KR20240023262A - 체관 발달을 조절하는 토마토 유래 SlJUL 유전자와 이의 용도 - Google Patents

체관 발달을 조절하는 토마토 유래 SlJUL 유전자와 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 식물의 영양 저장 조직(sink tissue)의 영양 저장 능력(sink strength) 증진용 조성물에 관한 것이다. 본 발명을 통해 제공되는 조성물은 SlJUL 단백질 또는 SlJUL 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 억제함으로써, 체관부 세포 수 및 체관 수송 속도를 증가시킬 수 있다. 따라서, 본 발명에 의할 경우 농작물의 생산성 및 수확성을 증가시키는 데에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

체관 발달을 조절하는 토마토 유래 SlJUL 유전자와 이의 용도 {Tomato-derived SlJUL gene regulating phloem development and uses thereof}
본 발명은 체관 발달을 조절하는 토마토 유래 SlJUL 유전자와 이의 용도에 관한 것이다.
대기 중 이산화탄소 농도의 증가로 인한 범지구적 이상 기후에 의한 피해가 증가하고 있으며, 이에 따른 2015년 195개 국가가 참여한 이산화탄소 배출 규제를 위한 파리협약은 대기 중 이산화탄소 농도 조절이 인류의 생존을 위해 얼마나 중요한 문제인지를 보여준다. 광합성을 통한 이산화탄소의 탄소 화합물로의 전환 과정은 지구 탄소 순환계를 구성하는 핵심 기작이며, 지구 생태계에서 태양으로부터 얻는 빛에너지를 유기에너지로 전환시키는 1차 생산과정이다. 더욱이, 독립 영양 생물인 식물의 발달과 성장의 근본 원리를 이해하고 응용하는 것은 인간 개개인의 생존이 아닌 인류의 지속적 생존을 위해 필수적인 부분이다. 이에, 종래에는 탄소 동화 효율 및 작물 생산성 증대를 위한 전략으로 광합성에 관여하는 효소의 활성을 증가시키거나 광합성 산물의 운반체 단백질의 발현을 증대시키는 방법들이 시도되어왔다. 이러한 방법들에 더하여 광합성 산물의 이동 통로가 되는 체관의 수송 용량을 증대시키는 방법 역시 중요한 전략이 될 수 있다.
체관부(Phloem)는 관다발식물(vascular plants)에서 살아있는 도관으로, 광합성 산물, 호르몬, mRNA, 단백질과 같은 거대분자의 이동통로로써 식물의 발달에서 중요한 기능을 하며, 특히 광합성 산물을 저장하고 이용하는 저장 기관의 발달 및 조절에 주요하게 작용한다. 체관부의 분화는 (전)형성층이라고 불리는 분열세포로부터의 비가역적인 세포 리프로그래밍을 수반하며, 이러한 변화에서 핵을 포함한 세포내 소기관의 선택적 퇴화, 세포벽 재구성 및 액포막 파괴가 전사적 케스케이드를 위한 신호의 조절을 통해 일어난다. 체관부 세포의 운명이 결정된 후, 체관부 초기 세포는 사관절로 발달하기 위해 핵이 제거되고 이들이 결합되어 체관을 형성한다. 세포가 전사 능력을 잃어 감에 따라 식물에서 체관부 네트워크를 구축하기 위해서는 전사 후 조절 과정이 필요할 수 있다. 그러나 체관부 분화의 근원이 되는 전사 후 조절 기작은 알려져 있지 않으며, 공급-수용 관계를 형성하는데 미치는 영향은 명확히 규명되어 있지 않다.
이에 따라 국내외에서 체관 분화에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있고, 체관 분화 조절 기작에 대한 지식도 점차적으로 확대되고 있다. 보다 구체적으로, 2003년 체관 발달 조절 유전자인 ALTERED PHLOEM DEVELOPMENT(APL)의 발견을 통해 체관 분화 기작에 관한 연구가 시작되었고(Bonke et al., 2003), 근래에는 APL의 하위 조절유전자로 하위 전사 인자인 NAC45/86과 체관 분화 중 발생하는 핵 제거에 관여하는 NEN1-4가 동정되었다. 이와 더불어 OCTOPUS와 BIN2, CVP2와 CVL1, BRX, BAM3, CLE45 등의 주요 체관 발달 조절 인자들이 동정되었다. 그러나 지금까지 인류가 체관 발달을 인위적으로 조절하기에 적합한 유전자는 발견되지 않았다. 이에, 본 발명은 체관 발달을 조절할 수 있는 유전자를 이용함으로써 식물의 영양 저장 조직으로의 영양 저장능력을 증가시켜 궁극적으로 작물의 생산성을 높이는 방법을 제시하고자 한다.
일 양상은 SlJUL 단백질 또는 SlJUL 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 억제제를 포함하는, 식물의 영양 저장 조직(sink tissue)의 영양 저장 능력(sink strength) 증진용 조성물로서,
상기 발현 억제제는 (a) SlJUL 단백질 또는 SlJUL 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 VIGS(virus-induced gene silencing) 벡터;
(b) SlJUL 돌연변이 단백질 또는 SlJUL 돌연변이 유전자를 포함하는 벡터; 및
(c) SlJUL 단백질 또는 SlJUL 단백질을 코딩하는 유전자를 편집하는 CRISPR/Cas9 벡터로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것인, 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 조성물을 식물체에 처리하는 단계;를 포함하는, 식물의 영양 저장 조직(sink tissue)의 영양 저장 능력(sink strength)을 증진시키는 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 방법에 따라, 영양 저장 조직(sink tissue)의 영양 저장 능력(sink strength)이 증진된 식물체를 제공하는 것이다.
본 발명은 SlJUL 단백질 또는 SlJUL 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 억제제를 포함하는, 식물의 영양 저장 조직(sink tissue)의 영양 저장 능력(sink strength) 증진용 조성물로서,
상기 발현 억제제는 (a) SlJUL 단백질 또는 SlJUL 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 VIGS(virus-induced gene silencing) 벡터;
(b) SlJUL 돌연변이 단백질 또는 SlJUL 돌연변이 유전자를 포함하는 벡터; 및
(c) SlJUL 단백질 또는 SlJUL 단백질을 코딩하는 유전자를 편집하는 CRISPR/Cas9 벡터로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것인, 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 (a) 벡터, (b) 벡터 및 (c) 벡터로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 벡터를 사용하는 경우, SlJUL 단백질 또는 SlJUL 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 억제함으로써, 식물의 영양 저장 조직(sink tissue)의 영양 저장 능력(sink strength)을 증진시킬 수 있고, 식물의 생산성 및 수확성을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 식물의 영양 저장 조직은 종자, 과실, 꽃, 뿌리 및 괴경(tuber)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있고, 구체적으로 과실일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 SlJUL 단백질은 애기장대에서 체관(phloem) 발달의 음성 조절자 기능을 수행하는 AtJUL1의 이종상동체(orthologue)로, SMXL5(SUPPRESSOR OF MAX2 1-LIKE5) mRNA의 5’UTR(Untranslated region)에 결합하여 RNA G-사중체(quadruplex)를 형성함으로써 상기 SMXL5의 발현을 억제할 수 있으며, 토마토의 체관 발달에서 음성 조절자 기능을 수행할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 SlJUL 단백질 또는 SlJUL 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 억제제는 토마토의 체관 발달에서 음성 조절자 기능을 수행하는 SlJUL의 발현을 억제함으로써, 체관 세포의 수 및 체관 수송 능력을 증가시킬 수 있다. 따라서, 상기 발현 억제제는 식물의 영양 저장 능력을 증진시키고, 식물의 생산성을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 발현 억제제는 VIGS 벡터, 돌연변이 단백질 또는 유전자를 포함하는 벡터, RNAi 벡터 또는 CRISPR/Cas9 벡터일 수 있고, 구체적으로 VIGS 벡터일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 (a) 벡터는 SlJUL 단백질 또는 SlJUL 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하여 VIGS(virus-induced gene silencing)를 통해 SlJUL 단백질 또는 SlJUL 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 억제할 수 있고, 식물의 영양 저장 능력 및 생산성을 증가시킬 수 있다.
상기 용어 "VIGS"는 바이러스 벡터에 외래 유전자를 도입하여 식물체에 접종할 경우, 전사 후 유전자 침묵 현상과 유사한 기작에 의해 도입 유전자 및 도입 유전자와 상동성 있는 내생 유전자의 발현이 억제되는 현상을 의미한다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 VIGS에 사용되는 바이러스 벡터는 TRV(Tobacco rattle virus) 벡터, CMV(Cucumber mosaic virus), PVX(Potato virus X)일 수 있고, 상기 (a) 벡터는 TRV에 SlJUL 유전자가 도입된 TRV-SlJUL 재조합 벡터일 수 있다.
