CN101360828A - 植物中类胡萝卜素的增强 - Google Patents

Abstract

本发明涉及增强植物、植物细胞、愈伤组织、组织、果实、根或植物的其它部分中类胡萝卜素和其它类异戊二烯(优选番茄红素和β－胡萝卜素)的含量，和/或涉及增加植物的高度的方法，涉及由这种方法产生的植物、植物细胞、愈伤组织、组织、根或果实，涉及获得类胡萝卜素(优选番茄红素和β－胡萝卜素)的方法，涉及核酸构建体以及涉及这种核酸构建体的使用。

Description

植物中类胡萝卜素的增强

技术领域

本发明涉及增强植物、植物细胞、愈伤组织、组织、果实、根或植物的其它部分中类胡萝卜素和其它类异戊二烯(优选番茄红素和β-胡萝卜素)的含量，和/或涉及增加植物的高度的方法，涉及由这种方法产生的植物、植物细胞、愈伤组织、组织、根或果实，涉及获得类胡萝卜素(优选番茄红素和β-胡萝卜素)的方法，涉及核酸构建体以及涉及这种核酸构建体的使用。

背景技术

在现代的疾病和病患中，癌和心血管疾病都排名靠前，并且影响很大一部分人群。已经将这些疾病与诸如活性氧簇(其引起对细胞膜、DNA和其它细胞功能的损伤)之类的因素关联。因此，抗氧化剂已经成为十分普及的食品添加剂，在所有年龄群体中，许多食品(例如新鲜水果、果汁、植物提取液和片剂)都可以使用并且每天消费以保持健康。这类化学物质包括维生素C和维生素E、多酚、黄酮醇和类胡萝卜素。由于人不能合成任何这些物质，它们要从微生物来源的植物获得。与活性氧簇猝灭有关的关键物质的其中一类是多元醇和多烯。众所周知，番茄红素(β-胡罗卜素的开链异构体)是一种最有效的抗氧化剂，为β-胡萝卜素的单线态氧猝灭能力的两倍和α生育酚的单线态氧猝灭能力的10倍。此外，其为人血浆中最主要的类胡萝卜素(Kaliora等，2005)。

番茄红素在血浆中的稳定性及其优越的猝灭能力使其在其产生和疾病治疗方面成为受到广泛研究的化合物。它的11个共轭双键和2个非共轭双键使其表征为红色(在472-476nm下出现峰吸收度)。在另外可能的1056种异构体中，大约12种在自然界中发现为直链全反式异构体，为最稳定且在植物中发现的。这种化合物是多不饱和烃，为亲脂性，并且对光、热和氧化作用敏感(Faulks和Southon，2005)。

番茄红素和饮食

番茄红素富含于多种水果和蔬菜中，例如葡萄柚、番石榴汁、西瓜、番茄中。在番茄中，红色大部分由番茄红素引起并且高-番茄红素水果表现出增强的红色。在植物，发现番茄红素为全反式形式，并且难以从不经烹饪的食物吸收。在油存在下加热已经显示了更好的可提取性，并且已经发现某些番茄产品(例如番茄汁、蕃茄糊、番茄酱和番茄沙司)具有更好(即更高量)的番茄红素。已经显示烹饪使番茄红素异构化为顺式构型，该构型增加了其生物利用率。此外在血清中，大多数番茄红素为顺式形式。据估计，每天需要35mg番茄红素并且可能目前不是消费者当前摄入的部分(Faulks和Southon，2005)。

番茄红素和健康

活性氧簇(ROS)由许多途径产生，凭借这些途径能量被转移至基态三线态氧，使其成为高度活性的受激单线态氧。这种物质能够造成脂、蛋白质和DNA损伤。ROS因而与衰老症状、癌和心血管疾病有关。由于富含不饱和键以及这些键的共轭，类胡萝卜素分子可以猝灭来自单线态氧的能量。伴随该步骤，类胡萝卜素获得激发态，激发态的类胡萝卜素随后通过与溶剂环境相互作用耗散为热。完成一个猝灭反应后，类胡萝卜素再生以进行另一个反应。有些估计认为，类胡萝卜素可以猝灭大约1000个单线态氧后，它们才分解(Krinsky，1998、Bhuvaneswari和Nagini 2005、Gruszecki和Strzalka，2005)。

由于ROS引起的氧化损伤，已经将其与许多慢性疾病相关联。继而，又已经将抗氧化剂与保护脂类、膜、低密度脂蛋白、蛋白质和DNA免受损伤相关联。更具体来讲，已经证明番茄红素能预防癌和心血管疾病。几个研究已经发现，番茄红素通过结合至亲脂性部分，保护这种复合物免受氧化损伤。此外还建议将其用来防止致癌物质诱导的p53和Rb抗癌基因的磷酸化，并使细胞分裂停止于G0-G1期。其还是HMG CoA还原酶的抑制剂，HMG CoA还原是胆固醇生物合成的关键步骤。另外，通过结合至LDL和VLDL，其阻止了胆固醇氧化物的形成并因而防止了CVD的形成(Kaliora等，2005、Agarwal和Rao 2000)。

虽然有几种转基因方法已经导致在番茄中增加了番茄红素，但是几乎没有发现天然的高番茄红素变种。历史上由Campbell Soup公司于1917在番茄鉴定的自发性突变(hp-1)、San Marzano变种(1975)修饰得到的hp-2和dg(Manapal变种，1973)已经与提高的番茄红素水平相关，并因而用于育种程序中(对于综述，参见Bramley 2002)。

植物代谢工程

对更有营养的具有增强的类胡萝卜素以及尤其是番茄红素的植物或植物产品的寻求已经使植物生物学经历了十分新且有奠基性的科学。对类胡萝卜素生物合成途径的理解和作图(对于综述，参见Fraser等，1994、Hirschberg 2001、Fraser等，2002和Bramley 2002)已经得到了丰富的信息，这些信息使得能进行提高类胡萝卜素产量的植物的代谢工程。最新进展的关键是发现，与其它生物体不同，植物经由1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸(DOXP)途径而不是甲羟戊酸途径合成类胡萝卜素。尽管两个途径都产生异戊烯基焦磷酸，但甲羟戊酸途径将碳引导进固醇、倍半萜和三萜途径中，而DOXP途径导致形成类胡萝卜素、植醇、质体醌-9和双萜(Bramley 2002、Romer和Fraser 2005)。

首先，IPP异构化为二甲基丙烯基焦磷酸(DMAPP)，其为活化的单体，该单体最终寡聚体化成牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸，牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸是C40类胡萝卜素和该途径的第一种化合物八氢番茄红素的前体。八氢番茄红素通过八氢番茄红素脱氢酶去饱和为六氢番茄红素，并进一步去饱和为ζ-胡罗卜素。接着番茄红素通过ζ-胡罗卜素脱氢酶经由链孢红素产生。有趣地是，细菌的crt1(来自噬夏孢欧文菌(Erwinia uredovora))将八氢番茄红素转化成全反式番茄红素(Ye等，2000、Bramley 2002)。尽管超出了该工作的范畴，但是也应该注意，全反式番茄红素进一步转化成α-胡罗卜素和β-胡罗卜素，其中β-胡罗卜素是维生素A前体。

鉴于其在健康上的有益效果而对植物进行工程改造和/或鉴定具有提高的番茄红素的植物已经进行了很多年，最早的一些要追溯至1917年，当时Campbell soup公司鉴定hp-1为番茄的高着色突变体(Reynard 1956)。hp-1现象的扩展由Liu等，(2004)等进行了说明，他表明hp-1的同系物DDB1、LeHY5和LeCOP1LIKE的调节影响了类胡罗卜素的生物合成(Bramley 1997)。

hp-2和dg也从天然群体得以鉴定，并与提高的类胡萝卜素水平相联系(对于综述，参见Levin)。根据这些结果，hp2和dg被确定为拟南芥属(Arabidopsis)DET1(DE-ETIOLATED1)的番茄同系物。该基因的组成型沉默导致番茄中的β-胡萝卜素和番茄红素水平升高(Davuluri等，2004)。对于hp-2，这些突变体具有严重的发育缺陷，因为它们发育受到阻碍、丛生且矮小。此外，Davuluri及其同事(2005)用RNA干扰策略降低了DET1的水平，这显著增加了类胡萝卜素的水平，导致番茄红素加倍且β-胡萝卜素增加了10倍。在类似的策略中，蓝光光感受器cry2的过表达通过降低番茄红素β环化酶而增加了番茄红素的含量(Giliberto等，2004)。

