KR20200057244A - 카로티노이드 함량이 증진된 기능성 식물체 및 이의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 식물 내 카로티노이드 함유량을 증진시키기 위하여, 카로티노이드 절단 효소(Carotenoid-cleavage dioxygenase, CCD) 유전자의 발현을 억제시킨 형질전환 식물체 및 이의 제조 방법에 대한 것으로서, 식물체 내의 대사 과정에 관여하는 유전자의 작용을 조절함으로 인하여, 대사산물의 함량을 조절할 수 있는 기술에 대한 것이다.

Description

카로티노이드 함량이 증진된 기능성 식물체 및 이의 제조 방법 {Transgenic plants with enhanced carotenoid content and methods for their production}

본 발명은 식물 내 기능성 물질인 카로티노이드의 함량을 증진시키기 위하여, 카로티노이드 절단 효소(Carotenoid-cleavage dioxygenase, CCD) 유전자의 발현을 억제시킨 형질전환 식물체 및 이의 제조 방법에 대한 것이다.

카로티노이드는 C40의 테르페노이드 대사산물로서, 식물에서 광합성 색소, 크산토필 사이클에서의 광 보호체, 아포카로티노이드 호르몬인 앱시스 산 및 스트리고락톤의 전구체로서 중요한 역할을 한다(Walter and Strack,2011; Nisar et al., 2015). 또한, 카로티노이드는 비타민 A 전구체와 항산화 물질로서(Mayer et al., 2008; Nisar et al., 2015; Giuliano, 2017) 신체 발달 및 면역 건강 증진에 도움을 주기 때문에(Mayer et al., 2008; Sommer and Vyas, 2012), 카로티노이드의 생물학적인 축적은, 식품 및 사료의 목적으로 사용되는 작물의 개선에 대한 지속적인 관심사였다(Giuliano (2017).

따라서, 생명공학에 의한 카로티노이드의 생합성, 분해, 격리 및 안정성을 대사공학적으로 조절 하기 위하여 다양한 개별 기술 및 복합 기술이 사용되었다(Zhai et al., 2016; Giuliano, 2017). 종래에는 영양적으로 가치 있는 베타카로틴과 지아산틴 등 특정 카로티노이드의 대사가 활발한 일부 작물에서 그 축적량을 증가시키기 위하여 베타카로틴 가수분해효소(BCH) 및 지아산틴 에폭시다아제(ZEP) 등의 해당 카로티노이드 대사기작의 바로 다운스트림 유전자를 사일런싱시키는 방법을 통해 달성할 수 있었다(Romer et al.,2002;Diretto et al., 2006; Pons et al., 2014). 카로티노이드가 결핍된 밀 종자의 배유에 카로티노이드를 생산하기 위해서는 박테리아의 파이토엔 합성효소(CrtB) 유전자를 과발현시키고 동시에 밀 내재 BCH 유전자인 TaHyd를 사일런싱시켜 카로티노이드를 증가시키도록 제작되었다(Zeng et al., 2015).

식물에는 카로티노이드를 분해하여 아포카로티노이드를 생성할 수 있는 9-cis-아포카로티노이드 디옥시게나아제(NCEDs)와 카로티노이드 분해효소(Carotenoid cleavage dioxigenases, CCDs)가 존재한다(Giuliano et al., 2003; Auldridge et al., 2006; Walter and Strack, 2011; Frusciante et al., 2014; Hou et al., 2016). 다양한 식물 유래에 CCD1, CCD2, CCD4, CCD7 및 CCD8과 같이 CCD 그룹에 속하는 동종 유전자가 존재한다. 이 중 CCD1 또는 CCD4의 발현과 카로티노이드 축적 사이의 음의 상관 관계는 국화 꽃잎, 감자 괴경, 난초 꽃, 복숭아 과일 및 아라비돕시스 종자를 포함하여 다양한 식물 종 및 기관에서 CCD가 카로티노이드 함량을 조절하는 역할을 한다는 것을 시사한다(Ohmiya et al., 2006; Campbell et al., 2010; Chiou et al., 2010; Brandi et al., 2011, Gonzalez-Jorge et al., 2013). 주요 식량작물 중 하나인 옥수수에서, 카로티노이드 축적이 결핍되어 배유색깔이 흰색인 옥수수 품종의 종자배유에서 ZmCCD1 유전자 발현이 카로티노이드가 축적되어 노랑색 배유색을 보이는 품종의 종자배유보다 훨씬 강하게 발현되고 있어, 이 또한 CCD의 카로티노이드 함량 조절 역할이 확인 되었다(Vallabhaneni et al., 2010). 이러한 이유로, 카로티노이드 분해효소(Carotenoid cleavage dioxigenases, CCDs)를 코딩하는 유전자를 사일런싱 한다면 카로티노이드가 아포카로티노이드로 분해되는 단계가 차단되어 카로티노이드 축적이 증진될 것이라고 추정되었다. 이와 관련하여, 벼 CCD 유전자 OsCCD4a와 OsCCD4b를 각각 CRISPR-CAS9으로 편집하여 knock-out 시켰을 때 카로티노이드 함량 조절에 관한 기능이 분석되었지만 카로티노이드 축적에 아무런 영향을 미치지 않는다고 보고되고 있다(Yang et al., 2017). 그러나, 이 보고는 카로티노이드의 증진효과를 제대로 검증하기에는 적절하지 않은 일반 벼 종자에서 OsCCD4a와 OsCCD4b의 발현제어를 시도한 결과로서 베타카로틴 등 카로티노이드가 생성되는 벼 종자에서 재 연구될 필요성을 논문에서 제시하였다. 한편, 주요 식량작물자원 중 하나인 벼는 다른 식량작물에 비해 식량원으로 사용되는 종자 배유에 카로티노이드가 전혀 축적되지 않는 특징이 있어 쌀을 주 식량원으로 하는 저소득 국가의 비타민 A 결핍이 심각한 상태이기 때문에 쌀 종자 배유에 비타민 A 의 주요 전구물질인 베타카로틴이 축적되는 ‘황금쌀’이 개발되었고(Paine et al., 2005; Ye et al., 2000), 이러한 ‘황금쌀’의 베타카로틴 함량을 증진하기 위하여 OsCCD1을 센스 또는 안티센스 방향으로 발현 시킴으로서 종자배유에서의 OsCCD1 의 카로티노이드 함량 축적을 조절하려고 했지만 OsCCD1의 센스 또는 안티센스 발현 모두 황금쌀 종자의 카로티노이드 축적에 대한 효과를 보지는 못했으며, 좀 더 정확하게는 센스 발현 연구를 중점적으로 수행하여 OsCCD1이 카로티노이드가 아닌 아포카로티노이드를 기질로 사용하여 절단 반응을 수행한다는 사실을 확인하였고, 안티센스 발현 연구는 OsCCD1의 발현억제를 확인할 수 있는 확실한 근거를 제시하지 않아 결과가 미흡하였다(Ilg et al., 2010).

이를 종합해보면, 카로티노이드를 분해하는 CCD 그룹 유전자들의 카로티노이드 함량 조절 기능에 대한 가능성은 여전히 높기 때문에 CCD 유전자 활용 카로티노이드 함량 조절 방법 개발에 대한 연구와 CCD 그룹 유전자들의 식물 조직별 특화된 기능에 대한 연구는 카로티노이드 함량 증진을 위한 대사공학 방법 개발에 매우 활용도가 높을 것으로 사료된다.

이러한 이유로, 본 발명에서는 CCD 유전자의 발현을 제어하여 조직별 카로티노이드 함량 조절에 관한 방법을 제시하고 CCD 기능이 제어된 플랫폼 식물체를 제공하고자 하며, 이를 활용하여 기능성 물질인 카로티노이드 함량이 증진된 식물체와 그 활용 방법을 제공하고자 한다.

본 발명자들은 식물체 내에서 카로티노이드 대사 과정에 관여하는 유전자의 기능을 연구하여 카로티노이드의 식물 내 축적량을 증가시킬 수 있는 유전자로서, 카로티노이드 절단효소(CCD) 유전자를 발견하고, 상기 유전자의 기능 및 발현을 조절하여 식물체에 도입하는 방법으로, 카로티노이드의 함유량이 증진된 식물체 및 이의 제조 방법에 대한 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명의 목적은 카로티노이드 절단효소 유전자의 활성을 억제하는 핵산 분자를 포함하는 식물체의 카로티노이드 함량 증진용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 카로티노이드 절단효소 유전자 활성이 억제된, 형질전환 식물체 및 이의 제조 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 카로티노이드 절단효소 유전자의 활성을 억제하는 핵산 분자를 포함하는, 식물체의 카로티노이드 함량 증진을 위한 조성물을 제공한다.

본 발명의 상기 카로티노이드 절단효소 유전자는, 카로티노이드 절단 효소를 코딩하는 서열을 포함하는 유전자를 의미하는 것이다. 이에 제한되는 것은 아니나, 본 발명의 일 실시예에서는 OsCCD1, OsCCD4a 및 OsCCD4b 유전자의 카로티노이드 함량에 대한 영향을 확인하였다. 상기 유전자의 기능을 완전히 밝히기 위해 일반 벼에서 RNAi에 의해 상기 유전자를 억제시켜 잎조직에서의 카로티노이드 함량 증진 기능을 확인하고, 기존에 개발되어 있는 베타카로틴 생성 쌀인 stPAC 벼 식물체(Jeong et al. 2017)와 교배를 통해 종자에서 카로티노이드 함량 증진 기능도 확인하였다. 뿐만 아니라, OsCCD1, OsCCD4a 및 OsCCD4b의 카로티노이드 분해 활성을 4종의 카로티노이드 기질(파이토엔, 라이코펜, 베타카로틴, 지아산틴)을 공급하는 대장균 균주에서 in vitro 확인 함으로써, 공통적으로 OsCCD4a, OsCCD1 및 OsCCD4a의 억제에 의하여 카로티노이드 분해가 차단되므로, 카로티노이드가 축적되어 있는 벼 잎과 종자에서 카로티노이드의 함량이 증가된 결과를 확인할 수 있었다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 카로티노이드 절단효소인 OsCCD1, OsCCD4a 및 OsCCD4b는 서열번호 1, 2, 3의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 카로티노이드 절단효소를 코딩하는 유전자인 OsCCD1, OsCCD4a 및 OsCCD4b는 각각 서열번호 4, 5, 6의 핵산 서열로 이루어진 것이다. 다만, 본 발명에 있어서, 상기 핵산 서열은 서열번호 1, 2, 3의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열인 것으로 족하며, 서열목록 1, 2, 3 내지 서열목록 4, 5, 6의 서열에 한정되는 것은 아니다. 즉, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈, 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 핵산 분자를 포함한다.

