KR101166715B1 - 토코트리에놀 생합성 과정에 관여하는 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 이를 이용한 형질전환체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 토코트리에놀 생합성 과정에 관여하는 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 이를 이용한 형질전환체에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 서열번호 1의 토코트리에놀 생합성 과정에 관여하는 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 이를 이용한 형질전환체에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 벡터는 토코트리에놀 성분이 합성되지 않는 콩 등의 식물체에서 토코트리에놀 생합성 과정에 관여하는 효소를 안정적으로 발현시킴으로써 비타민E, 즉 콩에는 생성되지 않는 토코트리에놀과 콩에 있는 토코페롤을 잎과 종자에서 종래의 식물체 및 형질전환체 보다 고농도로 합성하는 형질전환체를 제조할 수 있도록 하는 효과를 갖는다. 또한, 4종의 토코페롤 이성체와 4종의 토코트리에놀 이성체 등 8종의 이성체를 모두 포함하는 고기능성의 비타민E를 생합성하는 식물체를 제조할 수 있다. 따라서, 본 발명의 재조합 벡터는 유용물질인 토코페롤과 토코트리에놀 이성체 모두를 포함하는 비타민E를 다량으로 생합성하는 새로운 형질전환 작물 개발과 고기능성 식의약 소재용 식물체 제조를 위한 목적으로 사용할 수 있다.

토코트리에놀 생합성, 재조합 발현 벡터, 토코페롤, 비타민E

Description

토코트리에놀 생합성 과정에 관여하는 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 이를 이용한 형질전환체{Recombinant vector comprising polynucleotide related with tocotrienol biosynthesis and transformants transformed thereby}

본 발명은 토코트리에놀 생합성 과정에 관여하는 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 이를 이용한 형질전환체에 관한 것이다.

최근 주요 작물에 비타민, 철분, 아연 등 유용한 미량 영양소의 함량을 높이기 위한 생물영양 강화(biofortification) 연구가 활발히 진행되고 있다. 생물영양 강화를 위한 주요 방법으로는 전통적 육종방법(conventional selective breeding)과 유전공학기술을 이용하는 방법(genetic engineering)이 있으나 전통적 육종방법의 경우 교배가 가능한 작물 내에서만 생물영양 강화를 할 수 있다는 한계가 있어 기능성 유전자를 다양한 생물 종으로부터 확보하여 도입할 수 있는 유전공학을 이용하는 방법이 많이 활용되고 있는 실정이다.

비타민E는 토코페롤과 토코트리에놀로 구성되며, 두 종류의 화합물에 각각 알파, 베타, 감마, 델타 등 4 종류의 동족체가 있어 모두 8종의 이성체가 존재하고 있다. 주로 식물성 유지, 맥아 등에 많이 포함되어 있으며, 콩, 강낭콩, 해바라기, 들깨 등에는 토코페롤만 존재하고 토코트리에놀 성분은 없는 것으로 보고되었다[박 등, 한작지 49(3): 207-210, 2004].

비타민E의 주요 생리활성 기능으로는 지질과산화(lipid peroxidation)를 방지하는 항산화작용을 들 수 있으며, 지금까지 비타민E 이성체 중에서 알파-토코페롤이 가장 항산화 활성이 높은 것으로 알려져 있었으나, 최근 연구에서는 토코트리에놀이 토코페롤 보다 항산화작용이 40~60배 더 우수한 것으로 밝혀지고 있다. 더욱이 토코트리에놀의 경우, 항암, 혈중 콜레스테롤 저하, 심장 및 혈관계 질환 개선효과 외에도 세포 보호, 면역 강화, 치매 개선 등의 기능성 효과가 있는 것으로 보고되었다[Sen et al., Life Sci. 78(18): 2088-2098, 2006]. 또한, 토코페롤과 토코트리에놀을 동시에 투여하였을 때 항암 효과가 높아진다는 연구 결과[Nesaretnam et al., Lipids 30:1139-1143, 1995]와, 제니스테인과 토코트리에놀 혼합물이 전립선암을 억제할 수 있다는 보고[McAnally et al., Masters abstract international 42(4): 1199, 2002]를 참고할 때 콩에 존재하는 기능성 물질과 토코트리에놀이 동시에 처리되었을 때 기능성 효과에서 상승 작용을 나타낸다.

이에, 본 발명자들은 기존 콩에 없는 토코트리에놀 성분을 콩에 생성되게 함으로써 콩에 존재하고 있는 기능성 성분과의 상승 효과를 나타낼 수 있는 기능성이 우수한 콩을 개발하기 위해 연구한 결과, 벼에서 분리한 토코트리에놀 생합성 과정에 관여하는 HGGT(homogentisic acid geranylgeranyl transferase) 유전자를 최적의 조건으로 잎과 종실에 발현시키는 글로불린 프로모터에 연결하여 형질전환용 운반체를 제작하고 형질전환방법으로 콩에 도입함으로써 콩 잎과 종자에서 비타민E 함량을 고농도로 합성하는 형질전환체를 제조할 수 있다는 점을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 토코트리에놀 생합성 과정에 관여하는 HGGT 유전자를 글로불린프로모터에 연결하여 식물에 도입함으로써 잎과 종자에서 비타민E 함량을 고농도로 생합성할 수 있는 식물 형질전환용 재조합 벡터 및 이를 이용한 형질전환체를 제공하는데 그 목적이 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 잎과 종자에서 비타민E 함량을 고농도로 생합성할 수 있도록 하는 식물 형질전환용 재조합 벡터를 그 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 벡터에 의해 형질전환된 세포를 포함한다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 벡터에 의해 형질전환되고, 비타민E 함량을 고농도로 생합성할 수 있는 식물세포 또는 형질전환체를 포함한다.

본 발명은 토코트리에놀을 포함한 비타민E 함량을 높이는 재조합 벡터를 제공한다. 본 발명의 재조합 벡터는 토코트리에놀를 합성하지 않는 콩 등에서 토코트리에놀 합성에 관련하는 효소를 안정적으로 발현시킴으로써 토코트리에놀 합성을 가능하게 하고 또한 8개 이성체를 모두 가진 비타민E 함량이 매우 높은 콩 형질전환체를 제조할 수 있도록 한다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 서열번호 1의 토코트리에놀 생합성 과정에 관여하는 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 이를 이용한 형질전환체에 관한 것이다.

바람직하게 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 DNA 또는 RNA일 수 있다. 이때, 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 RNA인 경우 서열번호 1은 우라실(U)로 대체하는 것으로 이해될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 공지된 화학적 합성법에 의해서 제조될 수 있다.

상기 서열번호 1은 벼에서 분리된 토코트리에놀 생합성 과정에 관여하는 HGGT 유전자이다. 지금까지 보고된 HGGT 유전자는 벼, 보리, 밀, 수수, 옥수수 등의 화본과 작물에서 분리되었으며 이들 염기서열에서의 상동성은 75~100%를 나타낸다(NCBI, 미국). 본 발명에서는 상기 작물에서 분리한 다양한 종류의 HGGT 유전자를 사용할 수 있다.

