에 의해 C13-C14 이중결합이 끊어짐으로써 스트리고락톤의 전구물질인 carlactone 생산에 관여한다.

초기에 진행된 CCD4 연구에서는 CCD4가 고리가 있고 에폭시(epoxy)기는 없는 카로티노이드를 기질로 하여 β-이오논을 생산한다고 보고하였다. 하지만 이후에 진행된 연구들을 보면 CCD4가 기질 특이성, cleavage site, 그리고 최종 산물에 있어 다른 CCD보다 매우 복잡한 특징을 갖고 있다. CCD4는 고리가 있는 카로티노이드 뿐만 아니라 선형의 카로티노이드, 에폭시기가 있는 카로티노이드 또한 기질로 사용하며 C5-C6 (C5'-C6'), C7-C8 (C7'-C8') 그리고 C9-C10 (C9'-C10') 이중결합을 끊음으로써 다양한 아포카로티노이드를 생산한다. 또한 국화와 유채의 꽃잎, 사프란의 암술, 감자의 괴경, 시트러스 과실의 겉껍질, 복숭아의 과육 등 여러 식물 조직의 착색에 기여하는 것으로 보고되었다.

현재 재배되고 있는 토마토는 유전적 다양성이 매우 좁다. 따라서 야생종의 염색체 일부가 엘리트 계통에 이입된 이입계통은 카로티노이드 함량, 향미(flavor) 물질, 생산량 등 농업적으로 유용한 형질을 조절하는 유전적 요인을 찾는데 유용하게 사용된다. 향기는 소비자 선호도에 영향을 주는 중요한 형질 중 하나이지만 재배종 토마토의 향기성 물질은 재래종이나 야생종에 비해 상당히 감소되었다.

1. New Phytologist 187.1 (2010): 44-56. 2. Journal of experimental botany 69.14 (2018): 3393-3400.

이에 본 발명자들은 토마토 향기와 관련된 휘발성 물질들은 지방산(fatty acid), 아미노산(amino acids) 및 카로티노이드 등의 화합물로부터 유래되며 재배종의 향기성 물질이 감소한 것은 전구물질 생산량의 감소와도 관련이 있을 것이라고 예상되고 이와 관련에서 연구한 결과 토마토 야생종인 Solanum habrochaites로부터 분리한 ShCCD4b가 토마토의 짙은 오렌지 과색과 과향을 조절한다는 것을 하였으므로 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 야생종 토마토 유래 ShCCD4b(Solanum habrochaites carotenoid cleavage dioxygenase 4) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포에 형질전환시켜 CCD4 유전자를 과발현 하는 단계를 포함하는 식물체의 과색, 과향 및 뿌리 발달 증진 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 야생종 토마토 유래 ShCCD4b(Solanum habrochaites carotenoid cleavage dioxygenase 4) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 비형질전환체에 비해 식물체의 과색, 과향 및 뿌리 발달이 증대된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 과색, 과향 및 뿌리 발달이 증대된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 야생종 토마토 유래 ShCCD4b(Solanum habrochaites carotenoid cleavage dioxygenase 4) 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 식물의 식물체의 과색, 과향 및 뿌리 발달 증대용 조성물을 제공한다.

본 발명의 야생종 토마토 유래 ShCCD4b(Solanum habrochaites carotenoid cleavage dioxygenase 4)는 식물체에 과발현시키면 과색의 변화되고 과향이 증가되어 식물의 심미적, 영양학적 가치를 향상시킬 뿐만 아니라 뿌리의 길이도 신장되므로 식물의 생육 및 발달 향상에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 E6203 및 IL8A의 숙과에서의 표현형 및 카로티노이드 구성성분과 함량을 나타낸 그래프이다:
(A) E6203 및 IL8A의 B+10 단계에서 수확된 과실의 표현형
(B) E6203 및 IL8A의 B+10 단계에서 수확된 과실에서의 카로티노이드 구성성분과 함량 (μg / g FW; 5 반복의 평균값 ± 표준오차로 나타냄). * 및 **는 독립적인 t-검정에 따라 P <0.05 및 P <0.01에서 각각 유의한 차이를 나타낸다.
도 2는 IL8A의 8번 염색체의 맵핑 및 SlCCD4b의 발현을 나타낸 그래프이다:
(A) IL8A의 8번 염색체의 정밀한 매핑, 화살표는 8번 염색체의 400 kb 후보 지역에서 위치하는 유전자를 나타낸다.
(B) E6203 및 IL8A의 숙과에서 SlCCD4a 및 SlCCD4b의 상대적 발현. 3 반복의 평균값 ± 표준오차로 나타냄. **는 독립적인 t-검정에 따라 P <0.01에서 각각 유의한 차이를 나타낸다.
도 3은 ShCCD4b의 식별 및 세포 내 위치를 나타낸 사진이다:
(A) SlCCD4b와 비교하여 6 개의 변이가 ShCCD4b 코딩 지역에 위치하고 26 개의 변이가 프로모터 지역에 위치하였다. 화살표는 각 변이의 위치를 나타낸다.
(B) ShCCD4b-GFP의 공 발현은 플라스티드 내부에서 관찰되었다. 스케일 바 = 2 μm.
도 4는 다양한 식물의 CCD4의 아미노산 서열을 정렬한 것이다:
빨간색 문자는 cTP 영역을 나타내고 파란색 배경은 His 잔기를 나타낸다. 노란색 배경은 ShCCD4b와 SlCCD4b 사이의 치환된 잔기를 나타낸다.
도 5는 ShCCD4b를 과발현하는 T0 및 T1 형질 전환 식물로부터 수확된 숙과의 표현형:
#4, #10 및 #14의 3개의 독립적인 라인은 B+10 단계에서 수확된 숙과에서 진한 주황색을 나타냈다. 스케일 바 = 1 cm.
도 6은 ShCCD4b 과발현된 식물의 숙과에서 SlCCD4b의 상대적 발현량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다:
ShCCD4b 과발현 된 식물의 B+10에서 수확된 숙과(B+10)에서 SlCCD4a(A) 및 SlCCD4b(B)의 상대적 발현.
최소 3회 반복 실험의 평균값과 표준오차를 표시하였고, 알파벳 문자는 Duncan 테스트에 따라 P <0.05에서 유의한 차이를 나타낸다.
도 7은 qRT-PCR에 의한 ShCCD4b 과발현된 식물의 숙과에서 카로티노이드 생합성 유전자의 상대적 발현을 나타낸 그래프이다:
B+10 단계에서 수확한 숙과에서 카로티노이드 생합성 유전자의 상대적 발현 데이터는 최소 3 반복의 평균값과 표준오차로 표시하였다.
도 8은 ShCCD4b 과발현 계통의 숙과에서 휘발성 아포카로티노이드 함량을 나타낸 그래프이다:
3 반복의 평균값과 표준오차를 표시하였고, * 및 **는 Dunnett 테스트에 따라 P <0.05 및 P <0.01에서 각각 유의 한 차이를 나타낸다.
도 9는 서로 다른 카로티노이드를 생성하는 E. coli 균주에서 ShCCD4b의 발현을 유도한 사진이다:
피토엔,ζ-카로틴, 리코펜, δ-카로틴, β-카로틴 및 제아잔틴 (대조군)을 생산하도록 조작된 대장균 균주를 ShCCD4b와 공동-형질 전환시켰다.
도 10은 효소 분석을 통한 ShCCD4b의 활성을 GC-MS로 분석한 결과를 나타낸 그래프이다:
(A) β-카로틴 축적 대장균 균주의 GC-MS 분석
상단 패널, 컨트롤 셀; 중간 패널, ShCCD4b 발현 세포; 하단 패널, β-이오 논 표준 물질, 25.44에서 피크의 머무름 시간 (retention time) 및 질량 스펙트럼은 β-이오논과 동일함
(B)ζ- 카로틴 및 리코펜 축적 대장균 균주의 GC-MS 분석
상단 패널, 컨트롤 셀; 하부 패널, ShCCD4b 발현 세포, 24.78에서 피크의 질량 스펙트럼은 제라닐아세톤(geranylacetone)과 동일함
도 11은 ShCCD4b 과발현 식물의 식물 성장 매개 변수를 분석한 결과를 나타낸 그래프이다:
10 주차 ShCCD4b 과발현 식물에서 주 줄기의 길이(a), 측면 가지의 수(b) 및 측면 가지의 길이(c)를 측정함
도 12는 E6203 및 두개의 독립적인 ShCCD4b 과발현 라인(#4 및 #10)의 뿌리 발달을 분석한 결과를 나타낸 사진과 그래프이다:
(A) E6203 및 ShCCD4b 과발현 라인(#4 및 #10)에서 6주차 식물의 뿌리. bar = 1 cm.
(B) 6주차 식물의 뿌리 길이, 각 계통 당 최소 15개 식물의 뿌리 길이를 측정하여 평균값과 표준오차로 나타냄, 모든 점은 개별 식물의 뿌리 길이를 나타냄.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 야생종 토마토 유래 ShCCD4b(Solanum habrochaites carotenoid cleavage dioxygenase 4) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포에 형질전환시켜 ShCCD4b 유전자를 과발현 하는 단계를 포함하는 식물체의 과색, 과향 및 뿌리 발달 증진 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 ShCCD4b 단백질의 범위는 야생형 토마토(Solanum habrochaites)로부터 분리된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 60% 이상, 바람직하게는80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리 활성"이란 식물체의 과색, 과향 및 뿌리 발달 증진 방법를 의미한다. 본 발명은 또한 ShCCD4b 단백질의 단편, 유도체 및 유사체(analogues)를 포함한다.