본 명세서에서 용어 "핵산(nucleic acids)"은 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다.

본 발명의 카로티노이드 절단 효소의 발현을 억제하는 핵산 분자는 T-DNA, siRNA, shRNA, miRNA, 리보자임(ribozyme), PNA(peptide nucleic acids) 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 일 수 있고, 이들을 포함하는 RNAi 벡터일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 RNAi 벡터는 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 벡터도 포함될 수 있으며, 예를 들어 본 발명에서는 pANDA-β RNAi 벡터(Miki and Shimamoto, 2004)가 사용되었다.

본 명세서에서 상기 용어 "siRNA"는 특정 mRNA의 절단(cleavage)을 통하여 RNAi(RNA interference) 현상을 유도할 수 있는 짧은 이중사슬 RNA를 의미한다. 타겟 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥으로 구성된다. siRNA는 타겟 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운 방법으로서 또는, 유전자치료(gene therapy)의 방법으로 제공된다.

siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음)등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 전체 길이는 10 내지 100 염기, 바람직하게는 15 내지 80 염기, 가장 바람직하게는 20 내지 70 염기이다. siRNA 말단 구조는 타겟 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3 말단 돌출한 구조와 5 말단 쪽이 돌출한 구조 모두 가능하다. 돌출하는 염기 수는 한정되지 않는다. 예를 들어, 염기 수로는 1 내지 8 염기 , 바람직하게는 2 내지 6 염기로 할 수 있다. 또한, siRNA는 타겟 유전자의 발현억제 효과를 유지할 수 있는 범위에서 예를 들어, 한 쪽 말단의 돌출 부분에 저분자 RNA(예를 들어, tRNA, rRNA, 바이러스 RNA와 같은 천연의 RNA 분자 또는 인공의 RNA분자)를 포함할 수 있다. siRNA 말단구조는 양측 모두 절단 구조를 가질 필요는 없고, 이중사슬 RNA의 일방의 말단 부위가 링커 RNA에 의하여 접속된 스템 루프형 구조일 수도 있다. 링커의 길이는 스템 부분의 쌍을 이루는 데 지장이 없는 길이면 특별히 한정되지 않는다.

본 명세서에서 상기 용어 "shRNA(short hairpin RNA)"는 단일 가닥으로 50-70개로 구성된 뉴클레오타이드를 의미하며, in vivo상에서 스템-루프(stem-loop) 구조를 이루고 있다. 5-10개의 뉴클레오타이드의 루프 부위 양쪽으로 상보적으로 19-29개의 뉴클레오타이드의 긴 RNA가 염기쌍을 이루어 이중가닥의 스템을 형성한다.

본 명세서에서 상기 용어 "miRNA(microRNA)"는 유전자 발현을 조절하며, 전장 20-50개 뉴클레오타이드, 바람직하게는 20-45개 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 20-40개 뉴클레오타이드, 보다 더 바람직하게는 20-30개 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 21-23개의 뉴클레오타이드로 구성된 단일 가닥 RNA분자를 의미한다. miRNA 는 세포내에서 발현되지 않는 올리고뉴클레오타이드이며, 짧은 스템-루프 구조를 가진다. miRNA는 1 또는 2 이상의 mRNA(messenger RNA)와 전체 또는 부분적으로 상동성을 가지며, 상기 mRNA와 상보적인 결합을 통하여 타겟 유전자 발현을 억제시킨다.

본 명세서에서 용어 "리보자임(ribozyme)"은 RNA의 일종으로 특정한 RNA의 염기 서열을 인식하여 자체적으로 이를 절단하는 효소와 같은 기능을 가진 RNA 분자를 의미한다. 리보자임은 타겟 전령 RNA 가닥의 상보적인 염기서열로 특이성을 가지고 결합하는 영역과 타겟 RNA를 절단하는 영역으로 되어 있다.

본 명세서에서 용어 "PNA(Peptide nucleic acid)"는 핵산과 단백질의 성질을 모두 가지고 있는 분자로서, DNA 또는 RNA와 상보적으로 결합이 가능한 분자를 의미한다. PNA는 핵산염기(nucleobase)가 펩티드 결합으로 연결된 유사 DNA로 1999년에 처음 보고되었다(문헌 [Nielsen PE, Egholm M, Berg RH, Buchardt O, "Sequenceselective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide", Science 1991, Vol. 254: pp1497-1500]). PNA는 자연계에서는 발견되지 않고 인공적으로 화학적인 방법으로 합성된다.

PNA는 상보적인 염기 서열의 천연 핵산과 혼성화(hybridization) 반응을 일으켜서 이중가닥을 형성한다. 길이가 같은 경우 PNA/DNA 이중가닥은 DNA/DNA 이중가닥보다, PNA/RNA 이중가닥은 DNA/RNA 이중가닥보다 안정하다. 펩티드 기본 골격으로는 N-(2-아미노에틸)글리신이 아미드 결합에 의해 반복적으로 연결된 것이 가장 흔히 쓰이며, 이 경우 펩티드 핵산의 기본골격(backbone)은 음전하를 띠는 천연 핵산의 기본골격과 달리 전기적으로 중성이다. PNA에 존재하는 4개의 핵산염기는 공간적 크기와 핵산염기 사이의 거리가 천연 핵산의 경우와 거의 같다. PNA는 화학적으로 천연 핵산보다 안정할 뿐 아니라 핵산분해효소(nuclease)나 단백질분해효소(protease)에 의해 분해되지 않아 생물학적으로도 안정하다.

본 명세서에서 용어 "안티센스 올리고뉴클레오타이드"란 특정 mRNA의 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 특징이 오타이드 본 발명의 안티센스 뉴클레오타이드 서열은 타겟 유전자의 mRNA에 상보적이고 타겟 유전자의 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하고 타겟 유전자의 mRNA의 번역, 세포질내로의 전위(trans의 cation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 길이는 6 내지 100 염기이고, 바람직하게는 10 내지 40 염기이다.

상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될 수 있다(De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5(3):343-55, 1995). 올리고뉴클레오타이드 골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬, 시클로알킬, 단쇄 헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당간 결합 등으로 변형될 수 있다. 또한, 안티센스 핵산은 하나 이상의 치환된 당모이어티(sugar moiety)를 포함할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 변형된 염기를 포함할 수 있다. 변형된 염기에는 하이포크잔틴, 6-메틸아데닌, 5-메틸 피리미딘(특히 5-메틸시토신), 5-하이드록시메틸시토신(HMC), 글리코실 HMC, 젠토비오실 HMC, 2-아미노아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6 (6-아미노헥실)아데닌, 2,6-디아미노퓨린 등이 있다.

본 명세서에서 용어 "T-DNA"는 Agrobacterium 종의 Ti(tumor-inducing) 플라스미드내의 전달(transfer) DNA로서 숙주 식물세포의 핵으로 전달되는 DNA 절편을 말한다. T-DNA의 양 끝 가장자리에는 25 bp의 반복서열이 존재하며, 전달은 왼쪽 경계(border)에서 전달이 시작되어 오른쪽 경계에서 종료된다. 박테리아 T-DNA는 약 20,000 bp 길이로서 이들의 삽입에 의하여 타겟 유전자를 붕괴시킴으로서 삽입 돌연변이(insertional mutagenesis)를 일으키는 데에 사용되며, 삽입된 T-DNA 서열은 돌연변이를 일으킬 뿐 아니라 타겟 유전자를 표지하기도 한다.

본 발명에서 카로티노이드 함량 증진 효과는, 대상 식물체의 대사과정에 관여하는 카로티노이드 절단효소의 작용을 억제함으로써, 식물체 내의 카로티노이드 함량을 증진시키는 것을 특징으로 한다. 카로티노이드의 생합성을 증진시키는 방법에 대해서는 카로티노이드 생합성에 관여하는 기질 함량을 높이는 방안에 대한 기존의 연구가 있으나, 실제 식물체 내에서 카로티노이드 절단 효소의 작용에 의한 축적 효율을 조절하는 것은 본 발명에서 제시한 유전자의 발현 억제를 통하여 가능하게 된 것이다.

본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 카로티노이드 절단효소(CCD)를 코딩하는 유전자인 OsCCD에 속하는 OsCCD1, OsCCD4a 또는 OsCCD4b의 발현을 억제하였을 때, α-카로틴, β-카로틴, 루테인 및 지아산틴등을 포함하는 전체 카로틴 함량이 증가되었음을 확인하였다. 특히 OsCCD4a와 OsCCD4b 발현 제한에 의해 잎에서 카로티노이드 축적효율 증진에 효과가 있으며, 상기 OsCCD1, OsCCD4a 또는 OsCCD4b 발현 형질전환체 각각을 종자배유 특이 베타카로틴 생성 벼(stPAC)와 교배하여 이를 분석한 결과, 종자에서 OsCCD1과 OsCCD4a 발현 제한에 의해 각각 알파카로티노이드와 베타카로티노이드 함량 증진에 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

아울러 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 조성물에 의하여 형질전환된 형질전환 식물체를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 식물체는 카로티노이드 함량이 증진된 식물로서, 상기 본 발명의 조성물로 형질 전환된 것이다. 본 발명에서 상기 “식물체”는 성숙된 식물 뿐만 아니라, 성숙한 식물로 생장할 수 있는 식물 세포, 식물 조직 및 식물 종자 등을 모두 포함하는 개념으로 해석된다.