涉及类胡萝卜素的生物合成途径的酶的调节已经产生了混杂结果。Fray等，(1995)在番茄中过表达八氢番茄红素合酶基因，导致番茄红素增加以及由于赤霉酸生物合成的减少而同时导致矮化。Fraser等，(2002)进一步证明，利用多聚半乳糖醛酸酶启动子果实特异性地过表达八氢番茄红素合酶(crtB来自噬夏孢欧文菌(Erwiniauredovora))导致番茄红素增加1.8倍，八氢番茄红素、β-胡萝卜素和叶黄素也伴随增加(2.4、和2.4倍的增加)。然而，番茄中细菌八氢番茄红素脱氢酶(crtI来自噬夏孢欧文菌)的过表达(Romer等，2000)导致β-胡罗卜素增加3倍，而番茄红素含量减半。Mehta等，(2002)利用成熟诱导的E8启动子驱动的酵母S-腺苷蛋氨酸脱羧酶基因，对番茄中多胺积累进行了工程改造。果实提取物表明了120μg/mg的番茄红素的产率(大约增加了300％)。Rosati等，(2000)利用了一种不同的方法，藉此番茄红素环化酶通过反义技术失活，导致番茄红素增加。

育种者长期以来针对高番茄红素辛苦地育种，通过观察潘那利番茄(Lycopersicon pennellii)和M82(番茄(Lycopersiconesculentum))之间的75个渐渗品系，Liu等，(2003)报道，大约16个QTL决定番茄的颜色并因而决定番茄红素。

同样因为其有益的性质，番茄红素已经吸引了健康专家和植物科学家的注意。90年左右专注于发展新的策略以增加番茄中的类胡萝卜素水平说明了其重要性，并且说明尽管发展这种技术存在困难，仍然不断需要将注意力集中在番茄红素上。

发明内容

本发明的目标是提供增强植物和/或植物部分中的类胡萝卜素水平的手段。本发明的另一个目标是提供用于在植物和/或植物部分中产生增强水平的类胡萝卜素(尤其是番茄红素)的方法。本发明的还有一个目标是提供具有增强水平的类胡萝卜素，特别是番茄红素的植物或植物部分。

1本发明的目标通过增强植物、植物细胞、愈伤组织、组织、果实、根或植物其它部分中的类胡萝卜素和其它类异戊二烯(优选番茄红素和β-胡萝卜素)的含量，和/或增加植物的高度来解决，所述方法包括：

-损伤所述植物、植物细胞、愈伤组织、组织、果实、根或植物其它部分中的线粒体功能，优选损伤线粒体复合物I、II、III和/或IV，更优选损伤线粒体复合物I。

2在根据本发明方法的一个实施方案中，所述损伤利用所述植物细胞线粒体复合物I的经修饰蛋白质组分，优选为未编辑的编码序列的翻译产物的线粒体复合物I的蛋白质组分来进行。

3优选地，所述损伤通过用核酸构建体(优选DNA构建体)转化所述植物细胞，或通过用核酸构建体经由农杆菌(Agrobacterium)种介导的转化，优选根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的转化来转化所述植物细胞，或通过利用合适植物病毒(例如烟草花叶病毒)的病毒转染，或通过原生质体转化来进行。

4在本发明的一个实施方案中，所述核酸构建体(优选所述DNA构建体)或所述农杆菌包含，优选二元载体中，编码所述线粒体复合物I的所述经修饰蛋白组分的核酸。

5在本发明的一个优选的实施方案中，线粒体复合物I的所述经修饰蛋白质组分是来自不同于所述植物细胞的另一植物种的功能障碍性蛋白质或是与所述植物细胞相同的植物种的功能障碍性蛋白质。

6在根据本发明的方法的另一个实施方案中，线粒体复合物I的所述经修饰蛋白质组分是选自NAD 1、2、3、4、4L、5、6、7、9、核线粒体蛋白76Kda、55Kda、28.5Kda、22Kda和酰基载体蛋白的功能障碍性蛋白质。

7优选编码所述经修饰蛋白质组分的所述核酸选自SEQ ID NO：1-3。

8在根据本发明的方法的一个实施方案中，所述核酸构建体(优选所述DNA构建体)或所述农杆菌(优选所述农杆菌二元载体)另外包含编码线粒体转运肽的核酸，该核酸有效连接至编码所述线粒体复合物I的所述经修饰蛋白质组分的所述核酸。

9在本发明的一个优选实施方案中，其中所述核酸构建体(优选所述DNA构建体)或所述农杆菌(优选所述农杆菌二元载体)另外包含启动子和终止子，并且所述启动子和终止子有效连接至编码所述线粒体复合物I的所述经修饰蛋白质组分的所述核酸。

10在本发明的一个实施方案中，其中所述核酸构建体(优选所述DNA构建体)或所述农杆菌(优选所述农杆菌二元载体)包含所述启动子和所述终止子、编码线粒体转运肽的所述核酸和编码所述线粒体复合物I的所述经修饰蛋白质组分的所述核酸，全部如前面所定义，它们全部得以有效连接。

11优选所述损伤通过突变所述植物细胞来进行，所述突变是关于所述植物细胞中所述线粒体复合物I的至少一个组分。

12在本发明的一个优选实施方案中，所述突变是通过利用施加至至少一个植物细胞，优选相同植物的多个植物细胞的化学和/或物理诱变剂随机突变所述植物细胞来进行，所述的化学诱变剂优选选自甲基磺酸乙酯，而所述物理诱变剂选自快中子轰击、X射线、γ射线和其它诱变辐照。

13在根据本发明的方法的一个实施方案中，该方法在突变后，另外包括额外的筛选步骤，筛选是针对所述植物细胞或多个植物细胞中的线粒体复合物I的经修饰蛋白质组分或其它线粒体功能。

14在根据本发明的方法的一个实施方案中，所述损伤是通过施加所述植物细胞的线粒体功能的化学抑制剂，优选线粒体复合物I的化学抑制剂至所述植物细胞、植物、愈伤组织、组织、所述植物的部分、所述植物全部、果实、根和/或其它植物器官。

15在本发明的一个优选的实施方案中，所述化学抑制剂选自鱼藤酮、抗霉素A、乙氧氟草醚、堇菜黄质、杀粉蝶菌素、杀粉蝶霉素A、吡唑、哒螨酮、喹唑啉、聚乙酸、thiangazole和fenaza(抗螨唑)。

16在本发明的一个优选实施方案中，所述损伤是所述线粒体复合物I的抑制。

17在根据本发明的方法的一个实施方案中，所述方法另外包括栽培已经经受了任意前述权利要求的方法的所述植物细胞、植物部分、组织、种子或器官，以产生植物愈伤组织、组织、植物、根和/或果实的步骤。

18本发明的目标通过根据本发明方法产生的植物细胞、愈伤组织、组织、植物、根或果实来解决。

19优选地，所述植物细胞、愈伤组织、组织、植物、根或果实源自植物起源，所述的植物起源选自茄科种(solanaceous species)，包括番茄、胡椒、辣椒、马铃薯、碧冬茄和/或烟草。

20优选地，在植物细胞、愈伤组织、组织、植物、根或果实中，类胡萝卜素(优选番茄红素)的量增强至每100g鲜重的植物细胞、愈伤组织、组织、植物、根和/或果实＞10mg，优选＞15mg，甚至更优选＞16mg并且最优选＞20mg。

21优选的是，在植物细胞、愈伤组织、组织、植物、根或果实中，类胡萝卜素(优选番茄红素)的量相对于没有经历根据本发明方法的植物细胞/愈伤组织/组织/植物、根或果实，增强了至少2倍，优选3倍。

22本发明的目标通过获得类胡萝卜素，优选番茄红素和/或β-胡萝卜素的方法来解决，所述方法包括以下步骤：

根据本发明产生植物细胞、愈伤组织、组织、植物、根或果实，

-从所述植物细胞、愈伤组织、组织、植物、根或果实纯化类胡萝卜素，优选番茄红素和/或β-胡萝卜素，优选通过溶剂萃取和纯化或通过超临界二氧化碳萃取或本领域技术人员通常所采用的任意其它方法进行。

23本发明的目标也通过核酸构建体解决，所述核酸构建体包含编码线粒体复合物I的经修饰蛋白质组分的核酸序列。

24优选地，线粒体复合物I的所述经修饰蛋白质组分选自NAD1、2、3、4、4L、5、6、7和9或所述复合物的其它蛋白质性质的组分。

25在根据本发明的核酸构建体的一个实施方案中，线粒体复合物I的所述经修饰蛋白质组分来自选自番茄、马铃薯、烟草、稻、玉米、碧冬茄、拟南芥属和/或莲属(Lotus)、苜蓿属(Medicago)、小麦和/或高粱属(Sorghum)的物种。