또한, 상기 ShCCD4b 단백질을 코딩하는 유전자는 게놈 DNA, cDNA 또는 합성 DNA를 포함한다. 바람직하게는 본 발명의 ShCCD4b 유전자의 cDNA 염기서열은 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다. 또한, 상기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 60% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

ShCCD4b 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(Kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법, 원형질체의 전기천공법, 식물 요소로의 현미주사법, 각종 식물 요소의(DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법, 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다.

본 발명의 식물체는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물 또는 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽

식물일 수 있으며, 바람직하게는 쌍자엽 식물이며, 더욱 바람직하게는 가지과이며, 더 더욱 바람직하게는 토마토일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

또한, 본 발명은 야생종 토마토 유래 ShCCD4b(Solanum habrochaites carotenoid cleavage dioxygenase 4) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 비형질전환체에 비해 식물체의 과색, 과향 및 뿌리 발달이 증대된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 야생종 토마토 유래 ShCCD4b(Solanum habrochaites carotenoid cleavage dioxygenase 4) 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 식물의 식물체의 과색, 과향 및 뿌리 발달 증대용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 실험방법

<1-1> 실험재료

본 실험을 위해 빨간색 과실을 갖는 토마토 E6203 (Solanum lycopersicum)과 오렌지색 과실을 갖는 IL8A (Solanum habrochaites introgression lines), 및 이들을 양친으로 한 F2 분리집단을 사용하였다. 모든 식물은 16 시간 광/ 8시간 암 조건으로 경북대학교내 온실에서 재배되었다. 뿌리 길이 측정을 위한 식물은 128구 트레이에 파종하여 4주 동안 재배 후 32구 트레이로 이식하여 2주 동안 재배하였으며 식물 뿌리에 있는 흙을 제거한 후 뿌리 길이를 측정하였다. 잎과 꽃, 숙과 (breaker 단계 후 10일째 되는 날 수확, B+10), 뿌리 샘플은 샘플링 즉시 액체질소를 이용하여 얼린 후 -80℃ 보관하였다.

<1-2> Genomic DNA 추출

DNA 추출은 cetryltrimetylammonium bromide (CTAB) 방법 (Murray and Thompson 1980)을 사용하였다. Glass bead 2개가 들어있는 2 ml 튜브에 어린 잎을 채취하여 CTAB buffer (2% CTAB, 1.42M NaCl, 20mM EDTA, 100mM Tris-Cl, ddH₂O) 600 μl와 β-mercaptoethanol 3 μl, 100 mg/ml L-ascorbic acid 10 μl을 첨가한 후 Homogenizer를 이용하여 마쇄하고 65℃ heat block에서 15분 동안 처리하였다. 이후 chloroform과 isoamyl alcohol이 24:1 (v/v) 비율로 섞여 있는 용액을 600 μl 첨가한 후 잘 섞어 4℃로 맞추어진 원심분리기에 넣어 13,000 rpm으로 15분 동 안 원심 분리하여 층 분리를 유도하였다. 층 분리된 상층액 500 μl을 새로운 1.5 ml 튜브에 옮기고 pre-chilling된 100% 아이소프로판올을 500 μl 첨가한 후 천천히 섞어주었다. 4℃, 13,000 rpm 조건에서 15분 동안 원심분리 하여 DNA 펠렛을 침 전시킨 후 상층액을 제거하였다. DNA 펠렛만 남아있는 튜브에 70% 에탄올 750 μl를 넣어 천천히 섞어준 후 13,000 rpm으로 5분동안 원심 분리하였다. 이 후 펠렛만 남기고 상층액은 버린 후 13,000 rpm으로 1분동안 원심 분리하여 남아 있는 용액은 파이펫을 이용해 모두 제거하였다. 펠렛만 남아있는 튜브에 100 ug/ml RNase가 처리된 ddH₂O를 30 μl 첨가하여 DNA 펠렛을 녹였다. 추출한 genomic DNA 는 Nanodrop 2000 Sperctrophotometer (Thermo Scientific, USA)를 사용하여 정량 하였고, -20℃에 보관하여 사용하였다.

<1-3> Map-based cloning

IL8A의 오렌지 과색을 조절하는 유전자를 찾기 위해 E6203 x IL8A F2 분리집단 212 개체에서 map-based cloning을 진행하였다. 본 실험에 사용된 모든 프라이머는 표 1에 정리하였다. Mapping 프라이머는 Sol Genomics Network (https://solgenomics.net)의 S. habrochaites scaffolds를 기반으로 하여 디자인하였다.

<1-4> RNA 추출 및 유전자 발현 분석

잎과 꽃의 RNA는 TRI REAGENT (Molecular research center, Ohio, USA)을, 과실의 RNA는 Ribospin^TM Seed/Fruit (GeneAll, Korea)를 이용하여 추출하였다. 추출한 RNA 1 μg은 DiaStar^TM RT-kit (Solgent, Korea)와 18 bp의 oligo dT primer를 이용하여 cDNA로 합성하였다. Quantitative real-time PCR (qRT-PCR)은 100 ng cDNA, SYBG qPCR Master Mix (Applied Biosystems, USA)와 유전자 특이적 qRT primer (CCD4a-qRT, CCD4b-qRT, Actin)를 이용하여 실시하였다(표 1). 프라이머당 최소 3번의 생물학적 반복(biological replication)과 2번의 기술적 반복(technical replication)을 수행하였다. Reference 유전자로는 Actin을 이용하여 유전자 발현을 정규화(normalization)하였다. qRT-PCR 조건은 초기 95℃에서 10분 동안 변성을 하였고, 이후의 40 사이클은 95℃에서 15초 동안 변성, 60℃에서 1분 동안 어닐링과 익스테션하였다. qRT-PCR에 사용된 기기는 StepOneplus^TM Thermal Cycler (Applied Biosystems, USA)이며 결과 분석은 StepOne software v2.0 (Applied Biosystems, USA)를 이용하여 실시하였다.