본 발명의 상기 식물체는 특별히 제한되지 않으며, 벼, 보리, 밀, 옥수수, 콩, 감자, 맡, 귀리, 수수 등의 식량 작물; 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채를 포함하는 특용 작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드 클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료 작물류로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 카로티노이드를 함유한 식물체라면 제한 없이 사용될 수 있다. 특히 본 발명의 일 실시예에서는 일반벼와 카로티노이드 함량이 증진된 벼인 “황금쌀”에서 본 발명의 형질전환 식물을 사용하여 카로티노이드의 함량 증진 효과를 확인하였다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은, 다음의 단계를 포함하는 카로티노이드 함량이 증진된 식물체 제조 방법을 제공한다.

(a) 본 발명에서 개시하는 상기 조성물을 식물 세포에 도입시키는 단계;

(b) 상기 식물 세포로부터 카로티노이드 함량이 증진된 식물체를 수득하는 단계.

상기 제조 방법에 있어서, 카로티노이드 함량을 증진시키기 위하여, 카로티노이드 절단 효소를 억제하는 조성물을 식물 세포에 도입하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법으로 실시될 수 있다.

본 발명은 식물 내 카로티노이드 함량을 증진시키기 위하여, 카로티노이드 절단 효소(Carotenoid-cleavage dioxygenase, CCD) 유전자의 발현 억제 형질전환 식물체 및 이의 제조 방법으로서, 식물의 대사 과정에 관여하는 카로티노이드 절단 효소 유전자의 발현 조절을 통하여, 대사 과정에서 카로티노이드가 분해되는 것을 방지하므로, 카로티노이드 함량이 증진된 식물체를 효과적으로 제작할 수 있다. 또한, 카로티노이드 절단 효소 각각의 잎과 종자에 특화된 기능을 밝힘으로서 각 CCD 유전자의 조직 특이적 활용도에 대한 대사공학 전략을 제시할 수 있다.

도 1은 벼 CCD 유전자 3종(OsCCD1, OsCCD4a, OsCCD4b)을 포함하는 식물 유래 CCD1 및 CCD4 유전자군의 계통도(a) 및 아미노산 서열 비교(b) 결과를 나타낸 것이며, 상기 각 유전자의 조직별(c), 종자 발달과정(d)별 발현도를 각각 비교한 결과이다.
도 2는 벼 CCD 유전자 3종(OsCCD1, OsCCD4a, OsCCD4b)의 구조(a) 및 형질 전환을 위한 RNA interference 벡터 구축 모식도(b)를 나타낸 것이다.
도 3은 OsCCD1, OsCCD4a 및 OsCCD4b-RNA interference를 이용한 벼 형질전환 식물체 내에서 OsCCD1, OsCCD4a, OsCCD4b 발현억제 양상의 qRT-PCR(a) 및 small-interfering RNA의 검출을 위한 노던 블럿 결과(b)를 보여주는 것이다.
도 4는 OsCCD1, OsCCD4a, OsCCD4b-RNA interference 벼 형질전환 T₁세대(a)와 T₂세대(b) 식물체의 잎 카로티노이드 HPLC 분석 결과이다.
도 5는 OsCCD1, OsCCD4a, OsCCD4b-RNA interference 각각의 벼 형질전환 식물체 6종(2개 라인/1 유전자당)과 벼 종자 특이적으로 베타카로틴을 생성하는 형질전환체(stPAC)와의 교배 식물체 구축하여, Taqman-PCR을 통한 교배 전 부모계통(a)과 교배 후 자식계통(b)의 도입 유전자 카피를 확인한 것이다. 또한 (c)는 genomic PCR을 통한 교배 후 자식계통에서 해당 도입유전자 삽입 여부 및 각 CCD 유전자의 무효접합자(nullizyge)를 확인한 결과이다.
도 6은 OsCCD1, OsCCD4a, OsCCD4b-RNA interference 벼 형질전환 식물체와 벼 종자 특이적으로 베타카로틴을 생성하는 형질전환체(stPAC)와의 교배 식물체 종자의 카로티노이드 HPLC 분석 결과(a 및 b) 및 베타카로틴 생성에 의한 종자색 표현형을 비교한 사진(c)이다.
도 7은 OsCCD1, OsCCD4a, OsCCD4b의 카로티노이드 절단효소 기능 분석을 위하여 대장균 내에서 과발현시킨 벡터 모식도(a) 및 각 4종의 카로티노이드 물질(파이토엔, 라이코펜, 베타카로틴, 지아산틴)을 기질로 공급하기 위해 대장균 내에서 발현되는 플라스미드 벡터 모식도(b)이다.
도8은 OsCCD1, OsCCD4a, OsCCD4b의 대장균 내 과발현을 통한 카로티노이드 4종(파이토엔, 라이코펜, 베타카로틴, 지아산틴) 각각의 절단 기능을 확인한 결과이다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실험재료 및 방법>

1. 식물재료 준비

한국 전주 농촌진흥청 작물과학원으로부터 입수한 자포니카-형 한국 벼 종자(Oryza sativa L. cv. Ilmi)를 내재 유전자 발현 분석 및 유전자 증폭을 위해 사용하였으며, 대상 유전자 부위를 증폭시켜 벼 형질전환용 운반체 제작에 사용하였다. 70% 에탄올 및 2% 차아염소산나트륨으로 종자를 멸균시킨 후, 식물 배양기에서 Murashige-Skoog 한천 배지를 이용하여 1 주일간 발아시켜 토양에 이식한 다음, 자연 채광이 있는 온실에서 16/8 hr 명암주기, 28℃에서 배양하였다. T₀ 세대의 벼 형질전환 식물체는 식물 배양기에서 유기시킨 후 성숙 시까지 온실에서 재배되었고, T₁ 이후 세대와 교배 후대 세대는 하절기동안 논 포장에서 재배되었다. 벼 종자는 개화 후(60일)에 수확하고, TR-200 전동 탈곡기(Kett, Tokyo, Japan)을 사용하여 껍질을 벗긴 후 Pearlest Polisher (Kett)로 도정하여 배유(endosperm)색을 육안으로 확인하였다.

2. 식물 CCD 유전자의 내재적 발현 및 염기 서열 분석

서로 다른 발달 단계에 있는 다양한 벼의 조직 시료로부터 RNeasy Mini Kit(Qiagen)를 사용하여 제조 회사의 지시에 따라 각각의 RNA를 추출하였다. 총 RNA 1 μg를 사용하여 cDNA를 합성하고, 최종 부피 20 ㎕의 qRT-PCR반응에 사용되었으며 여기에는 cDNA 0.25 μl, Thunderbird^TM SYBR qPCR Mix (Toyobo, Osaka, Japan)가 포함되었다. 95℃에서 1분간 1회, 95 ℃에서 15초간 40회, 60 ℃에서 1분간 1회 수행하는 조건으로 CFX Connect^TM Real-Time System (Bio-Rad Laboratories)을 사용하여 200 nM의 각 유전자 특이적 프라이머 쌍(JXB online의 보충 표 S1 참조)을 사용하여 PCR을 진행하였다. PCR 증폭의 특이성을 용융 곡선 분석(60 ℃~95℃)으로 확인하였고, 임계주기(Ct; 형광 증가가 임계 값 설정을 초과하는 주기)는 자동으로 결정되었다. OsUbi5 유전자(Os01g22490)를 기준으로 CFX manager™v.2.1 (Bio-Rad Laboratories)을 이용하여 발현 정도를 분석 하였다. 식물 CCD 유전자의 서열과 구조는 National Center of Biotechnology Information(NCBI; https : //ncbi.nlm.nih.gov/)과 Knowledge-based Oryza Molecular Biological Encyclopedia(KOME)의 데이터베이스로부터 검색되었다. 단백질 서열 분석은 DNASTAR 프로그램(https://dnastar.com/)에서 MegAlign의 ClustalW 알고리즘을 사용하여 수행하였고, 엽록체 적중을 위한 수송 펩티드 서열은 ChloroP 알고리즘 버전 1.1(http://www.cbs. dtu.dk/services/ChloroP/)을 사용하여 수행하였다.

3. 벼 형질전환을 위한 벡터 제작 및 교배

Gateway cloning을 위한 첫 번째 PCR에서 유전자 특이적 프라이머 쌍을 이용하여 벼 잎 cDNA로부터 OsCCD1(Os12g44310), OsCCD4a(Os02g47510) 및 OsCCD4b(Os01g22490) 유전자 단편을 증폭시켰다. 공통 attB 프라이머 쌍을 사용하여 두 번째 PCR을 수행 한 후 Gateway cloning(Invitrogen)으로 재조합을 통해 유전자 발현을 억제하기 위한 RNAi를 매개하기 위해 pANDA-β 벡터(Miki and Shimamoto, 2004)에 3 종의 유전자를 최종 도입하였다. 사용된 프라이머 쌍은 표 1에 열거하였다.

3 가지의 유전자를 이용한 최종 RNAi 벡터를 대장균 DH5α을 거쳐 아그로박테리움 LBA4404에 형질 전환한 후, 성숙한 벼 종자(O. sativa cv. Iimi)로부터 유도된 배아 발생 캘러스와 공동 배양 하였다. 포스피노트리신(phosphinothricin, 4 mg l^{- 1})과 세포탁심(cefotaxime, 500 mg l^{- 1})을 함유한 선별 배지에서 생성된 녹색 캘러스를 발아 및 발근 과정을 통해 형질변환 식물체로 재생시켰다.

