KR20030072210A - 형질전환 식물 내 유전자 발현의 변형 - Google Patents

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오쿠모토사키코
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워드존
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Abstract

본 발명은 형질전환 식물체 내에서의 유전자 발현을 변형시키는 조절 인자, 수크로오스 수송체 유전자의 비-암호화 부위에서 유래한 뉴클레오타이드 인핸서 및 리프레서 서열, 및 형질전환 식물체에서의 유전자 발현 변형을 위한 조절 인자에 사용하기 위한 적절한 프로모터에 관한 것이다. 본 발명의 목적은 식물 유전자 발현, 예컨대, 식물체 내의 수송, 저장 및 성장 과정을 조절하기 위한 방법을 제공하는 것이다. 이러한 과제는 프로모터와 수크로오스 수송체 유전자의 비-암호화 부위를 포함하는 뉴클레오타이드 인핸서 및/또는 리프레서 서열인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 조절 인자에 의하여 해결된다.

Description

형질전환 식물 내 유전자 발현의 변형{MODIFICATION OF GENE EXPRESSION IN TRANSGENIC PLANTS}
식물체는 축적된 탄소 화합물의 광합성 활성 또는 저장 조직 및 기관(소스(source) 조직/기관)으로부터 이들 화합물을 소비하는 식물체의 비-광합성 부분(싱크(sink) 조직/기관)으로의 장거리 수송을 위하여, 관다발계, 체관을 사용한다. 이러한 수송 시스템의 주요 구성요소는 세포, 즉 사세포(sieve cells) 또는 사요소(sieve elements) 및 이들의 반세포(companion cells)들과 연결되어 있다. 사세포는 고등 식물에서 탈핵되어 있고, 마이크로 분자 또는 마크로 분자를 생성하고 원형질 연락사(plasmodesmata)를 통하여 이들 물질을 사요소로 이동시키는 반세포들에 의하여 살아 있는 세포이다. 사세포는 식물체 내의 장거리 수송을 위한 도관을 형성한다. 따라서, 단백질, 펩타이드, RNAs 및 다른 효소 반응 산물과 같이반세포에서 합성되는 물질은 사요소를 통하여 소스 부위에서 싱크 부위로 배분될 수 있다. 반세포 또는 사요소로 운송되는 물질도 또한 사요소를 통하여 소스 부위에서 생성 부위로 분배될 수 있다.
디사카라이드 수크로오스는 식물에 있어서 탄수화물의 주요한 수송 형태이다. 이것은 녹색 잎에서 합성되며, 뿌리, 분열조직 및 꽃과 같은 싱크 기관의 성장을 지속시키거나, 예컨대 괴경(tubers)에서와 같은 저장을 지속시키기 위하여 체관부를 통하여 수송된다. 식물에 있어서, 원형질막의 수크로오스 흡수 수송체(sucrose uptake transporters)가 장거리 수송에 있어서 결정적 역할을 한다고 생각되는 3 가지의 주요한 지점(locations)이 있다. 첫 번째로, 대부분의 식물에 있어서, 수크로오스는 체관부 로딩(phloem loading)으로 불리는 과정을 통하여 체관부 세포로 활발하게 수송되어야 한다. 이러한 로딩 과정은 장거리 수송을 위한 추진력을 발생시키는 것이라고 추측된다. 두 번째로, 수크로오스 수송체는 수송 동안의 과다한 손실을 방지하고 추진력을 지속적으로 재충전시키기 위한 체관부 길이에 따른 재-흡수에 적절하다. 세 번째로, 분열조직과 같은 싱크 조직과 괴경 및 열매와 같은 저장 기관에 있어서, 수크로오스 수송체는 싱크 세포에 의한 수크로오스 흡수를 담당한다.
이들 각각의 지점에서의 수크로오스 수송은 수크로오스 수송체(sucrosetransporters, SUTs)라는 일련의 특정 원형질막 단백질들에 의하여 매개되고 조절된다. 수크로오스 수송체는 또한 그것이 생성되는 잎의 체관부 가까이 위치하는 세포로부터의 수크로오스 방출, 싱크 조직의 체관부로부터의 수크로오스 방출 및 액포막을 통과하는 수송을 위하여 필요하다.
첫 번째 수크로오스 수송체인 SUT1을 효모에서의 기능적 발현(functional expression)에 의하여 클로닝하였다(Riesmeier et al., 1992, EMBO J. 11:4705-4713). 그 후, 토마토( L ycopersicon e sculentum)의 3 개의 유전자를 포함하는 SUT1 서열을 이용하여 식물체로부터의 관련 유전자를 얻었다. LeSUT1 및 다른 식물로부터 얻은 이의 오르토로그(orthologs)들은 도메인들을 연결하는 12 개의 막으로 구성되는 소수성 단백질이며, 단백질-관련 메카니즘을 사용하여 매우 특이적인 수크로오스 유입을 매개하는 세포의 원형질막에 위치한다. 특히, SUT1 발현이 손상된 형질전환 식물의 사용은 SUT1 기능이 체관부 수송에 필요하다는 강력한 증거를 제공하였다(Riesmeier et al., 1994, EMBO J. 13:1-7).
아미노산의 수송은 식물체 전체 및 식물 기관의 성장에 매우 중요한 또 하나의 과정이다. 아미노산은 단백질 합성 및 삼투용해 활성 화합물로서와 같은 다른 목적에 있어서 필수 불가결하므로, 아미노산 수송체/투과효소(aminoacid transporter/permease, AAP) 단백질을 통한 이들의 수송에 있어서의 제한은 식물 생산물 수율의 제한을 초래할 것이다.
상기한 수송 및 저장 과정은 매우 특이적인 유전자 발현을 필요로 한다. 이러한 과정에 수반되는 유전자의 발현을 조절하기 위한 수단이 사용가능하다면, 예컨대 증진된 성장, 증가된 수율, 병원균에 대한 내성, 커다란 잎 및 당도가 높은 열매와 같은 이로운 특성을 갖는 신규한 형질전환 식물을 제조할 수 있을 것이다.
본 발명은 형질전환 식물 내 유전자 발현의 변형을 위한 조절 인자(regulatory element), 수크로오스 수송체 유전자(sucrose transporter gene)의 비-암호화(non-coding) 부위에서 유래된 뉴클레오티드 인핸서(enhancer) 및 리프레서(repressor) 서열, 및 형질전환 식물체에서의 유전자 발현의 변형을 위한 조절 인자에 사용하기 위한 적절한 프로모터에 관한 것이다.
다음의 도면은 본 발명을 설명하기 위한 것이다. 이들은 다음을 나타낸다:
도 1은 LeSUT1에 대한 프로모터 결실(promoter-GUS) 구조의 개략적인 그림이다. 여기서,
HindIII, SalI, EcoRI, BamHI, XbaI, EcoRV, SmaI: 제한효소의 절단 부위
ATG: 번역 개시
uidA: GUS 유전자
npt II: 네오마이신-인산기전이효소 II 유전자
nT: 노팔린 합성효소(nopaline synthase) 종결부분
nP: 노팔린 합성효소 프로모터
LB: 좌측 가장자리 서열 (T-DNA 유래)
RB: 우측 가장자리 서열 (T-DNA 유래)
kb: kilobases
p: 프로모터
도 2은 LeSUT1에 대한 프로모터 SUT1-GUS 구조의 개략적인 그림이다. 여기서,
HindIII, SalI, EcoRI, BamHI, XbaI, EcoRV, SmaI, BclI, SstI: 제한효소의 절단 부위
ATG: 번역 개시
uidA: GUS 유전자
npt II: 네오마이신-인산기전이효소 II 유전자
nT: 노팔린 합성효소 종결부분
nP: 노팔린 합성효소 프로모터
LB: 좌측 가장자리 서열 (T-DNA 유래)
RB: 우측 가장자리 서열 (T-DNA 유래)
E1, E2, E3, E4: 엑손 1 내지 4
I1, I2, I3: 인트론 1 내지 3
3'UTR: 3' 비번역 부위
kb: kilobases
p: 프로모터
도 3A는 프로모터-GUS, 프로모터-SUT1-GUS 및 프로모터 SUT1-GUS-3'UTR 구조물들의 평균 β-글루쿠로니다아제 활성을 비교한 것이며, 도 3는 상이한 활성 간격으로 β-글루쿠로니다아제 활성을 나타내는, 프로모터-GUS, 프로모터-SUT1-GUS 및 프로모터 SUT1-GUS-3'UTR 구조물들로 형질변화된 식물의 퍼센트를 나타낸 것이다.
도 4는 LeSUT1에 대한 프로모터-인트론-GUS-3'UTR 구조물의 개략적인 그림이다. 여기서,
HindIII, SalI, EcoRI, BamHI, XbaI, EcoRV, SmaI: 제한효소의 절단 부위
ATG: 번역 개시
uidA: GUS 유전자
npt II: 네오마이신-인산기전이효소 II 유전자
nT: 노팔린 합성효소 종결부분
nP: 노팔린 합성효소 프로모터
LB: 좌측 가장자리 서열 (T-DNA 유래)
RB: 우측 가장자리 서열 (T-DNA 유래)
I1, I2, I3: 인트론 1 내지 3
3'UTR: 3' 비번역 부위
다음의 실시예를 참조하여 단지 예시 목적으로 본 발명을 보다 설명하기로 한다.
따라서, 본 발명의 목적은, 예컨대 식물체 내의 수송, 저장 및 성장 과정을 을 조절하기 위하여 식물 유전자의 발현을 조절하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
이러한 문제는 프로모터 및 수크로오스 수송체 유전자의 비-암호화 부위를 포함하는 뉴클레오타이드 인핸서(enhancer) 및/또는 리프레서(repressor) 서열인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 조절 인자에 의하여 해결된다.
본 발명에 따른 프로모터 및 뉴클레오타이드 인핸서 및/또는 리프레서 서열을 포함하는 조절 인자는 원래의 유전자 또는 도입된 유전자의 발현에 영향을 주기 위하여 사용될 수 있다. 이러한 유전자들은 식물체 기원이거나 비-식물체 기원일 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 인핸서 및/또는 리프레서 서열은 토마토(Lycopersicon esculentum)로부터 유래된 것이다.
기대하지 않게, SUT 유전자의 비-암호화 부위에서 유래한 뉴클레오타이드 서열. 특히 SUT 유전자의 인트론 1, 및/또는 인트론 2. 및/또는 인트론 3은 특정 세포 및 조직의 유전자를 과발현시키거나 발현을 감소시키기에 적합한 방식으로 유전자 발현을 변형시킨다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명에 따른 신규한 조절 인자는 유전자의 높은 발현을 유발하거나, 그들의 mRNA를 안정화시키거나, 유전자 발현을 감소시킨다. 상기 조절요소는 다음과 같은 목적으로 사용될 수 있다.