마커/프라이머	Forward	서열번호	Reverse	서열번호	제한효소	사이즈
마커/프라이머	Forward	서열번호	Reverse	서열번호	제한효소	Sl	Sh
Solyc08g067260.2 (a)	GGCTCGAGAAGAACATCTTCTATC	3	CATCACTTGGCTTGTAACATGC	4	AluI	238+154	392bp
Sgn-U580823 (b)	CAAACAATGTGATCTTGTGGAAG	5	GCAACCATTATCAACAGAGACAC	6	AluI	118+215	333 bp
Solyc08g068290.2 (c)	GGTTGGTATCTCAAACATGATTGG	7	GTCTCCCATTATTTCTTGTGTTCA	8	RsaI	383 bp	116+266
Solyc08g068780.1(d)	TTCCCAACTTTCTATAACTCTCCC	9	CCATGCATACCATAACAACACTCA	10	EcoRI	363 bp	143+220
Solyc08g075240.2 (e)	GATAAACAATAGATTGCAACATCC	11	ACCTGAGTGTAGAATACAAGGAGA	12	SalI	261 bp	108+153
Solyc08g075310.2 (f)	GAAGATCGAATCGTGATTAACG	13	CATTCAATGCAGCACAAACTAC	14	AluI	313 bp	202+111
Solyc08g075390.2 (g)	TCTCCTGCTTTACGAAGCAAGG	15	GGAATTCAACTTATGGAAAGATAG	16	AluI	135+90	225 bp
Solyc08g075710.2 (h)	ATGCTGTGCTTTTAGTTGTGCTTG	17	CGTGGTGCATTTGCATACTTAATC	18	NcoI	439 bp	271+168
Solyc08g075890.2 (i)	TGGTTGGTTCCAGAGTGCAGAA	19	GTTGATGCAACAGTATCACCAG	20	RsaI	82+26	351 bp
C2_At5g11490(j)	ATGGAGCCATGATTGTATAGCAGTTG	21	AGCTCCCAAGGCTTTCTGAGTCTC	22	HinfI	550+300	480+300+320
Solyc08g076250.1(k)	AGTACTTCCACATCATGTTCTTAG	23	AAGATCATGAACCTCATCTTGTCG	24	HindIII	321 bp	160+162
Solyc08g076430.2 (l)	TATCTTTCAGAGCAATCCAAGAAG	25	TATTTGGAAAAATCAACCTACCAG	26	AseI	190 bp	104+86
C2_At4g19003(m)	ACTAGGGAGAAGCAGATACAACTATGG	27	ACCCCAGAACGTATTTCTTCAACTGTC	28		1700 bp	1800 bp
CCD4-CAPS	GATACCTCCGTTTATAACTTAC	29	CATTCCTGTCTTCAAATTTATTTTC	30	MluI	300+136	436 bp
CCD4-eGFP	GGCGCGCCTCTAGAATGGATGCTTTGTCTTCAAC	31	GGCGCGCCGTCGACTAGCTTCATAAGATCATTTTC	32	XbaI, SalI
CCD4-LIC	CGACGACAAGACCCtATGGATGCTTTGTCTTCAACTTTC	33	GAGGAGAAGAGCCCTTTATAGCTTCATAAGATCATTTTCACT	34
CCD4-OX-2	CAAGAAAAATCAACCCCTTCAC	35	TCGAAAAGATGGTAAGGTCCAC	36				320 bp
CCD4-OX-4	AACCCAGGATGTACCCATATTCT	37	TCATTTTCACTCACGAAAAGTCC	38			801 bp
TrcHis2-NCED	CCATCTCCAAAAAGAGAAC	39	TTATAGCTTCATAAGATCATTTTC	40			1,584 bp
CCD4-cis-1	CATCTGGTCATGATGAGATATATC	41	GGGTTTTGTGATAATGTAGAAAGG	42			1,177bp
CCD4-cis-2	CAAAATGAAGAAAGAGTGATGCTC	43	GATGTGTTCAAAAGACAATTCAATC	44			629 bp
CCD4-cis-3	AGGCAATTTGGGAGGATGTATTAG	45	CGTCGTCAGTAGATAAAAGTTAAC	46			618 bp
CCD4b-qRT	GACAGGAATGGTGAGCAGACATC	47	CCTATTACTTTTGGCATAGGACCC	48
CCD4a-qRT	TAGTGGGGTAGTGAGTAGACATCC	49	CCTGATAACTTAGGTGGAGGGTAC	50
Actin-qRT	CCTCAGCACATTCCAGCAG	51	CCACCAAACTTCTCCATCCC	52

<1-5> ShCCD4b의 세포 내 위치 확인

ShCCD4b의 세포 내 위치를 확인하기 위해 CaMV 35S 프로모터의 조절 아래 GFP를 발현하는 pCAMBIA2300-C-eGFP vector를 이용하여 ShCCD4b-GFP fusion 단백질을 유도하였다. 종결 코돈을 제외한 전체 ShCCD4b를 특이적 프라이머를 (CCD4-eGFP) 이용하여 증폭하였다. 증폭된 ShCCD4b와 pCAMBIA2300-C-eGFP 벡터는 XbaI/SalI를 이용하여 37℃에서 4시간 동안 double digestion을 실시하였다. 이후 T4 DNA ligase (Promega Corporation, USA)를 이용하여 ShCCD4b와 pCAMBIA2300-C-eGFP이 상보적인 XbaI/SalI site에 ligation되도록 유도하였다. 제작된 construct를 E.coli (DH5α)에 transformation한 후 sequnce를 확인하였다 (Solgent, Korea). Sequnce가 확인 된 plasmid를 Agrobacterium tumefaciens (GV3101)에 freeze-thaw 방법을 이용하여 형질전환하여 50 μg/mL kanamycin과 50 μg/mL rifampicin이 첨가된 LB 배지에 도말하였다 (Ma et al., 2013). Single colony를 위와 같은 농도의 항생제가 첨가된 5mL LB 배지에 넣은 후 28℃에서 16시간 배양하였다. 세포 배양액을 항생제가 첨가된 100mL LB 배지에 넣은 후 28℃에서 OD600이 0.7이 되도록 배양하였다. 배양액을 20℃, 13,000 rpm에서 15분동안 원심 분리하여 펠렛을 분리 한 후 agroinfiltration buffer (10 mM MES, 10 mM MgCl2, 200 μM acetosyringone)에 resuspension하여 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 단백질의 일시적 발현을 위해 6주된 담배(N. benthamiana)잎의 아랫면에 바늘이 없는 1 mL 주사기를 이용하여 agroinfiltration을 실시하였다. 6일 뒤에 담배 잎을 수확하여 confocal laser 현미경 (LSM700, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 GFP fusion 단백질의 위치를 확인하였다. 640-700 nm에서 엽록체의 자발형광을 관찰하였고, GFP는 488 nm에서 관찰하였다.

<1-6> ShCCD4b 과발현 형질전환체 제작

ShCCD4b의 coding region을 증폭하기 위해 adaptor sequence를 포함하는 ShCCD4b 특이적 프라이머 (CCD4-LIC)를 제작하였다(표 1). 증폭된 PCR 산물은 T4 폴리머라아제와 dATP를 넣고 22℃에서 30분 동안 처리하였고, 이후 T4 폴리머라아제의 inactivation을 위해 75℃에서 20분동안 처리하였다. CaMV 35S 프로모터를 갖는 pCAMBIA2300-LIC 벡터에 PstI 제한효소를 처리한 후 T4 폴리머라아제와 dTTP를 넣고 22℃에서 30분 동안 처리하였다. T4 폴리머라아제가 처리된 PCR product와 pCAMBIA2300-LIC vector를 함께 넣고 실온에서 60분 동안 처리한 후 E.coli (DH5α)에 형질전환 하여 서열을 확인하였다 (Solgent, Korea). 서열이 확인된 construct는 Agrobacterium tumefaciens (LBA4404)에 형질전환한 후 E6203에 주입하여 ShCCD4b를 과다 발현 하는 형질전환 식물을 제작하였다(Fillatti et al., 1987). 이입된 전이유전자(transgene)는 CCD4-OX-2와 CCD4-OX-4 프라이머(표 1, 서열번호 35 및 36, 서열번호 37 및 38)를 이용하여 PCR을 통해 확인하였다.

<1-7> 효소 분석(Enzymatic assay)

pTcrHis2 vector (Invitrogen, USA)에 ShCCD4b의 chloroplast transit peptide를 제외한 cDNA를 인설트(insert)로 사용하여 컨스트럭트(construct)를 제작하였다 (TrcHis2-NCED, 서열번호 39 및 30 프라이머 사용). 제작된 컨스트럭트 pTrcHis2-ShCCD4b는 피토엔(피토엔), ζ-카로틴, 라이코펜(리코펜), δ-카로틴, β-카로틴 및 제아잔틴을 각각 생산하는 6개의 E.coli 균주에 형질전환하였다. ShCCD4b 발현이 유도되지 않은 각각의 균주은 대조군으로 사용하였다. 카로티노이드를 생산하는 균주은 엠피실린 (100 μg/mL)이 첨가된 LB 배지에, 및 ShCCD4b가 형질전환된 균주은 엠피실린 (100 μg/mL)과 클로람페니콜(chloramphenicol) (34 μg/mL)이 첨가된 LB 배지에 도말한 뒤 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 싱글 콜로니(Single colony)는 위와 같은 농도의 항생제가 첨가된 5 mL LB배지에 넣고 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 이후 카로티노이드 분석과 아포카로티노이드 분석 두 경우로 나누어 sub-culture를 진행하였다.

1. 카로티노이드 분석을 위해 세포배양액 500 μL를 위와 같은 농도의 항생제가 첨가된 100 mL LB 배지 에 넣은 후 OD 600이 0.6이 될 때까지 37℃에서 배양하였다. 이후 ShCCD4b 발현이 유도된 균주에는 0.2 mM IPTG를 넣은 후 28℃에서 125 rpm으로 12시간 동안 배양하였다. 세포배양액은 4℃, 4000 rpm에서 10분동안 원심분리하여 펠렛을 수확한 후 -80℃에 보관하였다.