비타민E를 생성시키는 주요 대사 경로로는 토코페롤과 토코트리에놀 구조에 서 머리 부분의 합성에 관여하는 시키메이트 경로(shikimate pathway)와 꼬리부분을 합성하는 엠이피 경로(MEP pathway)가 있으며, 위의 두 경로를 통해 생성된 호모젠티세이트(homogentisate)와 피틸-피피(phytyl-PP)를 결합시키는 효소인 호모젠티세이트피티딜트렌스퍼레이즈(homogentisic acid phytyltransferase, HPT)에 의해 토코페롤이 만들어지며, 이와 다른 경로인 호모젠티세이트와 지지디피(geranylgeranyl-PP)를 결합시키는 효소인 호모젠티세이트제라닐제라닐트렌스퍼레이즈(homogentisic acid geranylgeranyl, HGGT)에 의해 토코트리에놀이 생성된다[B. Karunanandaa et al., Metabolic engineering doi: 10.1016, 2005].

본 발명자들은 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 HGGT 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 상기 효소 중에서 콩에는 없는 토코트리에놀 합성 경로를 새롭게 생성시킴으로써 기존 콩에는 존재하지 않는 토코트리에놀이 합성할 수 있도록 하였다.

본 발명의 재조합 벡터는 공지의 식물 형질전환용 벡터를 기본 벡터로 하여 제조될 수 있으며, 일반적인 이원 벡터(binary vector) 또는 코인테그레이션 벡터(cointegration vector)가 사용될 수 있다. 식물 형질전환에 사용되는 바이너리 벡터의 종류는 매우 다양하며, 거의 모든 바이너리 벡터가 CAMBIA(Center for the Application of Molecular Biology to International Agriculture, GPO Box 3200, Canberra ACT2601, Australia)와 같은 국제센터 및 대학연구소에서 입수 가능하며, 기본적인 바이너리 벡터의 골격은 Ti 플라스미드를 모체로 하여 유전자가 전달되는 좌측 및 우측경계 부위에 형질전환체 선별 표지 유전자, 프로모터, 전사 종결부위 유전자 등을 다양하게 변형시켜 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 벡터는 식물 형질전환용 벡터이므로, 당업계에 알려진 다양한 식물체-기능적 프로모터가 사용될 수 있으며, 상기 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드의 발현을 위해서 상기 폴리뉴클레오티드는 프로모터와 작동가능하게 연결된다. 상기 ‘프로모터’란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미하며, ‘작동 가능하게 연결된다(operably linked)’는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다. 아울러, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 추가로 포함할 수 있다.

상기 프로모터로는 콩 종자에서 발현되는 것으로 알려진 베타-콘글라이신(β-conglycine) 프로모터, 완두에서 분리한 비실린(vicilin) 프로모터, 글로불린(globulin, Glb) 프로모터, 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터, 피그워트 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 슈가케인 바실리폼 바이러스 프로모터, 코메리나 옐로우 모틀 바이러스 프로모터, 리불로스-1,5-비스-포스페이트 카르복실라아제의 소단위(ssRUBISCO)로부터의 빛-유도성 프로모터, 쌀 사이토졸릭 트리오세포스페이트 이소머라아제(TPI) 프로모터, 아라비돕시스(Arabidopsis)로부터의 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제(APRT) 프로모터, 쌀 액틴 1 유전자 프로모터 및 만노핀 신타아제 및 옥토핀 신타아제 프로모터 중에서 선택된 1종을 포함하며, 바람직하게는 벼 종자에서 발현되는 글로불린(globulin, Glb) 프로모터[Qu & Takaiwa, Plant Biotech. J. 2: 113-125]이다.

또한, 상기 선별 표지 유전자는 항생제 저항성 유전자, 제초제 저항성 유전자, 대사관련 유전자, 발광 유전자, GFP(green fluorescence protein) 유전자, GUS(β-glucuronidase) 유전자, GAL(β-galactosidase) 유전자 등을 포함하지만, 그것에 한정되는 것은 아니다. 구체적으로 제초제 저항성 bar 유전자, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 Ⅱ(NPT Ⅱ) 유전자, 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자, 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제 유전자, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 또는 다이하이드로폴레이트 환원효소 유전자 등이 사용될 수 있지만, 제초제 저항성 bar 유전자가 바람직하다.

바람직하게는, 본 발명의 식물 형질전환용 벡터는 도 1에 개시된 개열지도를 가지는 벡터, 즉, pMJC-GGB-HGGT, pMJ-35S-HGGT 벡터일 수 있다. 상기 벡터는 pSB11 벡터(Genbank Accession No. AB027256)를 기본 백본(backbone)으로 하여 벼 배유특이발현 글로불린(globulin, Glb) 프로모터 및 감자 프로테아제 인히비터(protease inhibitor II, PinII)의 터미네이터 사이에 attB1서열; 서열번호 1의 HGGT 유전자; 및 attB2 서열이 순차적으로 연결된 구조물을 포함한다.

상기의 당 분야에 공지된 분자생물학적 기법인 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 다음 문헌에 기재되어 있다[Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY, 1989; by Silhavy, T. J., Bennan, M. L. and Enquist, L. W., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY, 1984; and by Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, published by Greene Publishing Assoc. and Wiley-lnterscience, 1987].

한편, 본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 재조합 벡터를 아그로박테리움 투메파시언스 LBA4404에 형질전환시킨 다음 상기 형질전환된 아그로박테리움에 의해 식물 세포 내로 본 발명의 유전자가 도입되도록 하였다.

따라서, 본 발명은 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다. 형질전환된 세포로는 아그로박테리움 속 미생물(Agrobacterium spp.), 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)와 같은 원핵 숙주 세포, 진균(예를 들어, 아스퍼질러스(Aspergillus)), 효모(예를 들어, 피키아 패스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세르비지애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스(Schizosaccharomyces), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa) 등과 같은 하등 진핵세포, 곤충 세포, 식물 세포, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵생물 유래의 세포일 수 있으나, 이에 제한되지는 않으며, 바람직하게는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefacience) 또는 아그로박테리움 라이조게네스(Agrobacterium rhizogenes) 일 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 벡터가 도입되고, 토코트리에놀을 포함한 비타민E 함량이 고농도로 합성하는 형질전환 식물 세포를 제공한다.

형질전환 식물 세포의 제조는 벡터를 식물에 도입하는 당분야에 공지된 형질전환 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나, 아그로박테리움 속(Agrobacterium spp.) 미생물을 이용한 형질전환, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 전기천공법(electroporation) 및 PEG(Polyethylenglycol)에 의한 침전법을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 아그로박테리움-매개 형질전환법을 이용할 수 있으며, 문헌에 예시된 방법을 사용할 수 있다[Horsch et al., Science 227:1229-1231, 1985].

상기 식물세포는 통상적인 방법에 따라 배양되어 액체 배양물, 캘러스, 원형질 배양물이 될 수 있으며, 분화되어 식물의 조직 또는 식물이 될 수 있다. 즉, 본 발명의 재조합 벡터가 도입된 형질전환 세포들은 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 신초 유도, 발근 및 토양 순화와 같은 과정을 거쳐 식물체로 재분화시킬 수 있으며, 꺾꽂이, 접붙이기 등과 같은 무성번식방법 및 종자를 이용하여 유성번식방법에 의해 생산할 수 있다.

