KR101629370B1 - 토코트리에놀 생합성 형질전환 벼를 포함하는 전립선암 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 토코트리에놀 생합성 형질전환 벼를 포함하는 전립선암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 HGGT(homogentisic acid geranylgeranyl transferase) 유전자가 형질전환되어 토코트리에놀을 생합성할 수 있는 형질전환 벼의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 전립선암 예방 또는 치료용 약학 조성물, 및 전립선암 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 HGGT 유전자가 형질전환된 흑남벼의 추출물은 전립선암의 예방 및 치료 효능을 가짐으로써, 전립선암의 치료를 위한 의약품 및 건강기능식품 등에 적용되어 널리 활용될 수 있다.

Description

토코트리에놀 생합성 형질전환 벼를 포함하는 전립선암 예방 또는 치료용 조성물{Composition for Preventing or Treating Prostate Cancer Comprising Rice Transformed with Tocotrienol Biosynthesis Gene}

본 발명은 토코트리에놀 생합성 형질전환 벼를 포함하는 전립선암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 HGGT(homogentisic acid geranylgeranyl transferase) 유전자가 형질전환되어 토코트리에놀을 생합성할 수 있는 형질전환 흑남벼의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 전립선암 예방 또는 치료용 약학 조성물, 및 전립선암 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.

최근 주요 작물에 비타민, 철분, 아연 등 유용한 미량 영양소의 함량을 높이기 위한 생물영양 강화(biofortification) 연구가 활발히 진행되고 있다. 생물영양 강화를 위한 주요 방법으로는 전통적 육종방법(conventional selective breeding)과 유전공학기술을 이용하는 방법(genetic engineering)이 있으나 전통적 육종방법의 경우 교배가 가능한 작물 내에서만 생물영양 강화를 할 수 있다는 한계가 있어 기능성 유전자를 다양한 생물 종으로부터 확보하여 도입할 수 있는 유전공학을 이용하는 방법이 많이 활용되고 있는 실정이다.

비타민 E는 토코페롤과 토코트리에놀로 구성되며, 두 종류의 화합물에 각각 알파, 베타, 감마, 델타 등 4 종류의 동족체가 있어 모두 8종의 이성체가 존재하고 있다. 주로 식물성 유지, 맥아 등에 많이 포함되어 있으며, 콩, 강낭콩, 해바라기, 들깨 등에는 토코페롤만 존재하고 토코트리에놀 성분은 없는 것으로 보고되었다[박 등, 한작지 49(3): 207-210, 2004].

비타민 E의 주요 생리활성 기능으로는 지질과산화(lipid peroxidation)를 방지하는 항산화작용을 들 수 있으며, 지금까지 비타민 E 이성체 중에서 알파-토코페롤이 가장 항산화 활성이 높은 것으로 알려져 있었으나, 최근 연구에서는 토코트리에놀이 토코페롤보다 항산화작용이 40~60배 더 우수한 것으로 밝혀지고 있다. 더욱이 토코트리에놀의 경우, 항암, 혈중 콜레스테롤 저하, 심장 및 혈관계 질환 개선효과 외에도 세포 보호, 면역 강화, 치매 개선 등의 기능성 효과가 있는 것으로 보고되고 있다[Sen et al., Life Sci. 78(18): 2088-2098, 2006]. 이러한 최근의 보고를 참고할 때 토코트리에놀을 다량 생합성할 수 있는 식물체가 다양한 생리 활성을 가질 수 있음을 예측할 수 있다.

이에, 본 발명자들은 선행 연구를 통하여 토코트리에놀 생합성 과정에 관여하는 효소 유전자(HGGT 유전자)를 도입한 형질전환체를 개발하여 이의 생리 활성 및 응용성에 대한 연구를 통해 특허출원(대한민국 공개특허 제10-2011-0075392호 및 제10-2012-0072545호)을 한 바 있다.

이에 더하여, 본 발명자들은 상기 형질전환체의 구체적인 생리 활성 및 계통별 차이에 주목한 결과, 상기 HGGT 유전자가 형질전환되어 토코트리에놀을 생합성할 수 있는 벼 중에서, 흑남벼의 경우 일미벼와는 달리 전립선 암세포의 세포 증식 및 세포 주기를 조절함으로써, 전립선암 예방 및 치료 효능이 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 HGGT(homogentisic acid geranylgeranyl transferase) 유전자가 형질전환된 흑남벼의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 전립선암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 HGGT 유전자가 형질전환된 흑남벼의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 전립선암 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 HGGT(homogentisic acid geranylgeranyl transferase) 유전자가 형질전환된 흑남벼의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 전립선암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은 기존에 본 발명자들에 의해 개발된 방법(대한민국 공개특허 제10-2011-0075392호 및 제10-2012-0072545호)을 이용하여 제조한 형질전환 흑남벼가 전립선암 세포의 증식을 저해하고 전립선암 세포 주기 활성화를 억제함으로써, 전립선암의 예방, 개선 또는 치료라는 신규한 용도를 가짐을 밝힌 것을 발명의 특징으로 한다.

본 발명에서 용어 "HGGT(homogentisic acid geranylgeranyl transferase, 호모젠티세이트 제라닐제라닐 트랜스퍼라제) 유전자"는 토코트리에놀 생합성 과정에 관여하는 유전자 중 하나이다. 지금까지 보고된 HGGT 유전자는 벼, 보리, 밀, 수수, 옥수수 등의 화본과 작물에서 분리되었으며 이들 염기서열에서의 상동성은 75~100%를 나타낸다.