2. 아포카로티노이드 분석을 위해 세포배양액 500 μL를 위와 같은 농도의 항생제가 첨가된 20 mL LB 배지 에 넣은 후 37℃에서 OD 600이 0.6이 될 때까지 배양하였다. 이후 5mL 배양액을 GC-MS 분석용 10 mL head-space vial에 넣은 후 ShCCD4b 발현이 유도된 균주에는 0.2 mM IPTG을 넣어 16℃에서 20시간 배양하였다. 세포배양액에 2.5 mL EDTA (100 mM, pH 7.5)와 5.5 g CaCl₂·2H₂O를 넣은 후 5분동안 sonication을 하였다. 이후 12시간 이내에 GC-MS를 이용해 아포카로티노이드를 분석하였다.

<1-8> 카로티노이드 추출 및 HPLC 분석

각 과실에서 카로티노이드 추출 및 함량 분석을 위해 breaker후 10일이 된 과실을 수확하였다. 수확한 과일은 액체질소를 이용해 동결시킨 후 -80℃ 초저온냉동고에 보관하였다. 카로티노이드 추출 전 동결시킨 샘플을 액체질소를 이용하여 가루로 곱게 마쇄한 후 Yoo et al. (2017) 논문을 참고하여 카로티노이드 추출 및 분석을 실시하였다. 카로티노이드 추출과정은 광이 차단 된 조건에서 진행 하였으며 추출에 사용된 용매는 모두 HPLC grade를 사용하였다. 약 100 mg의 sample powder에 300ug 의 Mg-carbonate와 300ul tetrahydrofuran (THF) 를 첨가 한 후 FastPrep-24?? (MP Biomedicals, USA)를 이용하여 20초씩 3번 homogenization 하였다. 이후 4℃, 암조건 에서 10분 동안 인큐베이션한 후 위와 동일한 조건으로 homogenization을 실시하였다. 다시 한번 4℃, 암조건 에서 20분간 인큐베이션시킨 샘플에 butylated hydroxyl-toluene (BHT)가 첨가된 methanol (MeOH) 을 300ul 넣고 동일한 조건으로 homogenization 한 후 4℃, 암조건에서 10분 동안 incubation을 실시하였다. Homogenate는 Spin-X centrifuge filter (0.45-mm nylon filter, Corning/Costar 8170, USA) 로 옮긴 후 4℃, 4,000rpm에서 1분 동안 원심분리 하였다. 기존의 tube에 남아있는 homogenate에 150ul의 THF와 MeOH/BHT를 각각 첨가하고 vortex한 후 끝을 잘라낸 tip을이용하여 원심분리가 끝난 Spin-X centrifuge filter로 모두 옮겨 주었다. 이후 4℃, 4,000rpm 조건에서 원심분리 하여 filtering 된 추출물은 새로운 2ml tube로 옮겨 4℃에서 인큐베이션하였다. Sample powder가 남아있는 Spin-X tube filter에 350ul의 THF를 넣고 vortex 한 후 4℃에서 10분간 인큐베이션하였다. 이후 4℃, 4,000rpm 조건에서 5분 동안 원심분리하고 다시 한번 150ul의 THF를 첨가하여 4℃에서 15분동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션후 4℃, 4,000rpm 조건에서 5분 동안 원심분리 하였으며 필터된(filtering) 추출물은 기존의 추출물이 담긴 2ml tube로 옮겨주었다. Aqueous 층과 carotenoid/nonpolar phase의 분리를 위해 375ul의 petroleum ether와 150ul의 25% NaCl을 첨가한 후 vortex 하여 4℃, 4,000rpm 조건에서 3분 동안 원심분리 하였다. 상층액을 분리하여 새로운 2ml tube로 옮겨주었으며, 다시 한번 500ul의 petroleum ether를 넣은 후 3분 동안 4℃, 4,000rpm 조건에서 원심분리 하였다. 분리 된 상층액은 기존의 상층액을 담아두었던 2ml tube에 합쳐주었다. 추출물은 MICRO-CENVAC (NB-503CIR, N-BIOTEK)을 이용하여 45℃에 2시간 동안 건조하였다. 건조된 카로티노이드 추출물에 250ul의 methyl t-butyl ether를 첨가한 후 15분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 이후 vortex 후 250ul의 MeOH를 첨가하여 다시 vortex 하였다. 카로티노이드 현탁액은 0.45 NYLON syringe filter를 이용해 filtering 한 후 HPLC vial로 옮겨주었다. 카로티노이드 분석을 위해 Agilent HPLC (1260 infinity) 와 Chemstation 소프트웨어가 사용되었다. 카로티노이드 분리를 위해 2종류의 이동상(0.1% ammonium acetate를 넣은 100% MeOH (A), methyl t-butyl ether (B))과 C₃₀고정상(YMC Carotenoid S-5um, 250x4.6mm, Japan), 그리고 guard column (YMC GuardCartridge, Japan)이 사용되었다. 두 이동상의 용매비율은 0분에서 6분까지는 100% A, 6분부터 26분까지는 4%A, 96% B가 되도록 gradient를 주었고 26분부터 36분까지는 다시100% A 가 되도록 gradient를 주었다. Diode Array Detector (DAD)를 이용해 5가지파장(286nm, 348nm, 434nm, 450nm, 471nm) 에서 관찰하였으며 각 카로티노이드는 maxima absorption spectrum을 통해 비교분석 되었다 (Britton, 1985; Gupta et al., ). 각 물질의 정량은 β-카로틴 기준(standard)을 이용하여 검정선(calibration curve)을 작성한 후 계산하였다.

<1-9> GC-MS를 통한 아포카로티노이드 분석

아포카로티노이드 분석을 위해 5 g 과실을 잘게 썰어 GC-MS용 10 mL head-space vial에 넣고 37℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 3 mL EDTA (100 mM, pH 7.5)와 6 g CaCl₂·2H₂O를 넣은 후 5분동안 sonication을 하였다. 이후 12시간 이내에 GC-MS (7890B-5977B GC/MSD, Agilent, Santa Clara, CA, USA)를 이용해 아포카로티노이드를 분석하였다. 샘플을 넣은 vial은 50℃에서 10분 동안 preheating 한 후 50℃에서 10분 동안 65-μm polydimethylsiloxane-divinylbenzene fiber (Supelco Inc., Bellefonte, PA, USA)에 노출시켜 휘발성 물질을 채집하였다. 휘발성 물질은 250℃에서 1분 동안 splitless 모드로 gas chromatography에 주입하였고 DB-5 ms column (60 m Х 0.25 mm i.d., 1-μm film thickness; J&W Scientific, Folsom, CA, USA)을 이용해 분리하였다. 운반 기체로는 헬륨을 이용하여 1.2 mL min^-1flow rate으로 흘려주었다. 분석 온도는 35℃에서 2분동안 유지 후 1분당 5도씩 250℃까지 증가시켰으며 250℃에서 5분동안 유지하였다. 질량 분석은 70 eV 에너지에서 초당 7 scans 속도로 수행하였다. 검출된 물질은 retention time과 Wiley Registry (11th Edition/NIST 2017) library와 비교한 질량 스펙트럼 데이터를 이용하여 정성분석을 하였다. Chromatogram 분석에는 MSD ChemStation Data Analysis software (Agilent, Santa Clara, CA, USA)를 사용하였다.

<실시예 2> 실험 결과

<2-1> IL8A 숙과의 카로티노이드 함량 분석

짙은 오렌지색을 갖는 IL8A의 숙과와 (Solanum habrochaites introgression line) 빨간색 숙과를 갖는 E6203 (Solanum lycopersicum)의 과색 차이가 카로티노이드 구성 및 함량 차이에 기인한 것인지 확인하기 위해 B+10 과실을 이용해 카로티노이드 분석을 실시하였다.

그 결과, IL8A에서 카로티노이드의 총 함량은 36.45 μg g^-1FW로 E6203 (147.00 μg g^-1FW)과 비교하였을 때 4.03배 감소하였다. IL8A에서 cis-리코펜과 trans-리코펜 함량은 각각 E6203보다 4.47배 그리고 3.81배 감소하였다. β-카로틴과 루테인은 E6203에서는 검출되었으나 IL8A 과실에서는 검출되지 않았다. 그리고 피토엔, phytofluene, and ζ-카로틴은 E6203과 IL8A에서 유사한 함량을 보였다(도 1). 이러한 결과로 IL8A 과색은 E6203과 비교하였을 때 각각의 카로티노이드 구성성분의 함량 차이로 인해 짙은 오렌색을 나타냈다.