상기 용어 "벡터"는 외래 유전자를 표적하는 세포로 전달하여 발현하는 수단을 의미하며, DNA를 복제하며 숙주 세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 벡터는 플라스미드, Ti-플라스미드, 코스미드, 인공 염색체, 리포솜, 바이너리 벡터, 이중 가닥 식물 바이러스 벡터(예를 들어, CaMV), 단일 가닥 바이러스 벡터 또는 비완전성 식물 바이러스 벡터일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 (b) 벡터는 SlJUL 돌연변이 단백질 또는 SlJUL 돌연변이 유전자를 포함할 수 있다. 상기 (b) 벡터는 SlJUL 돌연변이 단백질 또는 SlJUL 돌연변이 유전자를 발현함으로써, SlJUL의 우성-음성(Dominant-Negative)으로 작용하여, 체관 세포 수 및 체관 수송 능력을 증가시킬 수 있고, 식물의 영양 저장 능력 및 생산성을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 돌연변이는 염기의 삽입(insertion), 결실(deletion) 또는 치환(substitution)에 의해 발생할 수 있고, 점 돌연변이 또는 격자 이동 돌연변이일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 (b) 벡터는 SlJULR20/81/151A 단백질 또는 SlJUL R20/81/151A 유전자를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 (c) 벡터는 SlJUL 단백질 또는 SlJUL 단백질을 코딩하는 유전자를 편집하는 CRISPR/Cas9 벡터일 수 있다. 상기 (c) 벡터는 crRNA(CRISPR RNA) 및 tracrRNA(transactivating crRNA)를 포함하는 sgRNA(single guide RNA), Cas9(CRISPR associated protein 9) 단백질 또는 Cas9 단백질을 코딩하는 유전자 및 SlJUL 단백질 또는 SlJUL 단백질을 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 (c) 벡터는 SlJUL 단백질 또는 SlJUL 단백질을 코딩하는 유전자를 편집함으로써, SlJUL 단백질 또는 SlJUL 단백질을 코딩하는 유전자를 녹아웃(knockout)시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 조성물은 SlAPL, SlSUT1, SlSUT2, SlSUT4 및 SlSWEET1a로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현을 증가시키는 것일 수 있다. 상기 SlAPL 유전자는 체관부의 마커 유전자이고, 상기 SlSUT1, SlSUT2, SlSUT4 및 SlSWEET1a 유전자는 당 운반체(transporter) 관련 유전자이다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 조성물은 식물의 과실 수확량을 증가시키는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 조성물은 식물의 총 과실의 수 및 총 과실의 중량을 증가시키는 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 조성물은 식물의 과실 당도를 증가시키는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 조성물은 식물의 총 당의 양, 총 포도당의 양 및 총 과당의 양을 증가시키는 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 조성물은 식물의 뿌리 생육을 증가시키는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 조성물은 식물 뿌리의 총 생 중량(fresh weight) 및 건조 중량(dry weight)을 증가시키는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 식물은 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량작물류;
애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소작물류;
인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용작물류;
고구마, 돼지감자, 카사바, 마, 야콘을 포함하는 서류;
사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류;
장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류; 및
라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 식물은 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소작물류일 수 있고, 구체적으로 토마토일 수 있다.
본 발명은 상기 조성물을 식물체에 처리하는 단계;를 포함하는, 식물의 영양 저장 조직(sink tissue)의 영양 저장 능력(sink strength)을 증진시키는 방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 조성물은 SlJUL 단백질 또는 SlJUL 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 억제함으로써, 체관 세포의 수 및 체관 수송 속도를 증가시킬 수 있다. 따라서, 상기 방법을 통해 식물의 영양 저장 능력을 증진시키고, 식물의 생산성을 증가시킬 수 있다.
상기 용어 "식물체"는 식물이 가지고 있는 유형의 몸을 의미하며, 식물 세포, 식물 조직 및 식물의 종자 등을 모두 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 "조성물을 식물체에 처리하는 단계"는 DNA를 식물에 도입시키는 것 또는 식물을 형질전환시키는 단계를 의미한다. 본 발명에서 상기 형질전환은 공지된 방법에 따라 당업자가 적절히 선택하여 이용할 수 있는데, 예컨대 공지된 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌글리콜 방법, 원형질체의 전기천공법, 식물 요소로의 현미주사법, 아그로박테리움(Agrobacterium)을 이용한 방법, 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법, 바이러스에 의한 감염 등으로부터 선택될 수 있다.
본 발명은 상기 방법에 따라, 식물의 영양 저장 조직(sink tissue)의 영양 저장 능력(sink strength)이 증진된 식물체를 제공한다.
본 발명을 통해 제공되는 식물의 영양 저장 조직(sink tissue)의 영양 저장 능력(sink strength) 증진용 조성물은 SlJUL 단백질 또는 SlJUL 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 저해 및 억제함으로써, 체관부 세포 수 및 체관 수송 속도를 증가시킬 수 있다. 따라서, 본 발명에 의할 경우 농작물의 생산성 및 수확성을 증가시키는 데에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 SlJUL 및 AtJUL1의 아미노산 서열을 나타내는 도이다. 보존된 ZnF 도메인은 밑줄로 표시되어 있으며, 보존된 잔기는 다른 색으로 강조되어 있다. 보존된 아르기닌은 RNA 결합에 필요하고, 시스테인은 아연집게(zinc-finger) 구조를 안정화시킬 수 있다.
도 2는 Arabidopsis 원형질체에서 GFP 신호로 확인한 SlJUL 및 SlJULR20/81/151A의 세포 내 위치를 나타내는 도이다. 엽록소 및 DAPI는 각각 세포질과 핵에 대한 지표로 사용되었으며, 공초점 레이저 현미경으로 위치를 관찰하였다.
도 3a는 SlSMXL5 5'UTR에 GFP를 융합하여 SlJUL 농도에 따라 측정한 GFP 신호를 나타낸다.
도 3b는 SlSMXL5 5'UTR에 GFP를 융합하여 SlJULR20/81/151A 농도에 따라 측정한 GFP 신호를 나타낸다.
도 4a는 SlSMXL5 5'UTR에 루시퍼라제(LUC)를 융합한 뒤, SlJUL 또는 SlJULR20/80/146A를 처리하여 측정한 루시퍼라제 활성을 나타낸다.
도 4b는 mSlSMXL5 5'UTR에 루시퍼라제(LUC)를 융합한 뒤, SlJUL 또는 SlJULR20/80/146A를 처리하여 측정한 루시퍼라제 활성을 나타낸다.
도 5는 qRT-PCR로 식물의 기관에서 측정한 SlJUL의 발현양을 나타낸다. 발현양은 GAPDH 레퍼런스 유전자의 발현양으로 정규화하였다.
도 6a는 미성숙 녹색 과실의 횡단면 및 붉은 익은 과실의 종단면에서의 SlJUL 프로모터에 의한 GUS 신호를 나타내는 도이다.
도 6b는 꽃밥의 단면의 관다발 구조에서의 GUS 신호를 나타내는 도이다. 검은색 화살표는 물관(xylem)을 나타낸다.
도 6c는 발아 종자의 배아 뿌리, 작은 꽃자루(pedicel), 수술(stamen), 암술대(style), 꽃받침(sepals) 및 과실에서의 GUS 신호를 나타낸다.
도 7은 재조합 TRV로 SlJUL을 녹다운시킨 토마토 및 개화 30일 이후의 SlJUL의 발현 수준을 나타낸다.
도 8은 TRV-GFP(대조군) 및 TRV-SlJUL 식물의 꽃자루 단면 및 체관(phloem) 세포 수를 나타낸다. IP는 내부 체관을 의미하고, EP는 외부 체관을 의미하며, C는 형성층(cambium)을 의미하고, X는 물관을 의미한다.
도 9는 TRV-GFP(대조군) 및 TRV-SlJUL 식물의 체관 마커 유전자 SlAPL, 형성층 마커 유전자 SlTDR 및 물관 마커 유전자 SlIRX3의 발현 수준을 나타낸다.
도 10a는 CRISPR-Cas9를 사용하여 SlJUL 유전자의 돌연변이를 유발할 수 있는 바이너리 벡터 및 sgRNA 표적의 개략도를 나타낸다.
도 10b는 CRISPR-Cas9를 사용하여 SlJUL 유전자의 돌연변이를 유발할 수 있는 바이너리 벡터의 개략도를 나타낸다.
도 11a는 WT 및 sljul-Cas9 식물의 꽃자루 단면 및 체관 마커 유전자 SlAPL의 발현 수준을 나타낸다.