비타민 E를 생성시키는 주요 대사 경로로는 토코페롤과 토코트리에놀 구조에서 머리부분의 합성에 관여하는 시키메이트 경로(shikimate pathway)와 꼬리부분을 합성하는 엠이피 경로(MEP pathway)가 있으며, 위의 두 경로를 통해 생성된 호모젠티세이트(homogentisate)와 피틸-피피(phytyl-PP)를 결합시키는 효소인 호모젠티세이트 피틸트랜스퍼라제(homogentisic acid phytyltransferase, HPT)에 의해 토코페롤이 만들어지며, 이와 다른 경로인 호모젠티세이트와 지지디피(geranylgeranyl-PP)를 결합시키는 효소인 호모젠티세이트 제라닐제라닐 트랜스퍼라제(homogentisic acid geranylgeranyl transferase, HGGT)에 의해 토코트리에놀이 생성된다[B. Karunanandaa et al., Metabolic engineering doi: 10.1016, 2005].

본 발명에서는 흑남벼에 형질전환하기 위하여, 공지된 HGGT 유전자를 모두 사용할 수 있으며, 상기 작물에서 분리한 다양한 종류의 HGGT 유전자를 사용할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 흑남벼에 형질전환시키기 위한 목적으로, 벼에서 분리한 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 HGGT 유전자를 사용하였으며, 이는 공지의 데이터베이스에 개시된 서열과 동일한 것임을 확인하였다. 이에, 상기 HGGT 유전자는 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 것일 수 있다.

본 발명에서, 상기 형질전환 흑남벼는 HGGT 유전자가 형질전환됨으로써, 토코트리에놀을 생합성할 수 있는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 일실시예에서는 본 발명의 방법으로 형질전환된 흑남벼가 감마 토코트리에놀 함량을 유지하면서, 델타 토코트리에놀 함량을 현저하게 증가시킨다는 것을 확인하였다(도 4).

본 발명에서 상기 HGGT 유전자는 공지의 방법을 통하여 흑남벼에 형질전환될 수 있으며, 바람직하게는 프로모터에 작동가능하게 연결되어 재조합 벡터의 형태로 형질전환될 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터는 공지의 식물 형질전환용 벡터를 기본 벡터로 하여 제조될 수 있으며, 일반적인 이원 벡터(binary vector) 또는 코인테그레이션 벡터(cointegration vector)가 사용될 수 있다. 식물 형질전환에 사용되는 바이너리 벡터의 종류는 매우 다양하며, 거의 모든 바이너리 벡터가 CAMBIA(Center for the Application of Molecular Biology to International Agriculture, GPO Box 3200, Canberra ACT2601, Australia)와 같은 국제센터 및 대학연구소에서 입수 가능하며, 기본적인 바이너리 벡터의 골격은 Ti 플라스미드를 모체로 하여 유전자가 전달되는 좌측 및 우측경계 부위에 형질전환체 선별 표지 유전자, 프로모터, 전사종결부위 유전자 등을 다양하게 변형시켜 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 벡터는 식물 형질전환용 벡터이므로, 당업계에 알려진 다양한 식물체-기능적 프로모터가 사용될 수 있으며, 상기 HGGT 유전자의 발현을 위해서 상기 HGGT 유전자는 프로모터와 작동가능하게 연결될 수 있다. 상기 '프로모터'란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미하며, '작동 가능하게 연결된다(operably linked)'는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다. 아울러, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 추가로 포함할 수 있다.

상기 프로모터로는 공지의 프로모터를 모두 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나 콩 종자에서 발현되는 것으로 알려진 베타-콘글라이신(β-conglycine) 프로모터, 완두에서 분리한 비실린(vicilin) 프로모터, 글로불린(globulin, Glb) 프로모터, 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터, 피그워트 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 슈가케인 바실리폼 바이러스 프로모터, 코메리나 옐로우 모틀 바이러스 프로모터, 리불로스-1,5-비스-포스페이트 카르복실라아제의 소단위(ssRUBISCO)로부터의 빛-유도성 프로모터, 쌀 사이토졸릭 트리오세포스페이트 이소머라아제(TPI) 프로모터, 아라비돕시스(Arabidopsis)로부터의 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제(APRT) 프로모터, 쌀 액틴 1 유전자 프로모터 및 만노핀 신타아제 및 옥토핀 신타아제 프로모터를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 글로불린(globulin, Glb) 프로모터 또는 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터를 사용할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 상기 글로불린 프로모터 또는 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터를 이용하여 형질전환 흑남벼를 제조하였다.

또한, 상기 선별 표지 유전자는 항생제 저항성 유전자, 제초제 저항성 유전자, 대사관련 유전자, 발광 유전자, GFP(green fluorescence protein) 유전자, GUS(β-glucuronidase) 유전자, GAL(β-galactosidase) 유전자 등을 포함하지만, 그것에 한정되는 것은 아니다. 구체적으로 제초제 저항성 bar 유전자, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 Ⅱ(NPT Ⅱ) 유전자, 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자, 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제 유전자, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 또는 다이하이드로폴레이트 환원효소 유전자 등이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 제초제 저항성 bar 유전자가 사용될 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 식물 형질전환용 벡터는 도 1에 개시된 개열지도를 가지는 벡터, 즉, pMJC-GGB-HGGT, pMJC-35S-HGGT 벡터일 수 있다. 상기 벡터는 pSB11 벡터(Genbank Accession No. AB027256)를 기본 백본(backbone)으로 하여 벼 배유특이발현 글로불린(globulin, Glb) 프로모터 및 감자 프로테아제 인히비터(protease inhibitor II, PinII)의 터미네이터 사이에 attB1 서열; 서열번호 1의 HGGT 유전자; 및 attB2 서열이 순차적으로 연결된 구조물을 포함한다.