26优选的是，线粒体复合物I的所述经修饰蛋白质组分具有选自SEQ ID NO：4、5和6的序列。

27本发明的目标通过将根据本发明的核酸构建体用于增强植物细胞、植物、愈伤组织、组织、果实、根或所述植物的其它部分中的类胡萝卜素和其它类异戊二烯的含量，优选番茄红素和/或β-胡萝卜素的含量和/或用于增加植物的高度来解决。

定义

“转基因植物或转化的植物”指含有通过转化引入的重组多核苷酸的植物。转化意指以这样一种方式将多核苷酸序列引入植物中，该方式使得引起该核苷酸序列稳定整合或引起该序列的瞬时表达。这可以通过粒子轰击(基因枪)、农杆菌介导(利用经适当开发的质粒载体)、用病毒DNA或载体转染、通过电穿孔或脂转染引入DNA来实现。植物转化可以在植物细胞、花粉上、在植物种子上、在植物原生质体上，或任意其它类型的植物组织、完整的植物或植物部分上于无菌或有菌条件下进行。转化的植物可以指整个植物、任意植物部分、植物细胞、植物器官、植物组织、种子、根、花、果实、根或芽。其也指其子代。

“载体”是通过重组、人造或化学产生多核酸构建体，包含可以编码基因、蛋白质、启动子、终止子和转运肽的核酸元件。这些片段将被有效连接，以至于能够表达编码的基因或完全执行编码的程序。启动子区可以包括组成型的或组织特异性的、组织活性的、发育阶段活性的/发育阶段特异性的或可诱导的启动子，例如(但不限于)花椰菜花叶病毒35S启动子、木薯叶脉花叶病毒启动子或玉米泛素启动子。

核苷酸序列是“有效连接的”，在DNA序列的邻接片段以这样的方式连接时，以便使得具有如基因序列编码的细胞/生物学功能。

类胡罗卜素

类胡萝卜素是一类碳氢化合物(胡萝卜素类)以及它们的氧合衍生物(叶黄素)，由8个类异戊二烯单元组成，所述的类异戊二烯单元是以这样的方式连接：类异戊二烯单元的排列在分子的中心反转以便两个中心甲基基团处于1，6-位置关系，并且剩下的非末端甲基基团处于1，5-位置关系。所有的类胡萝卜素可以通过(i)氢化、(ii)脱氢、(iii)环化或(iv)氧化或这些方法的任意组合，从形式上源于开链C40H56结构，具有长的共轭双键的中心链。

损伤

损伤指细胞器、功能性复合物、酶或其它功能实体的功能的部分丧失或完全丧失。如在此所用的，功能的完全丧失有时也称为抑制。

线粒体复合物

线粒体复合物指分别称为I、II、III和IV的线粒体的四个电子传递链复合物，其中复合物I是NADH-脱氢酶，复合物II是琥珀酸脱氢酶，复合物III是细胞色素c还原酶，而复合物IV是细胞色素c氧化酶。它们为参与通过氧化NADH+H⁺和FADH2为NAD+和FAD而产生ATP的多-多肽复合物(multipolypeptide complex)。

线粒体复合物I蛋白

这种复合物包含大约43条多肽链，所述的多肽链包括线粒体编码的nad1、nad2、nad3、nad4、nad4Lm、nad5、nad6、nad7、nad9以及核编码的76Kda、55Kda、28.5Kda、22Kda酰基载体蛋白。

“经修饰蛋白质组分”指在其核酸序列、结构或功能上不同于天然的功能性蛋白质的蛋白质组分，并且可以是无功能的。应该注意，在植物线粒体中，由于一个或多个翻译后的RNA编辑事件，天然的(功能性)蛋白质的氨基酸序列不同于编码该蛋白质的天然基因序列的假定翻译产物。

“未编辑的”指与线粒体基因组中天然存在的基因序列相同的基因序列。由于转录后的RNA编辑(由此某些C核糖核苷酸被修饰为U核糖核苷酸，而少有的，某些U核糖核苷酸被修饰为C核糖核苷酸)，其通常不同于编码天然的(功能性)蛋白质的mRNA产物。例如，“未编辑序列的翻译产物”是如果在转录后水平上没有发生编辑事件时将期望产生的蛋白质。

功能障碍：部分或完全无功能的

转运肽指N-端前序列，其引导由核编码的线粒体结合蛋白至线粒体。需要转运肽来将这种蛋白质从它们在细胞质中的合成位点转运穿过相关的膜。

线粒体的抑制剂包括(但不限于)鱼藤酮、抗霉素A、氰化物、丙二酸(琥珀酸脱氢酶抑制剂)、2，4-二硝基苯酚(DNP)、碳酰基氰基对[三氟甲氧基]-苯基-腙(FCCP)、寡霉素、乙氧氟草醚、堇菜黄质、杀粉蝶霉素A、吡唑、哒螨酮、喹唑啉、聚乙酸、thiangazole、抗螨唑、噻吩甲酰三氟丙酮(thenoxyltrifluoroacetone)、carfboxin、氧化萎锈灵、丁烯酰胺、DDT、chlorproham、敌稗、地乐酚、碘苯腈、环戊二烯、百草枯、地乐酚、丁醚脲、灭多虫、米酵菌酸和氟蚁腙。

农杆菌指农杆菌种的细菌，其用于利用合适的重组农杆菌二元载体用所关注的基因转化植物。同样，农杆菌二元载体指重组DNA构建体，其将与所关注的其它基因一起转化进农杆菌细胞中。这些细胞继而将被用于转化植物细胞、植物部分、种子或完整的整株植物。

本发明人已经意外地发现，增强水平的类胡萝卜素可以用基因工程或其它手段通过损伤植物中的线粒体功能而实现。与没有经历根据本发明的方法的植物比较，利用本发明，本发明人能够在植物中产生出乎意料高的水平的类胡萝卜素，更显著的是番茄红素(表1)。类似水平的类胡罗卜素仅可以在经加工的和人工浓缩食品(例如调味番茄酱或浓缩番茄酱)中具有(也参见表2)。

例如，所述目标可以通过组装编码玉米泛素启动子(SEQ ID No 7)、拟南芥属At-mRBP1a线粒体靶向转运肽(核苷酸序列为SEQ ID No 8，多肽序列为SED ID No 9)、来自稻线粒体肽的未编辑的nad9基因(核苷酸序列为SEQ ID No 1，多肽序列为SED ID No 2)和胭脂碱合酶(NOS)终止子的多核苷酸构建体来实现。可以进行这种组装以便赋予该构建体在植物中的转录和翻译能力，并且此外还使得蛋白质产物得以转运至线粒体。可以观察到通过这种或类似构建体转化的植物细胞/植物/植物部分显示出上述高水平的类胡萝卜素，更显著的是番茄红素和/或β-胡萝卜素。

本发明因而涉及培养高类胡萝卜素植物、植物细胞、组织或植物部分(包括叶、茎、根、果实和花)的方法。

本发明还涉及培养具有增强水平的番茄红素和/或β-胡萝卜素的植物的方法。

本发明此外还涉及增强源于类异戊二烯途径的植物化合物的水平的方法，所述的植物化合物包括(但不限于)赤霉酸、脱落酸、色素、固醇。

下面提及了实例，所述的实例旨在举例说明本发明而不是限制本发明。也提及了图1-5，其中：

图1示出了：用作用于转化的基本构建体的质粒pBS(SK-)构建体。定向序列表示At-mRBP1a的编码区，其在Sac I和Xba I限制位点之间克隆进来以得到pNG1。

图2示出了：用作用于转化的基本构建体的质粒pBS(SK-)构建体。TS和未编辑的nad9表示At-mRBP1a和在Xba I和BamHI限制位点间克隆进来的经编辑的nad9基因的编码区，得到pNG3。

图3示出了：用作用于转化的基本构建体的质粒pBS(SK-)构建体。称为TP的盒和未编辑的nad9表示At-mRBP1a和在pBS(SK-)载体的多克隆位点插入的未编辑的nad9的编码区。该嵌合基因处于泛素启动子和Nos终止子的控制下。

图4示出了：编码潮霉素抗性基因(hph)的质粒pLAU6.hph，该基因由木薯叶脉花叶病毒(CVMV)启动子驱动，并具有NOS终止子。

图5示出了：番茄红素的标准曲线，其用于确定本发明的一个实施方案中的番茄红素含量。

图6示出了：通过解析如本文所述的番茄红素提取物而获得的典型的色谱图。

此外，还提及了序列，其中：

SEQ ID NO 1：NADH脱氢酶亚基9的稻(Oryza sativa)线粒体nad9基因(GenBank登记号D50099[RICMTNAD9])。

SEQ ID NO 2：NADH脱氢酶亚基9的马铃薯(Solanum tuberosum)线粒体nad9基因(GenBank登记号X79774[STMINAD9])。