1. SUT 또는 AAP 유전자의 의미있는 방향(sense orientation)으로의 발현에 의한 수크로오스 또는 아미노산 수송체 유전자 발현의 변형(사요소 수준에서의 보다 많은 체관부 로딩, 수송 경로를 통한 보다 많은 회복, 싱크 조직으로의 보다 많은 흡수).
2. 반세포, 공변세포 또는 모상체(trichomes) 내의 다른 유전자 발현의 변형.
3. 식물 또는 비-식물 유전자 발현의 반세포, 공변세포 또는 모상체 내로의 도입.
4. RNA 및 단백질과 같은 화합물의 체관부 내로의 도입. 이들은, 예컨대 옥토핀(octopin), 조절 RNAs 또는 단백질 등을 생성하기 위하여 단일 단계 경로들로부터 얻어지는 모든 신규한 화합물일 수 있다. 이것은 또한 체조직 획득 서프레션(systemic acquired suppression)을 유발시키는데 사용되어 바이러스 내성 식물을 생성하거나 표적 유전자의 발현을 감소시킨다.
5. 곤충 및 초식동물에 대한 식물 방어를 증가시키거나, 산업적 또는 농업적 가치를 갖는 분자를 생산하기 위한 유전자 발현의 도입 또는 변형. 예컨대, 분비(grandular) 모상체 내의 모노테르펜(monoterpene) 생합성 효소의 발현을 변형시킬 수 있다. 또한, 항염성 또는 다른 약리학적 특성을 갖는, 분비 모상체에서 생산되는 액포 플라보노이드류의 생산을 촉진시킬 수 있다.
6. 공변 세포 내 유전자 발현의 도입 또는 변형. 공변 세포에서 발현되는 천연 또는 합성 수용체, 시그날 트랜스덕션(signal transduction) 성분, 이온 채널 또는 수송체를 기공입구 통제의 조절을 변형시키거나 가능하게 하기 위하여 사용될 수 있다. 이는 건조한 조건에서의 건조 내성을 향상시키거나 충분한 물이 공급되는조건하에서의 CO2고정을 증진시킬 수 있다.
7. 생체이물(xenobiotics)의 체관부로의 도입. 식물에 적용되는 많은 화합물(제초제 또는 살충제와 같은 생체이물)들은 글리코실화되어 있기 때문에, 반세포에서의 생체이물에 대한 수송체의 과발현은 이들 화합물을 보다 잘 이동시킬 수 있다.
8. 반세포 활성의 변형. 예컨대, ATPase 활성의 증진 및 라피노오스 생합성의 증가.
9. 잎 내의 탄수화물을 증가시키기 위하여, 예컨대, 코서프레션(cosuppression) 또는 안티센스 서프레션(antisense suppression)을 통한, 체관부 로딩의 차단.
SUT1 유전자의 인트론 1은 유전자 발현을 감소시키므로 유전자 발현 리프레서로 생각된다. 다른 두 인트론은 유전자 발현을 증진시키고 유전자 발현의 공간적 분포에 영향을 미친다. 예컨대, 인트론 2는 공변 세포 및 체관부 잎맥 내의 유전자 발현을 증진시키고, 인트론 3은 모상체 내의 유전자 발현을 증진시킨다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 조절 인자는 SUT1 유전자의 인트론 1을 포함한다.
본 발명의 보다 바람직한 구체예에 따르면, 조절 인자는 SUT1 유전자의 인트론 2 및/또는 인트론 3을 포함한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에 따르면, 조절 인자는 SEQ ID NO:1의서열, 또는 SEQ ID NO:1과 상보적인 서열을 포함하거나, SEQ ID NO:1 서열의 뉴클레오타이드와 혼성화되어 있다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에 따르면, 조절 인자는 SEQ ID NO:2의 서열, 또는 SEQ ID NO:2와 상보적인 서열을 포함하거나, SEQ ID NO:2 서열의 뉴클레오타이드와 혼성화되어 있다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에 따르면, 조절 인자는 SEQ ID NO:3의 서열, 또는 SEQ ID NO:3과 상보적인 서열을 포함하거나, SEQ ID NO:3 서열의 뉴클레오타이드와 혼성화되어 있다.
또한, SUT1 유전자의 3'-비번역 부위(3'-untranslated region, 3'-URT)는 mRNA를 안정화시킴으로써, 발현 정도에 보다 더 기여한다. 따라서, 본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에 따르면, 조절 인자는 SEQ ID NO:4의 서열, 또는 SEQ ID NO:4과 상보적인 서열을 추가적으로 포함하거나, SEQ ID NO:4 서열의 뉴클레오타이드와 혼성화되어 있다.
인트론 1, 인트론 2 및 인트론 3의 뉴클레오타이드 서열을 각각 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:3의 서열로 나타내었다. 3'UTR의 DNA 서열을 SEQ ID NO:4의 서열로 나타내었다.
수송체 단백질을 코딩하는 유전자는 관다발계의 특정 부위 또는 특정 조직/기관에서 각각 활성이 있다. 유전자 발현 및 유전자 산물의 공간적 배치는 프로모터 활성에 따라 달라진다. 결과적으로, 본 발명에 따른 신규한 조절 인자 내의 조직 또는 기관 특이적인 프로모터의 사용은 예컨대 수크로오스와 같은 올리고사카라이드 등의 동화된 탄소 화합물 또는 아미노산의 수송, 저장 및 배치 과정의 조직적인 조절을 가능하게 한다.
따라서, 본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 조절 인자는 SUT1, SUT2, SUT4, AAP3 또는 AAP4 프로모터의 뉴클레오타이드 서열, 또는 SUT1, SUT2, SUT4, AAP3 또는 AAP4 프로모터와 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, SUT1, SUT2, SUT4, AAP3 또는 AAP4 프로모터 뉴클레오타이드 서열과 혼성화된 프로모터를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 혼성화라는 용어는 Sambrooket al.(Molecular Cloning. A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nded., 1989)에 기재된 바와 같은 통상적인 혼성화 조건, 보다 바람직하게는 엄격한 조건 하에서의 혼성화를 의미한다. 본 발명에 따르면, 혼성화는, 또한, 50 ℃, 바람직하게는 60 ℃, 특히 바람직하게는 68 ℃에서 2 × SSC 및 0.1 % SDS로 20 분 동안 세척하거나, 특히 50 ℃, 바람직하게는 60 ℃, 특히 바람직하게는 68 ℃에서 0.2 × SSC 및 0.1 % SDS에서 20 분 동안 세척한 후, 양성(positive) 혼성화 신호를 얻는 것을 의미한다.
이하, 본 발명의 목적에 적합한 프로모터를 설명하기로 한다.
SUT1/SUT4 프로모터
고 친화성 및 저 용량의 수크로오스 수송체 SUT1의 프로모터는 체관부의 반세포 내에서 활성을 갖는다. 인트론 2와 조합되는 경우에는 공변 세포에서도 활성을 가지며, 인트론 3과 조합되는 경우에는 모상체에서만 활성을 갖는다. 일반적으로, 상기 프로모터는 뿌리, 괴경, 꽃 및 열매와 같은 싱크 기관 또는 싱크 조직(예컨대, 분열조직)에서 보다 소스 조직(예컨대, 성체의 잎 또는 발아하는 씨앗)에서 보다 더 활성이 있다. SUT4와 함께, SUT1은 체관부 로딩을 담당한다. LeSUT1 프로모터의 뉴클레오타이드 서열을 SEQ ID NO:5로 나타내었다.
저 친화성 및 고 용량의 수크로오스 수송체 SUT4의 프로모터는 소스 잎의 비주요 잎맥(체관부 로딩 부위)에서 특히 활성이 있다. 또한, 싱크 조직에서도 매우 활성이 있다. 소스 잎에 있어서, SUT1과 같은 고 친화성의 수크로오스 수송체의 발현을 유발하는데 SUT4 프로모터를 사용할 수 있다. 이것은 싱크 부위인 수확 기관(예컨대, 열매 또는 씨앗)에서의 수용력(sink strength)의 증가와 동반하여 비주요 잎맥의 체관부 내로의 수크로오스 로딩을 증가시킬 수 있다. 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) SUT4 프로모터의 뉴클레오타이드 서열을 SEQ ID NO:6에 나타내었다.
SUT1 프로모터 및 인트론 2로부터 유도된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 본 발명에 따른 조절 인자의 조절 하에서의 소스 조직(예컨대, 잎) 내의 고 용량의 수크로오스 수송체 SUT4 유전자의 과발현은 높은 유출 속도의 조건(예컨대, 높은 광도) 하의 체관부로의 로딩을 증가시킬 수 있다. 이것은 수크로오스의 체관부로의 로딩을 증가시키고, 모든 싱크 조직, 특히 뿌리, 열매, 괴경, 꽃 및 씨앗의 당분 함량을 보다 높게하여, 수확 기관의 총 탄수화물 함량을 증가시킬 것이다. 오일 식물에 있어서, 이것은 오일 함량을 보다 높일 것이다. 열매, 괴경 등과 같은 수확기관의 개체수 및 건조 중량이 증가할 것이다. SUT4 유전자의 과발현은 또한 일반적으로 개화기를 조절하고 식물 성장을 증진시키는 수단일 것이다. 상기한 사실은, 또한, 고 친화성의 수크로오스 수송체 SUT1 유전자의 발현을 조절하는 SUT4 프로모터를 갖는 본 발명에 따른 조절 인자에 적용될 것이다.
소스 조직에서의 SUT1 및/또는 SUT4의 코서프레션 또는 안티센스 서프레션은 수용력을 감소시키고 소스 기관 내의 탄수화물 함량을 증가시킨다. 이것은 비-수확 싱크 부위로부터 경쟁을 감소시키고 줄기의 탄수화물 외층(investment)을 감소시켜서, 예컨대 생상력 있는 소형 변종의 생산하는데 중요하다. 또한, 이것은 상추 및 시금치와 같은 잎 작물의 당도를 향상시키는데 사용될 수 있다. 이것은 또한 생산 기관에서의 당분의 축적을 초래하고. 잎의 비-유관속 세포 내에서의 SUT4의 과발현과 유사한 효과를 갖는다. 줄기-특이적 억제는 줄기의 길이를 감소시켜 수확 인덱스를 증가시킨다.