본 발명에서 전립선암 예방 또는 치료의 유효성분으로 포함되는 것은 상기에서 설명한 바와 같은 형질전환 흑남벼의 추출물이다. 상기 "추출물(extract)"은 식물을 적절한 침출액으로 짜내고 침출액을 증발시켜 농축한 제제를 의미하는 것으로, 이에 제한되지는 않으나, 추출처리에 의해 얻어지는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 이들의 조정제물 또는 정제물일 수 있다. 상기 형질전환 흑남벼는 당업계에 공지된 일반적인 추출방법, 분리 및 정제방법을 이용하여 제조할 수 있다. 상기 추출방법으로는, 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게 열탕 추출, 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 방법을 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 추출물은 추출용매로 추출하거나 추출용매로 추출하여 제조한 추출물에 분획용매를 가하여 분획함으로써 제조할 수 있다. 상기 추출용매는 이에 제한되지 않으나, 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매 등을 사용할 수 있으며, 상기 유기용매는 탄소수 1 내지 4의 알코올이나, 에틸아세테이트 또는 아세톤 등의 극성용매, 헥산 또는 디크로로메탄의 비극성용매 또는 이들의 혼합용매를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 이들의 혼합용매를 사용할 수 있다.

본 발명에서 용어 "예방"이란 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여에 의해 전립선암의 발생, 확산 및 재발을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"란 상기 약학 조성물의 투여에 의해 전립선암의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에 따른 형질전환 흑남벼의 추출물은 전립선암을 예방 및 치료하는 효능을 가진다. 본 발명의 용어 "전립선암(Prostate Cancer)"은 전립선에서 발생하는 약성 종양을 의미하며, 남성암 중 가장 흔한 암으로 높은 발생 빈도를 보이는 암이다.

본 발명에서는 전립선암 세포주인 PC-3 세포주를 대상으로, 세포부착, 세포자살 및 세포생존에 관련된 단백질 발현 수준을 분석한 결과, 본 발명의 형질전환 흑남벼에서 FAK, beclin-1 및 AKT1 단백질의 발현 수준이 현저하게 감소하는 것을 확인하였으며(도 5), 전립선 암세포 주기 활성화를 억제하고(도 6), type II collagen 발현을 증가시켜(도 7) 전립선암 세포로 진전되는 것을 저해할 수 있음을 확인하였다.

특히, 본 발명에서는 비교군으로서 동일한 형질전환 과정을 거친 다른 품종인 일미벼를 사용하여 동일한 실험을 진행한 결과, 일미벼는 야생형과 형질전환 군 사이에 별다른 차이가 없음을 확인하였으며, 그에 따라 본 발명의 토코트리에놀 생합성 유전자의 형질전환은 오로지 흑남벼에서만 특이적으로 전립선암 치료 효능을 가질 수 있게 됨을 확인할 수 있었다.

본 발명에서 상기 "흑남벼"는 1991년 농촌진흥청 호남농업시험장에서 내병 다수성인 흑미품종을 육성할 목적으로 양질 다수성인 탐진벼에 흑미인 상해향혈나를 교배시켜 세대촉진 및 계통육종법으로 세대를 전진시킨 벼 품종으로서, 널리 알려진 벼 품종이다. 중만생종으로 출수기가 동진벼에 비하여 2일정도 빠르며, 벼키는 73㎝로 14㎝ 정도 짧은 단간이다. 주당 이삭수는 동진벼보다 약간 많으나 이삭당 벼알수는 비슷하며 등숙비율, 정현비율 및 현미천립중은 약간 낮고, 영색은 출수기에는 녹색을 띄다가 황숙기에는 진보라로, 완숙기에는 연보라색으로 변하는 품종이다. 쌀알의 모양은 동진벼보다 약간 길며 현미색은 흑자색이고 알카리붕괴도는 비슷하며 아밀로스 함량은 낮다. 한편, 상기 "일미벼"는 농촌진흥청 영남농업시험장에서 밀양 96호, 밀양 95호, 동진벼 등을 인공교배시켜 육성한 벼 품종이다.

상기 본 발명의 약학조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 용어 "약학적으로 허용가능한"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다. 상기 담체는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제, 기제, 부형제, 윤활제 등 당업계에 공지된 것이라면 제한없이 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 약학조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 나아가, 연고제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 크림제, 산제, 현탁제, 겔제 또는 젤의 형태의 피부 외용제의 형태로 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 형질전환 흑남벼의 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 61(tween 61), 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

한편, 본 발명의 약학조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명의 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 건강상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여, 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 HGGT 유전자가 형질전환된 흑남벼의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 전립선암 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물을 식품 조성물로 사용하는 경우, 상기 형질전환 흑남벼의 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상의 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 상기 조성물은 유효성분 이외에 식품학적으로 허용가능한 식품보조첨가제를 포함할 수 있으며, 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "식품보조첨가제"란 식품에 보조적으로 첨가될 수 있는 구성요소를 의미하며, 각 제형의 건강기능식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 식품보조첨가제의 예로는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 본 발명의 식품보조첨가제의 종류가 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 식품 조성물에는 건강기능식품이 포함될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "건강기능식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 '기능성'이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 건강기능식품의 제형 또한 건강기능식품으로 인정되는 제형이면 제한없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다.

또한, 본 발명의 조성물이 사용될 수 있는 건강식품의 종류에는 제한이 없다. 아울러 본 발명의 형질전환 흑남벼의 추출물을 활성성분으로 포함하는 조성물은 당업자의 선택에 따라 건강기능식품에 함유될 수 있는 적절한 기타 보조 성분과 공지의 첨가제를 혼합하여 제조할 수 있다. 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림 류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 본 발명에 따른 추출물을 주성분으로 하여 제조한 즙, 차, 젤리 및 주스 등에 첨가하여 제조할 수 있다.

본 발명의 HGGT 유전자가 형질전환된 흑남벼의 추출물은 전립선암의 예방 및 치료 효능을 가짐으로써, 전립선암의 치료를 위한 의약품 및 건강기능식품 등에 적용되어 널리 활용될 수 있다.