SEQ ID NO 3：NADH脱氢酶亚基9的烟草(Nicotiana tabacum)线粒体nad9基因(GenBank登记号YP 173479[YP 173479])。

SEQ ID NO 4：NADH脱氢酶亚基9的稻(Oryza sativa)线粒体nad9蛋白(SEQ ID NO 1的翻译产物)。

0.1％BSA

4.0mM 2-巯基乙醇

2mM DTT

洗涤缓冲液(无BSA & DTT的提取缓冲液)

2X梯度缓冲液

0.5M蔗糖

100mM Tris HCL pH 7.5

6.0mM EDTA

在2X梯度缓冲液中制备Percoll梯度

将稻线粒体(大约75ug)重新悬浮于重悬浮缓冲液中并用1/4体积的裂解缓冲液裂解。通过倒转温和地混合后，加入苯酚，随后加入氯仿。进行3次苯酚氯仿萃取，然后用氯仿萃取。在-20℃下孵育30分钟后，用2.5体积的乙醇和1/10体积的3M醋酸钠，通过在13，000转/分钟下离心20分钟，从液相中沉淀出DNA。用70％的乙醇洗涤DNA沉淀颗粒，干燥并溶解于水中。

利用如下引物对，通过聚合酶链式反应(PCR)从拟南芥cDNA克隆线粒体定向序列(At-mRBP1a，参见DNA序列SEQ ID No 8和肽序列SEQ ID NO 9)。

正向引物：5`AAGAGCTCCCATGGTCTTCTGTAACAAACTCG 3`

反向引物：5`AATCTAGACTTGGTAGACATCAACCGG 3`

正向引物和反向引物分别具有整合于它们中间的SacI位点和XbaI位点，而这使得易于将PCR产物克隆进pBS(SK-)中，将所得的载体称为pNG1(图1)。

线粒体的裂解

将稻线粒体(大约75μg)重新悬浮于重悬浮缓冲液中并用1/4体积的裂解缓冲液裂解。通过倒转温和地混合后，加入苯酚，随后加入氯仿。进行3次苯酚氯仿萃取，然后用氯仿萃取。在-20℃下孵育30分钟后，用2.5体积的乙醇和1/10体积的3M醋酸钠，通过在13,000转/分钟下离心20分钟，从液相中沉淀出DNA。用70％的乙醇洗涤DNA沉淀颗粒，干燥并溶解于水中。

pNG3：线粒体定向的未编辑NAD9

通过PCR从稻线粒体DNA获得未编辑的nad9(DNA序列为SEQ IDNO 1，肽序列为SEQ ID NO 4)。将以下的引物组合用于扩增：

正向引物：5`AATCTAGAATGGATAACCAATCCATTTTCCAA 3`

反向引物：5`AAGGATCCGGGATTATCCGTCGCTACG 3`

正向引物具有Xba I位点而反向引物具有BamHI位点，通过所述位点未编辑的nad9基因得以克隆至邻接所述线粒体定向序列，该载体称为pNG3(图2)。

pNG11：

利用Sac I位点和BamHI位点将未编辑的nad9基因从pNG3切出，并使之与上游的泛素启动子(SEQ ID NO 7)和下游的Nos终止子连接。得到的构建体称为pNG11(图3)。

已经为番茄(Lycopersicon esculentum)将完成了的基本的转化工作和实验室水平的组织培养程序进行了标准化，并且转化方法如下：

转化番茄的方法

种子：

番茄(Lycopersicon esculentum Mill)变种S-22(Arka Vikas)种子得自印度园艺研究所(Indian Institute of HorticulturalResearch)(IIHR，Hesarghatta，Bangalore)。

■用双蒸馏高压灭菌水洗涤两次。

■将种子在70％乙醇中漂洗2分钟。

■在摇动器中将种子浸入市售漂洗剂的70％溶液中30分钟。

■将它们进行洗涤直至所有的漂白剂痕迹都被移除。

■在高压灭菌的薄纸上干燥。

■步骤‘d’和‘e’在层流罩下进行以避免污染。

用于轰击的外植体的制备：

使种子在半强度MS培养基上体外发芽。将10天大的籽苗连根拔起并将子叶切掉，将该子叶的中心部分用于轰击。将大约40个这种外植体置于装有渗压剂培养基的陪替氏培养皿的中心。在该培养基中孵育4小时后，立即用粒子加速器(PDS-1000/He)让愈伤组织接受微粒轰击。

金悬浮液的制备：

使用的金微粒的大小在1.5-3.0μ之间，称出6mg的金微粒置于0.5ml的埃彭道夫管(eppendorf tube)内。将100μl的高压灭菌的双蒸馏水加至金微粒，并在离心机中涡旋30秒。将其离心30秒。加入100μl 100％的乙醇并涡旋一分钟。以10000转/分钟在离心机中离心30秒。吸移掉上清液。再次重复乙醇洗涤。将100μl无菌蒸馏水加至沉淀颗粒。将其涡旋并将50μl上清转移进另一个0.5ml管中。每个这种管含有50μl的金悬浮液，并在室温下或4℃下保存直至完成DNA包被。

颗粒包被方法：

以3∶1的比率将两种质粒加至50μl的金悬浮液以便得到10μgDNA的总浓度，所述的质粒是包含所关注基因的质粒(含有未编辑的nad9基因或经编辑的nad9或反义形式的未编辑的nad9的质粒)和pLAU6hph(含可选标记潮霉素的质粒，见图4)。将20μl 0.1M的亚精胺(Sigma，Aldrich)加入其中并涡旋机上低速混合。然后加入50μl 2.5M CaCl₂，并充分混合。让该混合物在室温下保持10分钟。稍后将其在离心机中离心30秒钟。在层流罩中移除上清液。

制备用于基因枪转化的微载体(microcarrier)、可裂膜以及阻挡网：

载体膜片(macrocarrier)

在进行样品细胞/组织轰击前将放置在载体膜片支持物中的载体膜片进行预装配和预消毒。首先将载体膜片浸入100％的乙醇中，然后将其在高压灭菌的薄纸上干燥。然后在层流罩中让载体膜片保持UV光下进行表面消毒10分钟。

可裂膜

将选择的可裂膜转移至各个陪替氏培养皿用于早期的处理。在插入保持盖前才通过简单地将它们浸入70％的异丙醇中来将可裂膜灭菌。不要浸泡多于几秒。过多浸泡可能使该可裂膜分层，导致过早破裂。所有的可裂膜都是层状的，除了额定为450、650和1,100psi的那些。因为潜在的分层而不推荐高压灭菌。

阻挡网

将选择的可裂膜转移至各个陪替氏培养皿用于早期的处理。推荐通过高压灭菌。备选地，这些部分可以通过在70％乙醇中浸泡，然后在无菌环境中干燥来灭菌。可以将阻挡网进行两次高压灭菌和再使用。

将在微载体涂覆于载体膜片上：

将上清液从DNA包被的金微粒除去。基于待轰击的盘的数目，将无水乙醇加至DNA包被的金微粒——对于待涂覆的每个载体膜片(即待轰击的薄板)加入10.0μl。将该混合物进行涡旋直至获得均匀的悬浮液，并吸移出10.0μl并涂覆于载体膜片的中心上。让乙醇干燥挥发，留下金颗粒在载体膜片上。

进行轰击：

轰击前

1.选择并调整保持可裂膜保持盖和微载体组之间的间隙距这个轰击参数。轰击在900psi的破裂压力和9cm的距离下进行。将阻挡网支承于微载体送出组(microcarrier launch assembly)的固定式巢内的正确位置。

2.将氦气供应调整至200psi，超过所需的破裂压力。

3.用70％乙醇将可裂膜保持盖、微载体送出组和整个装置擦干净。

4.在试验当天，用DNA涂覆载体膜片并装载于无菌载体膜片支持物上。

发射该装置

1.插上从主机至电源的电源线。

2.打开电源开关。

3.用70％的乙醇对轰击室壁进行灭菌。

4.将无菌可裂膜装载至无菌保持盖中。

5.将保持盖固定于气体加速管的末端(轰击室的内部顶端)，并用转矩扳手锁紧。

6.将载体膜片和阻挡网装载进微载体送出组中。

7.将微载体送出组和靶细胞放置于轰击室内并将门关上。

8.抽空轰击室，将真空保持在所需水平(最小5英寸汞柱)。

9.轰击样品：持续压下发射按钮直至可裂膜破裂且氦气压力降至零。

10.放开发射按钮。

轰击后

1.释放轰击室的真空。

2.将靶细胞从轰击室移出。

3.从载体膜片送出组取出载体膜片和阻挡网。

4.退出用过的可裂膜。

5.将氦气压力从系统移除(在完成当天的所有试验后)。

经轰击细胞的生长和选择：

16小时后将愈伤组织转移至含有BAP(4.5mg/L)和IBA(0.2mg/L-含有10mg/L潮霉素的选择培养基)培养基的番茄再生培养基用于选择和在25℃下光照孵育15天。将抗性愈伤组织每15天继代培养至新鲜培养基上使之伸长。如果芽在再生培养基中没有伸长的话，在再生后切取芽并置于含BAP(4.5mg/L)、IBA(0.2mg/L)和GA(1.0mg/L)的MS培养基上。将伸长的芽转移至含有IAA(0.1m/L)的MS培养基中用于生根。将生根的小植株转移至经高压灭菌的蒸馏水中以硬化几天，并然后转移进蛭石中。然后将小植株转移至红土中。