식물세포의 배양은 식물의 일부를 모체로부터 분리하여 적당한 조건 아래에서 무균적으로 배양하여 생육시키는 것으로 조직 절편의 액체 배양, 조직 절편의 캘러스 배양, 원형질체 배양 등 당업자에게 공지된 어떠한 방식의 것에 의할 수 있으며, 그 배양 조건 및 방법은 당업자에게 공지된 조건 및 방법에 의해 수행될 수 있다.

상기 배양된 식물세포를 식물로 분화시키는 것은 캘러스, 원형질체 형태의 배양된 식물세포를 적당한 조건 아래에서 분화를 유도하여 식물의 조직 또는 식물로 분화시키는 것으로 그 분화 조건 및 방법은 당업자에게 공지된 조건 및 방법에 의해 수행될 수 있다.

따라서, 본 발명은 또한, 상기 벡터가 도입되고, 토코트리에놀을 포함한 비타민E를 고농도로 합성하는 형질전환 식물을 제공한다.

이때, 상기에서 식물이란 전체 식물(whole plant), 식물의 일부분, 캘러스, 식물 조직, 식물 세포 및 식물 종자를 모두 포함한다. 상기 본 발명에 따른 방법이 적용될 수 있는 식물체로는 단자엽 식물 또는 쌍자엽 식물이 포함된다. 상기 단자엽 식물의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 벼, 밀, 보리, 귀리, 죽순, 옥수수, 토란, 아스파라거스, 양파, 마늘, 파, 부추, 달래, 마 및 생강이 있다. 쌍자엽 식물의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 애기장대, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 버즈풋 트레포일, 감자, 개구리밥, 들깨, 비둘기콩 및 완두가 있다.

본 발명의 실시예에서는 본 발명에 사용된 HGGT 유전자의 게놈 DNA를 분리하기 위해 동진벼의 잎으로부터 게놈 DNA를 분리하고, PCR 방법에 의해 HGGT 유전자를 클로닝하였다.

본 발명의 다른 실시예에서는 클로닝된 HGGT 유전자를 pSB11 벡터에 도입하여 본 발명의 pMJC-GGB-HGGT, pMJC-35S-HGGT를 제조하고, 이를 아그로박테리움 LBA4404 균주에 도입하였다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 상기 형질전환된 아그로박테리움 균주를 이용하여 콩에 형질전환하고 토코트리에놀을 포함한 비타민E를 고농도로 합성하는 형질전환 콩을 제조하였다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 본 발명의 형질전환 콩에서 유전자 도입 여부, 발현 여부 및 비타민E 합성 여부를 확인하였다. 그 결과, 형질전환 콩에서 HGGT 유전자가 도입되어 발현되고 있음을 알 수 있었으며, 유전자 발현을 위해 Glb 프로모터를 사용한 형질전환 콩에서 잎과 종자에서 그 정도의 차이는 있으나 비타민E 함량이 35S 프로모터를 사용한 형질전환체와 익산 나물 콩에 비해 현저히 높아짐을 알 수 있었다. 특히, 선발된 일부 형질전환계통에서는 8개의 비타민E 이성체가 모두 생성되어 기능성이 매우 높을 것으로 생각된다.

이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 구체적으로 설명하겠는 바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : HGGT 유전자의 클로닝

본 발명에 사용된 HGGT 유전자의 게놈 DNA를 분리하기 위해, 동진벼의 잎으로부터 게놈 DNA를 CTAB 방법(Rogers & Benich, In: Gelvin SB, Schilperoort RA, Verma DPS(eds) Plant Molecular Biology Manual. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands, pp 1-8, 1994)에 따라 분리하였다. 분리된 게놈 DNA 10 ng을 주형으로 하고, 각 프라이머 25 pM 및 최종 부피 50 ㎕의 PCR 반응 액(1X f-Taq 완충액(Solgent, Korea), 각 dNTP 50 μM, 1X 밴드 닥터(Solgent, Korea), f-Taq DNA 폴리머라아제 1.5 유닛(Solgent, Korea) 및 잔량의 이차증류수)을 이용하여 PCR을 수행하였다. 이때, HGGT 유전자를 클로닝하기 위한 프라이머로는 서열번호 3(T3FOR: 5'-AAAAAGCAGGCTAGACGATGCAAGCCTCATCGG-3') 및 서열번호 4(T3REV: 5'-AGAAAGCTGGGTCTCACTGCACAAATGGTATAAG-3')의 조합을 이용하였다. PCR 조건은 94℃ 4분; 94℃ 15초, 55℃ 30초, 72℃ 60초의 30 싸이클(cycle); 및 72℃ 7분의 조건으로 수행하였다.

증폭된 PCR 산물은 EtBr(ethidium bromide)이 첨가된 0.8% 아가로오스 겔(agarose gel)에서 전기영동한 다음 젤에서 회수하여 pGEM-T easy vector(Promega, USA)에 클로닝하여 염기서열을 분석하였다.

그 결과, 서열번호 1의 염기서열 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지고 있는 HGGT 유전자를 얻을 수 있었다.

클로닝된 HGGT 유전자를 기존에 NCBI에 등록된 서열과 비교 분석한 결과, 본 발명에서 클로닝한 HGGT 유전자의 염기서열과 아미노산 서열은 기존에 NCBI에 등록된 것(Nucleotide NCBI Accession No.: AY222862; Amino acid NCBI Accession No.: AAP43913.1)과 차이가 없었다.

실시예 2 : 형질전환을 위한 운반체의 제작 및 아그로박테리움에의 도입

본 발명을 위해 사용된 인트론을 포함하는 HGGT 유전자는 게이트웨이 시스템(Gateway system; Invitrogen, USA)을 이용하여 pSB11 벡터(Komari et al., Plant J. 10: 165-174, 1996)에 도입하였다. HGGT 유전자의 발현을 위해서 벼에서 분리한 종자 특이 발현 Glb 프로모터와 콜리플라워 모자이크 바이러스에서 분리한 CaMV 35S 프로모터가 사용되었다.

유전자의 도입이 확인된 형질전환용 운반체는 CaMV 35S 프로모터 조절 하의 것은 pMJC-35S-HGGT로, Glb 프로모터 조절하의 것은 pMJC-GGB-HGGT로 명명하였다. 형질전환된 신초 및 식물체의 선발을 위해서는 CaMV 35S 프로모터에 의해 제어되는 bar(Bialaphos resistance) 유전자를 이용하였으며, 양쪽 보더(border) 안쪽으로 MAR(Matrix attachment region)를 추가하여 유전자의 안정적인 발현을 유도하였다. 상기 재조합된 식물 형질전환 운반체의 주요 유전자 배열은 도 2에 나타내었다.