도 11b는 WT 및 sljul-d4-Cas9 식물의 꽃자루 단면을 나타낸다.
도 12는 WT 및 sljul-Cas9 식물의 형성층 마커 유전자 SlTDR 및 물관 마커 유전자 SlIRX3의 발현 수준을 나타낸다.
도 13은 WT 및 SlJUL R20/81/151A 식물의 꽃자루 단면 및 체관 세포 수를 나타낸다.
도 14는 WT 및 SlJUL R20/81/151A 식물의 체관 마커 유전자 SlAPL, 형성층 마커 유전자 SlTDR 및 물관 마커 유전자 SlIRX3의 발현 수준을 나타낸다.
도 15는 TRV-GFP, TRV-SlJUL 및 TRV-SlJUL/TRV-SlSMXL5 식물의 꽃자루 단면 및 체관 세포 수를 나타낸다.
도 16은 TRV-GFP(대조군) 및 TRV-SlJUL 식물의 잎의 수, 잎의 면적, 줄기 직경, 꽃의 수, 꽃자루 길이, 꽃자루 직경, 잎의 광합성 효율 및 CO2 동화율을 나타낸다.
도 17은 WT 및 SlJUL R20/81/151A 식물의 잎의 수, 잎의 면적, 줄기 직경, 꽃의 수, 꽃자루 길이, 꽃자루 직경, 잎의 광합성 효율 및 CO2 동화율을 나타낸다.
도 18은 WT 및 sljul-Cas9 식물의 잎의 수, 잎의 면적, 줄기 직경, 꽃의 수, 꽃자루 길이, 꽃자루 직경, 잎의 광합성 효율 및 CO2 동화율을 나타낸다.
도 19a는 TRV-GFP(대조군) 및 TRV-SlJUL 식물의 잎자루 단면을 나타낸다. 검은색 화살표는 체관을 나타낸다.
도 19b는 WT 및 SlJUL R20/81/151A 식물의 잎자루 단면을 나타낸다. 검은색 화살표는 체관을 나타낸다.
도 19c는 WT 및 sljul-Cas9 식물의 잎자루 단면을 나타낸다. 검은색 화살표는 체관을 나타낸다.
도 20a는 TRV-SlJUL 식물에서 에스큘린(esculin) 로딩 10분 후에 측정한 UV 형광 신호를 나타낸다.
도 20b는 SlJUL R20/81/151A 식물에서 에스큘린 로딩 10분 후에 측정한 UV 형광 신호를 나타낸다.
도 20c는 sljul-Cas9 식물에서 에스큘린 로딩 10분 후에 측정한 UV 형광 신호를 나타낸다.
도 20d는 sljul-d4-Cas9 식물에서 에스큘린 로딩 10분 후에 측정한 UV 형광 신호를 나타낸다.
도 21a는 중맥(midrib) 내 동일한 고정점에서 픽셀 강도 변화를 측정하기 위한 실험의 개략도 및 시간 간격 당 에스큘린 수송 모니터링 결과를 나타낸다. 픽셀 강도는 에스큘린 처리 위치로부터 중맥을 따라 1.5 cm 거리에서 1 mm 내에서 측정하였으며, 모니터링 결과에서 TRV-SlJUL 식물이 대조군 TRV-GFP 식물에 비해 중맥에서 기저부(basipetal) 방식으로 더 빠른 수송을 나타냄을 확인할 수 있다.
도 21b는 중맥의 양 측면에서 마모된 잎몸(abraded leaf lamina)에 에스큘린 염료(5 mg/ml) 용액 10 μl를 처리한 뒤 10분, 20분, 30분, 40분 및 50분 경과 후 측정한 UV 형광 신호를 나타낸다. 원은 에스큘린 로딩 부위를 나타내고, 선 막대는 에스큘린 측정 범위를 나타낸다.
도 21c는 단위 시간 당 중맥을 통한 에스큘린 수출 비율(export rate) 추정치를 나타낸다.
도 22a는 TRV-GFP(대조군) 및 TRV-SlJUL 식물의 근원 잎에서 수크로스 수송체를 코딩하는 주요 유전자의 발현양을 나타낸다.
도 22b는 WT 및 SlJUL R20/81/151A 식물의 근원 잎에서 수크로스 수송체를 코딩하는 주요 유전자의 발현양을 나타낸다.
도 22c는 WT 및 sljul-Cas9 식물의 근원 잎에서 수크로스 수송체를 코딩하는 주요 유전자의 발현양을 나타낸다.
도 23a는 TRV-GFP(대조군) 및 TRV-SlJUL 식물의 개화 후 30일(dpa)에서 꽃자루의 세로 단면을 나타낸다.
도 23b는 TRV-GFP(대조군) 및 TRV-SlJUL 식물의 사관절(sieve tube)의 길이 및 직경을 나타낸다.
도 24는 TRV-GFP(대조군), TRV-SlJUL 및 TRV-SlSMXL5/TRV-SlJUL 식물의 대표적인 이미지 및 평균 과실 수, 붉게 익은 과실의 평균 직경 및 식물 당 과실의 총 중량을 나타낸다.
도 25는 TRV-GFP(대조군) 및 TRV-SlJUL 식물의 꽃자루에서의 발육불완전(abortive)꽃 및 과실을 나타낸다. 초록색 화살표는 발육불완전 꽃을 나타내며, 노란색 화살표는 과실이 되는 꽃을 나타낸다.
도 26은 TRV-GFP(대조군) 및 TRV-SlJUL 식물의 총 과실의 당, 포도당 및 과당의 수준을 나타낸다. 당의 수준은 각 식물의 대표적인 붉게 익은 과실 5개에서 측정되었으며, 분리 매개변수 및 당의 정량화는 Sugar-Pak 컬럼(Waters) 및 Shodex RI-101 검출기(Shodex)가 장착된 Dionex Ultimate 3000 시리즈 고성능 액체 크로마토그래프(Thermo Fisher Scientific)로 수행하였다.
도 27은 TRV-GFP(대조군) 및 TRV-SlJUL 식물의 대표적인 이미지 및 뿌리의 총 생 중량 및 건조 중량의 수준을 나타낸다.
도 28은 WT 및 SlJUL R20/81/151A 식물의 대표적인 이미지 및 평균 과실 수, 붉게 익은 과실의 평균 직경 및 식물 당 과실의 총 중량을 나타낸다.
도 29a는 WT 및 sljul-Cas9 식물의 대표적인 이미지 및 평균 과실 수, 붉게 익은 과실의 평균 직경 및 식물 당 과실의 총 중량을 나타낸다.
도 29b는 WT 및 sljul-d4-Cas9 식물의 대표적인 이미지 및 평균 과실 수를 나타낸다.
도 30은 과실 크기 및 질량에 있어서, 과실 수와 영양 저장 능력(sink strength) 간 균형 관계(tradeoff)를 나타낸다. 발아 이후 2 내지 3개월 후에 덩굴에서 10개를 제외한 모든 과실을 제거하였고, 과실의 표현형은 붉게 익은 상태에서 기록되었다.
도 31은 TRV-GFP(대조군) 및 TRV-SlJUL 식물의 붉게 익은 과실 10개의 대표 이미지 및 과실의 평균 직경 및 중량을 나타낸다.
도 32a는 체관부 발달, 광동화 분포 및 생산성 간의 상관관계를 도시하는 개략도를 나타낸다. 파란색 선 및 화살표의 두께는 체관 수송 속도를 나타내며, 빨간색 화살표는 체관을 나타낸다.
도 32b는 WT, TRV-SlJUL, SlJUL R20/81/151A 및 sljul-Cas9 식물에서의 유전자 발현, 체관부 세포 수, 수송 능력 및 과실 생산량을 나타낸다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실험예 1: 재료 및 방법
1-1. 식물 재료 및 성장 조건
토마토 품종 Micro-Tom의 종자는 대한민국 서울대학교 최도일 교수에 의해 제공되었다. 모든 종자는 비타민(Duchefa), 3% 수크로스(Duchefa), 0.5% 2-(N-모르폴리노) 에탄설폰산(MES, Sigma-Aldrich) 및 0.8% 피토아가(Sigma-Aldrich)를 포함하고 절반 강도의 Murashige 및 Skoog 염을 포함하는 배지(pH 5.7)에서 장일 조건(16시간 동안 빛 처리/8시간 동안 암 처리)으로 1,200 μmols-1m-2의 세기의 빛을 처리하였으며, 24℃에서 발아되었다. 파종 10일 이후(DAS), 묘목을 화분에 이식하고 장일 조건에서 성장시켰다. 단일 조건(8시간 동안 빛 처리/16시간 동안 암 처리)에서 성장시킨 애기장대(Arabidopsis thaliana) 생태형(ecotype) Col-0는 원형질체(protoplast) 실험에 사용하였다.