SUT1 프로모터 및 인트론 2 유래의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 본 발명에 따른 조절 인자의 제어 하에서의 공변세포 내 SUT4 유전자의 과발현은 당분의 유량을 변화시켜서, 에너지 및 삼투용해를 공급하여 기공을 열리도록 용량을 증가시키거나 기공을 닫히도록 감소시키는데 사용될 수 있다. 보다 개방된 기공은, 물의 공급이 충분하다면, 최적 광합성을 위한 보다 적절한 CO2유입을 가능하게 할 것이다. 또한, 광 이용성이 신속하게 변화하는 조건하에서, 기공의 개/폐 주기를 보다 빈번하게 할 것이다.
SUT1 프로모터와 인트론 2를 사용하여 SUT1 유전자를 무의미 방향(antisense orientation)으로 발현시킴으로써 공변세포에서의 SUT1 과발현의 감소시킬 수 있다. 이는, 예컨대 낮 동안의 기공 열림을 방지할 것이고, 수분의 손실을 줄여서 수분 사용 효율을 증가켜서, 건조 내성과 관련하여 식물체가 건조한 조건에서 성장하지 않고 정상적으로 자라도록 할 것이다.
수크로오스 수송체 유전자의 코서프레션 또는 안티센스 서프레션은 효율적인 체관부 로딩을 억제하여 잎 내의 당분 함량을 증가시킬 것이다. 따라서, 이러한 결과로 잎은 더욱 커지고, 특히, 당분 함량의 증가, 보다 두꺼운 큐티클 및 예컨대 생분해 플라스틱(예컨대, PHB) 생산을 위한 전구체의 고함량과 같은 높은 이차 대사산물 함량에 의하여 방어 유전자가 상향 조절되어서, 병원균에 대한 방어 포텐셜이 증가하게 될 것이다. SUT1 및 SUT4 프로모터 단독으로 또는 예컨대 인트론 2와 같은 다른 cis 요소와의 조합 모두 이러한 목적에 적합하다.
인트론 3 및 SUT1 프로모터에서 유래된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 본 발명에 따른 조절 인자의 제어 하의 유전자는 모상체 내에서 배타적으로 발현될 것이다. 이는, 예컨대 방어 화합물(예컨대, 살충제) 또는 다른 화합물과 같은 특정 식물 생산물을 포함하는 모상체와 같은, 변형된 모상체를 갖는 식물체 생산에 사용될 수 있다. 또한, 금속의 축적을 증진시키고 식물개선(phytoremediation)에 있어서의 형질변형 식물의 유용성을 향상시키는, 모상체 내의 수송체 또는 다른 단백질을 코딩하는 유전자를 발현시키는데 사용될 수 있다.
종자에서의 SUT1과 같은 유전자의 과발현은 발아율을 향상시키는 결과를 가져올 것이다. 적절한 프로모터는 SUT4 프로모터이다.
SUT1 프로모터 및 인트론 2에서 유도된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 조절 인자의 제어 하에서의 SUT4 유전자의 발현 및 SUT4 프로모터를 갖는 본 발명에 따른 조절 인자의 제어 하에서의 SUT1 유전자의 발현 모두 매우 높은 생산율을 갖는 식물체의 생산을 유발할 수 있다.
모상체 내의 높은 당 수송이 종종 아미노산 수송과 소극적으로 관련되어 있기 때문에, SUT1 및/또는 SUT4 유전자의 과발현은, 예컨대 감자의 괴경 또는 사탕 무우 곧은 뿌리와 같은 싱크 조직 내의 아미노산 함량을 감소시키는 결과를 가져올 것이다. 그러나, 본 발명에 따른 조절 인자의 제어 하에서의 아미노산 수송체 유전자의 과발현은 (예컨대, 대두류 및 다른 콩과식물에 있어서) 보다 높은 아미노산 및/또는 단백질 함량을 갖는 열매의 생산을 유발할 것이다.
SUT2 프로모터
어린 식물체에 있어서, SUT2 프로모터는 식물체 전체에 대하여 활성을 갖는다. 늙은 식물체에 있어서, 상기 프로모터 활성은 뿌리, 색물체 잎의 주요 잎맥, 꽃받침 및 꽃밥에서 발견된다. 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) SUT2 프로모터의 뉴클레오타이드 서열을 SEQ ID NO:7에 나타내었다.
SUT2 프로모터는 체관부 및 다른 조직 내에서의 식물 또는 비-식물 유전자의 발현에 사용될 수 있다. 이는 수확 조직의 영양분 함량 또는 생산율을 증가시키는데 사용될 수 있다.
SUT2 유전자는 수크로오스 센서를 코딩한다. SUT2 프로모터는 SUT2를 무의미방향으로 발현시키거나 코서프레션을 유발하는 SUT2를 과발현시킴으로써, SUT2 유전자의 발현을 감소시키는데 사용될 수 있다. 감소된 SUT2의 발현은 SUT2 및/또는 다른 수크로오스 수송체(예컨대. SUT1 및 SUT4)에 의한 수크로오스 수송 및 수크로오스 감지를 변형시킬 것이다. 수크로오스 수송 활성이 변형은 상기한 바와 같은 수확 기관에 대한 탄소 분배를 증가시키는데 사용될 수 있다.
AAP3 프로모터
아미노산 수송체 AAP3의 프로모터는 주로 뿌리의 중심주, 꽃 및 떡잎에서 활성을 갖는다. 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) SUT2 프로모터의 뉴클레오타이드 서열을 SEQ ID NO:8에 나타내었다.
AAP3 유전자는 아미노산 수송체를 코딩한다. AAP3 프로모터는 AAP3을 무의미 방향으로 발현시키거나 코서프레션을 유발하는 AAP3을 과발현시킴으로써, AAP3 유전자의 발현을 감소시키는데 사용될 수 있다. 감소된 AAP3의 발현은 뿌리의 물관부와 체관부 사이의 이동을 변형시키고, 싹으로의 아미노산 이동을 감소시킨다. 이는독성이 있거나 바람직하지 않은 질소 화합물의 싹 내 농도를 감소시키는데 사용된다.
AAP4 프로모터
아미노산 수송체 AAP4의 프로모터는 꽃가루와 융단조직(tapetum tissue)에서 활성을 갖는다. 이것은, 또한, 성숙한 잎의 체관부의 주요 잎맥, 줄기 및 뿌리에서 활성을 갖는다. 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) SUT2 프로모터의 뉴클레오타이드 서열을 SEQ ID NO:9에 나타내었다.
AAP4 유전자는 아미노산 수송체를 코딩한다. AAP4 프로모터는 꽃가루 또는 융단 조직에서의 식물 또는 비-식물 유전자 발현에 사용될 수 있다. 이는 웅성 불임 식물을 생성하거나, 형질변환 식물체로부터의 교차수분을 제한(형질변환 유전자(transgene)의 분포를 제한)하는데 사용할 수 있다. 대표적으로, AAP4 프로모터는 AAP3을 무의미 방향으로 발현시키거나 코서프레션을 유발하는 AAP3을 과발현시킴으로써, AAP3 유전자의 발현을 감소시키는데 사용될 수 있다. 이는 꽃가루 기능을 억제하고 웅성 불임 식물체를 유발시킬 수 있다. 이것은 식물 육종에 중요할 것이다.
본 발명에 따른 조절 인자는, SUT1, SUT2, SUT4, AAP3 및 AAP4 유전자를 포함하지만 이에 한정되지 않는 식물 및 비-식물 유전자 변이체의 발현을 제어하는데 사용될 수 있다. 따라서, 이는, 올리고사카라이드 및 아미노산과 같은 영양 물질, 비타민, 미네랄, 또는 펩타이드 호르몬 또는 식물체 내의 다른 호르몬과 같은 성장 조절 물질을 위한, 복잡한 수송 및 분배 과정에 영향을 미치는데 사용될 수 있다.
본 발명은, 또한, 본 발명에 따른 조절 인자의 사용을 위한 프로모터에 관한 것으로, 상기 프로모터가 SUT1, SUT2, SUT4, AAP3 및 AAP4 프로모터 중 하나이다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 조절 인자를 포함하는 벡터 또는 가동 유전 요소(mobile genetic elements)에 관한 것이다. 예컨대, 바이러스, 박테리오파아지, 코스미드, 인조 효모 염색체(yeast artificial chromosomes), T-DNA, 전위 인자, 삽입 서열 등과 같은, 숙주 세포 내로 뉴클레오타이드 서열을 도입시키기 위한 적절한 벡터 또는 가동 유전 요소는 분자 클로닝 기술 분야의 통상의 지식을 가진자에게 잘 알려져 있다.
또한, 본 발명은 박테리아 세포, 효모 세포 또는 식물 세포와 같은 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 식물 세포, 특히 베타 불가리아스(Beta vulgaris) 속을 본 발명에 따른 조절 인자로 형질전환시킨다.
본 발명은, 또한, 본 발명에 따른 조절 인자로 형질전환된 세포를 포함하거나 그로부터 유도된, 식물체, 그들의 일부분 및 식물의 종자에 관한 것이다. 본 발명에 따른 조절 인자로 형질전환되는 식물체는, 소나무아강(Pinidae), 목련아강(Magnoliidae), 미나리아재비아강(Ranunculidae), 석죽아강(Caryophyllidae), 장미아강(Rosidae), 국화아강(Asteridae), 천남성아강(Aridae), 백합아강(Liliidae), 종려아강(Arecidae), 닭의 장풀아강(Commelinidae)(Sitte, P., Ziegler, H., Ehrendorfer, F., Bresinsky, A., eds., 1998, Strasburger-Lehrbuch der Bontanik fur Hochschulen; 34. ed., Gustav Fischer Verlag, Stuttgart에 따른 아강)을 포함하는, 그러나 이에 한정되지 않는, 군 중에서 선택된다. 따라서, 본 발명에 따른 형질변환 식물은 사탕무우(Beta vulgaris), 사탕수수, 돼지감자(Jerusalem artichoke), 아라비돕시스(Arabidopsis), 해바라기, 토마토, 담배, 옥수수, 보리, 귀리, 호밀, 쌀, 감자, 평지(rape), 카사바, 상추, 시금치, 포도, 사과, 커피, 차, 바나나, 코코넛, 야자, 완두, 콩, 소나무, 포플러 및 유칼리나무를 포함하지만, 이에 한정되지 않는, 군 중에서 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 식물 세포를 본 발명에 따른 조절 인자로 형질전환시키는단계 및 그로부터 식물을 재생시키는 단계를 포함하는, 형질변환 식물, 특히Beta vulgaris속 식물의 생산 방법에 관한 것이다. 이러한 단계들은 표준적인 절차를 사용하여 수행한다.