植株生长

将土壤中的小植株转移至温室中。在标准条件下培养植株以采集变种和果实。可以为试验目的或育种目的进行异花受精。也可以在温室中的植物上进行遗传试验。

通过HPLC方法进行的番茄样品中番茄红素含量的定量分析

色谱系统：

1.配备有自动采样器、除气器、PDA检测器和Millennium32软件的Waters 2695 XE Separations Module

2.HPLC级溶剂-甲醇、二氯甲烷(通过0.22微米的薄膜过滤器过滤)

3.HPLC样品瓶

用于样品制备：

旋转蒸发器、称重天平、离心机、试管、试管架和过滤器。

萃取剂：己烷∶丙酮∶甲醇(2∶1∶1)，具有2.5％BHT

样品溶剂：二氯甲烷∶甲醇(45∶55)

从番茄样品提取番茄红素：

称出1克新鲜的番茄(从温室采集)样品，并用马达和研杵在10ml萃取剂中研磨。转移至离心管，用超声处理6分钟并在7500转/分钟下离心5分钟。小心收集澄清的有机层并在旋转蒸发器中干燥，在-20℃下保存直至使用。所有操作均在暗光下进行。避免直接光照和高温。

样品制备：

将干燥样品再溶解于1ml的样本溶剂中并从该母液配制1∶10的稀释液。将稀释的样品通过0.22微米的过滤器，然后让其接受HPLC分析。样品制备应该快速进行以避免溶剂损失。

色谱条件：

流动相：甲醇∶二氯甲烷(95∶5)

甲醇(HPLC级溶剂用于HPLC分析)

泵模式：等度洗脱(MeOH∶DCM：：95∶5)

柱：Bondapak^TM C18，4.6x150mm，5μm

检测器：Waters 2996 PDA检测器

流速：1.5ml/分钟

注射体积：20μl

注射次数：2次

工作时间：15分钟。

检测波长：476nm

甲醇∶二氯甲烷(95∶5)的双溶剂系统用于在15分钟期间从样品溶解番茄红素。将工作时间减少至15分钟，使用1.5ml/分钟的流速，以容纳更多的样品。番茄红素的检测波长是476nm，其用标准曲线定量。

标准曲线：在具有0.1％BHT的HPLC级样品溶剂中制备范围为10-80μg/ml的标准番茄红素(Sigma)，并让其接受分析。画出校准曲线-‘番茄红素17Jun05’校准ID 1729，日期：17/06/2005，R＝0.9948，R2＝0.9897。(参见图5的标准曲线和图6的代表性色谱曲线)。

表1.从番茄的转基因变种和市售变种获得的番茄红素的水平：每100g果实的番茄红素(以mg表示)。

样品号	番茄来源的种类	样品名称	番茄红素含量(mg/100g鲜重)
				1	转基因品系	T11T1A101	26.9
2	转基因品系	T11T1A102	16.5
				3	转基因品系	T11T1C107	17.4
4	转基因品系	T11T1B107	14.3
				5	转基因品系	T11T1G115	23.5
6	转基因品系	T11T1B104	16.7
				7	市售变种	Arka Vikas(对照)	5.5
8	市售变种	Arka Vikas(对照)	6.2
				9	市售变种	Mruthunjayam M-2	5.8
10	市售变种	Agni	6.7
				11	市售变种	Abhinava	4.1

表1：分析的番茄红素(包括转基因品系和市售变种)的水平。

正如可以看到的，通过本发明获得的类胡萝卜素的水平，更显著的是番茄红素的水平可以高达6.5(26.9∶4.1)，并且范围为2.1(14.3∶6.7)至6.5，并且包括如下比率：4.2(17.4∶4.1)、3.0(16.7∶5.5)和5.7(23.5∶4.1)。

按绝对值计算，这么高的水平在别处仅在经加工的食品(浓缩番茄酱)中达到，这可以从下面的表2看出。

食品	食品形式	(mg/100g)
			杏	新鲜的	0.005
杏	罐装的，经糖浆初次浸渍后沥干的	0.065
			杏	干的	0.86
辣椒	经加工的	1.08-2.62
			葡萄柚	粉红色，新鲜的	3.36
备石榴	粉红色，新鲜的	5.40
			番石榴汁	粉红色，经加工的	3.34
调味番茄酱	经加工的	16.60
			番木瓜	红色，新鲜的	2.00-5.30
比萨沙司	罐装的	12.71
			比萨沙司	来自比萨	32.89
蔷薇果酱	罐装的	0.78
			莎莎酱	经加工的	9.28
意大利面沙司	经加工的	17.50
			番茄	红色，新鲜的	3.1-7.74
番茄	整个，剥皮的，经加工的	11.21
			番茄汁	经加工的	7.83
番茄汤	罐装的，浓缩的	3.99
			番茄酱	罐装的	30.07
西瓜	红色，新鲜的	4.10
			蔬菜汁	经加工的	7.28

表2：食物和食品中番茄红素的水平(参考文献：Nguyen，M.L.，Schwartz，S.J.1999.Lycopene：Chemical and biologicalproperties.Food Technol.53：38-45)

参考文献：

1.Agarwal S，Rao AV(2000)tomato lycopene and its role in human health andchronic diseases.Can Med Assoc Journ 163：739-744

2.Bertram JS，Vine AL(2005)Cancer prevention by retinoids and carotenoids：independent action on a common target.Biochim Biophys Acta 1740：170-178

3.Bhuvaneswari V，Nagini S(2005)Lycopene：a review of its potential as ananticancer agent.Curr Med Chem Anti-Canc Agents 5：627-635

4.Bramley PM(1997)The regulation and genetic manipulation of carotenoidbiosynthesis in tomato fruit.Pure & Appl Chem 69：2159-2162

5.Bramley PM(2002)Regulation of carotenoid formation during tomato fruitripening and development J Exp Bot 53：2107-2113

6.Davuluri GR，van Tuinen A et al(2004)Manipulation of DET1 expression intomato results in photomorphogenic phetotypes caused by post-transcriptionalgene silencing.Plant Journal 40：344-354

7.Davuluri GR，van Tuinen A，et al(2005)Fruit-specific RNAi-mediatedsuppression of DET1 enhances carotenoid and flavonoid content in tomatoes.NatBiotech 23：890-895

8.Faulks RM，Southon S(2005)Challenges to understanding and measuringcarotenoid bioavailability，Biochim Biophys Acta 1740：95-100

9.Fraser PD，Bramley P et al(2001)Effect of the Cnr mutation on carotenoidformation during tomato fruit ripening.Phytochem 58：75-79

10.Fraser PD，Truesdale MR et al(1994)Carotenoid biosynthesis during tomato fruitdevelopment.Plant Physiol 105：405-413

11.Fraser PD，Romer S et al(2002)Evaluation of transgenic tomato plantsexpressing an additional phytoene synthase in a fruit-specific manner.Proc NatAcad Sci USA 99：1092-1097

12.Fray RG，Wallace A et al(1995)Constitutive expressioni of a fruit phytoenesynthase gene in transgenic tomatoes causes dwarfism by redirecting metabolitesfrom the gibberellin pathway.Plant Journal 8：693-701

13.Giege P，Sweetlove LJ et al(2003)Identification of mitochondrial proteinicomplexes in Arabidopsis using two-dimensional blue-native polyacrylamide gelelectrophoresis.Plant Mol Biol Rep 21：133-144

14.Giliberto L，Perrotta G et al(2004)Manipulation of the blue light photoreceptorcryptochrome 2 in tomato affects vegetative development，flowering time，andfruit antioxidant content.Plant Physiol 137：199-208

15.Giovannoni JJ，DellaPenna D et al(1989)Expression of a chimericpolygalacaturonase gene in transgenic rin(Ripening inhibitor)tomato fruit resultsin polyuronide degradation but not fruit softening.Plant Cell 1：53-63