도 1은 재조합 벡터 pMJC-35S-HGGT 와 pMJC-GGB-HGGT의 제작과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 재조합 벡터의 개열지도를 나타낸 것이다(Glb (Glb promoter), HGGT(HGGT gene), 3'Pinll(Pin-Ⅱ terminator), 35S P(CaMV 35S promoter), bar(bar coding region), 3'Nos(Nos terminator)).
도 3은 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA4404에 대하여 형질전환 여부를 콜로니 PCR로 확인한 것이다(M: 크기 마커, lane 1 ~ 4: HGGT/GGB/LBA4404 , lane 5 ~ 8: HHGT/35S /LBA4404).
도 4는 형질전환 일미벼 및 흑남벼에서의 토코페롤 및 토코트리에놀 함량을 분석한 결과이다(T: 토코페롤, T3: 토코트리에놀).
도 5는 형질전환 일미벼 및 흑남벼 추출물 처리시 전립선암 세포주의 암세포 생성 관련 단백질의 발현을 분석한 결과이다(HGGT-IM#13: 형질전환 일미벼, HGGT-HN#22: 형질전환 흑남벼).
도 6은 형질전환 일미벼 및 흑남벼 추출물 처리시 전립선암 세포주의 암세포 주기 활성 관련 miR-30c-3p 발현을 분석한 결과이다(Con: 대조군, 5-1: 야생형 일미벼, 5-2: 형질전환 일미벼, 5-5: 야생형 흑남벼, 5-6: 형질전환 흑남벼).
도 7은 형질전환 일미벼 및 흑남벼 추출물 처리시 전립선암 세포주에서 type II collagen의 발현을 분석한 결과이다(Con: 대조군, 5-1: 야생형 일미벼, 5-2: 형질전환 일미벼, 5-5: 야생형 흑남벼, 5-6: 형질전환 흑남벼).

이하, 하기 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1 : HGGT 유전자의 클로닝

이하 실시예를 통하여 형질전환 벼를 제조하는 과정은 대한민국 공개특허 제10-2011-0075392호 및 제10-2012-0072545호에 개시된 방법과 동일하게 제조하였다.

구체적으로, 본 발명에 사용된 HGGT 유전자의 게놈 DNA를 분리하기 위해, 동진벼의 잎으로부터 게놈 DNA를 CTAB 방법(Rogers & Benich, In: Gelvin SB, Schilperoort RA, Verma DPS(eds) Plant Molecular Biology Manual. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands, pp 1-8, 1994)에 따라 분리하였다. 분리된 게놈 DNA 10 ng을 주형으로 하고, 각 프라이머 25 pM 및 최종 부피 50 μl의 PCR 반응액(1X f-Taq 완충액 (Solgent, Korea), 각 dNTP 50 μM, 1X 밴드 닥터(Solgent, Korea), f-Taq DNA 폴리머라아제 1.5 유닛 (Solgent, Korea) 및 잔량의 이차증류수)을 이용하여 PCR을 수행하였다. 이때, HGGT 유전자를 클로닝하기 위한 프라이머로는 서열번호 3(T3FOR: 5'-AAAAAGCAGGCTAGACGATGCAAGCCTCATCGG-3') 및 서열번호 4(T3REV: 5'-AGAAAGCTGGGTCTCACTGCACAAATGGTATAAG-3')의 조합을 이용하였다. PCR 조건은 94℃ 4분; 94℃ 15초, 55℃ 30초, 72℃ 60초의 30 싸이클(cycle); 및 72℃ 7분의 조건으로 수행하였다.

증폭된 PCR 산물은 EtBr(ethidium bromide)이 첨가된 0.8% 아가로오스 겔(agarose gel)에서 전기영동한 다음 젤에서 회수하여 pGEM-T easy vector(Promega, USA)에 클로닝하여 염기서열을 분석하였다.

그 결과, 서열번호 1의 염기서열 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지고 있는 HGGT 유전자를 얻을 수 있었다.

클로닝된 HGGT 유전자를 기존에 NCBI에 등록된 서열과 비교 분석한 결과, 본 발명에서 클로닝한 HGGT 유전자의 염기서열과 아미노산 서열은 기존에 NCBI에 등록된 것(Nucleotide NCBI Accession No.: AY222862; Amino acid NCBI Accession No.: AAP43913.1)과 차이가 없었다.

실시예 2 : 형질전환을 위한 운반체의 제작 및 아그로박테리움에의 도입

본 발명을 위해 사용된 인트론을 포함하는 HGGT 유전자는 게이트웨이 시스템(Gateway system; Invitrogen, USA)을 이용하여 pSB11 벡터(Komari et al., Plant J. 10: 165-174, 1996)에 도입하였다. HGGT 유전자의 발현을 위해서 벼에서 분리한 종자 특이 발현 Glb 프로모터와 콜리플라워 모자이크 바이러스에서 분리한 CaMV 35S 프로모터가 사용되었다.

유전자의 도입이 확인된 형질전환용 운반체는 CaMV 35S 프로모터 조절하의 것은 pMJC-35S-HGGT로, Glb 프로모터 조절하의 것은 pMJC-GGB-HGGT로 명명하였다. 형질전환된 신초 및 식물체의 선발을 위해서는 CaMV 35S 프로모터에 의해 제어되는 bar(Bialaphos resistance) 유전자를 이용하였으며, 양쪽 보더(border) 안쪽으로 MAR(Matrix attachment region)를 추가하여 유전자의 안정적인 발현을 유도하였다. 상기 재조합된 식물 형질전환 운반체의 주요 유전자 배열은 도 2에 나타내었다.