상기 발현벡터 pMJC-35S-HGGT 와 pMJC-GGB-HGGT의 제작과정은 다음과 같다. HGGT 유전자가 포함된 식물 형질전환용 pMJC-35S-HGGT 와 pMJC-GGB-HGGT를 제작을 위해 박테리오파지 람다(bacteriophage lamda)의 염기서열 특이 재조합(site-sequence specific recombination) 기작을 이용하는 방법인 게이트웨이 벡터 시스템(Gateway vector system)을 사용하였다. 먼저, 비피 클론나제(BP clonase)를 이용한 엔트리 클론(Entry clone)의 제작을 위해 attB 서열이 포함되도록 디자인된 PCR 프라이머로 증폭하였다. 첫 단계 증폭에서 사용된 PCR 프라이머는 실시예 1에서 HGGT 유전자의 분리에 사용한 서열번호 3(T3FOR: 5'-AAAAAGCAGGCTAGACGATGCAAGCCTCATCGG-3') 및 서열번호 4(T3REV: 5'-AGAAAGCTGGGTCTCACTGCACAAATGGTATAAG-3')의 조합을 이용하였다(attB 서열은 밑줄로 나타내었다). 얻어진 PCR 산물은 두 번째 PCR 반응을 위한 주형으로 첫 번째 PCR 산물 DNAs에 attB 서열이 추가된 프라이머 조합 즉 서열번호 5(5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3')와 서열번호 6(5'-GGGGACCACTTTGTACA AGAAAGCTGGG-3')을 사용하여 중폭시킨 후에 정제하였다. 정제된 PCR 산물(300 ng/reaction)과 pDONR vector(150 ng/㎕) 2㎕, 5X BP clonase reaction buffer 5㎕, BP clonase 4 ㎕를 첨가하고 TE buffer(pH 8.0)로 전체 볼륨이 25㎕가 되도록 맞춘 후 25℃에서 1시간 이상 반응시켰다. 반응이 끝난 후 2 ㎕ proteinase K를 첨가하고 37 ℃에서 10분 처리 후, 반응이 완료된 용액은 E. coli(계통, TOP10)에 형질전환 후 50 ㎍/㎖ kanamycin이 포함된 LB 배지에서 형질전환 콜로니를 선발하고 PCR 방법으로 재확인하였다. LR 재조합에 의한 발현 콜로니의 클로닝을 위해 작성된 pDONR:HGGT 벡터(300 ng/reaction)와 pMJC-35S 벡터와 pMJC-GGB 벡터(300 ng/reaction) 및 5X clonase Reaction buffer 4 ㎕를 첨가하였다. TE buffer(pH 8.0)를 이용하여 최종 부피가 16 ul가 되도록 첨가한 후 25 ℃에서 1시간 반응시켰다. 반응 후 2 ㎕의 protenase K를 E-튜브에 넣고 10분간 37 ℃에서 반응시켜 LR clonase 반응을 종료시켰다. E. coli(strain, TOP10)에 형질전환 후 50 ㎍/㎖의 spectinomycine이 포함된 LB 배지에서 형질전환된 콜로니를 선발하고 콜로니 PCR에 의해 형질전환체를 확인하여 pMJC-35S-HGGT 벡터와 pMJC-GGB-HGGT 벡터를 제작하였다.

제작된 형질전환용 바이너리 벡터들은 3계 교잡법(tri-parental mating)에 의해 아그로박테리움 LBA4404 균주에 도입하였으며, 재조합된 플라스미드가 포함된 아그로박테리움의 선발을 위해서 2종의 항생제인 스펙티노마이신(spectinomycin)과 테트라사이클린(tetracycline)을 사용하였다. 아그로박테리움 내로의 형질전환 여부는 콜로니 PCR 방법으로 확인하였다. PCR 반응은 1X f-Taq 완충액(Solgent, Daejeon, Korea), 각 dNTP 50 μM, 1X 밴드 닥터(Solgent, Daejeon, Korea), f-Taq DNA 폴리머라아제 1.5 유닛(Solgent, Daejeon, Korea) 및 각 프라이머 25 pM을 첨가하고 멸균수로 최종 부피를 25 ㎕로 맞춘 PCR 반응액에 각각의 운반체가 형질전환된 콜로니의 일부를 팁으로 찍어 첨가하였다. PCR은 94℃ 4분; 94℃ 15초, 55℃ 30초, 72℃ 60초의 30 싸이클; 및 72℃ 7분의 조건으로 수행하였다. 증폭된 산물은 0.8% 아가로오스 겔(agarose gel)에서 전기 영동하여 확인하였다.

그 결과, 도 3에서 보듯이, 선발된 8개의 콜로니(1 내지 8) 모두에서 사용한 프라이머의 기대 크기인 약 1.2 kb 위치에서 밴드를 나타내어 HGGT 유전자가 아그로박테리움에 안정적으로 형질전환된 것으로 확인되었다. 이러한 형질전환 아그로박테리움을 증식 후 콩의 형질전환에 이용하였다.

실시예 3 :　비타민E 고함유 형질전환 콩의 제조

3-1. 종자 발아

① 공시 품종으로는 국내품종인 익산 나물 콩을 사용하였다. 　　　　먼저, 종자를 75% 에탄올에 1분간 침지한 다음 멸균수로 2회 세척하였다. 　　　　세척된 종자를 20% 락스 용액으로 상온에서 12분 동안 다시 소독한 후 멸균수로 3회 세척하여 멸균 처리하였다. 　　　　멸균된 종자는 약 15~20개로 나누어 여과지가 깔린 배양접시(90×20 ㎝ petridish)에 넣고 멸균수를 10~15 ㎖ 정도 부어 27 ℃에서 2일 이상 발아시킨 다음 형질전환에 사용하였다.

3-2. 아그로박테리움의 배양 및 현탁액 준비

초저온 냉장고(-70 ℃)에서 글리세롤 스탁으로 저장되어 있는 2종의 재조합 플라스미드가 형질전환된 아그로박테리움을 꺼내 AB-ST 배지(표 1 참조)에 조밀하게 도말하여 27 ℃ 암　조건에서 5~7일간을 배양하였다.　　　　 배양이 끝난 아그로박테리움을 페트리 접시(petri dish)당 CCM-L 배지 15~20 ㎖(표 1 참조)을 분주한 후 멸균된 루프를 이용하여 긁어내고 팔콘 튜브(falcon tube)로 옮겨 담았다. 그 다음 아그로박테리움이 잘 현탁될 수 있도록 수초 동안 볼텍싱(vortaxing)하였으며, 최종 접종 농도는 650 ㎚에서 흡광도 2.5 이상이 되도록 하였다.

[표 1]