OsCCD1-RNAi, OsCCD4a-RNAi 및 OsCCD4b-RNAi 계통을 벼 종자의 배유에서 카로티노이드 생성에 의해 황금색을 나타내는 stPAC 벼 식물체(Jeong et al., 2017)와 교배하기 위하여, 상기 3가지 RNAi 형질전환 식물체인 모계와, T-DNA가 단일카피로 도입된 동형접합이 확인된 stPAC25 고정계통 식물체인 부계 사이에서 수행되었다. 그 결과 생성된 F₁ 교배 종자는 양친의 형질 전환 특징에 대해 동형접합성을 얻기 위해 논 포장에서 2 세대 이상 자가 수분했다.

4. 형질전환된 벼 식물체의 분자생물학적 분석

형질전환된 벼 식물체의 게놈 DNA는 T₀ 및 F₃ 세대의 잎 조직에서 변형된 CTAB 추출 방법을 사용하여 추출되었다. 유전자의 도입을 확인하기 위해, 해당 도입 유전자 특이적 프라이머 쌍과 Gateway 바이너리 벡터의 공통 attB 프라이머 쌍(표 1)을 사용하여 게놈 DNA PCR을 수행 하였다. 서던 블롯 분석을 위해 T₀ 세대의 잎 조직에서 얻은 각 게놈 DNA 20μg을 EcoRI 분해에 사용하고 1% 아가로즈겔에서 분리하여 Hybond N+나일론 멤브레인 블롯(Amersham Pharmacia)을 만들었다.

멤브레인은 PCR DIG 프로브 합성키트(Roche)를 사용하여 특정 프라이머쌍 (5'-GAAGGGACTGGCTGCTATTG-3 '및 5'-AATATCACGGTAGCCAACG-3')으로 증폭 된 NptII 유전자 프로브와 하이브리드화 되었다. 하이브리드화 및 검출은 DIG High Prime DNA Labeling 및 Detection Starter Kit II(Roche)를 사용하여 수행하였다. 시그널 밴드는 Lumi-Film Chemiluminescent Detection 필름(Roche)에 12 시간 동안 노출시킨 후 이미지 분석기 (FLA 3000, Fujifilm)에서 촬영하였다.

T₃과 F₃ 세대 벼 식물체에서 도입 유전자 동형 접합성을 확인하기 위하여, 도입유전자의 일부인 Bar 영역를 검출하기 위한 TaqMan PCR을 실시하였다. α-튜블린 유전자가 벼의 internal reference로 사용되었다. Bar 분석은 6-carboxyfluorescein(6-FAM) 형광 리포터로 표지된 프라이머 쌍 (5'-GCACGCAACGCCTACGA-3 '및 5'-CACCAGCGGACGGGA-3') 및 맞춤형 프로브 (5'-CCGTGTACGTCTCCC-3')를 포함하여 수행되었다. α-tubulin 분석에는 상업적으로 이용 가능한 형광 리포터 염료인 VIC로 표지된 프로브가 포함되어 있다(Assay ID : Os3643486_s1, Applied Biosystems). PCR 반응은 CFX Connect^TM Real-Time System (Bio-Rad Laboratories)에서 TaqMan Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems)를 사용하여 95 ℃에서 10 분간 1 회, 94 ℃에서 30 초간 40 회 , 58 ℃에서 40 초간, 68 ℃에서 1 분간 수행되었다.(Song et al. 2016). 도입유전자 1 copy를 갖는 동형접합체인 stPAC 25 벼(Jeong et al., 2017)의 T₃ 잎 게놈 DNA를 1의 값 reference로 하여, CFX Manager Software (Bio-Rad Laboratories)를 사용하여 Bar trans gene의 동형 접합성이 계산되었다.

형질전환 벼 식물체의 qRT-PCR은 상기 실험 2와 동일한 PCR 조건 및 프라이머 쌍을 사용하여 발아 후 78일째 된 T₁ 식물의 잎 조직으로부터 추출한 전체 RNA로 수행 하였다. siRNAs의 검출을 위해, 발아 후 1개월 된 T₂ 식물의 잎 조직을 Martin et al.의 방법에 따라 총 RNA 및 small RNA의 연속 추출에 사용 하였다(2005). 7M Urea 및 1 x Tris -Borate-EDTA(TBE) 완충액을 함유하는 15%(w/v) 변성 폴리아크릴아미드 겔(폭 86 mm, 길이 68 mm, 두께 1.5 mm)상에서 RNA 샘플 8 μg(pH 8.0)으로 40V에서 1 시간 동안 프리 런(pre-run)하고 1시간 동안 150 V에서 PAGE를 시행하였다. RNA는 Semi-Dry Transfer Unit (Bio-Rad Laboratories)를 사용하여 Hybond-N⁺ 나일론 멤브레인(GE Healthcare)으로 옮겨졌고, UV 가교 결합하고 Rapid-hyb^TM 완충액(GE Healthcare)에서 하이브리드화 되었다. OsCCD1, 4a 및 4b에 대한 유전자 특이적 프로브는 Random Prime Labeling System Rediprime II^TM(GE Healthcare)을 사용하여 ³²P-dCTP로 표지된 PCR 단편으로 준비되었다. 멤브레인을 Phosphor Imaging Screen(GE Healthcare)에 3일 동안 노출시킨 다음 Molecular Imager FX System (Bio-Rad)을 사용하여 시각화하였다.

5. 형질전환 벼의 카로티노이드 및 엽록소 분석방법

카로티노이드는 qRT-PCR 및 siRNA 검출에 사용된 T₁ 및 T₂ 잎 조직과 TaqMan PCRs 및 게놈 PCR을 위해 F₃ 식물에서 수확한 성숙된 F₄ 종자(40 DAF) 등과 동일한 시료를 사용하여 추출한 것을 각각 잎과 종자의 카로티노이드 사전 분석을 위하여 사용하였다(Song et al., 2016; Jeong et al., 2017). HPLC 분석을 위하여, β-아포-8'-카로테날(0.05 ml, 25 ㎍ ml-1, Sigma-Aldrich)을 첨가 한 후 50:50 (v/v) 디클로로 메탄/메탄올에 용해시켜 추출물 샘플을 제조하고, internal standard로써 헥산(1.5 ml)으로 분리된 층으로 추출한 후, 액체 질소 하에 건조 시켰다. 카로티노이드는 이전에 설명한 대로 용출 조건에서 포토 다이오드 어레이 검출기가 장착된 Agilent 1100 시리즈 HPLC 시스템을 사용하여 YMC ODS C-30 컬럼 (3 μm, 4.6 x 250 mm, YMC Europe)에서 분리되었다(Song et al., 2016 ). 정량 분석을 위해, 450 nm에서 생성된 HPLC 크로마토그램을 사용하여 β-apo-8'-carotenal과 피크 면적 비율에 기초한 개별 카로티노이드 스탠다드의 4 가지 농도에서 플롯된 검정 곡선(calibration curve)의 피크 면적을 결정하는데 사용되었다. 카로티노이드 스탠다드는 CaroteNature 스위스, Lupsingen)에서 구입하였으며, α-carotene(β,ε-carotene), 13Z-β-carotene, (all-E)-β-carotene, 9Z-β-carotene, lutein(β,ε-carotene-diol), zeaxanthin(β,β-carotene-diol), β-cryptoxanthin(β,β-caroten-ol), antheraxanthin(dihydro-epoxy-β,β-carotene-diol), 및 violaxanthin(diepoxy-tetrahydro-β-carotene-diol)을 포함한다. β-carotene의 함량은 13Z-β-carotene, (all-E)-β-carotene 및 9Z-β-carotene의 함량이 모두 더해진 것이다.

총 엽록소는 siRNA 검출 및 카로티노이드 분석과 동일한 T₂ 잎 조직에서 추출되었으며, Optizen POP 분광 광도계(Mecasys Company, Daejeon, Korea)에서 엽록소 a(666 nm)와 b(653 nm)로 정량화되었다(Song et al., 2016).

통계 분석을 위해 모든 개별 시료의 대사 산물을 3회 정량 분석하였다. 그룹 간의 비 형질 전환 식물에 대한 상대적인 차이는 단측의 Student's t-test를 사용하여 결정되었다.

6. 카로티노이드 생성 E. coli 균주의 형질전환을 위한 벡터 제작, E. coli 형질 전환 및 카로티노이드 분석

OsCCD1(Os12g44310), OsCCD4a(Os02g47510) 및 OsCCD4b(Os01g22490)의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 전장 유전자를 유전자 특이적 프라이머쌍(표 2)을 사용하여 벼 잎 cDNA로부터 증폭시켰다. 일반적인 attB 프라이머 쌍을 사용하여 Gateway cloning procedure(Invitrogen)를 통해 pDEST15 벡터에 도입된 3종의 second PCR 산물을 생성하였다. 생성된 박테리아 발현 벡터 pOsCCD1, pOsCCD4a 및 pOsCCD4b는 도 7에 도시하였다. 상기 벡터를 이용하여 L-아라비노스-유도성 T7 RNA 중합 효소 시스템을 갖는 대장균 BL21-AITM(Invitrogen) 균주를 형질 전환시켰다.

pPHYT, pLYC, pBETA 또는 pZEAX (보충 그림 S5 참조) 각 플라스미드가 들어있는 4 종의 대장균 균주는 카로티노이드 절단 작용의 기질로서 각각 파이토엔, 라이코펜, 베타카로틴 및 지아산틴을 생성하도록 제작된 균주로서 미시간 주립 대학의 DellaPenna 교수 그룹(Cunningham 외., 1996)으로부터 제공받았다. 플라스미드 DNA 정제 키트(Macherey Nagel)를 사용하여 플라스미드 DNA를 추출 후, pPHYT, pLYC, pBETA 및 pZEAX를 각각 pOsCCD1, pOsCCD4a 또는 pOsCCD4b 벡터를 갖는 BL21-AI 대장균 세포로 형질 전환시키고, 이들의 형질 전환을 95℃에서 5 분 및 98℃에서 10 초, 65℃에서 30 초, 72℃에서 2 분간의 PCR 조건 하에 특정 프라이머 쌍(표 2)으로 콜로니 PCR을 수행하였다.