상기 발현벡터 pMJC-35S-HGGT 와 pMJC-GGB-HGGT의 제작과정은 다음과 같다. HGGT 유전자가 포함된 식물 형질전환용 pMJC-35S-HGGT 와 pMJC-GGB-HGGT를 제작을 위해 박테리오파지 람다(bacteriophage lamda)의 염기서열 특이 재조합(site-sequence specific recombination) 기작을 이용하는 방법인 게이트웨이 벡터 시스템(Gateway vector system)을 사용하였다. 먼저 비피 클론나제(BP clonase)를 이용한 엔트리 클론(Entry clone)의 제작을 위해 attB 서열이 포함되도록 디자인된 PCR 프라이머로 증폭하였다. 첫 단계 증폭에서 사용된 PCR 프라이머는 실시예 1에서 HGGT 유전자의 분리에 사용한 서열번호 3(T3FOR: 5'-AAAAAGCAGGCTAGACGATGCAAGCCTCATCGG-3') 및 서열번호 4(T3REV: 5'-AGAAAGCTGGGTCTCACTGCACAAATGGTATAAG-3')의 조합을 이용하였다(attB 서열은 밑줄로 나타내었다). 얻어진 PCR 산물은 두 번째 PCR 반응을 위한 주형으로 첫 번째 PCR 산물 DNAs에 attB 서열이 추가된 프라이머 조합 즉 서열번호 5(5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3')와 서열번호 6(5'-GGGGACCACTTTGTACA AGAAAGCTGGG-3')을 사용하여 중폭시킨 후에 정제하였다. 정제된 PCR 산물(300ng/reaction)과 pDONR vector(150ng/㎕) 2㎕, 5X BP clonase reaction buffer 5㎕, BP clonase 4㎕를 첨가하고 TE buffer(pH 8.0)로 전체 볼륨이 25㎕가 되도록 맞춘 후 25℃에서 1시간이상 반응시켰다. 반응이 끝난 후 2㎕ proteinase K를 첨가하고 37℃에서 10분 처리 후, 반응이 완료된 용액은 E. coli(계통, TOP10)에 형질전환 후 50㎍/㎖ kanamycin이 포함된 LB배지에서 형질전환 콜로니를 선발하고 PCR 방법으로 재확인하였다. LR recombination에 의한 expression 콜로니의 클로닝을 위해 작성된 pDONR:HGGT vector(300ng/reaction)와 pMJC-35S vector와 pMJC-GGB vector(300ng/reaction) 및 5X clonase Reaction buffer 4㎕를 첨가하였다. TE buffer(pH 8.0)를 이용하여 최종 volume이 16ul가 되도록 첨가한 후 25℃에서 1시간 반응시켰다. 반응 후 2㎕의 protenase K를 E-tube에 넣고 10분간 37℃에서 반응시켜 LR clonase 반응을 종료시켰다. E. coli (strain, TOP10)에 형질전환 후 50㎍/㎖의 spectinomycine이 포함된 LB배지에서 형질전환된 colony를 선발하고 콜로니 PCR에 의해 형질전환체를 확인하여 pMJC-35S-HGGT vector와 pMJC-GGB-HGGT vector를 제작하였다.

제작된 형질전환용 바이너리 벡터들은 3계 교잡법(tri-parental mating)에 의해 아그로박테리움 LBA4404 균주에 도입하였으며, 재조합된 플라스미드가 포함된 아그로박테리움의 선발을 위해서 2종의 항생제인 스펙티노마이신(spectinomycin)과 테트라사이클린(tetracycline)을 사용하였다. 아그로박테리움 내로의 형질전환 여부는 콜로니 PCR 방법으로 확인하였다. PCR 반응은 1X f-Taq 완충액(Solgent, Daejeon, Korea), 각 dNTP 50 μM, 1X 밴드 닥터(Solgent, Daejeon, Korea), f-Taq DNA 폴리머라아제 1.5 유닛(Solgent, Daejeon, Korea) 및 각 프라이머 25 pM을 첨가하고 멸균수로 최종 부피를 25 μl로 맞춘 PCR 반응액에 각각의 운반체가 형질전환된 콜로니의 일부를 팁으로 찍어 첨가하였다. PCR은 94℃ 4분; 94℃ 15초, 55℃ 30초, 72℃ 60초의 30 싸이클; 및 72℃ 7분의 조건으로 수행하였다. 증폭된 산물은 0.8% 아가로오스 겔(agarose gel)에서 전기 영동하여 확인하였다.

그 결과, 도 3에서 보듯이, 선발된 8개의 콜로니(1 내지 8) 모두에서 사용한 프라이머의 기대 크기인 약 1.2 kb 위치에서 밴드를 나타내어 HGGT 유전자가 아그로박테리움에 안정적으로 형질전환된 것으로 확인되었다. 이러한 형질전환 아그로박테리움을 증식 후 벼의 형질전환에 이용하였다.

실시예 3 : 형질전환 벼 제조

벼에의 형질전환을 위하여 일미벼와 흑남벼 품종을 사용하였다. 종자소독을 위해 왕겨를 제거한 현미를 70% 에탄올에 5분간 침지하고, 50% hypochloride 용액에 15분 동안 2회 소독 후 멸균수로 세척하였다. 멸균된 종자는 2,4-D 2 mg/L가 포함된 2N6 배지에 배 부분이 위로 향하여 치상한 다음, 27 ℃ 암실에서 3~4주간 캘러스를 배양하고, 유도된 캘러스 중에서 1 ~ 2 mm의 일정한 둥근 모양의 갈변화가 안된 양호한 상태의 캘러스(embryonic callus)를 선발하여 형질전환에 사용하였다. 아그로박테리움은 AB-ST 배지에서 5일동안 배양하고, AAM 배지를 분주하여 현탁하였으며, 접종 농도는 650nm에서 흡광도 1.5~2.0이 되도록 하였다.