1-2. 플라스미드 구성 및 토마토 유전자 변형
VIGS(Virus-induced gene silencing) 분석을 위해, 오프-타겟(off-target)이 없는 SlJUL(Solyc08g067180.3.1; 214 bp) 및 SlSMXL5(Soly-c07g018070.3.1; 549 bp) (https://www.zhaolab.org/pssRNAit/)의 cDNA 단편을 Micro-Tom 토마토에서 유래한 cDNA 주형을 이용해 증폭하였고, pTRV2 벡터(pYL156, Addgeneplasmid # 148969; http://n2t.net/addgene:148969)에 클로닝하였다. 원형질체 리포터 분석을 위해, SlSMXL5(336 bp)의 5'UTR을 GFP 또는 LUC를 포함하는 식물 발현 벡터에 클로닝하였고(35S:SlSMXL5 5'UTR-GFP, 35S:SlSMXL5 5'UTR-LUC 및 35S:mSlSMXL5 5'UTR-LUC), SlJUL(513 bp)의 전장 코딩 서열(coding sequence, CDS)을 헤마글루티닌(hemagglutinin, HA) 태그를 포함하는 식물 발현 벡터에 클로닝하였다(35S:SlJUL::HA). SlJUL R20/81/151A 의 제조를 위한 SlJUL의 점 돌연변이(R20(AGA)(58,59,60)->A(GCA), R81(CGC)(241,241,243)->A(GCC) 및 R151(AGG)(451,452,453)->A(GCG))와 SISMXL5 5'UTR의 점 돌연변이(mSISMXL5 5'UTR)는 QuikChange Site-Directed Mutagenesis 키트(Stratagene California)를 사용하여 제조되었다.
SlJUL의 공간적 발현 패턴을 분석하기 위해, 번역 시작 부위의 상류 서열 2.0 kbp를 Micro-Tom 토마토 게놈 DNA에서 증폭하였고 CTAB 방법을 사용하여 분리 후 pCAMBIA1303에 클로닝하였다(pSlJUL:GUS-GFP). 점 돌연변이를 포함하는 SlJUL의 전장 코딩 서열은 CaMV35S 프로모터(Cauliower 모자이크 바이러스) 및 GUS 융합 서열을 포함하는 pBI121 바이너리 벡터에 도입되어 35S:SlJUL R20/81/151A ::GUS 구성체(construct)를 형성하였다.
CRISPR 녹아웃을 생성하기 위해, CRISPR-P 2.0 도구(Liu et al., 2017)를 사용하여 sgRNA를 설계하였고 CRISPR 벡터 구성에 사용하였다. 모든 T-DNA의 구조는 Gateway-compatible pEn-C1.1(HolgerPuchta, Addgene plasmid #61479; http://n2t.net/addgene:61479) 및 pDe-CAS9 (Holger Puchta, Addgene plasmid#61433; http://n2t.net/addgene:61433) 플라스미드에 기반하였다. 대상 벡터(destination vector) pDe-CAS9는 PcUbi4-2 프로모터[파슬리(Petroselinum crispum Miller)의 유비퀴틴 프로모터]로 구동되는 Cas9를 발현하고 완두콩(Pisum sativum L.)의 RIBULOSE-1,5-BISPHOSPHATE CARBOXYLASE(RBCS3A, pea3A) 유전자의 작은 소단위체 종결 서열을 포함한다. 스페이서 서열(20 bp)은 BbsI(New England Biolabs)를 사용하여 서열을 절단하는 고전적 클로닝 방법을 사용하여 어닐링된 올리고뉴클레오타이드 형태로 진입 벡터(entry vector)에 도입되었다. 맞춤형 RNA 키메라(chimera)는 Arabidopsis U6-26 프로모터에 의해 구동된다. SlJUL에서 두 개의 서로 다른 위치(5'UTR 및 3'UTR)를 동시에 표적화하기 위해 두 개의 프로그래밍된 sgRNA 카세트를 대상 벡터에 통합하였다. 첫 번째 키메라는 Bsu36I 및 MluI(New England Biolabs)를 사용하여 구성하였고, 두 번째 키메라는 이전에 설명한 대로 Gateway LR 반응(ThermoFischer Scientific)을 사용하여 구성하였다.
또 다른 CRISPR 녹아웃 대립유전자를 생성하기 위해 SlJUL에서 ZnF 모티프 1 및 2 서열 사이를 표적하는 sgRNA를 설계하였다. 여기서 사용된 T-DNA 구성체는 pHAtC(Jinsu Kim, Addgene plasmid #78098; https://www.addgene.org/78098) 플라스미드를 기반으로 하였다. pHAtC는 35S 프로모터에 의해 구동되는 Cas9를 발현하고 맞춤형 RNA 키메라는 Arabidopsis U6-26 프로모터에 의해 구동된다. 스페이서 서열(20 bp)은 AarI(Thermo Fischer Scientific)를 사용하여 서열을 절단하는 고전적 클로닝 방법을 사용하여 어닐링된 올리고뉴클레오타이드 형태로 식물 형질전환 벡터에 도입되었다. 맞춤형 RNA 키메라(chimera)는 Arabidopsis U6-26 프로모터에 의해 구동된다.
최종 바이너리 플라스미드는 Agrobacterium tumefaciens(EHA105 균주) 매개 형질전환을 사용하여 10일째 실생(토마토 품종 Micro-Tom)의 떡잎 절편(cotyledons explants)에 도입되었다. 토마토 형질전환체는 BASTA(1 mg/L; Bayer CropScience) 또는 hygromycin(5 mg/L; Duchefa)에서 선별되었다. 형질전환된 35S:SlJUL R20/81/151A 및 sljul-Cas9 계통의 T2 세대를 추가 연구에 사용하였다. 본 연구에 사용된 모든 프라이머는 하기 표 1과 같다.
실험 이름 서열(5'-3')
RT-PCR GFP-RT_F GTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTG(서열번호 1)
GFP-RT_R GTGCTGCTTCATGTGGTCGGGG(서열번호 2)
SlJUL-RT_F ATGAGCAGACCAGGAG(서열번호 3)
SlJUL-RT_R ATATGAAGACTTGTTACCAGC(서열번호 4)
qRT-PCR SlJUL-VIGS-qRT_F ATTGTTTTGGCGGAAGGGGA(서열번호 5)
SlJUL-VIGS-qRT_R TCAAAGCTGCTACCACCACC(서열번호 6)
SlSMXL5-Sl07g018070-qRT_F AGGCCATGCACAGGTTACTC(서열번호 7)
SlSMXL5-Sl07g018070-
qRT_R		 AGGAGTGGACCAGGACTTGT(서열번호 8)
SlSUT1-Sl11g017010-
qRT_F		 GGAAGAAGATCGGTGGTGCT(서열번호 9)
SlSUT1-Sl11g017010-qRT_R AATACCAAGGGCGGCAAAGA(서열번호 10)
SlSUT2-Sl05g007190-qRT_F TGAAGCAGCAGGAAGTGGAA(서열번호 11)
SlSUT2-Sl05g007190-qRT_R CCCATCCAAACTGAACCCCA(서열번호 12)
SlSUT4-Sl04g076960-qRT_F ACTGCCCTGACATGGATTGG(서열번호 13)
SlSUT4-Sl04g076960-qRT_R CCCCATTTTCGACAGAGCTTC(서열번호 14)
SlSWEET1a-Sl04g064610-qRT_F TGGTTTAGGAACAGTGCAAC(서열번호 15)
SlSWEET1a-Sl04g064610-qRT_R TTGCTTCTCCTCTTGGTGAG(서열번호 16)
SlAPL-Sl12g017370-qRT_F ACCAGACATTTCAGCTGCCT(서열번호 17)
SlAPL-Sl12g017370-qRT_R GGCTAGCCCTTTTCTTTCCAAG(서열번호 18)
SlIRX3-Sl07g005840-qRT_F TTGGAGGTGTATCTGCCCAC(서열번호 19)
SlIRX3-Sl07g005840-qRT_R GATTCCGGCTACAACCCCAA(서열번호 20)
SlTDR-Sl03g093330-qRT_F ACATGCCTAACGGTAGCCTG(서열번호 21)
SlTDR-Sl03g093330-qRT_R CAGATCGCCGTCCAGAAGAA(서열번호 22)
SlGAPDH-qRT_F CTGCTCTCTCAGTAGCCAACAC(서열번호 23)
SlGAPDH-qRT_R CTTCCTCCAATAGCAGAGGTTT(서열번호 24)
GFP-융합 구성 SlSMXL5-5'UTR-BamH1_F CGGGATCCAACGGAGTAGTAAATTTTCTTTAG