<2-2> Map-based cloning 및 후보유전자 선발

IL8A의 짙은 오렌지 과색을 조절하는 유전자를 선발하기 위해 E6203과 IL8A를 양친으로 한 F2 분리집단을 작성하였다. 총 212개의 F2 식물에서 숙과의 과색은 3:1 (짙은 오렌지색 162 : 빨간색 50)로 분리하였으며 따라서 짙은 오렌지색은 단일 우성 유전자에 의해 조절될 것으로 예상되었다. IL8A 과색을 조절하는 유전자를 찾기 위해 F2 분리집단을 이용해 map-based cloning을 진행하였다.

그 결과, IL8A에서 야생종 S.habrochaites의 염색체 위치는 마커와C2_At4g19003를 이용하여 8번 염색체의 53.5-60.1 Mb에 이입된 것을 확인하였다 (도 2). F2 분리집단에서 4개의 마커(a, b, k 및 l)를 이용해 53.5 Mb에서 57.6 Mb 지역에 재조합형을 갖는 27개의 개체를 확인하였다(도 2A). 이 재조합형은 6개의 (c, e, f, g, h, 및 i) 추가적인 마커를 이용하여 스크리닝하였고 마커 g와 h 사이의 400 Kb (56.6 to 57.0 Mb) 지역에 후보유전자가 있을 것으로 예상되었다. 이 지역에 위치하는 유전자 33개의 목록을 Jbrowse (https://solgenomics.net/jbrowse_solgenomics)의 ITAG2.4 gene model에서 확인하였다. 이중 카로티노이드 분열 반응과 관련된 유전자 SlCCD4a (solyc08g075480)와 SlCCD4b (solyc08g075490)가 위치하는 것을 확인하였다. 두 유전자의 발현을 E6203과 IL8A의 숙과에서 비교 분석한 결과, 두 토마토에서 SlCCD4a의 발현 차이는 미미한 반면 SlCCD4b의 발현은 IL8A에서 E6203보다 약 8,000배 이상 증가하는 것을 확인하였다(도 2B).

따라서 IL8A 오렌지 과색을 조절할 것으로 예상되는 후보유전자로 SlCCD4b를 선정하여 이후의 실험을 진행하였다.

<2-3> ShCCD4b 분리 및 서열 확인

SlCCD4b는 594개의 아미노산으로 구성된 단백질을 encoding 하며 ChloroP 1.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP)을 통해 N-terminal의 67개의 아미노산이 단백질의 위치에 관여하는 chloroplast transit peptide (cTP)일 것으로 예상되었다. IL8A 분리한 ShCCD4b는 593개의 아미노산으로 구성된 단백질을 encoding 하며 N-terminal의 66개의 아미노산이 cTP일 것으로 예상되었다. ShCCD4b는 아미노산 수준에서 SlCCD4b와 98.65%의 유사성을 보였으며, SlCCD4a와 76.92% 유사성을 보였다. SlCCD4b의 뉴클레오티드 서열과 비교하였을 때 ShCCD4b의 코딩 지역에는 6개의 변이가 시작코돈부터 -2.5 Kb까지의 프로모터 지역에는 총 25개의 변이가 있는 것을 확인하였다.

그 결과, 아미노산 서열 중 carotenoid cleavage activity를 위해 cofactor인 Fe²⁺를 결합하는데 필요한 4개의 히스티딘 (histidine) 잔기 (residues) 및 이 결합을 보조해주는 3개의 아스파르트산(aspartate) (또는 글루타메이트(glutamate)) 잔기 모두 SlCCD4a, SlCCD4b, ShCCD4b에 보존되어 있는 것을 확인하였다(도 4) (Huang et al., 2009).

따라서 아미노산 염기서열 결과로는 SlCCD4a, SlCCD4b, ShCCD4b 모두 carotenoid cleavage activity를 가질 수 있는 것으로 예상되었다.

IL8A의 ShCCD4b 발현이 E6203보다 8,000배 이상 증가하였기 때문에 시작코돈부터 -2.5 Kb까지의 프로모터 지역에서 전사 결합 위치의 차이를 비교하였다 (http://plantpan.itps.ncku.edu.tw/). E6203과 IL8A의 프로모터에 예상되는 전사 조절 결합 위치는 시작코돈부터 -1.6 Kb까지 큰 차이가 있었으며 이 차이에 의해서 두 유전자의 발현 차이가 유도될 것으로 예상되었다.

ShCCD4b의 subcellular localization을 확인하기 위해 종결코돈이 제외된 ShCCD4b의 C-terminal에 GFP 단백질을 fuse (ShCCD4b-GFP)하였다. 이 fusion 단백질은 Agroinfiltration을 통해 담배 (N. benthamiana)에 접종하여 CaMV 35S 프로모터 하에서 일시적인 발현이 유도되었다. 접종 후 6일 후 담배잎을 샘플링하여 confocal laser 현미경으로 ShCCD4b의 세포 내 위치를 확인하였다. ShCCD4b를 fuse 하지 않은 대조군의 경우 세포 전반에 걸쳐 GFP 시그널이 관찰된 반면 ShCCD4b-GFP는 색소체내에서 GFP 시그널이 관찰되었으며 플라스토글로불(plastoglobule)일 것으로 예상되었다. 색소체는 카로티노이드의 합성과 저장이 이루어지는 장소이며 따라서 ShCCD4b는 이곳에 위치하며 카로티노이드를 기질로써 쉽게 소비할 수 있을 것이다.

<2-4> ShCCD4b 과발현 형질전환체의 카로티노이드 함량 분석

증가된 ShCCD4b의 발현이 IL8A의 짙은 오렌지 과색에 관여하는지 알아보기 위해, E6203 토마토에 ShCCD4b의 과다발현을 유도한 형질전환 식물을 제작하였다. 32개의 형질전환체 중 짙은 오렌지 숙과색을 갖는 3개의 독립적인 개체 (#4, #10, #14)를 선발하였다(도 5).

E6203, 8A, 그리고 선발된 3개체와 azygous의 숙과에서 SlCCD4a와 SlCCD4b 유전자의 발현을 확인한 결과 SlCCD4a의 경우 #4번 개체에서 E6203보다 7배 증가하고 이외의 개체에서는 통계적인 유의성이 없었다. SlCCD4b의 경우 모든 형질전환체의 과실에서 E6203보다 발현이 약 600배 정도 증가하였다(도 6).

ShCCD4b를 과발현하는 T0와 T1 세대 식물의 과실에서 카로티노이드를 추출하여 분석하였다(표 2). ShCCD4b를 과발현하는 과실에서 카로티노이드 함량의 유형은 E6203과는 달랐지만 IL8A와는 유사하였다. E6203과 비교하였을 때 T0 세대에서는 #4 와 #14의 모든 과실에서 상위 물질인 피토엔, 파이토플루엔(Phytofluene), ζ-카로틴, 및 뉴로스포렌(Neurosporene) 함량은 증가하였으나 cis-리코펜, trans-리코펜, β-카로틴, 및 루테인 함량은 감소하였다. #10의 T0 과실에서는 상위 물질의 감소는 관찰되지 않았으나 cis-리코펜, trans-리코펜, β-카로틴, 및 루테인 함량은 감소하였다. #4와 #14의 T1 과실에서 카로티노이드 함량은 E6203과 비교하였을 때 피토엔과 파이토플루인에서는 차이가 없었으며 다른 구성성분들은 T0과 유사하였다.

E6203, IL8A 그리고 선발된 세 형질전환체의 과실에서 카로티노이드 생합성 유전자의 발현을 확인한 결과 모든 유전자에서 E6203과의 유의성이 확인되지 않았다(도 7). 따라서 IL8A와 형질전환 과실에서 리코펜 하위의 카로티노이드 함량이 감소하는 이유는 카로티노이드 생합성 유전자들의 발현차이에 의한 것이 아니며, SlCCD4b 발현의 증가로 합성된 카로티노이드가 기질로 소비된 결과일 것으로 예상되었다. 따라서 과실에서 함량이 감소한 cis-리코펜, and trans-리코펜, β-카로틴, 그리고 루테인이 ShCCD4b의 기질로 사용될 것으로 예상되었다.