형질전환 단계별 배지 종류 및 조성

형질전환 단계	배 지	조 성
아그로박테리움 배양	AB-ST	AB 완충액, 염, 글루코오스 5g/L, 박토-아가(Bacto-agar) 15g/L, 스펙티노마이신(spectinomycine) 50mg/L, 테트라사이클린(tetracycline) 10mg/L, pH 7.0
아그로박테리움 현탁 및 접종	CCM-L	1/2 B5 매크로 및 미세 염, B5 비타민, 엠이에스(MES) 4.26g/L, Na2EDTA 1ml/L, 수크로오스 30g/L, 아세토시린곤(acetosyringone) 200uM/L, 지에이쓰리(GA3) 0.25mg/L, 비에이피(BAP) 5mg/L, pH 5.2
공동배양	CCM	1/2 B5 매크로 및 미세 염, B5 비타민, 엠이에스(MES) 4.26g/L, Na2EDTA 1ml/L, 수크로오스 30g/L, 아세토시린곤(acetosyringone) 200uM/L, 지에이쓰리(GA3) 0.25mg/L, 비에이피(BAP) 5mg/L, 티오황산나트륨(sodium thiosulfate) 1mM/L, 디티오트레이톨(dithiothreitol) 1mM/L, 파이타-아가(phyta-agar) 5.5g/L, pH 5.2
신초 유도	SIMP6	MS 매크로 및 미세 염, B5 비타민, 엠이에스(MES) 0.63g/L, Na2EDTA 10ml/L, ferrous sulfate 28mg/L, 세포탁심(cefotaxime) 100mg/L, 카베니실린(carbenicillin) 500mg/L, 젤라이트(gelrite) 2.6g/L, 비에이피(BAP) 0.4mg/L, 아이비에이(IBA) 100ug/L, L-포스피노트리신(L-phosphinotricine) 6mg/L, pH 5.7
신초 신장	SEMP6	MS 매크로 및 미세 염, B5 비타민, 엠이에스(MES) 0.63g/L, Na2EDTA 10ml/L, Ferrous sulfate 28mg/L, 세포탁심(cefotaxime) 100mg/L, 카베니실린(carbenicillin) 500mg/L, 젤라이트 2.6g/L, GA3 0.5mg/L, IAA 0.1mg/L, Silver-nitrate 10mg/L, Zeatin-riboside 1mg/L, Asparagine 50mg/L, Pyroglutamic acid 100mg/L, L-포스피노트리신 6mg/L, pH 5.7
뿌리 유도	RM	1/2 B5 매크로 및 미세 염, B5 비타민, 엠이에스(MES) 0.63g/L, 수크로오스 20g/L, 아이비에이(IBA) 1mg/L, 플랜트아가(plant agar) 8g/L, 활성탄 0.5g/L, pH 5.6

3-3. 발아된 종자로부터 배축 조직의 분리 및 절단

② 2일 이상 발아시킨 콩 종자에서 먼저 자엽 한쪽을 떼어낸 다음 노출된 배축으로부터 남아있는 다른 한쪽의 자엽을 완전히 분리하였다. 　　　　이때, 초생엽을 포함한 분열조직이 상하지 않게 조심하였다. 분리된 배축에서 정단부 및 측아 분열조직을 포함한 0.5~2 cm 정도의 배축 부분만 남기고 나머지 부분은 잘라내었다. 　　　　잘라낸 배축은 15 ㎖ 튜브에 모아 아그로박테리움 접종에 사용하였다.

3-4. 아그로박테리움 접종 및 공동 배양

분리된 배축이 담겨져 있는 15　㎖ 튜브에 2　㎖의 아그로박테리움 현탁액을 첨가하고 5~6시간 동안 25　℃ 암　조건에서 접종하였다. 　　　　도입 유전자의 배축 조직 세포　내로의 도입을 향상시키고 형질전환된 세포의 생존율을 높이기 위해 공동배양 배지 조성 및 조건을 변경하였다. 　　　　배지　조성은 기본 배지(B5)의 함량을 1/2로 줄이고 아그로박테리움과의 공동 배양 과정에서 발생되는 식물 세포의 산화적 파괴를 최소화하기 위하여 2종의 항산화 화합물, 즉 티오황산나트륨 1mM, 디티오트레이톨 1　mM 등을 첨가하였다. 　　　　아가는 파이타-아가(phyta-agar)를 사용하였으며, 함량은 5.5 g/L로 조정하였다(표 1 참조).

공동　배양 조건으로는 먼저 접종된 배축은 공동　배양 배지 위에 깔아 놓은 여과지(Watman #1) 위에다 두었으며 동시에 아그로박테리움 현탁액 1~2 ㎖를 추가로 공급하여 배축 조직 세포 내로의 목표 유전자 도입을 극대화하였다. 　　　　공동　배양 기간은 7일로 조정하였으며, 늘어난 배양 기간으로 인한 아그로박테리움의 과도한 성장은 관찰되지 않았다. 　　　　또한, 공동 배양 기간 동안의 온도는 26.5 ℃(1일)에서 23.5 ℃(6일)로 변온 처리하였다.

3-5. 형질전환된 신초의 유도 및 선발

공동 배양 과정이 끝난 배축에서 아그로박테리움을 제거하기 위해 세포탁심(cefotaxime) 100 mg/L, 카베니실린(carbenicillin) 500 mg/L이 포함된 용액으로 약 3회 이상 세척하였으며, 세척이 끝난 배축은 멸균된 여과지가 들어 있는 페트리 접시로 옮겨 남아 있는 용액을 완전히 제거하였다. 이 과정을 마친 배축은 PPT(6 mg/L)가 포함된 신초 유도 배지(SIMP6)에 옮겨 16시간 명 조건인 25 ℃ 배양실에서 2주 동안 형질전환된 조직으로부터 신초 발생을 유도하고 선발하였다.

3-6. 형질전환된 신초의 신장 유도

유도된 신초는 GA3 0.5 mg/L, IAA 0.1 mg/L, Silver-nitrate 10 mg/L, Zeatin-riboside 1 mg/L, Asparagine 50 mg/L, Pyroglutamic acid 100 mg/L, L-포스피노트리신 6 mg/L, 세포탁심(cefotaxime) 100 mg/L, 카베니실린(carbenicillin) 500 mg/L, 젤라이트 2.6 g/L이 포함된 SEMP6 배지(표 1 참조)에 치상한 다음, 상기 조건에서 형질전환된 신초의 신장을 유도하였으며 2주 간격으로 계대하였다.

3-7. 뿌리 유도 및 순화

신장된 신초는 잘라내어 아이비에이(IBA) 2 mg/㎖ 용액에 6분 동안 침지하였다. 뿌리 유도 배지로는 1/2 B5배지를 기본 배지로 사용하였으며, 활성탄 0.5 g/L, 아이비에이(IBA) 1 mg/L, 설탕(sucrose) 20 g/L 및 플랜트-아가(plant-agar) 8 g/L 등을 추가하였다(표 1 참조). 뿌리가 유도된 식물체는 바로커 상토에 옮겨 순화시켰으며 순화된 식물체는 화분에 이식하고 온실에서 관리하였다.

실시예 4 : 형질전환 콩 식물체의 선발 및 세대 진전

4-1. 형질전환 콩 식물체의 선발

상기 실시예 3에서 제조된 2종의 형질전환 운반체가 형질전환된 식물체(T0)의 후대인 T1 식물체를 대상으로 선발마커로 사용된 bar 유전자를 활용하여 제초제저항성 생물 검정을 수행하였다. 생물 검정은 발아된 T1 식물체에 0.2% 바스타 액제를 고르게 바르거나 살포하는 방법으로 처리하고 1주일 후에 저항성을 평가하는 방법으로 실시하였다.

도 4A는 온실에서 수행한 제초제저항성 생물검정의 결과를 나타낸 것으로 본 발명에서 획득한 GGB/25 형질전환 T1 식물체의 경우 발아된 74개체를 대상으로 바스타를 살포하였을 때 50개체는 제초제에 저항성을 보였으나 24개체는 고사되어 제초제 저항성이 없는 것으로 나타났다. 또한, 35S/4 형질전환 식물체는 68개체를 평가하여 48개체는 제초제에 저항성을 보였으나 20개체는 제초제 저항성이 없는 것으로 조사되었다(도 4A). 이러한 결과는 본 발명에 의해 제조된 형질전환 콩은 분리세대인 T1 세대에서 제초제를 처리하였을 때 저항성과 감수성으로 정확히 분리하고 있어 도입 유전자가 안정적으로 유전되고 있음을 나타낸다.