(서열번호 25)
SlSMXL5-'UTR
+ATG-Stu1_R		 AAGGCCTCATAACTTAGATACAACCCCACC
(서열번호 26)
GUS-융합 구성 pSlJUL-BamH1_F CGGGATCCGTAAGCAAATTAAGGGCCC
(서열번호 27)
pSlJUL-Sma1_R TCCCCCGGGTTTTTTTCCTATAATAAAAAATAAAA
AAGAAT(서열번호 28)
점 돌연변이 SlJUL-R20A_F CTTTCAAAGGAGAGATTCATGCCAAAG
(서열번호 29)
SlJUL-R20A_R CTTTGGCATGAATCTGCCCTTTGAAAG
(서열번호 30)
SlJUL-R81A_F CATAACTTTGCAAGCCGCTCTAGCTGCTTC(서열번호 31)
SlJUL-R81A_R GAAGCAGCTAGAGGCGCTTGCAAAGTTATG(서열번호 32)
SlJUL-R151A_F CAACTTTGCTAGTAGGATGGAGTGTTTC(서열번호 33)
SlJUL-R151A_R GAAACACTCCATCGCACTAGCAAAGTTG(서열번호 34)
SISMXL5_5'UTR_SDM_F TTACGGTATTAACAACGAAAAAAAATGTAAAAAA
AATAAAATTGTATCTAAGTTCCATG
(서열번호 35)
SISMXL5_5'UTR_SDM_R CATGGAACTTAGATACAATTTTATTTTTTTTAC
ATTTTTTTTCGTTGTTAATACCGTAA
(서열번호 36)
리포터 구성 SlSMXL5-5'UTR-Stu1_R AAGGCCTAACTTAGATACAACCCCACC
(서열번호 37)
SlSMXL5-5'UTR-SDMStu1_R AAGGCCTAACTTAGATACAATTTTATT
(서열번호 38)
이펙터 구성 SlJUL-Sl08g067180-
BamH1_F		 CGGGATCCATGAGCAGACCAGGAG
(서열번호 39)
SlJUL-Sl08g067180-
Stu1_R		 AAGGCCTATATGAAGACTTGTTACCAGC
(서열번호 40)
유전형 분석 SlJUL-G.T._F ACTACTGCAAATAACAACTACCAA
(서열번호 41)
SlJUL-G.T._R GTATAATATTTGTGTAATACACGTA
(서열번호 42)
전이유전자 검정 GUS_F AACTGGACAAGGCACTAGC(서열번호 43)
GUS_R CACCGAAGTTCATGCCAGTC(서열번호 44)
BlpR_F TCTGCACCATCGTCAACCAC(서열번호 45)
BlpR_R AAACCCACGTCATGCCAGTT(서열번호 46)
형질전환 식물 SlJUL-VIGS-EcoR1_F GGAATTCCCGGTGACTGGTACTGCAAT
(서열번호 47)
SlJUL-VIGS-Stu1_R AAGGCCTCCAGACTTCCATCCAGAGCG
(서열번호 48)
SlPDS-Sl03g123760-VIGS-EcoR1_F GGAATTCGCTGGTAGCGAATCAATG
(서열번호 49)
SlPDS-Sl03g123760-VIGS-EcoR1_R AAGGCCTAACATCCCTTGCCTCC
(서열번호 50)
SlSMXL5-Sl07g018070-VIGS-EcoR1_F GGAATTCATTGGCTCGAGTGATCGCAA
(서열번호 51)
SlSMXL5-Sl07g018070-VIGS-Sma1_R TCCCCCGGGTCAGTCTTGGCCTCGTGTAC
(서열번호 52)
SlJUL-Guide2-Bbs1_TOP ATTGCTAGCTTGAAACAAGTACAA(서열번호 53)
SlJUL-Guide2-Bbs1_BOTTOM AAACTTGTACTTGTTTCAAGCTAG
(서열번호 54)
SlJUL-Guide5-Bbs1_TOP ATTGTGATTCAATCAAAATATGAG(서열번호 55)
SlJUL-Guide5-Bbs1_BOTTOM AAACCTCATATTTTGATTGAATCA
(서열번호 56)
SlJUL-sgRNA2_Aar1_TOP GATTGGATGTGGTGAGCCAAGACA(서열번호 57)
SlJUL-sgRNA2_Aar1_BOTTOM AAACTGTCTTGGCTCACCACATCC
(서열번호 58)
1-3. 원형질체 준비, 일시적 발현 분석 및 면역블롯팅
3-4주 된 Arabidopsis 식물의 완전히 확장된 잎을 원형질체 분리에 사용하였다. 엽육 원형질체와 플라스미드 DNA는 공개된 프로토콜에 따라 준비하였다(Hwang and Sheen, 2001). 리포터 분석을 위해, 원형질체를 2 x 104 세포/mL의 밀도로 희석하였고, 리포터(SlSMXL5 5'UTR-GFP, SlSMXL5 5'UTR-LUC 또는 mSlSMXL5 5'UTR-LUC), 이펙터(35S:SlJUL::HA 또는 35S:SlJUL R20/81/151A ::HA) 및 내부 대조군(루시퍼라제 분석을 위한 35S:Renilla)의 조합으로 구성된 20 μg의 플라스미드 DNA로 형질주입시켰다. 형질주입된 원형질체를 실온에서 6시간 동안 인큐베이션하였다. 리포터 분석을 위해, 반딧불이 루시퍼라제 분석 시스템(Promega)과 레닐라 루시퍼라제 분석 시스템(Promega)으로 구성된 이중 루시퍼라제 분석을 사용하여 각 유전자의 상대적인 활성도를 측정하였다.
목표 단백질 수준을 검출하기 위해, 총 단백질을 단백질 추출 완충액(50 mM Tris-HCl(pH 7.5), 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol, 1x 프로테아제 억제제 cocktail(Roche) 및 1% 트리톤 X-100)을 사용하여 추출하였다. 이어서, 추출된 단백질을 8-10% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 SDS-PAGE를 이용하여 분리하였고, 니트로셀룰로오스 막으로 전송한 후, 항-HA(SlJUL::HA 검출용; 1:2000; Roche) 또는 항-GFP(SlSMXL5 5'UTR-GFP 검출용; 1:2000; Santa Cruz)를 사용하여 면역관측하였다. 루비스코 서브유닛(Rubisco large subunit, RbcL) 수준을 대조군으로 사용하였다.
1-4. 공초점 현미경 분석
SlJUL 및 SlJULR20/81/151A의 세포 내 위치를 결정하기 위해, 이들의 코딩 서열을 35S 프로모터를 포함하는 벡터에 클로닝하여 일시적으로 원형질체에 발현되는 35S:SlJUL-GFP 구성체 및 35S:SlJUL R20/81/151A -GFP 구성체를 제조하였다. 형광 GFP 신호는 공초점 레이저 스캐닝 현미경(LSM 800; Carl Zeiss)으로 시각화 및 촬영하였다. 엽록소와 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)로 염색된 핵의 형광 신호는 각각 표적 단백질의 세포질 또는 핵 내 위치를 결정하는데 사용하였다. 엽록소는 640 nm 파장의 레이저로 여기(excitation)되었으며, 방출 스펙트럼은 650 내지 700 nm에서 관측되었다. 원형질체에서 DAPI 형광 검출을 위해 10 μM 농도의 DAPI를 샘플에 10분간 처리하였고, 405 nm의 여기 파장과 420 내지 470 nm의 방출 파장을 사용하였다.
1-5. 조직화학 염색(GUS)
GUS로 염색된 조직 및 장기의 이미지는 Axioplan 2 현미경(Carl Zeiss) 또는 Stemi SV 11 Apo 입체경(Carl Zeiss)에 장착된 디지털 카메라를 사용하여 캡쳐하였다.
1-6. 조직학적 포매(embedding), 단면화 및 이미징
꽃자루(peduncle), 잎자루(petiole) 및 꽃밥(anther) 샘플을 FAA 고정액(3.7% 포름알데히드, 5% 아세트산 및 50% 에탄올)에 4℃에서 16시간 동안 고정 및 탈수하고 파라핀 왁스(Paraplast; Leica Microsystems)에 포매하였다. 고정된 샘플을 Leica RM2265 마이크로톰(Leica Biosystems)을 사용하여 5 μm의 얇은 절편으로 단면화하였다. 절편을 poly-L-lysine이 코팅된 슬라이드에 장착하고 0.1%의 사프라닌 O로 염색하였다. 현미경 사진은 Axioplan 2 현미경을 사용하여 캡쳐하였다. 측정 및 계수(counting)는 ImageJ 소프트웨어(NIH; https://image j.nih.gov/ij)를 사용하여 수행하였다. 꽃자루는 관다발 발달을 완료했을 때 첫 번째 총상 화서(raceme)의 개화 후 30일(dpa)에 해당하는 꽃자루를 샘플링하였다. 잎자루는 첫 번째 총상 화서에 해당하는 근원 잎에 대응된다.