서열 프로토콜은 다음을 포함한다:
SEQ ID NO:1 :Lycopersicon esculentum에서 유래된 SUT1 유전자의 인트론 1의 뉴클레오타이드 서열
SEQ ID NO:2 :Lycopersicon esculentum에서 유래된 SUT1 유전자의 인트론 2의 뉴클레오타이드 서열
SEQ ID NO:3 :Lycopersicon esculentum에서 유래된 SUT1 유전자의 인트론 3의 뉴클레오타이드 서열
SEQ ID NO:4 :Lycopersicon esculentum에서 유래된 SUT1 유전자의 3'-비번역 부위의 뉴클레오타이드 서열
SEQ ID NO:5 :Lycopersicon esculentum에서 유래된 SUT1 프로모터의 2.3 kb 뉴클레오타이드 서열
SEQ ID NO:6 :Arabidopsis thaliana에서 유래된 SUT4 프로모터의 3.1 kb 뉴클레오타이드 서열
SEQ ID NO:7 :Arabidopsis thaliana에서 유래된 SUT2 프로모터의 2.4 kb 뉴클레오타이드 서열
SEQ ID NO:8 :Arabidopsis thaliana에서 유래된 AAP3 프로모터의 2.5 kb 뉴클레오타이드 서열
SEQ ID NO:9 :Arabidopsis thaliana에서 유래된 AAP4 프로모터의 2.7 kb 뉴클레오타이드 서열
실시예 1
GUS 융합 시스템에 의한 수크로오스 수송체 LeSUT1의 발현 분석
식물체 내에서의 공간적 발현이 GUS (β-글루쿠로니다아제) 유전자 융합 시스템을 사용하는 프로모터-리포터-유전자-융합에 의하여 밝혀졌다(Jefferson et al. 1987, EMBO J. 6: 3901-3907). 우선, 토마토에서 유래되는 SUT1 유전자의 프로모터를 분리하였다.
프로모터-GUS 구조물의 제조를 위하여, EMBL-3 벡터(Clontech) 내의Lycopersicon esculentumcv. VFN8에서 유래된 게놈 DNA를 포함하는 게놈 라이브러리를 선별함으로써 LeSUT1의 게놈 클론을 분리하였다. 낮은 엄한 조건 하에서32P-표지된 StSUT1 프루브(감자, S olanum T uberosum에서 유래)의 혼성화에 의하여, 11 개의 양성 λ-파아지를 동정할 수 있다. 7 개의 가장 강력한 혼성화 파아지 분리물을 사용하여 제한 분석(restriction analysis)을 위한 평판 용해물(plate lysates)에 의해서 λ-파아지 DNA를 얻었다. 가장 강한 신호(10/1 및 2/2)를 나타내는 2 개의 파아지를 서던 블라트 분석법을 사용하여 보다 상세히 분석하였다. 게놈 클론의 제한 패턴과 비교하여, 프로모터 및 LeSUT1의 5'-부위를 포함하는 2.1 kb BamHI 단편을 분리했다. BamHI 단편을 pON 184 내로 클로닝하였고, 그 시퀀싱 결과는 LeSUT1 cDNA의 5'-말단과 일치함을 보여주었다. LeSUT1의 번역 개시는 상기 단편의 1693 자리에서 시작되었다. LeSUT1의 cDNA 개시와 비교하여 결정된 전사 개시는 LeSUT1의 첫 번째 ATG(단편의 1633 자리)인 -60 자리에서 시작되었다.
1.7 kb 프로모터-GUS 구조물을 제조하기 위하여 2.1 kb BamHI 클론을 사용하였다. LeSUT1의 N-말단 부위 내 적절한 절단 부위가 없기 때문에, LeSUT1의 첫 번째 ATG의 15 bp 하류에 SamI에 대한 절단 부위를 포함하고, SamI 부위 뒤쪽에 KpnI에 대한 절단부위를 포함하는 역 프라이머(reversed primer) 5'-GGGGTACCCGGGTGTACCATTCTCCATTTT-3'를 사용하는 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의하여 840 bp 프로모터 단편을 증폭시켰다. 정 프라이머(forward primer) 5'-CCGATATCTCAATTGGTT-3'는 2.1 kb 단편 내 887 자리에 위치하는 EcoRV 부의를 포함하였다. EcoRV/KpnI를 사용하여 PCR 산물을 LeSUT1 프로모터 부위의 5'-말단의 850bp BamHI/EcoRV 단편을 포함하는 pON184 내로 클로닝하였다. 그리고 나서, 1.7 kb 프로모터 단편을 BamHI/SamI을 사용하여 식물 바이나리 벡터(binary vector) pBI101.3 (Jefferson et al. 1987, EMBO J. 6: 3901-3907) 내로 클로닝하였다. 이러한 번역 융합의 리딩 프레임을 uidA (GUS) 유전자를 시퀀싱하여 확인하였다. 이러한 구조물에 있어서, 처음 5 개의 아미노산은 LeSUT1에 의하여 코딩되고, 그 다음 7 개 아미노산은 uidA 유전자가 뒤쪽에 있는 pBI101.3의 폴리링커에 의하여 코딩된다.
LeSUT1의 1.7 kb 프로모터 단편의 조절 하에서의 GUS의 발현은 형질변형 감자 및 토마토 식물체의 소스 잎 내의 관다발 조직에 한정된 동일 발현 패턴을 나타내었다. 예상 외로, 이러한 경우 GUS를 발현시키는 식물체의 비율이 낮았다. 감자 및 토마토 두 종에 있어서, GUS 발현을 나타내는 형질변환 식물의 비율은 단지 약 20%였다. 이는 프로모터-GUS 구조믈을 인핸서 가까이에 삽입시킨 위치 효과를 보여준다. 따라서, 1.7 kb 프로모터 그 자체는 낮은 활성을 갖는다. 게다가, 잎맥 내 블루 스테이닝법에 의하여 유래된 GUS의 강도는 강한 발현을 보이는 1 또는 2 개의 형질변환주를 제외하고는 예상 외로 낮았다. 소스 잎에서의 매우 강력한 SUT1 발현을 보여주는 노던 블라트 분석(Riesmeier et al. 1993, Plant Cell 5: 1591-1598)과 비교하여, SUT1 프로모터 조절하에서의 GUS 발현은 미약했다.
따라서, 1.7 kb 프로모터 단편 내에 억제 요소가 존재하는지, 또는 1.7 kb 프로모터 단편 내에 SUT1 발현을 담당하는 중요한 상류 cis 요소가 결여되었는지 여부를 시험하였다. 한편으로는, 보다 상류의 프로모터 서열을 분리하여 보다 큰2.3 kb 프로모터 구조물을 생성하고, 다른 한편으로는 1.7 kb 단편을 절단하여 1.5 kb 및 0.6 kb 프로모터 구조물을 형성하였다(도 1).
LeSUT1의 신장된 프로모터 부위를 분리하기 위하여, 2.1 kb BamHI 단편의 5'-말단의 DIG-표지 프로브 (Boehringer)를 상이한 제한 효소로 절단된 파아지 용해물 10/1 및 2/2의 DNA와 혼성화시켰다. 파아지 10/1 유래의 양성 0.8 kb EcoRI 단편을 pBlueskript SK+(Stratagene) 내로 클로닝시켰다. 이러한 단편의 시퀀싱 결과, 2.1 kb BamHI 단편의 5'-말단과 동일성을 나타내고, EMBL-3 벡터와는 상동성을 갖지 않는 것으로 나타났다.
1.5 kb 프로모터-GUS 구조물:
1.5 kb 프로모터-GUS 구조물을 제조하기 위하여, LeSUT1의 5'-말단으로부터 유래하는 0.2 kb Xbal 단편을 1.7 kb 프로모터-GUS 구조물로부터 제거하고, 남아있는 구조물을 다시 연결시켰다.
0.6 kb 프로모터-GUS 구조물:
0.6 kb 프로모터-GUS 구조물을 제조하기 위하여, LeSUT1의 5'-말단으로부터 유래하는 1.1 kb HindIII 단편을 1.7 kb 프로모터-GUS 구조물로부터 제거하고, 남아있는 구조물을 다시 연결시켰다.
2.3 kb 프로모터-GUS 구조물:
2.3 kb 프로모터-GUS 구조물을 제조하기 위하여, LeSUT1의 5'-부위로부터 유래하는 0.8 kb EcoRI 단편을 pBlueskript SK+의 EcoRI 부위 내로 클로닝하였다. 그리고 나서, 이러한 단편을 SalI/Xbal로 절단하고, SalI/Xbal 절단된 1.7 kb 프로모터-GUS 구조물 내로 클로닝시켰다.
이러한 프로모터-GUS 구조물의 발현이Nicotiana tabacum내에서 조사되었다. 상이한 식물 종 내에서의 프로모터 특이성은 유지된다.
아그로박테리움 매개 유전자 전달을 통하여 번역 프로모터-GUS 융합을Nicotiana tabacum의 게놈 내에 유도시켰다. 카나마이신 함유 배지 상에서의 식물의 선택적 재생 후, 멸균 배양물로부터 얻은 중간 식물 잎반(leaf discs)의 β-글로쿠로니다아제(GUS) 활성을 시험하였다.
표 1에 β-글로쿠로니다아제 활성을 보이는 식물의 비율을 나타내었다. 2.3 kb, 1.7 kb 및 0.6 kb 프로모터 구조물에 있어서, 상기 비율은 비숫하게 40 내지 50 %로 비슷하게 나타난다. 1.5 kb 프로모터 구조물을 포함하는 식물체에 있어서 발현이 가장 낮았다. 표준 스테이닝법의 강도는 X-Gluc 용액 내에서 2 일동안 배양 후의 모든 구조물에 있어서 매우 낮았다. 약한 블루 스테이닝법의 패턴은 4 개의 모든 구조물에 있어서 대부분 주요 잎맥에서 제한되었다.
형질전환 LeSUT1 프로모터-GUS 타바코 세포주에서의 β-글로쿠로니다아제 활성(X-Gluc 용액 내에서 2 일간 배양 후)
구조물 형질전환된 식물체 수 GUS-스테이닝을 나타내는 식물체 수 GUS-스테이닝을 나타내는 식물체 %
2.3P-GUS 41 16 39
1.7P-GUS 36 14 39
1.5P-GUS 31 5 16
0.6P-GUS 36 19 50
GUS 발현에 대한 LeSUT1의 3'UTR 및 유전자내 서열(인트론)의 영향
기대만큼 높은 β-글루쿠로니다아제 발현율 및 발현수준을 유발하는 결실 구조물은 없었다. 필요한 보다 더 상류 프로모터 서열의 부재는 아닌 듯하다. 대부분의 식물 유전자는 자기 자신의 발현을 위하여 보다 짧은 프로모터를 필요로 한다. LeSUT1의 경우 번역 개시부위의 하류쪽의 다른 서열이 충분한 유전자 발현을 위하여 필요하다는 것이 보다 확실해 보인다.