OD_600nm 0.5의 로그 성장 단계에서의 E. coli 균주를 0.2% (w/v) 아라비노스로 처리하여 OsCCD1, 4a 및 4b의 과발현을 유도하였다. 밤새 배양 한 다음, 원심 분리 하고 대장균 세포의 펠렛 색을 육안으로 검사하고, 카로티노이드 함량을 HPLC로 분석 하였다. 요약하면 wet E. coli 세포를 4℃에서 40 초 동안 14,000g에서 펠렛화 하고 내부 표준 물질 인 β-apo-8'-carotenal 0.2ml 과 아세톤 300μl에 현탁시켜 10 ℃에서 볼텍싱한 후, 5 분 동안 초음파 처리 하였다. 빛을 차단하여 55 ℃에서 15 분 동안 배양하고, 10 초 동안 볼텍싱하고, 4 ℃에서 10 분 동안 14000g에서 원심 분리 한 후, 상등액을 새로운 튜브로 옮겨 상기 벼 잎과 종자의 카로티노이드 HPLC와 동일한 방법으로 분석하였다.

<실험 결과>

1. 다양한 조직과 발달 단계에서의 OsCCD1, OsCCD4a 및 OsCCD4b의 발현

OsCCD1, OsCCD4a 및 OsCCD4b의 발현 양상을 분석하기 위해 다양한 발달 단계 (발아, 식물 생장 및 생식)에서 다양한 조직(잎, 뿌리, 잔꽃 및 종자)의 벼 RNA를 사용하여 qRT-PCR로 분석하였다. 그 결과, OsCCD1의 발현은 어디에나 존재하였으며, 다른 조직에 비해 잎에서의 수준이 높았다(그림 1c). 또한 유묘 단계 이후에 잎에서 OsCCD4a의 발현이 높았지만, OsCCD1에 비해서는 상대적으로 발현이 낮았다. OsCCD4b의 발현 수준은 40 DAF의 종자를 제외하고 모든 샘플에서 일반적으로 매우 낮았으며 OsCCD4a와 유사한 발현을 보였으며 OsCCD1보다 약간 높은 발현을 보였다.

OsCCD1, OsCCD4a 및 OsCCD4b의 발현은 10, 15, 20, 30 및 40 DAF에서 종자 발달의 5 단계 동안 조사하였고, 1주일간 건조시킨 종자를 40 DAF에서 추가 단계로 조사하였다. (도면 1d). 흥미롭게도 세 유전자의 발현은 종자가 성숙함에 따라 다른 패턴을 나타냈다. OsCCD1은 초기 단계(10 DAF)에서 가장 높게 발현되었고 점차적으로 감소했다. OsCCD4a의 발현 수준은 중간 단계에서 가장 높았으며(20 DAF), OsCCD4b는 모든 단계에서 거의 동일했다. 건조는 성숙 후 3 가지 유전자의 발현에 영향을 미치지 않았다.

2. 단백질 서열 분석을 통한 OsCCD1, OsCCD4a 및 OsCCD4b의 분자 특성

식물 유래 CCD1 및 CCD4 단백질 서열의 계통 발생학적 분석은 NCBI의 서열 데이터베이스와 DNASTAR의 MegAlign의 ClustalW 알고리즘을 사용하여 수행되었다. OsCCD1과 OsCCD4 단백질을 포함한 CCD1과 CCD4 그룹은 식물체 내에서 각각 1과 4 그룹 내로 positive하게 구분되었다. 한 개의 OsCCD1과 두 개의 OsCCD4 단백질은 쌍자엽 식물의 다른 단백질보다 단자엽 식물인 Zea mays(ZmCCD1) 및 Crocus sativus(CsCCD1과 CsCCD4a, CsCCD4b, CsCCD4c, CsZCD)와 더 밀접한 관계를 보였다.

OsCCD1, CsCCD4a 및 CsCCD4b의 단백질 구조는 2 개의 아라비돕시스(Arabidopsis) 단백질 (AtCCD1 및 4), VP14 (Zea mays NCED) 및 3 개의 NCED 단백질 (OsNCED1, OsNCED2 및 OsNCED3)을 포함하는 CCD 간의 서열 정렬을 통해 비교할 수 있다. OsCCD는 CCD 패밀리로서 매우 보존된 특징을 보여 주었고, NCED와는 다르게 작은 CCD 그룹 및 CCD1과 CCD4 사이의 하위 그룹에 포함되었다. CCD 효소 기능을 위한 3개의 글루탐산 염과 4 개의 히스티딘을 포함한 주요 아미노산 잔기도 위치와 숫자에서 고도로 보존되어 있었다. ChloroP 프로그램을 이용하여 OsCCDs의 transit peptide(TP) 서열을 예측한 결과, OsCCD1은 TP 서열을 갖지 않았고, 두 개의 OsCCD4는 80 및 6 아미노산의 TP 서열을 가졌으며(그림 2a), 이는 각각 세포질과 엽록체로 위치됨을 암시하는 것이다.

3. 벼에서 OsCCD1, OsCCD4a 및 OsCCD4b에 대한 RNAi 매개 억제 라인 생성

벼에서 OsCCD1, OsCCD4a 및 OsCCD4b의 유전자 특이적 억제를 위해, C- 말단 및 3'- 비 번역 영역을 포함하는 cDNA 서열을 사용하여 3 개의 RNAi 매개 벡터를 제작 하였다(도 2b). OsCCD1-RNAi에 대한 10 개의 형질 전환 식물, OsCCD4a RNAi 및 OsCCD4b-RNAi에 대한 9 개의 형질 전환 식물이 생성되었고, 형질전환 유전자에 특이적인 PCR에 의하여 258, 177 및 226bp 앰플리콘을 확인하였다. 벡터 백본 내에서 NPT II probe를 이용한 Southern blot 분석 후, T0 세대에서 OsCCD1, OsCCD4a 및 OsCCD4b에 대한 RNAi 유전자 도입이 독립적인 3 개의 라인을 각각 선발하여 표적 유전자 억제 및 카로티노이드 함량에 대한 추가적인 분석을 수행하였다.

4. OsCCD1, OsCCD4a, OsCCD4b 유전자의 RNAi 매개 억제와 잎의 카로티노이드 함량에 미치는 영향

OsCCD1, OsCCD4a 및 OsCCD4b의 발현이 RNAi 매개 메커니즘에 의해 억제되었는지 여부를 확인하기 위해, OsCCD1-RNAi, OsCCD4a-RNAi 및 OsCCD4b-RNAi에 대한 3 개의 독립적인 T1 라인의 두 형제간의 성숙한 잎을 사용하여 qRT-PCR을 수행 하였다 (도 3a). 모든 형질전환 라인은 비형질전환(NT) 식물에 비해 OsCCD1(5.1-18.1 %), OsCCD4a(8.2-23.2 %) 및 OsCCD4b(18.81-86.81 %)의 전사율을 감소시켰다. OsCCD1-RNAi, OsCCD4a-RNAi 및 OsCCD4b-RNAi에 대한 두 개의 독립적인 T2 식물의 성숙한 잎을 이용하여 RNA 젤 블롯 분석을 수행 하였다(그림 3b). 그 결과, OsCCD1, OsCCD4a 및 OsCCD4b에 해당하는 siRNA가 모든 형질 전환 식물에서 검출되었으므로 RNAi 매개 억제가 RNAi 식물에서 한 세대에서 다음 세대로 잘 유지되고 있음을 알 수 있다.

잎의 카로티노이드에 대하여, OsCCD1, OsCCD4a 및 OsCCD4b 유전자 억제에 의한 영향을 평가하기 위해 카로티노이드와 엽록소의 수준을 RNA 분석에서와 같은 성숙한 잎 조직을 사용하여 HPLC로 분석하였다(그림 4). T1 세대의 총 카로티노이드 양은 OsCCD4a-RNAi-7과 -28 및 OsCCD4b-RNAi-21 계통에서 유의적으로 증가 하였다(도 4a). T2 세대에서 OsCCD4a-RNAi-7과 OsCCD4b-RNAi-21 계통에서도 비슷한 결과가 관찰되었고, 전체 카로티노이드뿐만 아니라 α-카로틴, β-카로틴, 루테인, 안테라잔틴(antheraxanthin) 및 바이올락산틴(violaxanthin)을 포함하는 5종의 카로티노이드를 포함하고 있음을 확인하였다(그림 4b). 다른 4 개의 계통(OsCCD1-RNAi-1 및 -8, OsCCD4a-RNAi-33 및 OsCCD4b-RNAi-31)은 NT 식물에 비해 T₂ 세대에서 카로티노이드 수준이 감소하였다(도 4b). 엽록소 수치는 카로티노이드와 비슷한 양상을 보였다. OsCCD4a 또는 OsCCD4b의 억제는 잎 카로티노이드의 축적에 영향을 줄 수 있으며 그 효과는 형질 전환 계통에 의존적이다.

5. 종자 카로티노이드 함량에 대한 OsCCD1, OsCCD4a 및 OsCCD4b 억제의 영향

종자 카로티노이드에 대해 OsCCD1, 4a 및 4b를 억제하는 효과를 확인하기 위해, 바이시스트로닉 재조합 유전자인 stPAC를 사용하여 정(Jeong) 등 (2017)이 공지한 카로티노이드 강화 황금 쌀 식물체를 전통적인 육종을 위한 부계 식물로 사용하였다(그림 2b). 동형접합자 stPAC 벼와, 각각의 OsCCD1-RNAi, OsCCD4a-RNAi 및 OsCCD4b-RNAi로부터 2개의 독립된 라인을 모계 식물로 교차 수정하였고, TaqMan-PCR로 T₃ 식물 세대의 동형접합성(homozygosity)을 확인하였다. 그 결과, F₁ 종자의 F₃ 세대로의 추가 세대진전 후, stPAC과 OsCCD1-RNAi, OsCCD4a-RNAi 또는 OsCCD4b-RNAi 각각 사이의 2 개의 도입 유전자에 대한 동형 접합성이 TaqMan-PCR을 사용하여 검증되었다.