4-2. 선발된 형질전환 계통의 세대 진전

상기 실시예 4-1에서 제초제저항성 생물검정에서 저항성을 보인 GGB/25와 35S/4 형질전환 T1 식물체의 종자는 수확 후에 포장에서 T2와 T3 세대를 진전하였다.

그 결과, 도 4B에서 보듯이, 형질전환 콩이 파종된 시험포장에 바스타 제초제를 살포하였을 때 잡초는 모두 고사하였으나 선발된 T2와 T3 콩 식물체는 살아남 아 선발마커로 사용된 bar 유전자가 안정적으로 발현되고 있는 것으로 확인되었다. 또한, 형질전환에 사용된 원품종인 익산 나물 콩의 종자와 형질전환 계통의 종자는 외관상 특별한 차이를 보이지 않아 안정적으로 종자 생산이 가능함을 확인하였다(도 4C).

실시예 5 : 형질전환 콩의 유전자 발현량 분석 및 도입 수 확인

5-1. 형질전환체에서의 유전자 발현 확인

형질전환 GGB/25와 35S/4 계통을 대상으로 HGGT 유전자의 발현량을 비교하기 위하여 다음과 같이 반정량적 RT-PCR과 실시간 PCR을 실시하였다. 형질전환계통(GGB/25, 35S/4)과 형질전환에 사용된 원 품종인 익산 나물 콩의 생육단계 중 V4(Leaf-1: L-1), R1(Leaf-2 : L-2) 시기의 잎과 R5(Seed-1 : S-1), R6 (Seed-2 : S-2) 시기의 종자를 수확하여 생체 중 100 mg으로 total RNA extraction을 수행하였다. RNeasy Plant Mini kit(QIAGEN)을 이용하였고 RNase-Free DNase(QIAGEN)을 처리하여 genomic DNA를 제거하였다. 얻어진 Total RNA 1 ug을 ReverTra-Plus-TM(TOYOBO, Japan)을 이용하여 cDNA를 합성하였다.

<반정량적 RT-PCR >

합성된 cDNA를 희석하여 내재성 유전자(Housekeeping gene, 18S rRNA)에 대해서는 서열번호 7(F: 5'-GAATTCTAGTAAGCGCGAGTCATCAG-3')와 서열번호 8(R: 5'-CTACGGAAACCTTGTTACGACTTCTC-3')의 조합을 프라이머로, 형질전환한 HGGT 유전자는 서열번호 9(F: 5'-AGCGTACGTTTGGGTCCAGAAAGA-3')과 서열번호 10(R: 5'-CTCTCTGCCAAAGTGCAAAGGCAA-3')의 조합을 프라이머로 사용하여 각각의 유전자에 대한 반정량적 RT-PCR를 수행하였다. 폴리머레이즈는 바이오툴스 디엔에이 폴리머레이즈(Biotools DNA polymerase: Biotools, Madrid, Spain)를 사용하였으며, PCR 조건은 94℃ 30초; 60℃ 30초, 72℃ 30초 조건으로 30, 38 사이클(cycle)로 각각 증폭하였고 증폭된 산물은 1.5% 아가로스 겔에서 확인하였다.

<실시간 PCR >

반정량적 RT-PCR과 동일한 조건의 cDNA로 내재성 유전자(18S rRNA)와 HGGT 유전자를 대상으로 Real-time PCR를 수행하였다. 기기로는 Rotor-gene 6000(Corbett Lift Science) 기종을 사용하였으며, LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I(Roche, Mannheim, Germany)을 이용하여 94℃ 10초, 60℃ 10초, 72℃ 15초 조건으로 40 사이클로 증폭하였고, 얻어진 결과는 대조구의 내재성 유전자를 캘리브레이터(calibrator)로 하여 델타 델타 Ct 분석법으로 형질전환체의 생육시기별 HGGT 발현량을 비교하였다

그 결과, 도 5A와 5B에서 보듯이, 반정량적 RT-PCR와 실시간 PCR를 이용하여 형질전환 GGB/25와 35S/4 계통의 HGGT 유전자 발현을 비교하였을 때 GGB/25 형질전환 계통은 35S/4 계통에 비해 잎과 종자에서 HGGT 유전자의 발현이 45~240배 높음을 확인하였다.

5-2. 형질전환체에 도입된 유전자의 카피수 확인

형질전환체에 도입된 각각의 유전자의 카피수를 확인하기 위해, 대조군 식물체(익산 나물 콩)와 형질전환 계통(GGB/25와 35S/4)을 이용하여 다음과 같이 서던블랏을 수행하였다.

대조군 식물체 및 형질전환 식물체의 콩 잎으로부터 게놈 DNA는 CTAB 방법(Rogers & Benich, 1994)으로 게놈 DNA를 분리하였다. 10 ug의 게놈 DNA를 제한효소 BamHI으로 처리하였다. 그런 다음 0.8% 젤에서 밤새 전기영동한 후, 나일론 멤브레인에 이전(transfer)시켰다. 탐침(probe)으로는 DIG로 표지한 HGGT 유전자를 사용하였다.

그 결과, 도 5C에서 보듯이, 형질전환 GGB 계통은 HGGT 유전자가 1 카피 도입되었으며 35S 계통은 1 내지 2 카피수로 도입되었음을 알 수 있었다

실시예 6 : 형질전환 콩에서 토코트리에놀 및 토코페롤 합성 확인

시료 0.5 g을 50 ㎖ 원심분리관에 취하여 아스코르빈산 0.1 g과 에탄올 5 ㎖를 가하고 80 ℃의 항온 수조에서 10분간 진탕 후 80% KOH 용액 0.15 ㎖를 가하여 80 ℃에서 10분간 비누화(saponification)을 실시한 후 빙욕에 옮겨 신속히 냉각하였다. 증류수 5 ㎖와 헥산 5 ㎖를 가하여 잘 혼합 후 원심분리하고 헥산층을 100 ㎖ 분액여두에 취하였으며, 헥산 5 ㎖씩 2회 더 추출작업을 반복하여 분액여두에 합하였다. 이 헥산층에 증류수 5 ㎖를 가하여 3회 세척하였고 헥산층을 Na₂SO₄로 탈수시킨 후 질소 가스로 농축하였다. 이 농축 잔사물을 1 ㎖ 이소옥탄으로 용해하여 0.2 ㎛ 나일론 시린지 필터(nylon syringe filter)로 여과한 것을 HPLC 분석 시료로 8종류의 이성체 별로 분석하였고, 그들 중 토코페롤의 합과 토코트리에놀의 합 및 총 비타민E 함량으로 나타내었다.

토코페롤 및 토코트리에놀 분석을 위한 HPLC(Sykam, S1101, Germany) 조건은 다음과 같다; 컬럼: Zorbax Silica(4.6 × 250 mm), 검출기: Fluorescence detector(excitation 290nm, emission 330 nm), 이동상 용매: isooctane/ethylacetate/acetic acid/ 2.2-di-methoxypropane = 98.5 : 0.7 : 0.7 : 0.1, 이동상 용매 유속: 1.6 ㎖/min, 시료 주입량: 20 ㎕. 토코트리에놀과 토코페롤의 표준품은 Merck사(Germany) 제품을 사용하였다.