다음으로, 선발된 캘러스는 아그로박테리움 현탁액에 20~30분 동안 접종하였다. 접종된 캘러스는 아그로박테리움 현탁액을 제거한 후 대한민국 등록특허 제10-0736209호에 개시된 방법을 이용하여 공동배양을 실시하였다. 공동배양 과정이 끝난 캘러스는 세포탁심(cefotaxime) 250 mg/L이 포함된 용액으로 세척하였다. 이 과정을 마친 캘러스는 포스피노트리신(phosphinotricin, PPT) 6 mg/L이 포함된 2N6-CP 배지에 옮겨 27℃ 암조건에서 5주동안 배양하는 과정을 통해 형질전환된 캘러스를 선발하였다. 선발된 캘러스는 PPT 3 mg/L가 포함된 MSR-CP 배지에 옮겨 치상하고, 25℃ 명조건에서 형질전환 식물체를 유도하였다. 재분화 식물체는 MS0 배지로 옮겨 뿌리를 유도하였다. 뿌리가 유도된 식물체는 하이포넥스 양액(1000배)에 약 7~10일간 침지하여 순화하였으며, 순화된 식물체는 화분에 이식하고 온실에서 관리하였다.

상기 형질전환 단계에서 각각 사용한 배지 조성은 다음과 같다.

형질전환 단계	배 지	조 성
캘러스 유도 및 증식	2N6	N6 매크로(macro), 미세 염(micro salt), N6 비타민. 카사미노산(casamino acid) 300mg/L, 프롤린 500mg/L, 수크로오스 30g/L, 글루타민 500mg/L, 젤라이트 2.5g/L, 2.4-D 2mg/L, pH 5.8
아그로박테리움 배양	AB-KT	AB 완충액, 염, 글루코오스 5g/L, 박토-아가(Bacto-agar) 15g/L, 가나마이신(kanamycin) 50mg/L, 테트라사이클린(tetracycline) 10mg/L, pH 7.0
아그로박테리움 현탁 및 접종	AAM	AA 매크로, 미세 염, 아미노산 스탁(stock), MS 비타민, 철 스탁(stock), 카사미노산 500mg/L, 수크로오스 68.5g/L, 글루코오스 36g/L, 아세토시린곤(acetosyringone) 100uM/L, pH 5.8
공동배양	1/2-2N6- AS-New	1/2-2N6 배지, 아세토시린곤 100uM/L, 글루코오스 10g/L, 티오황산나트륨 1mM, 디티오트레이톨 1mM, 질산은 5mg/L, 젤라이트 3.0g/L, 2.4-D 2mg/L, pH 5.2
형질전환 캘러스 선발	2N6-CP	2N6 배지, 세포탁심(cefotaxime) 250mg/L, L-포스피노트리신(L-phosphinotricine) 6mg/L, 젤라이트 2.5g/L, 2.4-D 2mg/L, pH 5.8
재분화	MSR-CP	MS 매크로, 미세 염, MS 비타민, 세포탁심 250mg/L, NAA 1mg/L, 키네틴(Kinetine) 5mg/L, 소르비톨 30g/L, 말토오스 20g/L, L-포스피노트리신 3mg/L, 젤라이트 4g/L, pH 5.8
뿌리 유도	MS0	MS 매크로 및 미세 염, MS 비타민, 수크로오스 30g/L, 젤라이트 2.5g/L, pH 5.8

실시예 4 : 형질전환 벼의 토코트리에놀 합성 확인

상기 방법에 의해 형질전환된 벼에 도입된 유전자를 확인한 결과, HGGT 유전자가 정상적으로 1카피 이상 도입되었음을 확인하였으며, 형질전환된 일미벼(이하, 일미벼 HGGT 13-3-2-1-2-1-B로 명명) 및 흑남벼(이하, 흑남벼 HGGT 22-4-1-1-2-1-B로 명명)에서 토코트리에놀 및 토코페롤 합성을 확인하고자 하였다.

토코페롤 및 토코트리에놀 함량 분석, 즉 비타민 E의 함량은 하기와 같은 방법으로 측정하였다. 미강 가루시료 0.5 g에 6% 프로필 갈레이트(Propyl gallate, PG)가 포함된 EtOH 용액 10mL를 넣고 5분간 초음파 처리(sonication) 시킨 후 60% KOH 용액 10mL를 가하여 70℃ 항온수조에서 50분간 비누화(saponification)를 실시하고 ice bath에 옮겨 신속히 냉각하였다. 2% NaCl 30mL를 가하여 잘 흔들어주고 질소 충진 후 여기에 20mL의 0.01% butyl hydroxy toluen(BHT)이 첨가된 Hexane과 EtOAc 혼합용액(85:15)을 넣고 흔들어주고, 수분을 제거하기 위해 무수 MgSO₄ 5 g에 통과시켜 여과하는 과정으로 2회 반복 추출하였다.

추출물은 50mL volmetic flask에서 정용한 후 5mL를 추출하여 질소가스로 농축 한 후 이동상(n-Hexane:isopropanol=99:1, v/v) 1 mL에 재용해시킨 후 0.20 ㎛ 멤브레인 필터로 여과하였다.

토코페롤 및 토코트리에놀 분석을 위한 HPLC(Sykam, S1101, Germany) 조건은 다음과 같다; 컬럼: Zorbax Silica(4.6 × 250 mm), 검출기: Fluorescence detector(excitation 290nm, emission 330 nm), 이동상 용매: isooctane/ethylacetate/acetic acid/ 2.2-di-methoxypropane = 98.5 : 0.7 : 0.7 : 0.1, 이동상 용매 유속: 1.6 ㎖/min, 시료 주입량: 20 ㎕. 토코트리에놀과 토코페롤의 표준품은 Merck사(Germany) 제품을 사용하였다.