E6203과 IL8A의 꽃, 잎, 뿌리에서 SlCCD4a와 SlCCD4b의 발현을 확인 한 결과, 꽃에서 SlCCD4a의 발현이 IL8A에서 E6203보다 4배 증가하였다. 꽃에서 SlCCD4b 발현과 잎에서 SlCCD4a와 SlCCD4b 발현은 모두 IL8A에서 발현이 감소하였다. 뿌리에서는 두 유전자 모두 E6203과 IL8A에서 유사하게 발현하였다. E6203, IL8A, 형질전환체의 꽃과 잎에서 카로티노이드를 추출하여 분석한 결과, 꽃에서는 IL8A, #4, 그리고 #14에서 루테인의 함량이 E6203보다 감소하였다(표 3). 이 외에

-카로틴, zeaxanthin, anthraxanthin, violaxanthin, 그리고 neoxanthin의 함량은 통계적으로 유의성이 없었다. 잎에서는 IL8A에서 루테인, β-카로틴, zeaxanthin, neoxanthin, 그리고 chlorophyll b가 E6203과 비교하였을 때 통계적으로 유의하게 감소하였으며, 형질전환체의 카로티노이드 함량은 E6203과 유사하였다. 토마토 조직 별 RPKM 데이터에 의하면 꽃에서는 SlCCD4a가, 잎에서는 SlCCD4b가 주요하게 발현하는 유전자로 보고되었다. (The Tomato Genome Consortium, 2012) 따라서 IL8A의 꽃에서 카로티노이드 함량이 E6203보다 감소한 것은 꽃의 주요하게 발현하는 유전자인 SlCCD4a의 발현이 증가하여 카로티노이드를 기질로써 많이 소비한 결과로 예상된다. 잎에서 카로티노이드 함량의 변화가 없는 것은 SlCCD4b가 이미 잎에서 충분히 발현하여 활성을 가지기 때문으로 예상된다. ShCCD4b의 과발현이 CCD4 cleavage activity에 영향을 주지 않는 것으로 예상된다. 따라서 ShCCD4b가 과실에서 IL8A의 짙은 오렌지색을 조절 하는 데에는 유전자 발현의 영향이 클 것으로 예상되었다.

<2-5> ShCCD4b 과발현 형질전환체 과실의 아포카로티노이드 함량 분석

E6203, 8A, 그리고 선발된 형질전환체의 토마토 숙과에서 GC-MS를 이용하여 아포카로티노이드를 분석하였다.

그 결과, MHO와 cirtal은 모든 형질전환체와 IL8A에서 E6203보다 감소하였다. #4 그리고 #14 형질전환체의 숙과에서 geranylacetone은 E6203과 비교하였을 때 각각 2.05배, 3.34배 증가하였다. β-이오논 함량은 E6203과 비교하였을 때 #14 과실에서는 1.68배 증가하였으며 #4 과실에서는 비슷한 수준을 보였다. α-이오논은 #4 및 #14 과실에서만 검출되었다(도 8). MHO와 citral의 기질은 라이코펜으로써 형질전환 과실에서 이들 함량의 감소는 기질인 라이코펜의 함량이 감소했기 때문일 것으로 예상되었다. 형질전환체의 숙과에서 증가한 각각의 아포카로티노이드 합성을 위한 기질은 α-카로틴, δ-카로틴 (α-이오논), ζ-카로틴, 피토엔 (geranylacetone), 그리고 β-카로틴 (β-이오논)이며 모두 기질의 C9-C10 (C9'-C10') 이중결합을 끊음으로써 생산된다. 따라서 in planta 수준에서는 예상되는 ShCCD4b의 기질은 α-카로틴, δ-카로틴, ζ-카로틴, 리코펜, 피토엔, β-카로틴이며 이들의 C9-C10 (C9'-C10') 이중결합을 끊음으로써 α-이오논, geranylacetone, β-이오논 합성에 관여할 것으로 예상되었다.

<2-6> Enzymatic assay

ShCCD4b의 기질과 cleavage site 그리고 최종 산물에 대한 효소 활성을 면밀히 알아보기 위해 피토엔, ζ-카로틴, 라이코펜, δ-카로틴, β-카로틴, 제아잔틴을 각각 합성하는 E. coli 균주에 ShCCD4b의 발현을 유도하였다. 각각의 균주과 (대조군) ShCCD4b의 발현을 유도한 균주의 (+ShCCD4b) 펠렛 색상을 육안으로 비교하였을 때 피토엔을 제외한 모든 ShCCD4b가 유도된 균주에서 펠렛의 색상이 대조군 보다 연해지는 것을 확인하였다(도 9). 피토엔의 경우 대조군의 펠렛과 ShCCD4b 발현이 유도된 균주의 펠렛 모두 흰색이어서 육안으로는 펠렛 색의 차이를 확인할 수 없었다. ShCCD4b의 기질로 사용되는 카로티노이드와 합성되는 아포카로티노이드를 확인하기 위해 GC-MS를 이용하여 휘발성 아포카로티노이드를 분석하였다.

그 결과, 피토엔, δ-카로틴, 그리고 제아잔틴에 ShCCD4b 발현을 유도한 균주에서는 아포카로티노이드가 검출되지 않아 ShCCD4b의 기질로써 소비되지 않을 것으로 예상되었다. 그리고 ζ-카로틴, 라이코펜에 ShCCD4b의 발현을 유도하였을 때에는 24.78분에 geranylacetone이 검출되었으며, β-카로틴에 ShCCD4b의 발현을 유도하였을 때에는 25.44분에 β-이오논이 검출되었다(도 10). 구조적 특성으로 보았을 때 리코펜은 geranylacetone으로 변환될 수 없다. 따라서 리코펜 균주에서 관찰된 geranylacetone은 ζ-카로틴 에서 리코펜d으로 합성 되기 전에 ζ-카로틴을 기질로 하여 합성 되었을 것으로 예상되었다. 따라서 in vivo assay에서는 ShCCD4b가 ζ-카로틴, β-카로틴의 C9-C10 (C9'-C10') 이중결합을 끊음으로써 9 geranylacetone과 β-이오논 합성에 관여하는 것으로 예상되었다.

ShCCD4b 과발현 형질전환체에서 숙과의 카로티노이드 함량과 아포카로티노이드 함량 분석 결과 및 효소 분석을 통한 아포카로티노이드 분석 결과를 종합해 보았을 때 ShCCD4b는 ζ-카로틴과 β-카로틴의 C9-C10 (C9'-C10) 이중결합을 끊음으로써 geranylacetone과 β-이오논을 생산하는 촉매작용을 할 것으로 예상된다. 또한 효소반응에서 δ-카로틴+ShCCD4b 균주에서는 아포카로티노이드가 검출되지 않았으나 ShCCD4b를 과발현시킨 과실에서는 α-이오논이 검출된 결과를 통해 ShCCD4b는 α-이오논을 생산하기 위한 기질로써 α-카로틴을 소비할 것으로 예상되었다.

ShCCD4b 과발현에 의한 짙은 오렌지색의 과색은 3종류의 기작에 의해 조절될 것으로 예상된다.

1. ShCCD4b에 의해 ζ-카로틴과 β-카로틴이 기질로 소비됨에 따라 함량이 감소한다.

2. 카로티노이드 생합성 과정 중 ζ-카로틴과 라이코펜 사이에서 합성되는 물질이 ShCCD4b에 의해 카로티노이드 생합성의 항상성을 조절할 것으로 예상되는 apocarotenoid signaling molecule을 생산함으로써 피토엔 합성을 조절하고 이에 따라 피토엔 하위 물질 또한 함량이 유지된다. E6203과 ShCCD4b를 과발현하는 과실에서 PSY1 뿐만 아니라 모든 카로티노이드 생합성 유전자간의 발현차이는 없었으므로 apocarotenoid signaling molecule에 의해 PSY 합성을 조절되는 것은 효소 수준에서 이루어질 것으로 예상된다.

3. 이 알려지지 않은 signaling molecule을 생산하기 위해 리코펜 상위 물질이 기질로 소비되면서 E6203에 비해 ζ-카로틴에서 리코펜으로 전환될 수 있는 물질의 양이 줄어듦에 따라 리코펜의 함량이 감소되고 리코펜 하위 물질인 β-카로틴과 루테인의 합성 또한 감소된다. 루테인 함량 저하에는 ShCCD4b가 α-카로틴으로부터 α-이오논을 생산하는 촉매 과정도 영향을 미칠 것이다.