또한, 잎과 종자에서 생합성된 토코트리에놀 이성체의 정성 분석을 위하여 LC/MS/MS 분석을 실시하였다. 분석기기로는 ZMD 4000(Micromass, UK)을 이용하였으며, 분무 가스로는 질소를 사용하였다. 원료 온도(source temperature)는 150 ℃, 분해 온도(desolvation temperature)의 온도는 250 ℃로 하였으며, 증폭시의 전압은 650 V로 하여 토코트리에놀 각각의 이성체에 해당하는 424.7, 410.6, 410.6, 396.6 m/z 값을 갖는 이온을 모니터링하였다. 토코트리에놀 각각의 이성체의 확인은 표준 시료의 UV 스펙트럼, 잔존 시간과 m/z 값을 기준으로 동정하였다.

그 결과, 도 6A에서 보듯이, 대조군인 익산 나물 콩의 경우 토코트리에놀이 합성되지 않았으나 대부분의 형질전환 계통에서는 토코트리에놀의 합성이 확인되었다(도 6A, 표 2). 아울러, LC/MS/MS 정성 분석에서도 형질전환 계통의 잎과 종자에서 토코트리에놀 이성체가 검출되어 HGGT 유전자에 의해 토코트리에놀이 성공적으로 합성됨을 확인하였다(도 6B)

또한, Glb 프로모터 조절 하에 HGGT 유전자를 발현시키는 콩 형질전환 5계통은 8종의 비타민E 이성체 모두를 합성하였으며, 비타민E 합성량에서도 35S 프로모터의 조절하의 HGGT 유전자를 발현시키는 형질전환 계통에 비해 높음을 확인하였다(도 6C, 표 2).

[표 2] (수치 : 피크면적)

계통	토코페롤				토코트리에놀				토코페롤	토코트리에놀	비타민 E	증가량 (배)
	dT	bT	gT	aT	dT3	bT3	gT3	aT3
B1	21.5	1.4	36.1	3.2	2.9				62.2	2.9	65.1	93
B2	13.2	3.5	27.9	3.1	4.0				47.7	4.0	51.6	74
B3	16.2	2.2	29.3	3.0	6.1				50.7	6.1	56.7	81
B4	16.7	1.9	29.2	3.0	7.8				50.9	7.8	58.6	84
B6	18.9	5.7	35.6	3.4	6.5				63.6	6.5	70.2	100
B8	17.0	1.3	30.7	2.6	6.5				51.6	6.5	58.1	83
B9	27.4	5.3	36.5	13.7	8.3	5.2	4.2	2.3	82.9	20.0	102.9	147
B10	20.4	7.7	28.6	13.3	10.0	13.2	4.8	1.5	70.0	29.4	99.4	142
B11	14.6	0.9	30.1	8.0	4.6	3.2	3.2	1.5	53.6	12.4	66.0	94
B12	11.5	1.3	22.4	8.5	3.6	5.6	3.9	1.6	43.7	14.6	58.3	83
B14	0.2				0.1	0.4		0.2	0.2	0.7	0.9	1
B15	0.7		1.6	0.2	0.2	0.1		0.1	2.4	0.4	2.9	4
B16	5.5		15.7	3.7	3.0	0.9	2.8		24.9	6.7	31.6	45
B17	11.2		20.9	6.9	7.8	2.8	5.6		39.0	16.2	55.2	79
B18	11.0	1.6	22.1	7.2	6.9	2.5	5.2		41.8	14.6	56.5	81
B19	8.1		30.5	5.0	0.7	1.3	2.4		43.6	4.4	48.0	69
B22	16.8	5.3	29.0	10.1	5.1				61.2	5.1	66.3	95
B23	13.6	3.2	22.6	7.1	4.2	1.2	3.6	2.8	46.5	11.8	58.4	83
B29	16.0	1.9	29.9	8.3	8.5		1.5		56.1	9.9	66.1	94
B30	15.5	6.3	28.5	11.1	7.5		4.5		61.4	12.0	73.3	105
C3			0.3	Trace		0.4		0.1	0.3	0.5	0.8	1
C4	15.5	3.5	28.8	9.2		0.8			56.9	0.8	57.7	82
C5	9.6	1.8	23.4	4.7				1.4	39.4	1.4	40.8	58
C6	10.2	2.6	20.6	4.7		0.6	0.2	1.3	38.1	2.2	40.2	57
C7	10.4	3.1	18.9	6.1			1.6		38.5	1.6	40.1	57
C9	14.3	4.9	24.0	8.5	1.6		1.2	2.0	51.7	4.8	56.6	81
C10	12.0	4.5	22.2	6.9			2.5		45.6	2.5	48.1	69
C11	4.9	1.7	11.1	2.9	1.4		1.7	0.9	20.6	4.1	24.6	35
C12	9.2	2.3	22.5	5.9	2.1			1.7	40.0	3.8	43.8	63
C13	3.5	0.6	12.1	2.2	0.2		0.9		18.4	1.1	19.4	28
C14	10.9	3.5	20.8	5.9	1.4				41.2	1.4	42.6	61
C16	8.8	1.3	25.0	5.4	2.3	0.5		1.2	40.4	4.0	44.5	64
C17	9.4	2.1	26.2	5.3	1.8		0.8	0.9	43.0	3.6	46.6	67
C18	0.1		0.3	Trace	0.1	0.2		0.1	0.4	0.3	0.7	1
C19	1.2	0.7	2.9	1.5	0.5	1.6		2.8	6.3	4.9	11.2	16
C20	12.9		22.0	7.0		2.4			41.9	2.4	44.2	63
C21	0.4		0.4	0.1	0.2	0.2		0.4	0.9	0.8	1.7	2
C22	0.2		0.5	Trace	0.2	0.3		0.1	0.7	0.7	1.4	2
C23	0.4		0.2	Trace	0.2	0.1		0.1	0.6	0.5	1.1	2
C24	0.3	0.2	0.3	0.1	0.2	0.3		0.1	1.0	0.5	1.5	2
익산	0.2		0.4	0.1					0.6	0.0	0.7	1

도 1은 재조합 벡터 pMJC-35S-HGGT 와 pMJC-GGB-HGGT의 제작과정을 나타낸 모식도이다.

도 2는 본 발명의 재조합 벡터의 개열지도를 나타낸 것이다(Glb (Glb promoter), HGGT(HGGT gene), 3'Pinll(Pin-Ⅱ terminator), 35S P(CaMV 35S promoter), bar(bar coding region), 3'Nos(Nos terminator)).

도 3은 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA4404에 대하여 형질전환 여부를 콜로니 PCR로 확인한 것이다(M : 크기 마커, lane 1 ~ 4 : HGGT/GGB/LBA4404 , lane 5 ~ 8 : HHGT/35S /LBA4404).

도 4는 콩 형질전환 식물체 선발 및 세대 진전을 나타낸 것이다(A : 온실에서 제초제 바스타를 살포하여 형질전환 식물체를 선발하는 과정, B : 포장에서 제초제를 처리하여 형질전환 식물체를 선발하고 세대 진전과정, C : 세대 진전된 형질전환 콩으로부터 수확한 종자).