유전자 내 서열이 SUT1 발현에 역할을 하는지 여부를 알아내기 위하여 두 개의 추가적인 구조물을 제조하였다(도2). 하나의 구조물에는 LeSUT1의 종결 코돈 전에 위치하는 6 종결 아미노산의 전체 코딩 부위(인트론 포함)와 함께 가장 긴 프로모터 단편(23 kb)를 GUS 유전자에 융합시켰다. LeSUT1은 4 개의 엑손과 3 개의 인트론을 갖는다. 두 번째 구조물은 GUS 유전자와 노팔린 합성효소 종결부분(terminator) 사이에 위치하는 Lesut1의 3'UTR을 포함하는 약 1.2 kb 단편을 추가적으로 포함한다(도 2).
2.3 kb 프로모터-SUT1-GUS 구조물:
프로모터 부위 외에도 LeSUT1의 전체 게놈 서열을 포함하는 구조물을 제조하기 위하여, 1.5 kb 프로모터 부위를 포함하는 게놈 7.1 kb EcoRI 단편, SIT1 유전자(4 엑손 및 3 인트론)의 전체 게놈 서열 및 추가적인 상류 서열을 pBlueskript SK+내로 상기 벡터의 폴리링커의 SalI 부위로 오리엔테이션 된 프로모터 서열과 함께 클로닝시켰다. SUT1 종결 코돈 근처의 적절한 제한 부위가 없기 때문에, PCR에의하여 1.4 kb 단편을 증폭시켰다. 역 프라이머 LeSUT1-1394 rev (5'-GAAACCGCCCATCCCGGGTGGTGGTTTAG-3')는 SUT1 종결 코돈 앞에 SmaI 부위 18 BP를 포함하고, SUT1의 첫 번째 ATG 뒤의 2764 자리의 BclI 부위 앞의 두 번째 인트론 357 bp의 중간에 정 프라이머 LeSUT1-1394 for (5'-GTGGGCTTGTAAACGGTTGTAAGTCAC-3')을 설계하였다. 그리고 나서, 이와 같은 PCR 산물을 BclI 및 SmaI으로 절단하고 BclI및 SmaI로 절단된 pBlueskript SK+내의 7.1 kb EcoRI 내로 클로닝시켰다. 그리고 나서, 상기 클론에 대하여, LeSUT1 프로모터 부위의 5'-말단을 포함하는 0.8 kb EcoRI 단편을 EcoRI 부위에 클로닝시켰다. 2.3 kb프로모터 부위 및 LeSUT1의 종결 코돈 앞에 종결 6 아미노산 게놈 서열 을 포함하는 최종적인 6.0 kb 단편을 SalI 및 SmaI 절단 식물 바이나리 벡터 pBI101.3 내로 클로닝시켰다(Jefferson et al. 1987, EMBO J. 6: 3901-3907). 프라이머 5'uidA를 사용하는 SmaI 융합 부위 내로의 시퀀싱에 의하여 리딩 프레임이 유지되어 있음을 확인하였다.
2.3 kb 프로모터-SUT1-GUS-3'UTR 구조물:
EagI 부위를 포함하는 정 프라이머 5'-TTCCGGCCGAAAAAATTACAAAAGACGAGGAAG-3' 및 LeSUT1의 7.1 kb 게놈 EcoRI 클론 상의 SalI 부위를 포함하는 역 프라이머 5'-TACCGAGCTCCTAGGCGAGGTCGACGGTAT-3'를 사용하는 PCR에 의하여 LeSUT1의 3'UTR을 분리하였다. 1.2 kb 산물을 EagI/SalI로 절단하고 pBlueskript SK+내로 클로닝시켰다. 가능한 PCR 에러를 최소화하기 위하여, pBlueskript SK+내의 약 1 kb의 PCR 산물 C-말단 서열을 3' UTR의 212 자리를 절단하는 BstI 및 pBlueskript SK+내의 7.1 kb EcoRI 단편의 상류부분을 절단하는 SalI을 사용하여 7.1 kb EcoRI 클론 유래의 게놈 서열로 대체시켰다. 그리고 나서, 상기 단편을 EagI 및 EcoRI로 절단시켰다. EagI 부위의 5' 돌출부위(overhang)를 클레노우 효소(Klenow enzyme)를 사용하여 채워넣었다. 그리고 나서, 블런트 말단을 갖는 상기의 단편을 pBI101.3의 uidA 유전자와 nos 종결부분 사이의 SstI 부의 내로 클로닝시켰다.LeSUT1의 종결코돈 앞의 6 아미노산 종결 게놈서열 및 2.3 kb 프로모터 부위를 포함하는 6.0 kb 단편을 SalI 및 SmaI로 절단하고, 3'UTR 을 포함하는 pBI101.3 내로 클로닝시켰다.
Nicotiana tabaco 내의 β-글루쿠로니다아제 활성에 대한 LeSUT1의 3'UTR 및 유전자내 서열의 양적 효과
Nicotiana tabaco내로 GUS 융합을 도입시키고 멸균 배양물로부터 형질전환 타바코 식물체 내에서 처음으로 β-글루쿠로니다아제 활성을 분석하였다. 2.3P SUT1-GUS 구조물과 관련하여, 20 개의 형질전환 식물체를 얻었으며, 이 중에서 11 식물체는 GUS 발현을 나타내었다. 이들 55%의 형질전환 식물체는 모든 프로모터 결실 구조물로 형질젼환된 식물체에 비하여 평균적으로 확실히 보다 강력하고 보다 특이적인 블루 스테이닝을 나타내었다. 2.3P SUT1-GUS-3'UTR 구조물과 관련하여, 46 형질전환 식물체를 얻었으며, 이 중에서 36 식물체(78%)가 GUS 발현을 나타내었다. 이러한 식물체의 블루 스테이닝 강도로서 결정된 발현 수준은 평군적으로 가장 높은 것으로 보인다.
이러한 구조물에 대한 보다 높은 GUS 발현의 가시적은 효과를 정량화하기 위하여, 형질전환 식물체 내에서의 β-글루쿠로니다아제 효소 활성을 측정하였다(Jefferson et al. 1987, EMBO J. 6: 3901-3907). 이를 위하여, 2.3P-GUS, 2.3P-SUT1-GUS 및 2.3P-SUT1-GUS-3'UTR 구조물의 모든 형질전환 타바코 계통을 온실내로 전이(transfer)시켜 멸균 배양물 내의 조건과 비교하여 보다 생리학적인 조건 하에서 이들을 성장시킨다. 온실 내로의 전이 후 10 내지 12 주 후, 환전하게 성장한 소스 잎을 잎꼭지(petiole) 내의 입 기저 아래 약 1cm에서 식물체로부터 잘라내고 액체 질소에서 동결시켰다. 관다발 조직 및 엽육 조직(leaf mesophyll tissue)의 균등한 분포를 위하여, 우선 잎을 액체 질소 내에서 미세한 분말로 분쇄하였다. 그리고 나서 상기 분말의 일부를 표준 형광 GUS 측정법을 이용한 잎 내에서의 β-글루쿠로니다아제 활성 측정에 사용하였다.(Gallagher, S.R., 1992, in GUS protocols: Using the Gus gene as a reporter of Gene exression, Gallagher, S.R., (ed.), Academic Press, Inc., pp 47-59; Jefferson et al. 1987, EMBO J. 6: 3901-3907).
모든 식물체에 대한 평균 β-글루쿠로니다아제 활성(도 3A)으로서 활성을 측정하였고 그 값을 상이한 활성 간격으로 효소활성을 나타내는 식물체의 퍼센트로 결정하였다(도 3B).
2.3P-GUS 구조물에 대한 β-글루쿠로니다아제 활성을 약 50 pmol MU mg protein-1min-1이었다(도 3A). 식물체 내에서의 2.3P-SUT1-GUS 구조물을 포함하는GUS 활성은 평균 약 2 배 정도 높았으며, 2.3P-SUT1-GUS03'UTR 구조물에 있어서 활성이 약 120 pmol MU mg protein-1min-1정도로 평균적으로 가장 높은 활성을 나타내었다. 2.3P-SUT1-GUS 구조물과 비교한 이러한 구조물이 보다 높은 활성은 현저하지 않다(t-test, α=0.05). 그럼에도 불구하고, 가시적으로는 GUS 발현이 평균적으로 보다 강력한 것으로 보인다.
상이한 간력으로의 β-글루쿠로니다아제 활성 분포는 2.3P-GUS 식물체의 대다수(모든 식물체의 70%)가 0 내지 25 pmol MU mg protein-1min-1범위의 효소활성을 갖는다는 것을 보여준다. 2.3P-SUT1-GUS 식물체 분포는 대다수의 식물체(모든 식물체의 56%) 가 5 내지 150 pmol MU mg protein-1min-1사이의 활성을 나타내는 것으로 분명하게 바뀐다. 2.3P-SUT1-GUS-3'UTR 식물체의 대다수(모든 식물체의 65%)는 25-300 pmol MU mg protein-1min-1의 활성을 나타낸다.
이와 같이 사이한 구조물에 대한 상이한 효소 활성 분포는 LeSUT1 프로모터에 대한 엑손 및/또는 인트론 및 3'UTR의 강화 효과를 보여준다.
Nicotiana tabaco 내의 2.3P-SUT1-GUS-3'UTR의 이종(heterologous) 발현의 조직화학적 분석
2.3P-SUT1-GUS 및 3P-SUT1-GUS-3'UTR 타바코 세포주에서의 발현 페턴은 유사하였다. 36 개의 2.3P-SUT1-GUS-3'UTR 세포주 중에서 34 개가 다양한 강도를 갖는 동일한 발현 페턴을 나타내었다. 2 식물체는 상이한 스테이닝 패턴을 보였다. 11개의 2.3P-SUT1-GUS 세포주는 일반적으로 낮은 강도로 3'UTR 구조물와 동일한 평균 발현 패턴을 나타내었다.