야생형 일미벼, 형질전환 일미벼, 야생형 흑남벼 및 형질전환 흑남벼에 대하여 토코트리에놀 조성 변화를 분석한 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 형질전환 일미벼에서는 알파와 베타 토코페롤이 낮아지고 감마와 델타 토코페롤이 높아졌으며, 알파 토코트리에논 함량이 낮아지고 감마와 델타 토코트리에놀이 증대된 것을 확인할 수 있었다.

반면, 형질전환 흑남벼에서는 형질전환 일미벼와는 다르게, 알파 토코페롤, 베타 토코페롤 및 감마 토코트리에놀의 함량이 유사하였으며, 델타 토코트리에놀의 함량이 약 2배 가량 증대된 것을 확인할 수 있었다.

이러한 결과를 통하여, 형질전환 흑남벼가 델타 토코트리에놀의 조성 변이로 인하여 기능성 활성이 나타날 것이라고 예측하고, 이하 분석을 진행하였다.

실시예 5 : 토코트리에놀 생합성 형질전환 흑남벼의 전립선암 예방 및 치료 효과 확인

실시예 5-1 : 암세포 증식 저해 효과 확인

먼저, 전립선암 세포주(PC-3)를 이용하여 암세포 생성 관련 유전자 발현의 양상 및 변화를 확인하고자 하였다.

구체적으로, 각각 야생형 일미벼, 형질전환 일미벼, 야생형 흑남벼 및 형질전환 흑남벼 추출물을 처리한 군을 대상으로, 암세포의 세포부착, 세포자살 및 세포생존에 관련된 단백질의 발현 패턴을 비교하였다.

단백질의 발현 패턴을 비교하기 위한 웨스턴 블랏은 다음과 같은 방법으로 실시하였다. 구체적으로, 목표유전자의 단백질 발현을 비교분석하기 위하여, 0.1% SDS를 포함하는 10% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동을 실시하였으며, 니트로셀룰로스 멤브레인(Schleicher and Schuell)에 트랜스퍼 하였다. 단백질이 옮겨진 멤브레인은 블라킹 버퍼(0.1% Tween 및 3% nonfat dry milk가 포함된 20 mM Tris-HCl, 137 mM NaCl, pH 8.0)에 담아 실온에서 1시간 배양하여, 다음과 같은 항체로 표지하였다. FAK(GenScript), beclin-1(Pierce), pp38(Cell Signaling Technology), AKT1(Proteintech), 및 CyclinG(abcam), GAPDH(abcam) 제품을 각각 이용하였다. 퍼옥시다아제 결합 2차 항체와 반응시킨 다음, electro chemiluminescence (ECL) system (Pierce)을 이용하여 현상하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 세포와 기질 간의 접착에 따른 신호전달에 중요한 역할을 담당하는 인산화 효소로서, 암세포의 기질 접착성과 세포 이동성 조절에 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려진 FAK(focal adhesion kinase), 암세포를 키우고 신경을 감퇴시키는 beclin-1, 및 암세포의 성장·침윤·전이·대사, 혈관 생성 등을 촉진하는 AKT1에 대하여, 형질전환 흑남벼 추출물을 처리한 군에서 그 발현이 현저히 낮아진 것을 확인할 수 있었다. 반면, 일미벼의 경우 야생형과 형질전환 군 사이에 별다른 유의성을 찾을 수 없었다.

실시예 5-2 : 암세포주기 활성화 관련 유전자 발현 억제 효과 확인

다음으로, cyclin D1 및 D2의 발현을 조절함으로써, 암세포주기 활성화와 관련된 유전자인 miR-30c-3p의 발현 양상을 확인하였다.

구체적으로, 전립선암 세포주(PC-3)에 각각 야생형 일미벼, 형질전환 일미벼, 야생형 흑남벼 및 형질전환 흑남벼 추출물을 처리한 군을 대상으로, 상기 miR-30c-3p의 발현량을 확인하였다.

그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 형질전환 일미벼의 경우 오히려 야생형 일미벼에 비하여 miR-30c-3p의 발현량이 증가한 반면, 형질전환 흑남벼를 처리한 경우에는 miR-30c-3p의 발현량이 현저하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 5-3 : type II collagen 발현 확인

마지막으로, 전립선암 세포주(PC-3)에서 각각의 추출물 처리시 염증억제 관련 유전자인 type II collagen의 발현의 변화를 확인하였다.

그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 형질전환 일미벼의 경우 별다른 차이를 보이지 않은 반면, 형질전환 흑남벼의 경우에는 현저한 수준의 type II collagen 발현 증가를 확인할 수 있었다.