도 5는 HGGT 유전자가 도입된 형질전환 콩 GGB 계통과 35S 계통의 발현정도를 비교하기 위해 반정량적 RT-PCR(A), 실시간 PCR(B) 및 서던블랏 분석(C)으로 확인한 것이다(L1과 L2는 콩 생육시기 V4와 R1 : S1과 S2는 콩 생육시기 R5와 R6).

도 6은 대조구과 형질전환 콩에서 토코페롤 및 토코트리에놀을 HPLC(A), LC/MS/MS(B)로 분석한 것이며, C는 8개의 비타민E 이성체 모두를 합성한 계통을 나타낸 것이다.

<110> RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION <120> Recombinant vector comprising polynucleotide related with tocotrienol biosynthesis and transformants transformed thereby <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1215 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HGGT gene <400> 1 atgcaagcct catcggcggc ggcggcggcg gcgtgctcgg ctatcaagcc ggcggcgcat 60 cagcacaccg tgcaagtcca ggaagataag aggggatcgg aattcagggc tcggtttgga 120 acgaggaaac tgtcctgggg aggtaaattg tcggtggaaa attctgctct acaccagtgt 180 caaagtctca caagaagcat aaggaggcaa aaaagacaac attctccagt cctccaagtg 240 agatgctatg ccattgctgg tgatcagcac gaatccatcg ccactgagtt tgaagaaatt 300 tgcaaagaag ttccccagaa actgggagct ttttatcggt tttgccgacc ccacacaatt 360 tttggcacta taataggaat cacttcagtt tctctcctgc caatgaggag cctagatgat 420 tttactatga aagcattatg gggatttctt gaggctttat cctcttcttt atgtatgaat 480 atctatgttg taggcctgaa tcaactatat gacatccaga ttgataaggt caataagccc 540 agccttccgt tggcgtcagg agaattttca gtggcaactg gagcagtgtt agtactcacg 600 tccttgatca tgagcattgc cattggaatc agatccaaat cagctccttt gttatgtgct 660 ttgtttatca gtttctttct tggaagtgca tactctgttg atgctccgtt actccggtgg 720 aaaaggaacg cgtttctcgc tgcatcttgt atactatttg taagagctgt cttagttcag 780 ctagctttct ttgcacatat gcagcaacat gttctgaaga ggcccttggc accaacaaag 840 tcggtggttt tcgcaacatt attcatgtgt tgcttttctt cagttatagc tttattcaag 900 gatattccag atattgatgg tgacagacat tttggcgtcg aatccctgag cgtacgtttg 960 ggtccagaaa gagtgtattg gctctgcata aacatactat taacagcata tggggctgcc 1020 attttggctg gagcatcatc tacaaatcta tgtcaaatga ttatcaccgt tttcggccat 1080 ggcctgcttg cctttgcact ttggcagaga gcacagcact gtgacgttga aaacaaggcg 1140 tggatcacat cattttacat gttcatttgg aagttgttct acgctgagta tttccttata 1200 ccatttgtgc agtga 1215 <210> 2 <211> 404 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HGGT protein <400> 2 Met Gln Ala Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Cys Ser Ala Ile Lys 1 5 10 15 Pro Ala Ala His Gln His Thr Val Gln Val Gln Glu Asp Lys Arg Gly 20 25 30 Ser Glu Phe Arg Ala Arg Phe Gly Thr Arg Lys Leu Ser Trp Gly Gly 35 40 45 Lys Leu Ser Val Glu Asn Ser Ala Leu His Gln Cys Gln Ser Leu Thr 50 55 60 Arg Ser Ile Arg Arg Gln Lys Arg Gln His Ser Pro Val Leu Gln Val 65 70 75 80 Arg Cys Tyr Ala Ile Ala Gly Asp Gln His Glu Ser Ile Ala Thr Glu 85 90 95 Phe Glu Glu Ile Cys Lys Glu Val Pro Gln Lys Leu Gly Ala Phe Tyr 100 105 110 Arg Phe Cys Arg Pro His Thr Ile Phe Gly Thr Ile Ile Gly Ile Thr 115 120 125 Ser Val Ser Leu Leu Pro Met Arg Ser Leu Asp Asp Phe Thr Met Lys 130 135 140 Ala Leu Trp Gly Phe Leu Glu Ala Leu Ser Ser Ser Leu Cys Met Asn 145 150 155 160 Ile Tyr Val Val Gly Leu Asn Gln Leu Tyr Asp Ile Gln Ile Asp Lys 165 170 175 Val Asn Lys Pro Ser Leu Pro Leu Ala Ser Gly Glu Phe Ser Val Ala 180 185 190 Thr Gly Ala Val Leu Val Leu Thr Ser Leu Ile Met Ser Ile Ala Ile 195 200 205 Gly Ile Arg Ser Lys Ser Ala Pro Leu Leu Cys Ala Leu Phe Ile Ser 210 215 220 Phe Phe Leu Gly Ser Ala Tyr Ser Val Asp Ala Pro Leu Leu Arg Trp 225 230 235 240 Lys Arg Asn Ala Phe Leu Ala Ala Ser Cys Ile Leu Phe Val Arg Ala 245 250 255 Val Leu Val Gln Leu Ala Phe Phe Ala His Met Gln Gln His Val Leu 260 265 270 Lys Arg Pro Leu Ala Pro Thr Lys Ser Val Val Phe Ala Thr Leu Phe 275 280 285 Met Cys Cys Phe Ser Ser Val Ile Ala Leu Phe Lys Asp Ile Pro Asp 290 295 300 Ile Asp Gly Asp Arg His Phe Gly Val Glu Ser Leu Ser Val Arg Leu 305 310 315 320 Gly Pro Glu Arg Val Tyr Trp Leu Cys Ile Asn Ile Leu Leu Thr Ala 325 330 335 Tyr Gly Ala Ala Ile Leu Ala Gly Ala Ser Ser Thr Asn Leu Cys Gln 340 345 350 Met Ile Ile Thr Val Phe Gly His Gly Leu Leu Ala Phe Ala Leu Trp 355 360 365 Gln Arg Ala Gln His Cys Asp Val Glu Asn Lys Ala Trp Ile Thr Ser 370 375 380 Phe Tyr Met Phe Ile Trp Lys Leu Phe Tyr Ala Glu Tyr Phe Leu Ile 385 390 395 400 Pro Phe Val Gln <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T3FOR <400> 3 aaaaagcagg ctagacgatg caagcctcat cgg 33 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T3REV <400> 4 agaaagctgg gtctcactgc acaaatggta taag 34 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 5 gaattctagt aagcgcgagt catcag 26 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 6 ctacggaaac cttgttacga cttctc 26 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 7 agcgtacgtt tgggtccaga aaga 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 8 ctctctgcca aagtgcaaag gcaa 24

Claims (10)

1. 삭제
2. 삭제
3. 형질전환용 운반체는 도 2에 기재된 개열 지도를 가지는 pMJC-GGB-HGGT 인 것을 특징으로 하는 벡터.
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 청구항 3에서의 벡터가 도입되어, 토코트리에놀을 합성하고 총 토코페롤 합성량이 증가된 형질전환 콩.
8. 제 7 항에 있어서, 4종의 토코페롤(알파, 베타, 감마, 델타)과 4종의 토코트리에놀(알파, 베타, 감마, 델타)를 생성하는 것을 특징으로 하는 형질전환 콩.
9. 삭제
10. 삭제

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