1-7. 바이러스 유발 유전자 억제(Virus-induced gene silencing)
pTRV2 유래 재조합 구성체를 A. tumefaciens 균주 GV3101로 형질전환시켰다. A. tumefaciens를 pTRV1(pYL192; Addgene plasmid # 148968; http://n2t.net/addgene:148968) 또는 pTRV2 구성체를 포함하여 28℃에서 밤새 인큐베이션하고(OD600=0.6), 수확한 뒤 10 mM MES(pH 5.5)에서 재현탁시켰다. 아그로박테리움(Agrobacterium) 독성(virulence)은 100 μM의 아세토시링곤(acetosyringone)을 배양 현탁액에 첨가한 뒤 실온에서 3시간 동안 배양하여 유도하였다. pTRV1 또는 pTRV2를 함유하는 A. tumefaciens 세포(OD600=1.0)를 1:1 비율로 혼합하여 3주차 토마토 잎에 침투시켰다. 실험은 아그로박테리움 접종 후 6주까지(30 dpa) 표현형 또는 해부학적 기록의 특성에 따라 수행되었다. TRV 감염의 영향을 배제하기 위해, 표적 유전자 억제 식물을 벡터 대조군으로 pTRV-GFP 및 pTRV1을 동시 접종한 식물과 비교하였다. VIGS 실험에 대한 양성 대조군으로 PHYTOENE DESATURASE(SlPDS) 유전자(pTRV-PDS)에 대한 억제 효과를 모니터링하였다.
1-8. qRT-PCR
60일된 식물의 꽃자루 또는 잎에서 총 RNA를 TRIzolTM 시약(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 제조업체의 지침에 따라 분리하였다. 역전사는 1 μg의 총 RNA, 올리고(dT) 프라이머 및 ImProm-II 역전사효소(Promega)를 사용하여 수행하였다. qRT-PCR은 SYBR Premix ExTaq 시스템(Takara Bio)과 StepOnePlus Real-Time PCR 시스템(Thermo Fisher Scientific)에 제공된 지침에 따라 수행하였다. GLYCERALDEHYDE PHOSPHATE DEHYDROGENASE(SlGAPDH)의 발현 값을 표적 유전자 발현 수준을 정규화하는데 사용하였다.
1-9. 체관부(Phloem) 수송 분석
체관부 수송은 첫 번째 총상 화서를 지지하는 근원 잎(source leaves)에서 평가하였다. 잎 가장자리와 중맥(midrib) 영역에서 같은 거리에 위치한 작은 영역(~25 mm2 이하)을 완전히 확장된 잎의 축방향(abaxial) 표면에 표시하였다. 표피층을 메스로 부드럽게 문지르고 10 μL의 esculin 용액(5 mg/mL; Alfa Aesar)을 표면에 떨어뜨렸다(De Moliner et al., 2018; Knox et al., 2018). Esculin 수송을 보여주는 UV 형광은 esculin 처리 후 0분 및 10분에서 Davinch-Gel 이미징 시스템 MC-2000(Davinch-K)을 사용하여 306-nm의 UV 광 조건에서 기록되었다. Esculin 수송의 정도는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 상대적인 픽셀 강도 측면으로 정량화하였다.
1-10. 엽록소 형광 측정
IMAGING-PAM 엽록소 형광계(MAXI 버전, Walz)를 사용하여 30 dpa의 식물에서 암적응된 잎의 광합성 효율을 측정하였다. 식물 당 측정은 첫 번째 총상 화서를 지지하는 완전히 확장된 어린 잎에 대해 수행되었다. 데이터 기록을 위해 직경 0.5 cm의 관심 영역을 무작위로 선택하였다.
1-11. 잎의 CO 2 동화율(assimilation rate) 측정
근원 잎의 순 CO2 동화율(μmols-1m-2)의 순간값(instantaneous values)은 LI-6400 적외선 가스 분석기(LI-COR)로 측정되었다. 식물 당 측정은 첫 번째 총상 화서를 지지하는 완전히 확장된 어린 잎에 대해 수행되었고, 5에서 6개의 독립된 다른 식물을 사용하였다. 측정 챔버의 조건은 500 mols-1의 유속, 1200 μmols-1m-2의 포화 PAR, 400 μmolmol-1의 CO2 및 24℃의 잎 온도로 제어되었다.
1-12. 식물 표현형
꽃자루 및 줄기의 길이 및 직경은 화서(inflorescences)에서 꽃의 절반 이상이 열려 있을 때 수동으로 정량화하였다. 과실이 붉게 익은 상태에서 크기(직경)와 무게를 측정하였고, 꽃자루의 길이를 측정하기 위해 아래에서 첫 번째 총상 화서를 사용하였다. 직경은 전자 디지털 버니어 캘리퍼스(Mitutoyo)로 측정하였고, 꽃자루 길이는 30 cm 및 60 cm 표준자를 사용하여 측정하였다. 과실의 신선 중량은 디지털 저울(CAS)을 사용하여 기록하였고, 잎, 꽃 및 과실의 수는 동일한 발달 연령의 다른 유전자형에서 계산하였다. 식물 뿌리의 총 생 중량은 뿌리의 둘러싼 흙과 이물질을 제거하고 물기를 제거 후 측정하고, 총 건조 중량은 건조 후 디지털 저울(CAS)을 사용하여 기록하였다. 정량화된 개별 수는 각 수치에 표시하였다.
실험예 2: 실험 결과
2-1. JUL1의 유전적 기능이 토마토에서 보존되며 관다발(vascular) 조직에서 발현됨을 확인
(1) AtJUL1의 이종상동체(orthologue) SlJUL의 확인
토마토의 체관 발달을 분석하기 위해, 체관 발달의 음성 조절자로 알려진 AtJUL1의 이종상동체(orthologue)를 검색하였다. 검색 결과, Arabidopsis 이종상동체 및 3개의 RanBP2-type Zinc finger(ZnF) 도메인과 동일한 아미노산의 65%(116/178)를 공유하는 단백질을 암호화하는 Solyc08g067180.3.1(SlJUL) 유전자를 확인하였다. 각 도메인은 RNA 결합에 필요한 보존된 아르기닌 잔기(각각 ZnF1, ZnF2 및 ZnF3의 R20, R81 및 R151)를 포함한다(도 1 참조).
이전 연구에서, AtJUL1이 SUPPRESSOR OF MAX2 1-LIKE 5(AtSMXL5)의 5'UTR 영역의 G-사중체(quadruplex)에 결합하여 AtSMXL5 전사체가 번역 활성 리보솜으로 번역되는 것을 방지함으로써 AtSMXL5 단백질의 생합성을 방지한다는 것을 입증한 바 있고, Solyc07g018070.3.1(SlSMXL5)은 AtSMXL5의 이종상동체로 확인되었다. 이후, G-테트라드(tetrads)의 수와 G-테트라드 연결 루프의 길이를 기반으로 G-점수를 예측하는 스코어링 알고리즘으로 계산한 결과, AtSMXL5 5'UTR의 G-사중체는 41점으로 계산되었고, SlSMXL5 5'UTR의 경우 39점으로 계산되었다. 이는, SlSMXL5의 5'UTR도 G-사중체를 형성할 수 있음을 의미한다.
(2) SlJUL이 SlSMXL5의 번역을 억제함을 확인
SlJUL의 세포 내 위치를 확인한 결과, SlJUL이 세포질과 핵 모두에 위치함을 발견하였다(도 2 참조). 이는 SlJUL이 RNA에 결합하여 표적 전사체가 번역 활성 리보솜으로 번역되는 것을 방지할 수 있음을 의미한다. 이를 검증하기 위해, SlSMXL5의 5'UTR G-사중체에 대한 SlJUL의 결합이 번역에 영향을 미치는지 여부를 확인하였다.
우선, 원형질체(protoplasts)를 GFP 유전자 상류(upstream)에 융합된 리포터 SlSMXL5 5'UTR과 이펙터로서 SlJUL을 사용하여 공동으로 형질주입시켰다. 형질주입 후 GFP 신호 및 mRNA 수준을 측정한 결과, GFP 신호는 농도 의존적으로 SlJUL 이펙터의 첨가에 의해 감소되었으나, GFP mRNA 수준에는 변화가 나타나지 않았다(도 3a 참조).