16.Giuliano G，Aquilani R et al(2000)Metabolic engineering of plant carotenoids.Trends in Plant Sci 5：405-407

17.Gruszecki WI，Strzalka K(2005)Carotenoids as modulators of lipid membranephysical proerties.Biochim Biophys Acta 1740：108-115

18.Hirschberg J(2001)Carotenoid biosynthesis in flowering plants.Curr Op PlanBiol 4：210-218

19.Kaliora AC，Dedoussis GVZ et al(2005)Dietary antioxidants in preventingatherogenesis.Atherosclerosis 11：1-17

20.Levin I，Frankel P et al(2003)the tomato dark green mutation is a novel allel ofthe tomato homolog of the DEETIOLATED1 gene.Theor Appl Genet 106：454-460

21.Liu Y-S，Gur A et al(2003)There is more to tomato fruit colour than candidatecarotenoid genes.Plant Biotechnology Journal(2003)1：195-207

22.Liu Y，Roof S et al(2004)Manipulation of light signal transduction as a means ofmodifying fruit nutritional quality in tomato.Proc Nat Acad Sci USA 101：9897-9902

23.Lümmen P(1998)Complex I inhibitos as insecticides and acaricides.BiochimBiophys Acta 1364：287-296

24.Mackenzie S，McIntosh L(1999)Higher plant mitochondria.Plant Cell 11：571-585

25.Mehta RA，Cassol T et al(2002)Engineered polyamine accumulation in tomatoenhances phytonutrent content，juice quality，and vine life.Nature Biotech 20：613-ppppppppp

26.Muir SR，Collins GJ(2001)Overexpression of petunia chalcone isomerase intomato results in fruit containing increased levels of flavonols.Nature Biotech 19：470-474

27.Nguyen ML，Schwartz SJ(1999)Lycopene：Chemical and biological properties.Food technol 53：38-45.

28.Reynard GB(1956)Origin of Webb Special(Black Queen)in tomato.RepTomato Genet Coop 40：44-64

29.Romer S，Fraser PD et al(2000)Elevation of the provitamin A content oftransgenic tomato plants.Nature Biotech 18：666-669

30.Romer S，Fraser PD(2005)recent advances in carotenoid biosynthesis，regulationand manipulation.Planta 221：305-308

31.Rosati C，Aquilani R et al.(2000)Metabolic engineering of beta-carotene andlycopene content in tomato fruit.Plant Journal 24：413-419

32.Washam C(2005)An ounce of prevention from a ton of tomatoes.EnvironmentalHealth Perspectives 113：A178-A181

33.Ye X，Al-Babili S et al(2000)Engineering the provitamin A(B-carotene)biosynthetic pathway into(carotenoid-free)rice endosperm.Science 287：303-305

34.Geifman et al(2005)Clear tomato concentrate as a taste enhancer US Patent6,890,574

35.Zelkha et al(2004)Carotenoid Extraction Process US Patent 6,797,

                      序列表

<110>Avesthagen

     Gengraine Technologies Pvt Ltd，Avestha

     Morawala Patell.Villoo

<120>植物中类胡萝卜素的增强

<130>LYC 091205

<160>9

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>573

<212>DNA

<213>稻

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(573)

<400>1

atg gat aac caa tcc att ttc caa tat agt tgg gag att tta ccc aag       48

Met Asp Asn Gln Ser Ile Phe Gln Tyr Ser Trp Glu Ile Leu Pro Lys

1               5                   10                  15

aaa tgg gta cat aaa atg aaa aga tcg gaa cat ggg aat aga tct tat       96

Lys Trp Val His Lys Met Lys Arg Ser Glu His Gly Asn Arg Ser Tyr

            20                  25                  30

acc aat act gac tac cca ttt cca ttg ttg tgc ttt cta aaa tgg cat      144

Thr Asn Thr Asp Tyr Pro Phe Pro Leu Leu Cys Phe Leu Lys Trp His

        35                  40                  45

acc tat aca agg gtt caa gtt tcg atc gat att tgc gga gtg gat cat      192

Thr Tyr Thr Arg Val Gln Val Ser Ile Asp Ile Cys Gly Val Asp His

    50                  55                  60

ccc tct cga aaa cga aga ttt gaa gtt gtc cat aat tta ctg agt act      240

Pro Ser Arg Lys Arg Arg Phe Glu Val Val His Asn Leu Leu Ser Thr

65                  70                  75                  80

cgg tat aac tca cgc att cgt gta caa aca agt gca gac gaa gta aca      288

Arg Tyr Asn Ser Arg Ile Arg Val Gln Thr Ser Ala Asp Glu Val Thr

                85                  90                  95

cga ata tct ccg gta gtc agt cca ttt cca tca gcc ggc cgg tgg gag      336

Arg Ile Ser Pro Val Val Ser Pro Phe Pro Ser Ala Gly Arg Trp Glu

            100                 105                 110

cga gaa gta tgg gat atg tct ggt gtt tct tcc atc aat cat ccg gat      384

Arg Glu Val Trp Asp Met Ser Gly Val Ser Ser Ile Asn His Pro Asp

        115                 120                 125

tta cgc cgt ata tca aca gat tat ggt ttc gag ggt cat cca tta cga      432

Leu Arg Arg Ile Ser Thr Asp Tyr Gly Phe Glu Gly His Pro Leu Arg

    130                 135                 140

aaa gac ttt cct ctg agt gga tat gtg gaa gta cgc tat gat gat cca      480

Lys Asp Phe Pro Leu Ser Gly Tyr Val Glu Val Arg Tyr Asp Asp Pro

145                 150                 155                 160

gag aaa cgt gtg gtt tct gaa ccc att gag atg acc caa gaa ttt cgc      528

Glu Lys Arg Val Val Ser Glu Pro Ile Glu Met Thr Gln Glu Phe Arg

                165                 170                 175

tat ttc gat ttt gct agt cct tgg gaa cag cgt agc gac gga taa          573

Tyr Phe Asp Phe Ala Ser Pro Trp Glu Gln Arg Ser Asp Gly

            180                 185                 190

<210>2

<211>862

<212>DNA

<213>马铃薯

<220>

<221>基因

<222>(1)..(862)

<400>2

atggagacag atatatagaa agtgtgcagt gagggtgctt gtaaatcact aggtagccta     60

gctcgaccca agcaatgccc aaaagtccca tgcctttctt ggtcggacca acccaaccgg    120

cgatttccga caagtctttc tgaattggaa gagaagaagc ggaactagaa gaaaactttc    180

tttctcttta tggataacca attcattttc aaatatagtt gggagacttt acccaagaaa    240

tgggtaaaaa aaatggaaag atcggaacat gggaatagat ctgataccaa tacggactac    300

ctatttcaat tgttgtgctt tatgaaattg catacctata caagggttca agtttcgatc    360

gatatttgcg gagttgatta tccctctcga aaacaaagat ttgaagtggt ctataattta    420

ctgagtattc ggtataactc acgcattcgt gtacaaacca gtgcagacga agtaacacga    480

atatctccgg tagtcagtct atttccatca gccggccggt gggagcgaga agtttgggac    540

atgtttggtg tttcttccat caatcatccg gatctacgcc gtatatcaac agattatggt    600

ttcgagggtc atccattacg aaaagacctt cctctgagtg gatatgtgga agtacgctat    660

gatgatccag agaaacgtgt ggtttctgaa cccattgaga tgacccaaga atttcgctat    720

ttcgattttg ctagtccttg ggaacagcgt agcgacggat aattcagaat cagaataggt    780

ccagtccagg ggacaaatca ataggaaatg ctatttgcct tcgtaagaat aagaatgaac    840

ttctatgaat gaagagtttc ac                                             862

<210>3

<211>573

<212>DNA

<213>烟草

<220>

<221>基因

<222>(1)..(573)