현재 재배되고 있는 토마토는 야생종이나 재래종에 비해 향미 물질의 함량이 적고, 따라서 향미를 향상시키는 것은 토마토의 중요한 육종 목표 중 하나이다. 토마토의 소비자 선호 향미 물질인 MHO, citral, geranylacetone, β-이오논 등은 ShCCD4b의 촉매작용을 통해 생산된다. ShCCD4b 과발현에 의한 토마토 향미 관련 아포카로티노이드 변화는 2가지 유형으로 구분된다.

1. ShCCD4b이 기질인 ζ-카로틴과 β-카로틴의 C9-C10 (C9'-C10') 이중결합을 끊음으로써 geranylacetone과 β-이오논의 함량이 증가한다.

2. 리코펜은 ShCCD4b의 기질로 소비되지는 않지만 생합성 과정 중 함량이 감소됨에 따라 이를 기질로 하여 생산되는 아포카로티노이드인 MHO와 citral의 함량도 감소한다.

ShCCD4b에 의해 생산되는 아포카로티노이드 중 β-이오논은 odor threshold가 0.007 nL/L로 매우 낮다 (Goff and Klee, 2006). 따라서 미미한 양의 변화도 소비자의 감도(sensitivity)에는 크게 영향을 줄 것으로 예상된다.

<2-7> 식물 생장에서 과발현된 ShCCD4b의 영향

ShCCD4b 과발현이 식물 생장에 영향을 주는지 알아보기 위하여 초장, 분지 수, 분지 길이, 뿌리 길이 등을 조사하였다. 10주 된 E6203, IL8A, 그리고 ShCCD4b 과발현 형질전환체에서 식물의 초장, 분지 수, 분지 길이를 조사한 결과 유의 있는 차이는 없었으며 식물 생장에서 형태적 차이는 관찰되지 않았다(도 11). 6주 된 식물 15개 이상을 이용하여 뿌리 길이를 측정한 결과 ShCCD4b를 과다발현시킨 형질전환체에서 E6203보다 17.05~29.37% 가량 뿌리길이가 긴 것을 확인하였다(도 12). 따라서 ShCCD4b의 과발현은 식물의 shoot 생장에는 영향을 주지 않으나 뿌리 발달은 강화시키는 것으로 예상된다.

따라서 본 연구를 통해 야생종에서 분리한 ShCCD4b의 기능 및 ShCCD4b 과발현으로 인한 토마토 과색, 과향, 뿌리 발달의 변화를 규명하였으며 이는 토마토의 심미적, 영양학적 가치를 향상시키는데 유용할 것이다.