OsCCD1, OsCCD4a 및 OsCCD4b 유전자가 knock-down 되었을 때, 카로티노이드 함량에 미치는 효과를 더 정확하게 평가하기 위해 OsCCD1, OsCCD4a 및 OsCCD4b 억제를 위한 T-DNA가 없는 stPAC 종자를 각각의 교차교배 라인으로부터 nullizygotes로써 분리했다. 이것은 genomic PCR에 의해 stPAC 및 OsCCD1-RNAi, OsCCD4a-RNAi 또는 OsCCD4b-RNAi의 두 가지 T-DNA 단편을 검출함으로써 확인되었다. OsCCD1-RNAi와 OsCCD4a-RNAi의 두 개의 독립 계통의 자손 세대에 대한 HPLC 분석은 nullizygous seed에 비해 총 카로티노이드가 증가된 양상을 보였다(그림 6a). 이 중 OsCCD1-RNAi-8 및 OsCCD4a-RNAi-33에서 각각 생산된 대표적인 계통은 누적된 라인 각각에 비해 총 카로티노이드에서 1.4 배 및 1.6 배까지 유의미하게 증가되었고, 황금색이 강하게 나타났다(도 6b, c). 이와 대조적으로, OsCCD4b-RNAi의 교차 라인은 총 카로티노이드와 α-카로틴, β-카로틴, 루테인, 제아잔틴 및 β-크립토잔틴을 포함한 각각의 성분의 함량의 증가가 보이지 않았다(그림 6b). OsCCD1-RNAi와 OsCCD4a-RNAi는 각각 α-환형 카로티노이드 (α-카로틴과 루테인의 최대 1.9-1.7 배)와 β-환형 카로티노이드(β-카로틴과, 제아잔틴의 최대 2.0-1.7배)의 함량이 크게 증가됨을 확인하였다(그림 6b). 이것은 OsCCD1 또는 OsCCD4a가 발현이 저하되었을 때 종자 카로티노이드의 수준을 유의하게 증가시킬 수 있음을 보여주는 결과이며, OsCCD4b에서는 이러한 효과가 나타나지 않았다.