<400>3

atggataacc aattcatttt caaatatagt tgggagactt tacccaagaa atgggtcaaa     60

aaaatggaaa gatcggaaca tgggaataga tctgatacca atacggacta cctatttcaa    120

ttgttgtgct ttctgaaatt gcatacctat acaagggttc aagtttcgat cgatatttgc    180

ggagttgatt atccctctcg aaaacaaaga tttgaagtgg tctataattt actgagtatt    240

cggtataact cacgcattcg tgtacaaacc agtgcagacg aagtaacacg aatatctccg    300

gtagtcagtc tatttccatc agccggccgg tgggagcgag aagtttggga tatgtttggt    360

gtttcttcca tcaatcatcc ggatctacgc cgtatatcaa cagattatgg tttcgagggt    420

catccattac gaaaagacct tcctctgagt ggatatgtgg aagtacgcta tgatgatcca    480

gagaaacgtg tggtttctga acccattgag atgacccaag aatttcgcta tttcgatttt    540

gctagtcctt gggaacagcg tagcgacgga taa                                 573

<210>4

<211>190

<212>PRT

<213>稻

<400>4

Met Asp Asn Gln Ser Ile Phe Gln Tyr Ser Trp Glu Ile Leu Pro Lys

1               5                   10                  15

Lys Trp Val His Lys Met Lys Arg Ser Glu His Gly Asn Arg Ser Tyr

            20                  25                  30

Thr Asn Thr Asp Tyr Pro Phe Pro Leu Leu Cys Phe Leu Lys Trp His

        35                  40                  45

Thr Tyr Thr Arg Val Gln Val Ser Ile Asp Ile Cys Gly Val Asp His

    50                  55                  60

Pro Ser Arg Lys Arg Arg Phe Glu Val Val His Asn Leu Leu Ser Thr

65                  70                  75                  80

Arg Tyr Asn Ser Arg Ile Arg Val Gln Thr Ser Ala Asp Glu Val Thr

                85                  90                  95

Arg Ile Ser Pro Val Val Ser Pro Phe Pro Ser Ala Gly Arg Trp Glu

            100                 105                 110

Arg Glu Val Trp Asp Met Ser Gly Val Ser Ser Ile Asn His Pro Asp

        115                 120                 125

Leu Arg Arg Ile Ser Thr Asp Tyr Gly Phe Glu Gly His Pro Leu Arg

    130                 135                 140

Lys Asp Phe Pro Leu Ser Gly Tyr Val Glu Val Arg Tyr Asp Asp Pro

145                 150                 155                 160

Glu Lys Arg Val Val Ser Glu Pro Ile Glu Met Thr Gln Glu Phe Arg

                165                 170                 175

Tyr Phe Asp Phe Ala Ser Pro Trp Glu Gln Arg Ser Asp Gly

            180                 185                 190

<210>5

<211>190

<212>PRT

<213>马铃薯

<220>

<221>肽

<222>(1)..(190)

<400>5

Met Asp Asn Gln Phe Ile Phe Lys Tyr Ser Trp Glu Thr Leu Pro Lys

1               5                   10                  15

Lys Trp Val Lys Lys Met Glu Arg Ser Glu His Gly Asn Arg Ser Asp

            20                  25                  30

Thr Asn Thr Asp Tyr Leu Phe Gln Leu Leu Cys Phe Met Lys Leu His

        35                  40                  45

Thr Tyr Thr Arg Val Gln Val Ser Ile Asp Ile Cys Gly Val Asp Tyr

    50                  55                  60

Pro Ser Arg Lys Gln Arg Phe Glu Val Val Tyr Asn Leu Leu Ser Ile

65                  70                  75                  80

Arg Tyr Asn Ser Arg Ile Arg Val Gln Thr Ser Ala Asp Glu Val Thr

                85                  90                  95

Arg Ile Ser Pro Val Val Ser Leu Phe Pro Ser Ala Gly Arg Trp Glu

            100                 105                 110

Arg Glu Val Trp Asp Met Phe Gly Val Ser Ser Ile Asn His Pro Asp

        115                 120                 125

Leu Arg Arg Ile Ser Thr Asp Tyr Gly Phe Glu Gly His Pro Leu Arg

    130                 135                 140

Lys Asp Leu Pro Leu Ser Gly Tyr Val Glu Val Arg Tyr Asp Asp Pro

145                 150                 155                 160

Glu Lys Arg Val Val Ser Glu Pro Ile Glu Met Thr Gln Glu Phe Arg

                165                 170                 175

Tyr Phe Asp Phe Ala Ser Pro Trp Glu Gln Arg Ser Asp Gly

            180                 185                 190

<210>6

<211>190

<212>PRT

<213>烟草

<220>

<221>肽

<222>(1)..(190)

<400>6

Met Asp Asn Gln Phe Ile Phe Lys Tyr Ser Trp Glu Thr Leu Pro Lys

1               5                   10                  15

Lys Trp Val Lys Lys Met Glu Arg Ser Glu His Gly Asn Arg Ser Asp

            20                  25                  30

Thr Asn Thr Asp Tyr Leu Phe Gln Leu Leu Cys Phe Leu Lys Leu His

        35                  40                  45

Thr Tyr Thr Arg Val Gln Val Ser Ile Asp Ile Cys Gly Val Asp Tyr

    50                  55                  60

Pro Ser Arg Lys Gln Arg Phe Glu Val Val Tyr Asn Leu Leu Ser Ile

65                  70                  75                  80

Arg Tyr Asn Ser Arg Ile Arg Val Gln Thr Ser Ala Asp Glu Val Thr

                85                  90                  95

Arg Ile Ser Pro Val Val Ser Leu Phe Pro Ser Ala Gly Arg Trp Glu

            100                 105                 110

Arg Glu Val Trp Asp Met Phe Gly Val Ser Ser Ile Asn His Pro Asp

        115                 120                 125

Leu Arg Arg Ile Ser Thr Asp Tyr Gly Phe Glu Gly His Pro Leu Arg

   130                 135                 140

Lys Asp Leu Pro Leu Ser Gly Tyr Val Glu Val Arg Tyr Asp Asp Pro

145                 150                 155                 160

Glu Lys Arg Val Val Ser Glu Pro Ile Glu Met Thr Gln Glu Phe Arg

                165                 170                 175

Tyr Phe Asp Phe Ala Ser Pro Trp Glu Gln Arg Ser Asp Gly

            180                 185                 190

<210>7

<211>1989

<212>DNA

<213>玉米

<220>

<221>启动子

<222>(1)..(1989)

<400>7

ctgcagtgca gcgtgacccg gtgcccctct ctagagataa tgagcattgc atgtctaagt     60

tataaaaaat taccacatat tttttttgtc acacttgttt gaagtgcagt ttatctatct    120

ttatacatat atttaaactt tactctacga ataatataat ctatagtact acaataatat    180

cagtgtttta gagaatcata taaatgaaca gttagacatg gtctaaagga caattgagat    240

ttttgacaac aggactctac agttttatct ttttagtgtg catgtgttct cctttttttt    300

tgcaaatagc ttcacctata taatacttca tccattttat tagtacatcc atttagggtt    360

tagggttaat ggtttttata gactaatttt tttagtacat ctattttatt ctattttagc    420

ctctaaatta agaaaactaa aactctattt tagttttttt atttaataat ttagatataa    480

aatagaataa aataaagtga ctaaaaatta aacaaatacc ctttaagaaa ttaaaaaaac    540

taaggaaaca tttttcttgt ttcgagtaga taatcgcagc ctgttaaacg ccgtcgagtc    600

taacggacac caaccagcga accagcagcg tcgcgtcggg ccaagcgaag cagacggcac    660

ggcatctctg tcgctgcctc tggacccctc tcgagagttc cgctccaccg ttggacttgc    720

tccgctgtcg gcatccgaaa attgcgtggc ggagcggcag acgtgagccg gcacggcagg    780

cggcctcctc ctcctctcac ggcacggcag ctacggggga ttcctttccc accgctcctt    840

cgctttccct tcctcgcccg ccgtaataaa tagacacccc ctccacaccc tctttcccca    900

acctcgtgtt gttcggagcg cacacacaca caaccagatc tcccccaaat ccacccgtcg    960

gcacctccgc ttcaaggtac gccgctcgtc ctcccccccc ccccctctct accttctcta   1020

gatcggcgtt ccggtccatg gtaagggccc ggtagttcta cttctgttca tgtttgtgtt   1080

agatccgtgt ttgtgttaga tccgtgctgc tagcgttcgt acacggatgc gacctgtacg   1140

tcagacacgt tctgattgct aacttgccag tgtttctctt tggggaatcc tgggatggct   1200

ctagccgttc cgcagacggg atcgatttca tgattttttt tgtttcgttg catagggttt   1260

ggtttgccct tttcctttat ttcaatatat gccgtgcact tgtttgtcgg gtcatctttt   1320

catgcttttt tttgtcttgg ttgtgatgat gtggtctggt tgggcggtcg ttctagatcg   1380

gagtagaatt ctgtttcaaa ctacctggtg gatttattaa ttttggatct gtatgtgtgt   1440

gccatacata ttcatagtta cgaattgaag atgatggatg gaaatatcga tctaggatag   1500

gtatacatgt tgatgcgggt tttactgatg catatacaga gatgcttttt gttcgcttgg   1560

ttgtgatgat gtggtgtggt tgggcggtcg ttcattcgtt ctagatcgga gtagaatact   1620

gtttcaaact acctggtgta tttattaatt ttggaactgt atgtgtgtgt catacatctt   1680

catagttacg agtttaagat ggatggaaat atcgatctag gataggtata catgttgatg   1740

tgggttttac tgatgcatat acatgatggc atatgcagca tctattcata tgctctaacc   1800

ttgagtacct atctattata ataaacaagt atgttttata attattttga tcttgatata   1860

cttggatgat ggcatatgca gcagctatat gtggattttt ttagccctgc cttcatacgc   1920

tatttatttg cttggtactg tttcttttgt cgatgctcac cctgttgttt ggtgttactt   1980

ctgcagatg                                                           1989

<210>8

<211>111

<212>DNA

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<220>

<221>转运肽

<222>(1)..(111)