<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Method for increasing color, Aroma and root development in plant <130> PN1910-544 <160> 52 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1782 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> ShCCD4b_cDNA <400> 1 atggatgctt tgtcttcaac tttcctttct acattatcac aaaaacctaa atctcttctt 60 tctccttata ataataataa taattatcat tactattctc ctactctaaa agtattttct 120 gttagaattg aagaaagacc acaaacaacc actactatag caaaaccaca agaaaaatca 180 accccttcac caccaaaacc atctccaaaa agagaaccaa taccctcaag aaaacctatt 240 gaaccatcat ttccctcttt tatcttcaat gcattcgatg atttcgtaaa tactttcatt 300 gatccaccta ggaaatcgtc tattgatcca aggtatgttc tctctaacaa ctttgctcca 360 gtagacgaac ttcctcctac tgaatgcgaa gtagtggaag gctcccttcc ctcttgccta 420 gacggcgcgt atattagaaa tgggcctaac cctcaatatc ttccacgtgg accttaccat 480 cttttcgacg gtgatggcat gcttcactct attaaaattt cccaaggtaa agctacgtta 540 tgtagtcgat ttgtcaaaac ttacaagtac aacatcgaaa atgaagccgg atcgcccatt 600 attcctaatg tgttctccgg tttcaacggt cttaccgcct cggccgcgcg tggtgcactc 660 accgcggccc gagctattgc gggacagttc aatcccgcaa acggtatagg ccttgcgaat 720 acaagcttag ctttatttgg aggtaaactt ttcgccctcg gtgaatctga tttaccatat 780 gaggtaaaaa tagccccaaa tggtgacatt tttaccctcg gccgtcacga ttttaacgga 840 aaactttcta tgagcatgac ggcacatccg aaaatcgacc ccgaaactaa cgaggctttt 900 gctttccgtt acggcccgat acctccgttt ataacttact ttcgggtcaa cccggatggt 960 acaaaaaccc aggatgtacc catattctca atgacccgcc cgtcatttct tcatgacttt 1020 gcaatcacaa aaaaatacgc gatattttcg gacatacaaa ttggaatgaa tccaattgat 1080 ttactcaccg gtggttcacc ggtgggtact gactcgggga aaattccccg aattggtgtg 1140 ataccacgtt acgccaaaga tgagtcggaa atgaggtggt ttgatgtatc aggatttaat 1200 attgtacacg cgatcaatgc gtgggatgag gatggaggtg atacgatagt gttgatcgcg 1260 ccgaatatat tatcggtgga acacacacta gagaggatgg acatgataca tgcaagtgtt 1320 gagaaagtga aaataaattt gaagacagga atggtgagca gacatccaat ttctacaaga 1380 aatcttgatt ttggagtcat caatccagct tatgttggga aaaagaacaa gtacgtatat 1440 gcagccattg ggggtcctat gccaaaagta atagggatag caaaattaga cgtatccgta 1500 gcagaaattg atcgtcgcga ttgcatcgtg gcatgtcgta tatttggaaa agattgctat 1560 ggtggtgaac catttttcgt gcctaaaaat ccttcgattg atgaagacga tggctacgtg 1620 gtgtcatacg tacacaatga gaagacaggg gaatcaaatt ttttggtcat ggatgcaaca 1680 tcacctaatc ttgacattgt ggctaatgtc aaattgcctc atcgtgtgcc atatggtttc 1740 catggacttt tcgtgagtga aaatgatctt atgaagctat aa 1782 <210> 2 <211> 593 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> ShCCD4b_protein <400> 2 Met Asp Ala Leu Ser Ser Thr Phe Leu Ser Thr Leu Ser Gln Lys Pro 1 5 10 15 Lys Ser Leu Leu Ser Pro Tyr Asn Asn Asn Asn Asn Tyr His Tyr Tyr 20 25 30 Ser Pro Thr Leu Lys Val Phe Ser Val Arg Ile Glu Glu Arg Pro Gln 35 40 45 Thr Thr Thr Thr Ile Ala Lys Pro Gln Glu Lys Ser Thr Pro Ser Pro 50 55 60 Pro Lys Pro Ser Pro Lys Arg Glu Pro Ile Pro Ser Arg Lys Pro Ile 65 70 75 80 Glu Pro Ser Phe Pro Ser Phe Ile Phe Asn Ala Phe Asp Asp Phe Val 85 90 95 Asn Thr Phe Ile Asp Pro Pro Arg Lys Ser Ser Ile Asp Pro Arg Tyr 100 105 110 Val Leu Ser Asn Asn Phe Ala Pro Val Asp Glu Leu Pro Pro Thr Glu 115 120 125 Cys Glu Val Val Glu Gly Ser Leu Pro Ser Cys Leu Asp Gly Ala Tyr 130 135 140 Ile Arg Asn Gly Pro Asn Pro Gln Tyr Leu Pro Arg Gly Pro Tyr His 145 150 155 160 Leu Phe Asp Gly Asp Gly Met Leu His Ser Ile Lys Ile Ser Gln Gly 165 170 175 Lys Ala Thr Leu Cys Ser Arg Phe Val Lys Thr Tyr Lys Tyr Asn Ile 180 185 190 Glu Asn Glu Ala Gly Ser Pro Ile Ile Pro Asn Val Phe Ser Gly Phe 195 200 205 Asn Gly Leu Thr Ala Ser Ala Ala Arg Gly Ala Leu Thr Ala Ala Arg 210 215 220 Ala Ile Ala Gly Gln Phe Asn Pro Ala Asn Gly Ile Gly Leu Ala Asn 225 230 235 240 Thr Ser Leu Ala Leu Phe Gly Gly Lys Leu Phe Ala Leu Gly Glu Ser 245 250 255 Asp Leu Pro Tyr Glu Val Lys Ile Ala Pro Asn Gly Asp Ile Phe Thr 260 265 270 Leu Gly Arg His Asp Phe Asn Gly Lys Leu Ser Met Ser Met Thr Ala 275 280 285 His Pro Lys Ile Asp Pro Glu Thr Asn Glu Ala Phe Ala Phe Arg Tyr 290 295 300 Gly Pro Ile Pro Pro Phe Ile Thr Tyr Phe Arg Val Asn Pro Asp Gly 305 310 315 320 Thr Lys Thr Gln Asp Val Pro Ile Phe Ser Met Thr Arg Pro Ser Phe 325 330 335 Leu His Asp Phe Ala Ile Thr Lys Lys Tyr Ala Ile Phe Ser Asp Ile 340 345 350 Gln Ile Gly Met Asn Pro Ile Asp Leu Leu Thr Gly Gly Ser Pro Val 355 360 365 Gly Thr Asp Ser Gly Lys Ile Pro Arg Ile Gly Val Ile Pro Arg Tyr 370 375 380 Ala Lys Asp Glu Ser Glu Met Arg Trp Phe Asp Val Ser Gly Phe Asn 385 390 395 400 Ile Val His Ala Ile Asn Ala Trp Asp Glu Asp Gly Gly Asp Thr Ile 405 410 415 Val Leu Ile Ala Pro Asn Ile Leu Ser Val Glu His Thr Leu Glu Arg 420 425 430 Met Asp Met Ile His Ala Ser Val Glu Lys Val Lys Ile Asn Leu Lys 435 440 445 Thr Gly Met Val Ser Arg His Pro Ile Ser Thr Arg Asn Leu Asp Phe 450 455 460 Gly Val Ile Asn Pro Ala Tyr Val Gly Lys Lys Asn Lys Tyr Val Tyr 465 470 475 480 Ala Ala Ile Gly Gly Pro Met Pro Lys Val Ile Gly Ile Ala Lys Leu 485 490 495 Asp Val Ser Val Ala Glu Ile Asp Arg Arg Asp Cys Ile Val Ala Cys 500 505 510 Arg Ile Phe Gly Lys Asp Cys Tyr Gly Gly Glu Pro Phe Phe Val Pro 515 520 525 Lys Asn Pro Ser Ile Asp Glu Asp Asp Gly Tyr Val Val Ser Tyr Val 530 535 540 His Asn Glu Lys Thr Gly Glu Ser Asn Phe Leu Val Met Asp Ala Thr 545 550 555 560 Ser Pro Asn Leu Asp Ile Val Ala Asn Val Lys Leu Pro His Arg Val 565 570 575 Pro Tyr Gly Phe His Gly Leu Phe Val Ser Glu Asn Asp Leu Met Lys 580 585 590 Leu <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Solyc08g067260.2 (a)_F <400> 3 ggctcgagaa gaacatcttc tatc 24 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Solyc08g067260.2 (a)_R <400> 4 catcacttgg cttgtaacat gc 22 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sgn-U580823 (b)_F <400> 5 caaacaatgt gatcttgtgg aag 23 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sgn-U580823 (b)_R <400> 6 gcaaccatta tcaacagaga cac 23 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Solyc08g068290.2 (c)_F <400> 7 ggttggtatc tcaaacatga ttgg 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Solyc08g068290.2 (c)_R <400> 8 gtctcccatt atttcttgtg ttca 24 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Solyc08g068780.1(d)_F <400> 9 ttcccaactt tctataactc tccc 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Solyc08g068780.1(d)_R <400> 10 ccatgcatac cataacaaca ctca 24 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Solyc08g075240.2 (e)_F <400> 11 gataaacaat agattgcaac atcc 24 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Solyc08g075240.2 (e)_R <400> 12 acctgagtgt agaatacaag gaga 24 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Solyc08g075310.2 (f)_F <400> 13 gaagatcgaa tcgtgattaa cg 22 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Solyc08g075310.2 (f)_R <400> 14 cattcaatgc agcacaaact ac 22 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Solyc08g075390.2 (g)_F <400> 15 tctcctgctt tacgaagcaa gg 22 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Solyc08g075390.2 (g)_R <400> 16 ggaattcaac ttatggaaag atag 24 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Solyc08g075710.2 (h)_F <400> 17 atgctgtgct tttagttgtg cttg 24 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Solyc08g075710.2 (h)_R <400> 18 cgtggtgcat ttgcatactt aatc 24 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Solyc08g075890.2 (i)_F <400> 19 tggttggttc cagagtgcag aa 22 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Solyc08g075890.2 (i)_R <400> 20 gttgatgcaa cagtatcacc ag 22 <210> 21 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C2_At5g11490(j)_F <400> 21 atggagccat gattgtatag cagttg 26 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C2_At5g11490(j)_R <400> 22 agctcccaag gctttctgag tctc 24 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Solyc08g076250.1(k)_F <400> 23 agtacttcca catcatgttc ttag 24 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Solyc08g076250.1(k)_R <400> 24 aagatcatga acctcatctt gtcg 24 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Solyc08g076430.2 (l)_F <400> 25 tatctttcag agcaatccaa gaag 24 <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Solyc08g076430.2 (l)_R <400> 26 tatttggaaa aatcaaccta ccag 24 <210> 27 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C2_At4g19003(m)_F <400> 27 actagggaga agcagataca actatgg 27 <210> 28 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C2_At4g19003(m)_R <400> 28 accccagaac gtatttcttc aactgtc 27 <210> 29 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCD4-CAPS_F <400> 29 gatacctccg tttataactt ac 22 <210> 30 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCD4-CAPS_R <400> 30 cattcctgtc ttcaaattta ttttc 25 <210> 31 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCD4-eGFP_F <400> 31 ggcgcgcctc tagaatggat gctttgtctt caac 34 <210> 32 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCD4-eGFP_R <400> 32 ggcgcgccgt cgactagctt cataagatca ttttc 35 <210> 33 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCD4-LIC_F <400> 33 cgacgacaag accctatgga tgctttgtct tcaactttc 39 <210> 34 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCD4-LIC_R <400> 34 aggagaagag ccctttatag cttcataaga tcattttcac t 41 <210> 35 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCD4-OX-2_F <400> 35 caagaaaaat caaccccttc ac 22 <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCD4-OX-2_R <400> 36 tcgaaaagat ggtaaggtcc ac 22 <210> 37 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCD4-OX-4_F <400> 37 aacccaggat gtacccatat tct 23 <210> 38 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCD4-OX-4_R <400> 38 tcattttcac tcacgaaaag tcc 23 <210> 39 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TrcHis2-NCED_F <400> 39 ccatctccaa aaagagaac 19 <210> 40 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TrcHis2-NCED_R <400> 40 ttatagcttc ataagatcat tttc 24 <210> 41 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCD4-cis-1_F <400> 41 atctggtcat gatgagatat atc 23 <210> 42 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCD4-cis-1_R <400> 42 gggttttgtg ataatgtaga aagg 24 <210> 43 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCD4-cis-2_F <400> 43 caaaatgaag aaagagtgat gctc 24 <210> 44 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCD4-cis-2_R <400> 44 gatgtgttca aaagacaatt caatc 25 <210> 45 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCD4-cis-3_F <400> 45 aggcaatttg ggaggatgta ttag 24 <210> 46 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCD4-cis-3_R <400> 46 cgtcgtcagt agataaaagt taac 24 <210> 47 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCD4b-qRT_F <400> 47 gacaggaatg gtgagcagac atc 23 <210> 48 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCD4b-qRT_R <400> 48 cctattactt ttggcatagg accc 24 <210> 49 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCD4a-qRT_F <400> 49 tagtggggta gtgagtagac atcc 24 <210> 50 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCD4a-qRT_R <400> 50 cctgataact taggtggagg gtac 24 <210> 51 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Actin-qRT_F <400> 51 cctcagcaca ttccagcag 19 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Actin-qRT_R <400> 52 ccaccaaact tctccatccc 20

Claims

서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 야생종 토마토 유래 ShCCD4b(Solanum habrochaites carotenoid cleavage dioxygenase 4) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포에 형질전환시켜 CCD4 유전자를 과발현 하는 단계를 포함하는 식물체의 과색, 과향 및 뿌리 발달 증진 방법.
서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 야생종 토마토 유래 ShCCD4b(Solanum habrochaites carotenoid cleavage dioxygenase 4) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 비형질전환체에 비해 식물체의 과색, 과향 및 뿌리 발달이 증대된 형질전환 식물체의 제조방법.
제2항의 방법에 의해 제조된 과색, 과향 및 뿌리 발달이 증대된 형질전환 식물체.
제3항에 따른 식물체의 형질전환된 종자.
서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 야생종 토마토 유래 ShCCD4b(Solanum habrochaites carotenoid cleavage dioxygenase 4) 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 식물의 식물체의 과색, 과향 및 뿌리 발달 증대용 조성물.