6. 카로티노이드 생성 E. coli 균주에서 OsCCD1, OsCCD4a 및 OsCCD4b의 카로티노이드 절단 활성

OsCCD1, OsCCD4a 및 OsCCD4b가 카로티노이드 분해에 관여하는지 여부를 in vitro에서 확인하기 위해 pCsCCD1, pOsCCD4a 및 pOsCCD4b이 과발현되는 3 종의 아라비노스-유도성 대장균 발현 벡터를 제작하였다(도 7a). 그들은 phytoene(pPHYT), lycopen (pLYC), β-caroten (pBETA) 및 zeaxanthi (pZEAX)을 생성하는 4 개의 다른 벡터의 개별 기질 공급능을 가지는 용도로 사용되었다(도 7b). pOsCCD1, pOsCCD4a 및 pOsCCD4b를 포함하는 대장균 균주에 이들 4 종의 카로티노이드 생성 플라스미드가 성공적으로 도입된 것은 각 OsCCD 유전자 및 CrtE, CrtB, CrtI, CrtY 및 CrtZ 등의 카로티노이드 생합성 오페론 유전자의 상응하는 PCR 단편의 검출에 의해 확인되었다(도 7c). 대장균 균주를 아라비노스로 처리하여 카로티노이드 축적 플라스미드에서 OsCCD1, OsCCD4a 및 OsCCD4b의 전사를 유도하여 파이토엔(백색), 라이코펜(핑크색), 베타카로틴(황색), 지아산틴(황색)이 절단하는지를 시험하였다(도 8). 유전자의 발현은 무색의 파이토엔을 제외하고 라이코펜, 베타카로틴 및 지아산틴을 생산하는 대장균 세포에서 더 옅은 색을 나타냈다. 결과는 OsCCD1 발현 대장균 균주의 색에서 다른 유전자들보다 더 뚜렷한 차이를 보였다. 또한 HPLC 분석 결과, 카로티노이드 기질 함량 저하률에 따른 기질 절단 활성은 OsCCD1의 발현에 의해 4 가지 카로티노이드 기질 모두에서 파이토엔(14 %), 라이코펜(14 %), 베타카로틴(30 %), 지아산틴(16 %)으로 가장 높았으며, 이런 절단 양상은 OsCCD4a와 OsCCD4b 순으로 뒤따랐다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> UNIVERSITY-INDUSTRY COOPERATION GROUP OF KYUNG HEE UNIVERSITY <120> Transgenic plants with enhanced carotenoid content and methods for their production <130> PN1810-432 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 540 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 1 Met Gly Gly Gly Asp Gly Asp Glu Val Leu Leu Leu Pro Glu Pro Arg 1 5 10 15 Pro Arg Arg Gly Leu Ala Ser Trp Ala Leu Asp Leu Leu Glu Arg Ala 20 25 30 Ala Val Arg Leu Gly His Asp Ala Ser Lys Pro Leu Tyr Trp Leu Ser 35 40 45 Gly Asn Phe Ala Pro Val His His Glu Thr Pro Pro Ala Pro Ala Leu 50 55 60 Pro Val Arg Gly His Leu Pro Glu Cys Leu Asn Gly Glu Phe Val Arg 65 70 75 80 Val Gly Pro Asn Pro Lys Phe Val Pro Val Ala Gly Tyr His Trp Phe 85 90 95 Asp Gly Asp Gly Met Ile His Ala Met Arg Ile Lys Asp Gly Lys Ala 100 105 110 Thr Tyr Val Ser Arg Tyr Val Lys Thr Ser Arg Leu Lys Gln Glu Glu 115 120 125 Tyr Phe Gly Gly Ala Lys Phe Met Lys Ile Gly Asp Leu Lys Gly Phe 130 135 140 Tyr Gly Leu Phe Met Val Gln Met Gln Gln Leu Arg Lys Lys Leu Lys 145 150 155 160 Val Leu Asp Phe Thr Tyr Gly His Gly Thr Ala Asn Thr Ala Leu Ile 165 170 175 Tyr His His Gly Lys Leu Met Ala Leu Ser Glu Ala Asp Lys Pro Tyr 180 185 190 Val Val Lys Val Leu Glu Asp Gly Asp Leu Gln Thr Leu Gly Leu Leu 195 200 205 Asp Tyr Asp Lys Arg Leu Lys His Ser Phe Thr Ala His Pro Lys Val 210 215 220 Asp Pro Phe Thr Asp Glu Met Phe Ala Phe Gly Tyr Ser His Glu Pro 225 230 235 240 Pro Tyr Cys Thr Tyr Arg Val Ile Thr Lys Asp Gly Ala Met Leu Asp 245 250 255 Pro Val Pro Ile Thr Ile Pro Glu Ser Val Met Met His Asp Phe Ala 260 265 270 Ile Thr Glu Asn Tyr Ser Ile Phe Met Asp Leu Pro Leu Leu Phe Arg 275 280 285 Pro Lys Glu Met Val Lys Asn Gly Glu Phe Ile Tyr Lys Phe Asp Pro 290 295 300 Thr Lys Lys Ala Arg Phe Gly Ile Leu Gln Arg Tyr Glu Lys Asp Asp 305 310 315 320 Thr Asn Ile Arg Trp Phe Glu Leu Pro Asn Cys Phe Ile Phe His Asn 325 330 335 Ala Asn Ala Trp Glu Glu Gly Asp Glu Val Ile Leu Ile Thr Cys Arg 340 345 350 Leu Glu Asn Pro Asp Leu Asp Lys Val Asn Gly Tyr Gln Ser Asp Asn 355 360 365 Leu Glu Asn Phe Gly Asn Glu Leu Tyr Glu Met Arg Phe Asn Met Lys 370 375 380 Thr Gly Ala Ala Ser Gln Lys Gln Leu Ser Val Ser Ala Val Asp Phe 385 390 395 400 Pro Arg Ile Asn Glu Ser Tyr Thr Gly Arg Lys Gln Arg Tyr Val Tyr 405 410 415 Cys Ala Ile Leu Asn Ser Ile Ala Lys Val Ala Gly Ile Ile Lys Phe 420 425 430 Asp Leu His Ala Glu Pro Glu Ile Ser Gly Met Lys Gln Leu Glu Val 435 440 445 Gly Gly Asn Val Arg Gly Ile Phe Asp Leu Gly Pro Gly Arg Phe Gly 450 455 460 Ser Glu Ala Ile Phe Val Pro Arg Glu Pro Gly Val Ser Gly Glu Glu 465 470 475 480 Asp Asp Gly Tyr Leu Ile Phe Phe Val His Asp Glu Asn Thr Gly Lys 485 490 495 Ser Glu Val Asn Val Ile Asp Ala Lys Thr Met Ser Ala Asp Pro Val 500 505 510 Ala Val Val Glu Leu Pro Ser Arg Val Pro Tyr Gly Phe His Ala Phe 515 520 525 Phe Ile Asn Glu Glu Gln Leu Ala Lys Gln Ser Ala 530 535 540 <210> 2 <211> 638 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 2 Met Gln Arg Ile Cys Pro Ala His Cys Ser Val Thr His Ser Leu Thr 1 5 10 15 Met Lys Ser Met Arg Leu Ser Tyr Ile Pro Pro Ala Ala Ser Ala Ala 20 25 30 Pro Gln Ser Pro Ser Tyr Gly Arg Lys Lys Asn Ala Ser Ala Ala Pro 35 40 45 Pro Ser Ala Ala Ala Ser Thr Thr Val Leu Thr Ser Pro Leu Val Thr 50 55 60 Thr Thr Arg Thr Pro Lys Gln Thr Glu Gln Glu Asp Glu Gln Leu Val 65 70 75 80 Ala Lys Thr Lys Thr Thr Arg Thr Val Ile Ala Thr Thr Asn Gly Arg 85 90 95 Ala Ala Pro Ser Gln Ser Arg Pro Arg Arg Arg Pro Ala Pro Ala Ala 100 105 110 Ala Ala Ser Ala Ala Ser Leu Pro Met Thr Phe Cys Asn Ala Leu Glu 115 120 125 Glu Val Ile Asn Thr Phe Ile Asp Pro Pro Ala Leu Arg Pro Ala Val 130 135 140 Asp Pro Arg Asn Val Leu Thr Ser Asn Phe Val Pro Val Asp Glu Leu 145 150 155 160 Pro Pro Thr Pro Cys Pro Val Val Arg Gly Ala Ile Pro Arg Cys Leu 165 170 175 Ala Gly Gly Ala Tyr Ile Arg Asn Gly Pro Asn Pro Gln His Leu Pro 180 185 190 Arg Gly Pro His His Leu Phe Asp Gly Asp Gly Met Leu His Ser Leu 195 200 205 Leu Leu Pro Ser Pro Ala Ser Ser Gly Asp Asp Pro Val Leu Cys Ser 210 215 220 Arg Tyr Val Gln Thr Tyr Lys Tyr Leu Val Glu Arg Asp Ala Gly Ala 225 230 235 240 Pro Val Leu Pro Asn Val Phe Ser Gly Phe His Gly Val Ala Gly Met 245 250 255 Ala Arg Gly Ala Val Val Ala Ala Arg Val Leu Thr Gly Gln Met Asn 260 265 270 Pro Leu Glu Gly Val Gly Leu Ala Asn Thr Ser Leu Ala Tyr Phe Ala 275 280 285 Gly Arg Leu Tyr Ala Leu Gly Glu Ser Asp Leu Pro Tyr Ala Val Arg 290 295 300 Val His Pro Asp Thr Gly Glu Val Thr Thr His Gly Arg Cys Asp Phe 305 310 315 320 Gly Gly Arg Leu Val Met Gly Met Thr Ala His Pro Lys Lys Asp Pro 325 330 335 Val Thr Gly Glu Leu Phe Ala Phe Arg Tyr Gly Pro Val Pro Pro Phe 340 345 350 Val Thr Tyr Phe Arg Phe Asp Pro Ala Gly Asn Lys Gly Ala Asp Val 355 360 365 Pro Ile Phe Ser Val Gln Gln Pro Ser Phe Leu His Asp Phe Ala Ile 370 375 380 Thr Glu Arg Tyr Ala Ile Phe Pro Glu Ile Gln Ile Val Met Lys Pro 385 390 395 400 Met Asp Met Val Val Gly Gly Gly Ser Pro Val Gly Ser Asp Pro Gly 405 410 415 Lys Val Pro Arg Leu Gly Val Ile Pro Arg Tyr Ala Thr Asp Glu Ser 420 425 430 Glu Met Arg Trp Phe Glu Val Pro Gly Phe Asn Ile Met His Ser Val 435 440 445 Asn Ala Trp Glu Glu Ala Gly Gly Glu Glu Leu Val Leu Val Ala Pro 450 455 460 Asn Val Leu Ser Ile Glu His Ala Leu Glu His Met Glu Leu Val His 465 470 475 480 Ser Cys Val Glu Lys Val Arg Ile Asn Leu Arg Thr Gly Val Val Thr 485 490 495 Arg Thr Pro Leu Ala Ala Gly Asn Phe Asp Phe Pro Val Ile Asn Pro 500 505 510 Ala Phe Leu Gly Arg Arg Asn Arg Tyr Gly Tyr Phe Gly Val Gly Asp 515 520 525 Pro Ala Pro Lys Ile Gly Gly Val Ala Lys Leu Asp Phe Asp Arg Ala 530 535 540 Gly Glu Gly Asp Cys Thr Val Ala Gln Arg Asp Phe Gly Pro Gly Cys 545 550 555 560 Phe Ala Gly Glu Pro Phe Phe Val Ala Asp Asp Val Glu Gly Asn Gly 565 570 575 Asn Glu Asp Asp Gly Tyr Leu Val Cys Tyr Val His Asp Glu Ala Thr 580 585 590 Gly Glu Asn Arg Phe Val Val Met Asp Ala Arg Ser Pro Asp Leu Glu 595 600 605 Ile Val Ala Glu Val Gln Leu Pro Gly Arg Val Pro Tyr Gly Phe His 610 615 620 Gly Leu Phe Val Thr Gln Ala Glu Leu Gln Ser Gln His Gln 625 630 635 <210> 3 <211> 576 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 3 Met Glu Val Pro Ile Ala Ala Met Thr Phe Ala His Pro Ala Asn Val 1 5 10 15 Met Thr Leu Ala Ser Arg Gln Pro Lys Ser Lys Arg Ser His Ile Ser 20 25 30 Pro Ala Thr Thr Ala His Arg Asn Leu Gln Thr Arg Leu Ala His His 35 40 45 His His Ala Thr Pro Ala Ser Leu Pro Met Ala Ile Cys Asn Thr Val 50 55 60 Asp Lys Val Ile Asn Arg Phe Ile Asp Leu Pro Glu Gln Arg Pro Thr 65 70 75 80 Val Asp Pro Arg Arg Val Leu Ser Gly Asn Phe Ala Pro Val Asp Glu 85 90 95 Leu Pro Pro Thr Ser Cys His Val Ile Arg Gly Ser Ile Pro Ser Cys 100 105 110 Leu Ala Gly Gly Val Tyr Ile Arg Asn Gly Pro Asn Pro Gln His Arg 115 120 125 Leu Pro Gln Arg Thr His His Leu Phe Asp Gly Asp Gly Met Leu His 130 135 140 Ser Leu Leu Ile Pro Ser Ala Ser Ser Thr Leu Leu Ser Glu Pro Val 145 150 155 160 Leu Cys Ser Arg Tyr Val His Thr Tyr Lys Tyr Leu Leu Glu Arg Glu 165 170 175 Thr Gly Gly Pro Val Leu Pro Asn Phe Phe Ala Gly Phe His Gly Val 180 185 190 Ala Gly Leu Ala Arg Ala Val Val Met Ile Ala Arg Val Leu Ala Gly 195 200 205 Gln Ile Asn Leu Asn Lys Gly Phe Gly Leu Ala Asn Thr Ser Ile Thr 210 215 220 Leu Phe Ala Asp Cys Leu Tyr Ala Leu Cys Glu Ser Asp Leu Pro Tyr 225 230 235 240 Ser Met His Ile Asn Pro Ala Asn Gly Glu Val Thr Thr Leu Gly Arg 245 250 255 Cys Asp Phe Gly Gly Asp Leu Ser Phe Arg Met Thr Ala His Pro Lys 260 265 270 Lys Asp Pro Val Thr Met Glu Leu Phe Ala Phe Arg Tyr Asn Val Phe 275 280 285 Gln Pro Phe Ile Thr Tyr Phe Trp Phe Asp Arg Ala Gly Ser Lys Val 290 295 300 Ala Asp Val Pro Ile Leu Ser Leu Gln Lys Pro Ser Val Met His Asp 305 310 315 320 Phe Ala Ile Thr Glu Arg Tyr Ala Ile Phe Pro Glu Ser Gln Leu Ile 325 330 335 Val Asn Pro Met Asp Met Val Met Arg Gly Ser Ser Leu Val Gly Leu 340 345 350 Asp Arg Thr Met Val Pro Arg Ile Gly Val Leu Pro Arg Tyr Ala Lys 355 360 365 Asp Glu Ser Asp Met Arg Trp Phe Glu Val Pro Arg Phe Asn Met Leu 370 375 380 His Thr Thr Asn Gly Trp Glu Glu Ala Asp Gly Glu Glu Ile Val Leu 385 390 395 400 Val Ala Pro Asn Ile Leu Ser Ile Glu His Met Leu Gly Asn Met Glu 405 410 415 Leu Met Arg Ala Arg Val Asp Met Val Arg Ile Asn Leu Cys Thr Gly 420 425 430 Asp Val Ser Cys Thr Ala Leu Ser Pro Glu Ser Leu Glu Phe Gly Val 435 440 445 Ile His Gln Gly Tyr Val Gly Arg Lys Asn Arg Tyr Gly Tyr Phe Gly 450 455 460 Val Ser Gly Pro Leu Pro Lys Ile Lys Gly Ile Arg Lys Leu Asp Phe 465 470 475 480 Asp Leu Val Gly Ser Gly Asp Cys Thr Val Gly Arg Arg Asp Phe Gly 485 490 495 Leu Gly Cys Phe Ala Gly Glu Pro Phe Phe Val Pro Asp Asn Ile Asp 500 505 510 Gly Tyr Gly Asn Glu Asp Ser Gly Tyr Val Val Cys Tyr Thr His Glu 515 520 525 Glu Asp Thr Gly Glu Ser Trp Phe Val Val Met Asp Ala Lys Ser Pro 530 535 540 Glu Leu Asp Ile Val Ala Glu Val Gln Leu Pro Ser Arg Ile Pro Tyr 545 550 555 560 Gly Phe His Gly Ile Phe Val Lys Gln Ala Glu Leu Leu Ala Gln Gln 565 570 575 <210> 4 <211> 1623 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 4 atgggaggcg gcgatggcga tgaggtgctg ctgctgccgg agccgcgccc tcgcaggggc 60 ctcgcctcct gggcgctcga tctgctggag cgcgccgccg tccgcctcgg ccacgacgcc 120 tccaagccgc tctactggct ctccggcaac ttcgcccccg tccaccacga gaccccgccg 180 gccccggccc tccccgtccg cggccacctc cccgagtgct tgaatggaga atttgtcagg 240 gtaggaccca atccaaagtt tgtccctgtc gctggctatc attggtttga tggagatgga 300 atgatccatg cgatgcgtat caaagatggg aaagctacct atgtgtcgag atatgtgaag 360 acttctcgtc tcaagcaaga agagtatttt ggtggagcaa agtttatgaa gattggagac 420 ctgaagggat tttatggatt gtttatggtc caaatgcaac aactccggaa aaaactcaaa 480 gtattggatt ttacatatgg acatgggaca gctaatactg cacttatcta tcaccatggt 540 aaacttatgg ccctgtcaga ggcagataag ccctatgttg ttaaggtcct tgaagatgga 600 gacttgcaaa ctcttggatt gttggattac gacaaacggt tgaaacactc tttcactgct 660 catccaaagg tcgatccatt tacagacgaa atgttcgctt ttggatattc gcatgaacct 720 ccttactgta cataccgggt cattaccaag gatggagcca tgcttgatcc tgtgccaata 780 acaattccag aatctgtaat gatgcacgac tttgccatta cagagaatta ttctattttc 840 atggaccttc ctctgttgtt ccgaccaaag gaaatggtga agaatggtga gtttatctac 900 aagtttgatc ctacaaagaa agctcgtttt ggtatactcc aacgttatga aaaggatgac 960 acaaacatca gatggtttga acttcccaac tgcttcatat tccacaatgc taatgcttgg 1020 gaagagggtg acgaagttat cctaattacc tgccgcttgg agaatcctga cttggacaag 1080 gtgaacggtt accaaagcga caatctcgag aactttggga atgagctgta tgagatgaga 1140 ttcaacatga aaaccggtgc tgcttcacaa aagcaactat ctgtttctgc tgtagatttt 1200 cctcgaatta atgagagcta cactggcaga aagcagcggt atgtgtattg cgctattcta 1260 aacagcatag cgaaggtagc aggcattata aaatttgatc tacatgctga accggagatc 1320 agtggcatga aacaacttga agtgggggga aatgtgagag gaatatttga cttgggacct 1380 ggtagattcg ggtccgaggc aatttttgtg cctagggaac ccggtgtatc tggagaagaa 1440 gatgatggtt atttgatatt ctttgtccac gacgagaata cagggaaatc tgaagtcaat 1500 gtgattgatg caaagacaat gtctgctgat ccggtggcag ttgttgagct accaagccga 1560 gttccctacg gattccatgc tttctttata aacgaggaac aactggcaaa acaatcagcg 1620 tga 1623 <210> 5 <211> 1917 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 5 atgcaaagga tttgccctgc tcactgctcg gtcactcact cactcaccat gaagtccatg 60 aggctttcct acatccctcc tgctgcttct gctgctccac agagccccag ctatggcagg 120 aagaagaacg cctccgccgc tccgccatcg gctgccgcct ccaccaccgt tctcacctcc 180 ccgctggtga ccaccacccg cactccgaag cagaccgagc aagaggacga gcagttggta 240 gccaagacca agactacgag aactgttatt gctacgacga atggcagggc ggcgccgagc 300 cagtctcggc ctcgccgccg gcctgccccc gccgccgcgg cgtcggccgc ttcgctgccg 360 atgacgttct gcaacgcgct ggaggaggtg atcaacacgt tcatcgaccc gccggcgctt 420 cggccggcgg tggacccgcg gaacgtgctg accagcaact tcgtgcccgt ggacgagctg 480 ccgccgacgc cctgccccgt cgtgcgcggc gccatcccgc gctgcctcgc cggcggcgcc 540 tacatccgca acgggcccaa cccgcagcac ctcccgcgcg ggccgcacca cctgttcgac 600 ggcgacggca tgctgcactc cctcctcctc ccgtcgcccg cgtcgtccgg cgacgacccc 660 gtcctgtgct cgcgctacgt gcagacgtac aagtacctcg tggagcgcga cgccggcgcg 720 cccgtcctgc ccaacgtctt ctccggcttc cacggcgtgg ccgggatggc gcgcggcgcc 780 gtcgtggcgg ccagggtcct gaccgggcag atgaatccgt tggagggcgt cgggctcgcc 840 aacaccagcc tcgcctactt cgccggccgc ctctacgcgc tcggcgagtc cgacctcccc 900 tacgccgtgc gcgtccaccc ggacaccggc gaggtgacca cgcacggcag gtgcgacttc 960 ggcggccgcc tcgtcatggg catgaccgcg caccccaaga aggaccccgt caccggcgag 1020 ctcttcgcgt tccgctacgg ccccgtgccg ccgttcgtga cgtacttccg gttcgacccg 1080 gccggcaaca agggcgccga cgtgcccatc ttctccgtgc agcagccgtc gttcctgcac 1140 gacttcgcca tcaccgagcg gtacgccatc ttcccggaga tccagatcgt gatgaagccc 1200 atggacatgg tggtgggcgg cggctcgccc gtggggtcgg accccggcaa ggtgccccgc 1260 ctcggcgtga tcccgcgcta cgccaccgac gagtcggaga tgcggtggtt cgaggtgccg 1320 ggcttcaaca tcatgcactc ggtgaacgcg tgggaggagg ccggcggcga ggagctggtg 1380 ctggtggcgc ccaacgtcct ctccatcgag cacgccctgg agcacatgga gctagtgcac 1440 tcctgcgtcg agaaggtgcg catcaacctc cgcaccggcg tcgtcacgcg caccccgctc 1500 gccgccggga acttcgactt ccccgtgatc aacccggctt tcctcggccg ccgcaacagg 1560 tacggctact tcggcgtcgg cgaccccgcg cccaagatcg gcggcgtggc caagctcgac 1620 ttcgaccgcg ccggcgaggg cgactgcacc gtggcgcagc gcgacttcgg gcccgggtgc 1680 ttcgccggcg aaccgttctt cgtggccgac gacgtcgagg gcaacggcaa cgaggatgac 1740 gggtacttgg tgtgctacgt ccacgacgag gccaccggcg agaaccggtt cgtggtgatg 1800 gacgcgcggt cgccggacct ggagatcgtc gcggaggtgc agctgcccgg acgcgtcccc 1860 tacggcttcc atggcctgtt cgtcacgcag gccgagctcc agtcacagca ccaatga 1917 <210> 6 <211> 1731 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 6 atggaggtac ccattgctgc catgactttt gcccacccag ccaatgttat gactctggct 60 tcaaggcagc caaagagtaa aaggtcccat atctcccctg ctaccacggc tcaccgtaat 120 ctacagactc gcctggctca ccaccaccat gcaacaccag cttcattgcc tatggcaatc 180 tgcaacacag tagacaaagt gatcaatagg ttcattgacc tgccggagca gcgaccaacg 240 gtggatccgc ggcgtgtgct ctctggcaac ttcgctcctg ttgatgagct gcccccgaca 300 agctgccatg tcatccgcgg ctccatccca agctgcctcg ccggtggggt ctacatccgc 360 aatggtccca acccacagca ccggcttccc cagcgaacac accacctctt cgatggtgat 420 ggcatgctcc actcccttct cattccctcg gcctcgtcaa cactgttgtc ggagcctgtg 480 ctttgttcac gctatgtgca cacgtacaag tatctcttgg agcgtgagac cggaggaccg 540 gttttaccaa acttcttcgc tggcttccat ggagtggccg gcttggctcg tgcagtggtc 600 atgatcgcaa gagtgcttgc tggtcaaatt aacctgaaca agggcttcgg gctggccaac 660 actagcatca ctctttttgc agattgccta tatgcgctat gcgaatctga ccttccctac 720 tccatgcaca tcaacccagc caacggagaa gtcaccacac ttggtcgatg tgactttggt 780 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gcaaagtctc cagagctaga cattgttgca gaagtgcaac ttcctagtcg tatcccctat 1680 ggctttcatg gtatttttgt caaacaggcc gaacttctcg cacaacaata a 1731