이후, 표적 SlSMXL5에 대한 SlJUL의 RNA 결합 활성을 입증하기 위해, SlJUL에서 보존된 아르기닌을 알라닌으로 돌연변이시켜 SlJULR20/81/151A를 제조하였다. 원형질체를 SlJULR20/81/151A 및 SlSMXL5 5'UTR 융합 GFP로 공동으로 형질주입시켜 GFP 신호를 측정한 결과, SlSMXL5 5'UTR 융합 GFP로만 형질주입된 원형질체와 유사한 GFP 신호가 SlJULR20/81/151A의 농도와 무관하게 측정되었다(도 3b 참조).
상기 결과와 유사하게, SlSMXL5 5'UTR 융합 루시퍼라제(LUC) 리포터로 형질감염된 원형질체는 SlJUL 의존적으로 활성의 감소를 보인 반면(도 4a 참조), SlSMXL5 5'UTR에서 G-사중체를 형성하지 못하도록 변이시킨 이펙터(mSlSMXL5 5'UTR) 또는 SlJULR20/81/151A 이펙터는 표적 번역을 억제하지 못함을 확인하였다(도 4b 참조).
상기 실험을 통해서, SlJUL과 RNA의 G-사중체 모티프의 상호작용 및 SlSMXL5 5'UTR에서 온전한 G-사중체의 존재가 SlSMXL5 번역에 대한 SlJUL 의존적 억제에 필수적임을 검증하였다.
(3) SlJUL 발현의 공간적 패턴 분석
SlJUL의 기능을 추가적으로 분석하기 위해, 초기 발달 단계에서 후기 발달 단계에 이르는 다양한 기관에서 SlJUL 발현의 공간적 패턴을 분석하였다.
정량적 RT-PCR로 발현 프로필을 분석한 결과, 뿌리, 배축(hypocotyl), 떡잎(cotyledons), 잎, 줄기, 꽃 봉오리 및 과실에 SlJUL 전사체가 보편적으로 존재하는 것으로 나타났으며, 꽃에서 전사체가 가장 풍부하게 존재함을 확인하였다(도 5 참조).
이후, SlJUL 프로모터의 제어 하에 GUS 리포터 유전자를 발현하는 형질전환 토마토 식물을 제조하여 조직화학적 GUS 염색을 수행하였다.
염색 결과, GUS 신호는 미성숙한 녹색 과실, 빨갛게 익은 과실 및 꽃밥의 관다발 구조에서 관찰되었으며(도 6a 및 6b 참조), 발아 종자의 배아 뿌리와 후기 발달 단계에서 작은 꽃자루(pedicel), 수술(stamen), 암술대(style), 꽃받침(sepals) 및 과실을 포함한 모든 기관에서 관찰되었다(도 6c 참조).
상기 실험을 통해, SlJUL이 식물의 다양한 기관에서 보편적으로 관찰됨을 검증하였다.
2-2. SlJUL의 토마토 체관 분화에 대한 음성 조절 효과 확인
(1) SlJUL 의 발현을 억제할 경우, 토마토 체관 분화가 증가함을 확인
SlJUL의 체관 발달 조절 효과를 확인하기 위해, 바이러스 유도 유전자 억제(Virus-induced gene silencing, VIGS) 기술을 사용하여 SlJUL을 녹다운시킨 TRV-SlJUL을 제조하였고, 이들의 관다발 구조를 대조군 토마토 식물[TRV-SlPDS(PHYTOENE DESATURASE) 및 TRV-GFP]과 비교하였다(도 7 참조).
대조군과 SlJUL 녹다운 식물의 꽃자루 단면을 비교한 결과, SlJUL의 억제가 TRV-GFP 식물과 비교할 때 총 체관부 세포 수를 약 1.77배 증가시킴을 확인하였다(도 8 참조).
이와 유사하게, 체관부 마커 유전자인 ALTERED PHLOEM DEVELOPMENT(SlAPL)의 발현이 TRV-SlJUL에서 약 1.82배 증가한 반면, 형성층(cambium) 마커 유전자(TDIF RECEPTOR(TDR)) 및 물관부(xylem) 마커 유전자(IRREGULAR XYLEM 3(IRX3))의 발현은 변화하지 않았다(도 9 참조).
추가적으로, CRISPR-Cas9 시스템을 사용하여 두 개의 안정적인 sljul null 돌연변이 라인(sljul 및 sljul-d4)을 제조하였다(도 10a 및 10b 참조). TRV-SlJUL 녹다운 식물과 마찬가지로, sljul null 대립유전자를 포함하는 형질전환 식물은 야생형과 비교하여 SlAPL 마커 발현이 약 7.74배 증가하여 체관부 조직이 극적으로 분화함을 확인하였다(도 11a 및 11b 참조). 이와 달리, 형성층 마커 유전자 TDR 및 물관부 마커 유전자 IRX3의 발현은 변화하지 않았다(도 12 참조).
상기 실험을 통해, SlJUL이 토마토의 체관 분화에 있어서 진화적으로 보존된 음성 조절자이며, SlJUL 발현의 억제를 통해 체관부 조직의 분화를 유도할 수 있음을 검증하였다.
(2) SlJUL의 RNA 결합 활성을 억제할 경우, 토마토 체관 분화가 증가함을 확인
SlJUL의 RNA 결합 활성이 체관 발달 유도에 필요한지 확인하기 위해, 돌연변이 SlJULR20/81/151A(35S:SlJULR20/81/151A)을 발현하는 토마토 식물을 제조하였다.
상기 SlJULR20/81/151A을 발현하는 형질전환 토마토 식물의 체관부 세포 수 및 SlAPL의 발현을 측정한 결과, 야생형 대조군에 비해 체관부 세포수는 약 1.84배 증가하였고(도 13 참조), SlAPL의 발현은 약 3.14배 증가하였으나, 형성층 마커 유전자 TDR 및 물관부 마커 유전자 IRX3의 발현은 변화하지 않음을 확인하였다(도 14 참조). 상기 실험 결과는 SlJULR20/81/151A이 SlJUL의 우성-음성(dominant-negative) 형태로 기능하여 식물의 표적 G-사중체에 결합할 때 야생형 SlJUL과 경쟁함을 의미할 수 있다.
추가적으로, SlJUL 녹다운 식물에서 VIGS를 사용해 체관 발달에 있어서 SlJUL의 표적인 SlSMXL5의 발현을 억제한 식물을 제조하였다. 상기 식물의 체관부 세포 수를 측정한 결과, TRV-SlJUL 토마토에 비해 총 체관부 세포 수가 감소하였으나, 양성 대조군에 비해서는 체관부 세포수가 증가함을 확인하였다(도 15 참조).
상기 실험을 통해, SlJUL이 SlSMXL5를 조절하는 SlJUL-SlSMXL5 조절 모듈이 식물체의 체관 분화를 조절함을 검증하였다.
2-3. SlJUL 의 억제 수준이 식물의 성장 속성을 결정함을 확인
SlJUL의 억제로 인한 식물 관다발 구조의 해부학적 변화가 식물 형태 또는 성장 속성을 결정하는지 확인하기 위해, 녹다운 식물(TRV-SlJUL), 억제 식물(35S:SlJULR20/81/151A) 및 녹아웃 식물(sljul-Cas9)에서 다양한 성장 파라미터를 측정하였다.
측정 결과, TRV-SlJUL의 경우, 대조 식물에 대하여 잎의 수, 잎의 면적, 줄기 직경, 꽃의 수, 꽃자루 길이, 꽃자루 직경, 잎의 광합성 효율 및 CO2 동화율 모두 유의한 변화가 나타나지 않았다(도 16 참조). 35S:SlJULR20/81/151A의 경우, 대조 식물에 대하여 잎의 수, 잎의 면적, 줄기 직경, 꽃의 수, 꽃자루 직경, 잎의 광합성 효율 및 CO2 동화율은 유의한 변화가 나타나지 않았으나, 근원(source)과 저장부(sink) 간 체관 경로의 척도인 꽃자루 길이는 대조 식물에 비해 감소한 것으로 나타났다(도 17 참조). 이와 달리, sljul-Cas9의 경우, 대조 식물에 대하여 꽃자루 직경, 잎의 광합성 효율 및 CO2 동화율은 유의한 변화가 없었으나, 잎의 수, 잎의 면적, 줄기 직경, 꽃의 수 및 꽃자루 길이는 대조 식물에 비해 크게 감소하였다(도 18 참조). 광합성 기관의 수가 감소했음에도 CO2 동화율이 변화하지 않은 것은 sljul-Cas9 식물에서 순 탄소 동화가 전반적으로 감소했음을 의미한다.