<400>8

atggctttct gtaacaaact cggtggtcta ttgagacaaa acatttcttc taacggaaat     60

gttccggtta cgtctatgct cggatctctc cggttgatgt ctaccaagtc t             111

<210>9

<211>37

<212>PRT

<213>拟南芥

<220>

<221>转运

<222>(1)..(37)

<400>9

Met Ala Phe Cys Asn Lys Leu Gly Gly Leu Leu Arg Gln Asn Ile Ser

1               5                   10                  15

Ser Asn Gly Asn Val Pro Val Thr Ser Met Leu Gly Ser Leu Arg Leu

            20                  25                  30

Met Ser Thr Lys Ser

        35

Claims (27)

1.一种增强植物、植物细胞、愈伤组织、组织、果实、根或植物其它部分中的类胡萝卜素和其它类异戊二烯，优选番茄红素和/或β-胡萝卜素的含量，和/或增加植物的高度的方法，所述方法包括：

a.损伤植物、植物细胞、愈伤组织、组织、果实、根或植物其它部分中的线粒体功能，优选损伤线粒体复合物I、II、III和/或IV，更优选损伤线粒体复合物I。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述损伤是利用所述植物细胞线粒体复合物I的经修饰蛋白质组分，优选利用作为未编辑的编码序列的翻译产物的线粒体复合物I的蛋白质组分来进行。

3.根据权利要求1-2任意一项所述的方法，其中所述损伤是通过用核酸构建体(优选DNA构建体)转化所述植物细胞，或通过用核酸构建体经由农杆菌种介导的转化，优选根瘤农杆菌介导的转化来转化所述植物细胞，或通过利用合适植物病毒(例如烟草花叶病毒)的病毒转染，或通过原生质体转化来进行。

4.根据权利要求2-3任意一项所述的方法，其中所述核酸构建体(优选所述DNA构建体)或所述农杆菌包含，优选二元载体中的编码所述线粒体复合物I的所述经修饰蛋白质组分的核酸。

5.根据权利要求2-4任意一项所述的方法，其中所述线粒体复合物I的经修饰蛋白质组分是来自不同于所述植物细胞的另一植物种的功能障碍性蛋白质或是与所述植物细胞相同的植物种的功能障碍性蛋白质。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述线粒体复合物I的经修饰蛋白质组分是选自如下的功能障碍性蛋白质：NAD 1、2、3、4、4L、5、6、7、9、核线粒体蛋白76Kda、55Kda、28.5Kda、22Kda和酰基载体蛋白。

7.根据权利要求4的方法，其中编码所述经修饰蛋白质组分的所述核酸选自SEQ ID NO：1、2、3。

8.根据权利要求4-7任意一项所述的方法，其中所述核酸构建体(优选所述DNA构建体)或所述农杆菌(优选所述农杆菌二元载体)另外包含编码线粒体转运肽的核酸，该核酸有效连接至编码所述线粒体复合物I的所述经修饰蛋白质组分的所述核酸上。

9.根据权利要求4-8任意一项所述的方法，其中所述核酸构建体(优选所述DNA构建体)或所述农杆菌，优选所述农杆菌二元载体，另外包含启动子和终止子，并且所述启动子和终止子有效连接至编码所述线粒体复合物I的所述经修饰蛋白质组分的所述核酸上。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述核酸构建体(优选所述DNA构建体)或所述农杆菌(优选所述农杆菌二元载体)包含根据权利要求9的所述启动子和所述终止子、根据权利要求8的编码所述线粒体转运肽的所述核酸和根据权利要求4的编码所述线粒体复合物I的所述经修饰蛋白质组分的所述核酸，它们全部得以有效连接。

11.根据权利要求1-2任意一项所述的方法，其中所述损伤通过突变所述植物细胞来进行，所述突变是关于所述植物细胞中所述线粒体复合物I的至少一个组分。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述突变是通过利用施加至至少一个植物细胞，优选相同植物的多个植物细胞的化学和/或物理诱变剂随机突变所述植物细胞来进行，所述的化学诱变剂优选选自甲基磺酸乙酯，而所述物理诱变剂选自快中子、X射线、γ射线和其它诱变射线。

13.根据权利要求11-12任意一项的方法，所述方法在突变后，另外包括额外的筛选步骤，筛选是针对所述植物细胞或多个植物细胞中的线粒体复合物I的经修饰蛋白质组分或其它经损伤的线粒体功能。

14.根据权利要求1-2任意一项的方法，其中所述损伤是通过施用所述植物细胞的线粒体功能的化学抑制剂，优选线粒体复合物I的化学抑制剂至所述植物细胞、植物、愈伤组织、组织、所述植物的部分、所述植物全部、果实、根和/或其它植物器官。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述化学抑制剂选自鱼藤酮、  抗霉素A、乙氧氟草醚、堇菜黄质、杀粉蝶菌素、杀粉蝶霉素A、吡唑、哒螨酮、喹唑啉、聚乙酸、thiangazole和抗螨唑。

16.根据前述任意一项权利要求所述的方法，其中所述损伤是所述线粒体复合物I的抑制。

17.根据前述任意一项权利要求所述的方法，所述方法另外包括栽培已经经受了前述任意一项权利要求所述的方法的所述植物细胞、植物部分、组织、种子或器官，以产生植物愈伤组织、组织、植物、根和/或果实的步骤。

18.通过根据前述任意一项权利要求所述的方法产生植物细胞、植物愈伤组织、组织、植物、根或果实。

19.根据权利要求18所述的植物细胞、愈伤组织、组织、植物、根或果实，其源自植物起源，所述的植物起源选自茄科种，包括番茄、胡椒、辣椒、马铃薯、碧冬茄和/或烟草。

20.根据权利要求18-19任意一项所述的植物细胞、愈伤组织、组织、植物、根或果实，其中类胡萝卜素(优选番茄红素)的量增强至每100g鲜重的植物细胞、愈伤组织、组织、植物、根和/或果实＞10mg，优选＞15mg，甚至更优选＞16mg并且最优选＞20mg。

21.根据权利要求18-20任意一项所述的植物细胞、愈伤组织、组织、植物或果实，其中类胡萝卜素(优选番茄红素)的量相对于没有经历根据权利要求1-17任意一项所述的方法的植物细胞/愈伤组织/组织/植物/根或果实，增强了至少2倍，优选3倍。

22.获得类胡罗卜素，优选番茄红素和/或β-胡罗卜素的方法，所述方法包括：

a.产生根据权利要求18-21任意一项所述的植物细胞、愈伤组织、组织、植物、根或果实，

b.从所述植物细胞、愈伤组织、组织、植物、根或果实纯化类胡萝卜素，优选番茄红素和/或β-胡萝卜素，优选通过溶剂萃取和纯化或通过超临界二氧化碳萃取纯化。

23.核酸构建体，所述核酸构建体包含编码线粒体复合物I的经修饰蛋白质组分的核酸。

24.根据权利要求23所述的核酸构建体，其中线粒体复合物I的所述经修饰蛋白质组分选自NAD 1、2、3、4、4L、5、6、7和9或所述复合物的其它蛋白质性质的组分。

25.根据权利要求23-24任意一项所述的核酸构建体，其中线粒体复合物I的所述经修饰蛋白质组分来自选自番茄、马铃薯、烟草、稻、玉米、碧冬茄、拟南芥属和/或莲属、苜蓿属、小麦和/或高粱属的物种。

26.根据权利要求23-25任意一项所述的核酸构建体，其中线粒体复合物I的所述经修饰蛋白质组分具有选自SEQ ID NO：4、5和6的序列。

27.根据权利要求23-26任意一项所述的核酸构建体的用途，其用于增强植物细胞、植物、愈伤组织、组织、果实、根或所述植物的其它部分中的类胡萝卜素和其它类异戊二烯的含量，优选番茄红素和/或β-胡萝卜素的含量，和/或用于增加植物的高度。

Images