Claims (9)

1. 카로티노이드 절단 효소 유전자의 발현을 억제하는 핵산 분자를 포함하는 식물체의 카로티노이드 함량 증진용 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 카로티노이드 절단 효소 유전자는 OsCCD1, OsCCD4a 또는 OsCCD4b 중 선택되는 것을 특징으로 하는 식물체의 카로티노이드 함량 증진용 조성물.
3. 제1항에 있어서,
   상기 카로티노이드 절단 효소 유전자는 서열번호 4 내지 6으로 표시되는 염기 서열 중 1 이상을 선택하여 포함하는 것을 특징으로 하는 식물체의 카로티노이드 함량 증진용 조성물.
4. 제1항에 있어서,
   상기 핵산 분자는 T-DNA, siRNA, shRNA, miRNA, 리보자임(ribozyme), PNA(peptide nucleic acid), 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 또는 RNAi 벡터인 것을 특징으로 하는 조성물.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 조성물로 형질 전환된 식물체.
6. 제5항에 있어서,
   상기 식물체는 형질 전환된 식물체와 타 식물체의 교배를 통하여 생산되는 자손 세대를 포함하는 것인, 식물체.
7. (a) 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 조성물을 식물세포에 도입하는 단계;
   (b) 상기 식물세포로부터 카로티노이드 절단효소 유전자 활성이 억제된 형질전환 식물체를 수득하는 단계를 포함하는 카로티노이드 절단효소 유전자 활성이 억제된 형질전환 식물체의 제조 방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 형질전환 식물체는 카로티노이드 함량이 증진된 것을 특징으로 하는, 형질전환 식물체의 제조 방법.
9. 제7항에 있어서, 타 식물체를 상기 형질전환 식물체와 교배하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 형질전환 식물체의 제조 방법.

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