이러한 결과를 종합하면, 본 발명의 토코트리에놀 생합성 유전자의 형질전환이 유도되는 경우 중에서, 흑남벼에서 특이적으로 전립선암 세포의 증식을 저해하고 전립선암 세포 주기 활성화를 억제함과 동시에, 염증억제를 통해 암세포로 진전되는 것을 저해함으로써, 결과적으로 전립선암 예방 및 치료 효능을 가짐을 알 수 있었다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Composition for Preventing or Treating Prostate Cancer Comprising Rice Transformed with Tocotrienol Biosynthesis Gene <130> PA131288/KR <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1215 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HGGT gene <400> 1 atgcaagcct catcggcggc ggcggcggcg gcgtgctcgg ctatcaagcc ggcggcgcat 60 cagcacaccg tgcaagtcca ggaagataag aggggatcgg aattcagggc tcggtttgga 120 acgaggaaac tgtcctgggg aggtaaattg tcggtggaaa attctgctct acaccagtgt 180 caaagtctca caagaagcat aaggaggcaa aaaagacaac attctccagt cctccaagtg 240 agatgctatg ccattgctgg tgatcagcac gaatccatcg ccactgagtt tgaagaaatt 300 tgcaaagaag ttccccagaa actgggagct ttttatcggt tttgccgacc ccacacaatt 360 tttggcacta taataggaat cacttcagtt tctctcctgc caatgaggag cctagatgat 420 tttactatga aagcattatg gggatttctt gaggctttat cctcttcttt atgtatgaat 480 atctatgttg taggcctgaa tcaactatat gacatccaga ttgataaggt caataagccc 540 agccttccgt tggcgtcagg agaattttca gtggcaactg gagcagtgtt agtactcacg 600 tccttgatca tgagcattgc cattggaatc agatccaaat cagctccttt gttatgtgct 660 ttgtttatca gtttctttct tggaagtgca tactctgttg atgctccgtt actccggtgg 720 aaaaggaacg cgtttctcgc tgcatcttgt atactatttg taagagctgt cttagttcag 780 ctagctttct ttgcacatat gcagcaacat gttctgaaga ggcccttggc accaacaaag 840 tcggtggttt tcgcaacatt attcatgtgt tgcttttctt cagttatagc tttattcaag 900 gatattccag atattgatgg tgacagacat tttggcgtcg aatccctgag cgtacgtttg 960 ggtccagaaa gagtgtattg gctctgcata aacatactat taacagcata tggggctgcc 1020 attttggctg gagcatcatc tacaaatcta tgtcaaatga ttatcaccgt tttcggccat 1080 ggcctgcttg cctttgcact ttggcagaga gcacagcact gtgacgttga aaacaaggcg 1140 tggatcacat cattttacat gttcatttgg aagttgttct acgctgagta tttccttata 1200 ccatttgtgc agtga 1215 <210> 2 <211> 404 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HGGT protein <400> 2 Met Gln Ala Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Cys Ser Ala Ile Lys 1 5 10 15 Pro Ala Ala His Gln His Thr Val Gln Val Gln Glu Asp Lys Arg Gly 20 25 30 Ser Glu Phe Arg Ala Arg Phe Gly Thr Arg Lys Leu Ser Trp Gly Gly 35 40 45 Lys Leu Ser Val Glu Asn Ser Ala Leu His Gln Cys Gln Ser Leu Thr 50 55 60 Arg Ser Ile Arg Arg Gln Lys Arg Gln His Ser Pro Val Leu Gln Val 65 70 75 80 Arg Cys Tyr Ala Ile Ala Gly Asp Gln His Glu Ser Ile Ala Thr Glu 85 90 95 Phe Glu Glu Ile Cys Lys Glu Val Pro Gln Lys Leu Gly Ala Phe Tyr 100 105 110 Arg Phe Cys Arg Pro His Thr Ile Phe Gly Thr Ile Ile Gly Ile Thr 115 120 125 Ser Val Ser Leu Leu Pro Met Arg Ser Leu Asp Asp Phe Thr Met Lys 130 135 140 Ala Leu Trp Gly Phe Leu Glu Ala Leu Ser Ser Ser Leu Cys Met Asn 145 150 155 160 Ile Tyr Val Val Gly Leu Asn Gln Leu Tyr Asp Ile Gln Ile Asp Lys 165 170 175 Val Asn Lys Pro Ser Leu Pro Leu Ala Ser Gly Glu Phe Ser Val Ala 180 185 190 Thr Gly Ala Val Leu Val Leu Thr Ser Leu Ile Met Ser Ile Ala Ile 195 200 205 Gly Ile Arg Ser Lys Ser Ala Pro Leu Leu Cys Ala Leu Phe Ile Ser 210 215 220 Phe Phe Leu Gly Ser Ala Tyr Ser Val Asp Ala Pro Leu Leu Arg Trp 225 230 235 240 Lys Arg Asn Ala Phe Leu Ala Ala Ser Cys Ile Leu Phe Val Arg Ala 245 250 255 Val Leu Val Gln Leu Ala Phe Phe Ala His Met Gln Gln His Val Leu 260 265 270 Lys Arg Pro Leu Ala Pro Thr Lys Ser Val Val Phe Ala Thr Leu Phe 275 280 285 Met Cys Cys Phe Ser Ser Val Ile Ala Leu Phe Lys Asp Ile Pro Asp 290 295 300 Ile Asp Gly Asp Arg His Phe Gly Val Glu Ser Leu Ser Val Arg Leu 305 310 315 320 Gly Pro Glu Arg Val Tyr Trp Leu Cys Ile Asn Ile Leu Leu Thr Ala 325 330 335 Tyr Gly Ala Ala Ile Leu Ala Gly Ala Ser Ser Thr Asn Leu Cys Gln 340 345 350 Met Ile Ile Thr Val Phe Gly His Gly Leu Leu Ala Phe Ala Leu Trp 355 360 365 Gln Arg Ala Gln His Cys Asp Val Glu Asn Lys Ala Trp Ile Thr Ser 370 375 380 Phe Tyr Met Phe Ile Trp Lys Leu Phe Tyr Ala Glu Tyr Phe Leu Ile 385 390 395 400 Pro Phe Val Gln <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T3FOR forward primer <400> 3 aaaaagcagg ctagacgatg caagcctcat cgg 33 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T3REV reverse primer <400> 4 agaaagctgg gtctcactgc acaaatggta taag 34 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 5 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggct 29 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 6 ggggaccact ttgtacaaga aagctggg 28

Claims (6)

1. HGGT(homogentisic acid geranylgeranyl transferase) 유전자가 형질전환된 흑남벼의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 전립선암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 흑남벼는 HGGT 유전자가 형질전환되어 토코트리에놀을 생합성할 수 있는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 HGGT 유전자는 프로모터에 작동가능하게 연결되어 재조합 벡터의 형태로 형질전환된 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
   
4. 제3항에 있어서, 상기 프로모터는 글로불린(globulin) 프로모터 또는 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV) 35S 프로모터인 것인, 약학 조성물.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 HGGT 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 것인, 약학 조성물.
   
6. HGGT 유전자가 형질전환된 흑남벼의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 전립선암 예방 또는 개선용 식품 조성물.
   

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