멸균 배양물에서 자란 타바코 식물체의 잎에서의 발현 패턴은 단지 2.3 kb 프로모터 단편만의 조절하에서의 식물체 발현 GUS와 비교하여 분명하게 다르게 ㅏ나타났다. GUS 발현은 모든 잎의 잎맥, 모상체 및 공변세포에서 발견되었다. 주요 잎맥에서의 스테이닝은 잎맥 내에서 균일하게 분포하지 않았고, 스파트에 집중되는 것으로 보여진다. 온실에서 자란 식물의 잎 내 발현도 동일하였다.
관다발 조직에서의 GUS-발현을 얇은 단면에서 보다 더 조사하여 어떠한 세포 유형에 GUS 발현이 위치하는가를 결정하였다. GUS 스테이닝은 내부 체관에서 측정가능하며, 중앙 잎맥의 외부 체관에서는 보다 강력하게 나타났다. 중앙 잎맥의 종단면에 있어서, 스테이닝은 체관을 따라서 스파트 내에 집중되는 것으로 나타났다. 비주요(minor) 잎맥의 횡단면에 있어서, GUS 발현이 반세포에서 분명하게 측정되었다. 비주요 잎맥의 사요소에서는 GUS 발현이 관찰되지 않았다. 중앙 잎맥의 종단면에 있어서, GUS 발현이 반세포에서 강력하게 나타나고 핵 주변에 집중되는 것으로 나타났다. 몇 몇 경우, 사요소에서 약간의 스테이닝이 또한 측정되었다.
Nicotiana tabaco 내 LeSUT1의 2.3P-인트론-GUS-3'UTR의 이종 발현의 조직화학적 분석
LeSUT1 발현에 대한 인트론의 기능을 밝히기 위하여, 다른 구조물을 제작하였다(도 4). 고효율의 인트론 스플라이싱(splicing)을 위하여, 인트론 삽입을 위한 5'UTR을 선택하였다. 3'UTR의 강화 효과를 유지시키기 위하여, 3'UTR을 GUS 유전자와 노팔린 합성효소 종결부분 사이의 인트론 구조물 내에 위치시켰다. 필요한 XhoI 제한 부위의 도입 및 인트론 경계 서열의 유지로 인하여 LeSUT1의 5'UTR 내의 약간의 서열 변형이 일어났다.
인트론을 LeSUT1의 5'UTR에 삽입하기 위하여, 모든 인트론, 식물 바이나리 벡터, 2.3 kb 프로모터 단편, 또는 LeSUT1의 3'UTR에서 절단하지 않는 XhoI을 위한 제한 부위를 도입시켰다. PCR에 의하여, 미리 도입된 sMAi 부위 및, 보다 상류쪽으로, 3 개의 염기쌍 교환을 유발하는 XhoI 부위를 갖는 역프라이머 LeSUT1PXhoIrev (5'-TTTCCCGGGTGTACCATTCTCCATTTTTTTTTCTTCTAAGAAACTAAAATTGCTCGAGTTTAATTTTGGG-3') 및 uidA 유전자 내에서 두 번 절단하는 내인성 Bsp4107I 부위를 포함하는 정 프라이머 LeSUT1PXhoIfor (5'-GATAAATCAAGGTGATATATGTACATAC-3')를 사용하여 2.3 kb 프로모터의 3' 말단의 650 bp 단편을 증폭시켰다. 따라서, 그리고 나서, 상기 PCR 산물을 LeSUT1의 3'UTR을 포함하는 SalI/SmaI 절단 pBI101.3 벡터 및 2.3 kb 프로모터 단편의 절단된 5'SalI/Bsp1407I 단편과 함께 삼중 연결(triple ligation) 단계에 사용하였다.
PCR을 이용하여, 3 개의 인트론을 증폭시켰다. 양 말단에 XhoI 부위를 포함하는 다음의 프라이머를 사용하였다:
인트론 1에 대하여:
LeSUT1PXhoIfor 5'-GCTAATAACATGCTCGAGGTAATTTTCAAATCG-3'
LeSUT1PXhoIrev 5'-CCAGTAGTGCTCTGCTCGAGCCCTG-3'
인트론 2에 대하여:
LeSUT1PXhoIfor 5'-CCCTTGGTATTCCTCGAGCGGTGAGTTTC-3'
LeSUT1PXhoIrev 5'-CCAAAGCAAATGGAATACCTCGAGTTACCTG-3'
인트론 3에 대하여:
LeSUT1PXhoIfor 5'-CTTGCTATTGTTGTACTCGAGGTAC-3'
LeSUT1PXhoIrev 5'-CTTACTAGTGACCTCGAGATCTATATC-3'
그리고 나서, 인트론을 2.3 PXhoI-GUS-3'UTR 구조물의 XhoI 절단 5'UTR 내로 클로닝시켰다. 인트론의 정확한 방향을 시퀀싱을 통하여 확인하였다.
인트론 구조물에 더하여, XhoI 변형 5'UTR을 갖는 구조물을 또한 대조군으로서 타바코 식물체에 도입시켰다. 인트론 1 구조물과 관련하여, 30 개의 카나마이신 내성 식물체를 얻은 반면, 인트론 2 구조물에 대해서는 8 개, 인트론 3 구조물에 대해서는 20 개 및 대조군 구조물에 대해서는 24 개를 얻었다. 멸균 배양물에서 자란 식물체의 잎을 37 ℃ X-Gluc 용액에서 하룻밤동안 배양하였다.
인트론 3 구조물을 포함하는 17 식물체가 GUS 활성을 나타냈으며(=85%), 이 중에서 16 식물체에 있어서 모상체 내에서 블루 스테이닝이 배타적으로 측정되었다. 한 개의 식물체는 잎에서 전체적인 GUS 발현을 나타내었다. 인트론 2 구조물을 포함하는 6 개의 식물체가 GUS 발현을 나타내었다(=75%). 이들 식물체 중 6 개에 있어서 발현이 공변세포와 잎맥에 한정되었다. 2 개의 식물체는 스테이닝을 나타내지 않았다.
대조군 구조물로 형질전환된 타바코 세포주 중 7 개에 있어서, 약하고 비-특이적인 GUS 스테이닝이 관찰되었다. 일반적으로, 스테이닝 패턴은 2.3 P-GUS 구조물로 형질전환된 식물체와 유사하였다.
상기 결과는 인트론 3 및 인트론 2에 대한 명확한 강화 및/또는 공간적 조절 기능을 보여준다. 인트론 3의 존재는 모상체에서의 높은 수준의 유전자 발현을 유발하는 데 필요한 반면, 인트론 2는 잎맥 및 공변세포에서의 유전자 발현에 필요한 요소를 대표하는 것이다.
인트론 1은 유전자 발현에 대하여 부정적 효과를 유발하였다. 대조군 구조뮬로 형질전환된 24 식물체 중에서, 단지 7 개만이 GUS 스테이닝을 나타내었다(30%). 그러나, 인트론 1 구조물을 포함하하는 식물체(30 개) 중, 어느 것도 가시적인 GUS 스테이닝을 나타내지 않았다. 이는 인트론 1이 유전자 발현에 대하여 부정적 조절 효과를 갖는다는 것을 나타낸다. 따라서, 다른 유전자, 특히 존재하는 인트론 내로의 인트론 1의 도입은 발현을 하향-조절할 것이다. 이는 발현을 조절하는 ㅅㄴ규한 방법을 보여준다.
2.3P-GUS 구조물에 대한 대조군 구조물의 비교 가능한 발현은 XhoI 부위의 도입에 의한 5'UTR의 변형이 적어도 발현 수준에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여준다. 게다가, 이러한 결과는, 3'UTR이 프로모터와 조합된 상태로 2.3P-SUT1-GUS-3'UTR 구조물에 대하여 관찰되는 강력한 발현을 제공하는 데 충분하지 못하다는 것을 보여준다.
실시예 2
아라비돕시스(Arabidopsis) 내 프로모터-GUS 융합에 의한 스크로오스 수송체 유전자 SUT2의 발현 분석
AtSUT2의 프로모터를Arabidopsis thalianaCol-O 생태형의 게놈 DNA 상에서 Pfu-중합효소 및 프라이머 AtSUT2Prev (5'GTCCCCCGGGCAACACACAGATCCCTAATTCG-3')와 AtSUT2Pfor (2.2 kb 및 1.2 kb 프로모터 단편에 대하여, 각각 5'-ACGCTTGTCGACCCGGCTCTATCACGTTAACAC-3'5'-ACGCTTGTCGACCGTTTGAGAAATGACGAAGGAG-3')를 이용하여 중합효소 연쇄 반응(PCR) 시킴으로써 분리하였다.2.2 kb 및 1.2 kb 프로모터 단편을 pGPTV-HPT의 SalI/SmaI 부위 내로 클로닝시킴으로써, 전사 융합을 발생시켰다(Becker et al. 1992, Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197). 형질변환된 아그리박테리움(Agribacterium) GV2260을 사용하는 진공 침투(vacuum infiltration)에 의하여 아라비돕시스(Arabidopsis)를 형질전환시켰다(Clough and Bent 1998, Plant J. 16: 735-743). 1.2 kb 프로모터 구조물에 대한 10 개의 하이그로마이신 내성 형질전환체 세포주 중에서 9 개가 동일한 발현 패턴을 나타냈다. 2.2 kb 프로모터 구조물에 대해서는 2 개의 식물체 모두가 1.2 kb 프로모터 구조물과 동일한 발현을 나타내며 재생되었다.
어린 발아체(seedings) 및 식물체에 있어서, GUS 발현이 새싹과 뿌리의 모든 조직에서 발견되었다. 성숙한 온실 재배 식물에 있어서, 소스 잎에서의 GUS 발현이 주요 잎맥과 배수조직(hydathodes)에 한정되었다. 줄기에 있어서, GUS 발현이 측정되지 않았다. 꽃에서는 꽃받침, 꽃밥, 암술의 암술머리 및 꽃자루에서 GUS 발현이 관측되었다.
실시예 3
프로모터-GUS 융합에 의한 아라비돕시스 내 AtSUT4의 발현 분석
식물체 내의 AtSUT4 발현을 분석하기 위하여, 프로모터를 분리하고 GUS 리포터 유전자에 융합시켰다(Jefferson et al. 1987, BMBO J. 6: 3901-3907). 3.1 kb, 2.2 kb 및 1.1 kb 단편을 Pfu 중합효소를 사용하여Arabidopsis thalianaCol-O의 게놈 DNA 상에서 중합효소 연쇄 반응에 의하여 분리하고 식물 바이나리 벡터 pGPTV-HPT 내 GUS 유전자에 전사적으로 융합시켰다(Becker et al. 1992, Plant Mol. Biol. 20:1195-1197). 프로모터 단편의 분리를 위하여, 다음의 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로서 사용하였다:
AtSUT4Prev 5'-TCCCCCGGGCTCGCTTCACAGTCGTCGTGGCGTAG-3'
AtSUT4P3.1kbfor 5'-GTTTGTTGTCGACGGGCGAAATCTCGCATAACTTC-3'
AtSUT4P2.2kbfor 5'-ACGGTCGACAGGGTCGCATCTCGATATTATGG-3'
AtSUT4P1.1kbfor 5'-ACGCTTGTCGACGACCCGGTGAGTAATTGAACGC-3'
3.1P-GUS 구조물에 대하여, 17 식물체가 하이그로마이신 함유 배지 상에서 재생되었고, 이들 중 14 개가 동일한 GUS 발현을 나타냈으며, 2.2P-GUS 구조물에 대해서는 12 식물체를 얻었는데, 이들 중 8 개가 동일한 GUS 발현을 나타내었다. 3.1P-GUS 및 2.2P-GUS 구조물에 대한 발현 패턴은 동일하였다. 1.1P-GUS 구조물에 대해서는 어떠한 형질전환체도 얻어지지 않았다.
발아중인 종자 및 매우 어린 발아체에 있어서, GUS의 전체적인 발현이 발견되었다. 발생중인 어린 식물체에 있어서, 스테이닝이 싱크 잎 및 총생(rosette)의 중심부에서 가장 높은 활성을 나타내며 보다 특이적으로 나타났으며, 소스 잎으로의 전이 후, 발현이 비주요 잎맥에 제한되어 나타났다. 이러한 발현 패턴은 소스잎의 모든 잎맥에서의 발현을 유발하는, 토마토 유래 LeSUT1과 대조적인 것이다.
화서(inflorescence)에 있어서, 발생중인 꽃의 꽃밥과 암술 내에서 GUS 활성이 발견되었다. 개화기에는 스테이닝이 꽃밥에 제한되어 나타난다. 성숙한 꽃에서는 GUS 활성이 잘 관찰되지 않는다. 수분 후, 발생중인 장각과 식물 전체에 걸쳐서 GUS 활성이 발견되었으며, 주병(funiculi) 및 안에서 자란 화분관에서 상대적으로 강하게 나타났다.
일반적으로, 꽃과 열매에서의 GUS 활성은 높은 특이성 없이 아직도 발생중에 있는 성장중인 기관에 제한되며, 성장중인 싱크 기관에 있어서의 싱크 세포로의 직접적인 수크로오스 흡수에 대한 AtSUT4의 역할을 보여준다.
분지의 엽액(axils) 내에서를 제외하고는 줄기에서의 GUS 활성은 전혀 발견되지 않았다. GUS 활성은 식물 총생의 중앙에서의 발생을 통하여 가장 강력하게 유지되었다.
뿌리에서의 GUS 발현은 측생 뿌리 개시부 지점에서 가장 강력하였다. 또한, GUS 활성은 측생 뿌리의 분지에서 보다 강력한 활성을 가지며 관다발계에서 관측되었다.
실시예 4
프로모터-GUS 융합에 의한 아라비돕시스 내 AtAAP3의 발현 분석
AAP3의 발현 패턴을 조사하기 위하여, 7 kb AAP3 프로모터를 GUS 유전자에 융합시키고, 타바코 내로 도입시켰다(Fischer et al. 1995, J. Biol. Chem. 270: 16315-16320, Fischer 1997, Dissertation, Eberhard-Karls University.Tuebingen). 그러나, GUS 활성의 발현은 안정적이지 않으며, 대부분의 형질전환 세포주는 전혀 스테이닝을 나타내지 않는다. 이는 사용된 프로모터의 길이 때문이다. 따라서, AAP3 프로모터의 3.5 kb 및 1.5 kb를 운반하는 두 개의 프로모터-GUS 융합 구조물ㅇ르 제조하였다. 아라비돕시스(Arabidopsis) 및 니코티아나(Nicotiana) 식물체를 이들 구조물로 형질전환시켰다. 3.5 kb (1.5P-GUS) 및 1.5 kb (3.5P-GUS) 프로모터-GUS 융합 구조물로부터 각각 형질전환주를 얻고 분석하였다. 또한, 전사 개시부로부터 상류의 뉴클레오타이드 서열 2.5 kb를 시퀀싱하였다.
아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 형챌변환주 유래의 발아체 내 GUS 활성은 주로 뿌리 관다발 조직, 자엽 및 수술 끝에서 발견된다. 1.5P-GUS 식물체 및 3.5P-GUS 식물체 모두에 있어서, GUS 활성이 뿌리 관다발 조직에서 나타났다. 그러나, 3.5P-GUS 식물체 계통과 비교하여, 1.5P-GUS 식물체 계통은 뿌리 관다발 조직에서 보다 강한 활성을 보였다. 보다 상세하게 조직 특이성을 조사하기 위하여, 3.5P-GUS 식물체 유래의 뿌리를 레진에 넣었다. 뿌리의 횡단면은 GUS 스테이닝이 중앙 실린더의 세포에서 나타남을 보여주었다. 물관부에서는 어떠한 스테이닝도 관찰되지 않았다. 또한, 꽃 내: 필라멘트 끝에서 GUS 활성이 관찰되었다. 이러한 발현 패턴에 대하여, 1.5P-GUS와 3.5P-GUS 식물체 사이의 어떠한 중대한 차이점도 발견되지 않았다. 흥미롭게도, 수술에서의 GUS는 발생의 초기 단계에서는 발견되지 않는다. 이는 스미스 분류(Smith's Classification)에 따른 13 단계 이후에 가시화되었다.
아라비돕시스에 있어서, 열개(dehiscence)는 일반적으로 개화 직전의 13 단계에서 일어난다. 레진에 넣어 둔 12 단계의 꽃의 횡단면은 열개되지 않은 수술의 필라멘트에서 GUS 활성이 나타났다. 이러한 결과는 상기 발현이 열개 약간 전에 유도된다는 것을 보여준다.
엽원판법(leaf disc method)를 이용하여 타바코(Nicotiana tabacum) 식물체를 아그로박테리움으로 형질전환시켰다. 1.5P-GUS 구조물에 대하여 110 세포주, 3.5P-GUS 구조물에 대해서는 76 세포주를 얻었다. 양 세포주들(1.5P-GUS 계통 중 13 개 및 3.5P-GUS 계통 중 5개) 유래의 뿌리를 스테이닝시켰다. 아라비돕시스 식물체에서 보여지는 바와 같이, 두 구조물 사이의 상이한 GUS 활성이 타바코 계통의 뿌리에서도 관찰되었다. 1.5P-GUS 식물체는, 심지어 페로/페리(ferro/ferri) 시아나이드 3 mM/o.5 mM 조건에서 하룻밤 동안 배양시키는 경우에도, 뿌리에서 어떠한 스테이닝도 관찰되지 않았다. 반면, 3.5P-GUS 식물체의 모든 세포주는 관다발 스트랜드에서 스테이닝을 나타내었다. 상세한 분석을 위하여, 스테이닝된 뿌리를 레진에 넣어 두었다. GUS 스테이닝은 뿌리의 체관부에 위치하였다.
3.5P-GUS를 발현시키는 형질전환 아라비돕시스 및 타바코 식물체는 뿌리의 관다발 조직에서 1.5P-GUS 식물체보다 강력한 GUS 활성을 나타내었다. 따라서, 3.5 kb 프로모터가 1.5 kb 프로모터-GUS 부위에 존재하지 않는 인핸서 모티프를 가지고 있다고 결론지을 수 있다.
AAP3 프로모터-GUS의 연구 결과 AAP3 이 아라비돕시스 뿌리의 관다발 조직에서 발현된다는 것이 밝혀졌다. 3.5P-GUS 타바코 식물체에 있어서, GUS 활성은 체관에서 발견된다. 이는 체관부 내로의 아미노산 로딩에 있어서의 이들의 역할을 보여주는 것이다.
AAP3의 프로모터-GUS 분석은 또한 AAP3이 수술의 결합조직에서 특이적으로 발현된다는 것을 보여준다. 흥미롭게도, 리포터 유전자의 발현이 열개 약간 직전에 유도되었다. 열개는 일반적으로 탈수 과정(desiccation process)로 간주된다. 보다 개연성 있게는, 열개는 단순한 탈수의 결과인 것 보다 미세하게 조절되는 과정인 것으로 보인다. 이러한 조절은 몇 몇 유전자의 전사 조절을 포함할 수 있다. 당, 프롤린 및 베타인과 같은 삼투압적 활성 화합물의 축적을 가속화하여 꽃밥 벽으로부터의 물의 유출을 유발하고, 열개를 촉진시킨다. APP3이 프롤린 및 식물체 내에서 주요한 삼투분해물로 알려진 다른 적절한 용질을 인지함을 고려하면, 이는 또한 결합조직에서의 삼투압적 활성 성분의 축적에 역할을 하며, 열개를 촉진시킬 수 있다. AAP3은 또한 더 이상 아미노산을 필요로 하지 않는 열개된 꽃밥으로부터 아미노산을 회수할 수 있다.
실시예 5
프로모터-GUS 융합에 의한 아라비돕시스 내 AtAAP4의 발현 분석
AAP4의 발현 패턴을 연구하기 위하여, Pfu-중합효소(Stratagene, USA)를 이용하는 아라비돕시스 게놈 DNA 상에서의 중합효소 연쇄반응에 의하여 2.5 kb 프로모터 부위를 분리하였다. 아라비돕시스 식물체를 형질전환시키고 GUS 발현을 분석하였다.
68 개의 형질전환체(pGPTV-HPT 유래 2 세포주, pGPTV-BAR 유래 66 세포주)를 얻었다. 이들 형질전환체에서 유래한 기관을 취하고, 3 mM/o.5 mM 농도의 페로/페리 시아나이드 내에서 하룻밤 동안 스테이닝하였다. GUS 스테이닝은 주로 성숙한 꽃의 꽃받침, 꽃밥 및 잎의 관다발 조직에서 관찰되었다.
GUS-스테이닝은 잎의 관다발 조직에서 관찰되었다. 어린 잎의 관다발 조직에서는 GUS 활성이 관찰되지 않았다. 중간-크기의 잎에서는 잎 끝의 주요 잎맥에서 GUS 활성이 나타났다. 따라서, 융합 유전자의 발현은 발생적으로 상향조절되는 것처럼 보이며, 싱크-소스 번역을 뒤따른다. 성숙한 잎의 절편은 GUS 스테이닝이 체관부에서 관찰됨을 보여주었다. 꽃받침과 꽃잎의 관다발 조직은 GUS 활성을 나타내었다. 꽃밥 조직은 강한 GUS 활성을 나타내었다. GUS 활성은 이미 발생 초기 단계에서 관찰되었다. 꽃 발생의 추기 단계에 있어서, 꽃밥 조직은 더이상 GUS 활성을 나타내지 않았다. 그러나, 성숙한 꽃에서 방출된 화분립은 약한 스테이닝을 보였다.
GUS 유전자를 발현시키는 조직을 조사하기 위하여, 꽃밥 조직에서 강력한 스테이닝을 나타내는 어린 꽃을 레진에 넣고, 분할하였다. 화분립과 융단 조직 모두에서 GUS 스테이닝이 발견되었다. 웅단 조직은 그들의 생존 전체에 걸쳐서 GUS 활성을 갖는 것으로 보인다. 화분립에서의 GUS-발현은 보다 복잡해 보인다. 4분자(tetrad) 소포자는 스테이닝을 나타내었다. 발생 후기에는 GUS 활성이 관찰되지 않았다. 그러나, 성숙한 꽃밥에서 방출된 화분립은 GUS 활성을 나타내었다. 시험 대상인 3개 세포주 모두에 있어서, 뿌리 관다발 조직은 GUS 활성을 나타내며, GUS 활성은 관다발 조직에 한정되었다.
AAP4-GUS 융합 유전자를 발현시키는 아라비돕시스 식물체는 화분과 융단 조직에서 GUS 활성을 나타내었다. AAP4 유전자의 프로모터 분석 결과, 토마토 lat52 프로모터에서 발겨노디는 미량 화분-특이적 조절인자와 높은 상동성을 갖는다는 것이 밝혀졌다. lat52 경우에서와 같이, AAP4의 몇몇 알려지지 않은 도메인이 화분-특이적-인자-유사 서열과 협력하여 화분에서의 AAP4 발현은 조절할 수 있다. 게다가, lat52 프로모터-GUS 연구는 융단 조직에 있어서의 약한 발현을 보여준다. 따라서, 새로운 cis-요소가 융단 조직에서의 발현을 가능하게 하는 AAP4 프로모터 내에 존자할 것이다.
AAP4 프로모터-GUS 융합 유전자를 발현시키는 아라비돕시스 식물체는 성숙한 잎의 주요 잎맥에서 GUS 활성을 나타내었다. 현미경 분석 결과, GUS 스테이닝이 체관부에 한정되어 나타남이 밝혀졌고, 이는 체관부에서의 AAP4 발현을 나타내는 것이다.AAP4는 또한, 체관부/물관부 경계에서, 아미노산을 물관에서 체관 내로 수송하는 기능을 할 수 있다.
AAP4 발현은 APP4 프로모터-GUS 식물체의 융단 조직 및 화분립에서 관찰되었다. 급속한 성장 때문에, 화분은 영양상의 아미노산을 대량으로 필요로 한다. 게다가, 특성 프롤린과 같은 아미노산은, 아마도 삼투 분해물로서, 화분에 축적된다고 알려져 있다. 따라서, 발생중인 화분립은 전체 식물체에 있어서, 주요한 아미노산 싱크일 수 있다. 따라서, AAP4는 화분립으로의 아미노산 로딩을 담당하는 유력한 후보이다.
융단 조직 또한 APP4 2.5 kb 프로모터-GUS 식물체에서 강한 GUS 활성을 나타내었다. 융단 조직은 일차적 기능이 양분 제공인 세포질이 풍부한 세포로 구성되며, 반복된 수직 세포 분열에 의하여 일차 벽으로부터 형성된다. 따라서, 융단 조직은 발생을 유지하기 위하여 영양상의 아미노산을 필요로할 것이며, APP4는 아미노산을 융단 조직 내로 이동시킬 것이다.
본 발명은 식물의 유전자 발현을 강화시키거나 억제하는 조절 인자 및 이를 이용한 형질전환 식물체를 제공하여, 식물체 특정 조직 및 기관에 있어서 당, 아미노산 및/또는 단백질, 또는 오일의 함량을 증가시키는데 사용된다.

Claims (32)

  1. 프로모터 및, 수크로오스 수송체 유전자의 비-암호화 부위를 포함하는 뉴클레오타이드 인핸서 및/또는 리프레서 서열인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 형질전환 식물체 내 유전자 발현의 변형을 위한 조절 인자.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 인핸서 및/또는 리프레서 서열이Lycopersicon esculentum로부터 유래되는 조절 인자.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 리프레서 서열이 SUT1 유전자의 인트론 1로부터 유래되는 조절 인자.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 인핸서 서열이 SUT1 유전자의 인트론 2 및/또는 인트론 3으로부터 유래하는 조절 인자.
  5. 제 3 항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 리프레서 서열이 SEQ ID NO:1의 서열, 또는 SEQ ID NO:1과 상보적인 서열을 포함하거나, SEQ ID NO:1의 뉴클레오타이드 서열과 혼성화하는 것인 조절 인자.
  6. 제 4 항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 인핸서 서열이 SEQ ID NO:2의 서열,또는 SEQ ID NO:2와 상보적인 서열을 포함하거나, SEQ ID NO:2의 뉴클레오타이드 서열과 혼성화하는 것인 조절 인자.
  7. 제 4 항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 인핸서 서열이 SEQ ID NO:3의 서열, 또는 SEQ ID NO:3과 상보적인 서열을 포함하거나, SEQ ID NO:3의 뉴클레오타이드 서열과 혼성화하는 것인 조절 인자.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, SUT1 유전자의 3' 비번역 부위의 뉴클레오타이드 서열을 추가적으로 포함하는 조절 인자.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 3' 비번역 부위의 뉴클레오타이드 서열이 SEQ ID NO:4의 뉴클레오타이드 서열, 또는 SEQ ID NO:와 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, SEQ ID NO:의 뉴클레오타이드 서열과 혼성화하는 것인 조절 인자.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터가 SUT1, SUT2, SUT4, AAP3 및 AAP4 유전자의 프로모터 중 하나인 조절 인자.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 프로모터가 다음을 포함하는 조절 인자:
    a) SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, 또는 SEQ ID NO:9의 뉴클레오타이드 서열, 또는
    b) SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, 또는 SEQ ID NO:9의 뉴클레오타이드 서열과 상보적인 뉴클레오타이드 서열, 또는
    c) SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, 또는 SEQ ID NO:9의 뉴클레오타이드 서열과 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열.
  12. SUT1, SUT2, SUT4, AAP3 및 AAP4 프로모터를 포함하는 프로모터 군 중에서 선택되는 프로모터 중 하나이며, 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 조절 인자에 사용되는 프로모터.
  13. 제 12 항에 있어서, 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 조절 인자에 사용되는 프로모터로서,
    a) SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, 또는 SEQ ID NO:9의 뉴클레오타이드 서열, 또는
    b) SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, 또는 SEQ ID NO:9의 뉴클레오타이드 서열과 상보적인 뉴클레오타이드 서열, 또는
    c) SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, 또는 SEQ ID NO:9의 뉴클레오타이드 서열과 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로모터.
  14. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 조절 인자를 포함하는 벡터 또는 가동 유전 요소.
  15. 제 14 항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  16. 박테리아 세포, 효모 세포 또는 식물 세포인 숙주 세포.
  17. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 조절 인자로 형질절환된 식물체 및 상기 식물체의 일부분.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 식물체가 소나무아강(Pinidae), 목련아강(Magnoliidae), 미나리아재비아강(Ranunculidae), 석죽아강(Caryophyllidae), 장미아강(Rosidae), 국화아강(Asteridae), 천남성아강(Aridae), 백합아강(Liliidae), 종려아강(Arecidae), 닭의 장풀아강(Commelinidae)을 포함하는 식물 군 중에서 선택되는 형질전환 식물체.
  19. 제 17 항 또는 제 18 항에 있어서, 상기 식물체가 사탕무우(Beta vulgaris), 사탕수수, 돼지감자(Jerusalem artichoke), 아라비돕시스(Arabidopsis), 해바라기, 토마토, 담배, 옥수수, 보리, 귀리, 호밀, 쌀, 감자, 평지(rape), 카사바, 상추, 시금치, 포도, 사과, 커피, 차, 바나나, 코코넛, 야자, 완두, 콩, 소나무, 포플러 및 유칼리나무를 포함하는 식물 군 중에서 선택되는 형질전환 식물체.
  20. 제 17 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 따른 식물의 종자.
  21. 프로모터를 강화하기 위한 제 1 항 내지 제 11 항에 기재된 바와 같은 뉴클레오타이드 인핸서 서열의 용도.
  22. 프로모터를 억제하기 위한 제 1 항 내지 제 11 항에 기재된 바와 같은 뉴클레오타이드 리프레서 서열의 용도.
  23. 식물 유전자의 발현을 강화하거나 억제하기 위한 제 1 항 내지 제 11 항 주 어느 한 항에 따른 조절 인자의 용도.
  24. 제 23 항에 있어서, SUT1, SUT2, SUT4, AAP3 또는 AAP4 유전자의 발현을 강화하거나 억제하기 위한 용도.
  25. 제 23 항 또는 제 24 항에 있어서, 식물체 내에서의 이산화탄소의 흡수(uptake)를 강화시키기 위한 용도.
  26. 제 23 항 또는 제 24 항에 있어서, 식물 성장을 강화시키기 위한 용도.
  27. 제 23 항 또는 제 24 항에 있어서, 식물체 내에서의 수크로오스 체관부 로딩능력을 강화시키기 위한 용도.
  28. 제 23 항 또는 제 24 항에 있어서, 식물 조직 또는 기관 내 당 함량을 증가시키기 위한 용도.
  29. 제 23 항 또는 제 24 항에 있어서, 식물 조직 또는 기관 내 아미노산 및/또는 단백질 함량을 증가시키기 위한 용도.
  30. 제 23 항 또는 제 24 항에 있어서, 식물 조직 또는 기관 내 오일 함량을 증가시키기 위한 용도.
  31. 식물 세포를 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 조절 인자로 형질전환시키고 그것으로부터 재생시키는 단계를 포함하는, 형질전환 식물, 특히Beta vulgaris속의 형질전환 식물의 제조방법.
  32. 제 31항에 있어서, 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 조절 인자의 조절 하에서 한 가지 이상의 SUT1, SUT2, SUT4, AAP3 또는 AAP4 유전자를 발현시키는, 형질전환 식물의 제조방법.
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