상기 실험으로, 체관부 조직이 최적으로 증가한 녹다운 식물과 체관부 조직이 다량으로 증가한 녹아웃 식물에서의 식물 성장 속성을 비교하였고, 이를 통해 체관의 과형성(hyperplasia)이 토마토의 발달을 제한할 수 있음을 확인하였다.
2-4. 체관 조직 증가로 인한 수송 능력 향상 효과의 확인
(1) SlJUL 녹다운 및 녹아웃 식물에서 에스큘린(esculin) 수송이 증가됨을 확인
체관부 세포 수가 증가할 경우 체관 수송 능력이 향상되는지를 확인하기 위해, SlJUL 녹다운 및 녹아웃 식물에서 과방(fruit truss)에 광동화체(photoassimilate)를 공급하는 근원 잎의 수송 특성을 분석하였다. 분석을 위해, 자외선 형광 염료인 에스큘린(esculin)을 사용하여 수송을 관찰하였다. 에스큘린은 수크로스 유사체로서, SUCROSE TRANSPORTER(SUT) 패밀리에 의해 체관에 로딩되므로, 체관 수송을 추적하는데 사용될 수 있다.
그 결과, 녹다운 및 녹아웃 토마토 식물의 근원 잎의 잎자루에서 체관 세포 수가 증가하였고(도 19a 내지 19c 참조), 대조군에 비해 잎 맥관 구조에서 에스큘린 부하가 증가하였다(도 20a 내지 20d 참조).
이후, 잎 중맥에서 에스큘린의 체관 수송 속도(transport velocity) 및 수출 비율(export rate)을 측정하였다. 측정 결과, 에스큘린은 TRV-SlJUL 잎에서 10분 이내에 중맥 기저부에 도달하였으나, TRV-GFP 잎에서는 약 35분이 소요되었다(도 21a 및 21b 참조). 그러나, 수출 비율은 대조군과 비교하여 TRV-SlJUL에서 유의한 차이가 나타나지 않았다(도 21c 참조). 이는, TRV-SlJUL에서 증가된 에스큘린 수송이 처음 10분 이내에 발생한 체관 부하의 증가에 의한 것임을 의미할 수 있다.
(2) SlJUL 녹다운 및 녹아웃 식물에서 수크로스 수송 유전자의 발현이 증가됨을 확인
활성된 체관의 로딩 메커니즘은 당 운반체를 포함한다. 구체적으로, SUT 및 SWEET(SUGARS WILL EVENTUALLY BE EXPORTED TRANSPORTERS) 패밀리와 같은 당 운반체는 근원 잎에서 광합성으로 고정된 탄소를 내보내고, 수크로스를 체관으로 가져오거나 과실과 같은 저장 조직에 가져오는 데 중요한 역할을 수행한다.
이에, qRT-PCR을 사용하여 근원 잎에서 수크로스 수송에 관여하는 주요 유전자의 전사 수준을 측정하였다.
측정 결과, TRV-SlJUL의 경우 SlSUT1, SlSUT2, SlSUT4 및 SlSWEET1a의 발현이 대조군에 비해 각각 1.66배, 1.62배, 1.78배 및 1.36배 증가하였고(도 22a 참조), 35S:SlJULR20/81/151A의 경우, SUT1의 발현이 대조군에 비해 3.54배 증가하였으며(도 22b 참조), sljul-Cas9의 경우 SUT1의 발현이 대조군에 비해 3.83배 증가하였다(도 22c 참조).
또한, 장거리 수송은 사요소(sieve element)의 길이 및 반경의 영향을 받기 때문에, TRV-SlJUL 및 TRV-GFP 식물의 종단면에서 이러한 특징을 측정하였으나, 두 식물의 사관절(sieve tube)에서 측정 가능한 차이가 나타나지 않았다(도 23a 및 23b 참조).
상기 실험들을 통해서, SlJUL 녹다운 또는 녹아웃 식물에서 증가된 체관부 세포 집단이 체관부 수송 능력을 증가시킴을 검증하였다.
2-5. 체관 역치(threshold)가 토마토의 과실 저장 능력을 결정함을 확인
증가된 체관부 흐름이 수확량에 영향을 미치는지 여부를 확인하기 위해, 식물 당 평균 과실 수, 과실 크기 및 과실 중량을 측정하였다.
측정 결과, TRV-SlJUL 녹다운 식물은 TRV-GFP에 비해 과실 크기에서는 유의한 차이를 보이지 않았으나, 과실 수는 37%가량 증가하였고, 증가된 과실 수로 인해 총 과실 중량은 60%가량 증가하였다(도 24 참조).
추가적으로, SlJUL이 SlSMXL5를 조절하여 과실의 수확량을 증가시키는 지 확인하기 위해, TRV-SlJUL 식물에서 TRV-SlSMXL5를 이용하여 SlSMXL5를 저해한 식물 TRV-SlSMXL5/TRV-SlJUL를 제조한 뒤 과실 수확량을 측정하였다.
측정 결과, SlSMXL5를 억제한 식물 TRV-SlSMXL5/TRV-SlJUL의 과실 수확량은 TRV-GFP 대조군 식물과 유사한 수준으로 측정되었다(도 24 참조). 상기와 같이 TRV-SlJUL 식물에서 과실 수가 TRV-GFP 식물과 비교하여 현저하게 증가하는 것은 TRV-SlJUL 식물에서 발육불완전(abortive)꽃/과실 비율이 감소되어 있는 것에 기인할 수 있으며(도 25 참조), 이러한 현상은 SlJUL 녹다운 식물의 화서(inflorescence) 저장부에서 광동화 할당 비율이 증가하기 때문으로 해석된다.
또한, TRV-SlJUL 과실의 총 당의 함량이 TRV-GFP 과실에 비해 최대 25% 증가함을 확인하였다. 구체적으로, TRV-SlJUL 과실은 TRV-GFP 과실보다 포도당과 과당 함량이 각각 28% 및 22% 더 높았다(도 26 참조).
뿐만 아니라, TRV-SlJUL 식물 뿌리의 총 생 중량 및 건조중량이 TRV-GFP 뿌리에 비해 유의하게 증가함을 확인하였다(도 27 참조).
한편, 35S:SlJULR20/81/151A 식물의 경우, 대조군과 비교할 때 과실 수는 51% 증가하였으나, 과실 크기가 더 작아 총 과실 중량은 대조군과 유의한 차이가 나타나지 않았다(도 28 참조).
sljul-Cas9 녹아웃 식물의 경우, 녹다운 식물과는 달리 대조군에 비해 식물의 성장이 약화되었고, 꽃의 수도 감소되었으며, 과실 수가 현저하게 감소되었으나 과실의 크기는 더 크게 관찰되었다(도 29a 및 29b 참조). 이는, 광동화에 대한 증가된 저장부 경쟁에 따라, 과실 수 및 과실 크기가 절충 관계(trade-off)에 있음을 의미한다.
또한, 체관이 증가한 토마토에서 충분한 자원을 주었을 때, 저장부로의 에너지 분배 정도를 확인하기 위해, 토마토 식물을 가지치기하여 경쟁을 줄이고 과실 성장이 손상되지 않는 과실 성장 조건을 구성하였다. TRV-SlJUL 식물과 대조군 TRV-GFP 식물 모두 식물 당 과실 수를 10개로 조정하였고, 저장부 바이오매스의 지표로 과실 크기 및 중량을 측정하였다(도 30 참조).
측정 결과, TRV-SlJUL 식물에서 과실 크기 및 중량은 대조군 과실에 비해 각각 최대 24% 및 66%로 크게 증가하였다(도 31 참조). 이는, 가지치기 후 남은 TRV-SlJUL의 과실 또는 sljul-Cas9의 희소한 과실이 더 많은 바이오매스를 축적할 수 있음을 의미한다.
상기 실험을 통해, SlJUL 발현을 억제할 경우 체관부 세포 집단이 증가하여 토마토의 저장 능력을 향상시키고, 체관의 증가와 수송 능력 증가 사이에 상관관계가 존재함을 확인하였다. 또한, 과실이 저장 능력보다 자원 공급에 제한적인 영향을 받음을 검증하였다.
상기 실시예들을 통해 확인한 녹다운 식물(TRV-SlJUL), 우성-음성 기능 식물(35S:SlJULR20/81/151A) 및 녹아웃 식물(sljul-Cas9)에서의 체관 세포 수, 체관부 마커 유전자 발현, 수송 능력 및 과실 수확량에 대한 종합적인 비교 결과를 정리한 결과, TRV-SlJUL 식물이 가장 높은 과실 수확량을 나타냄을 확인하였다(도 32 참조). 따라서, SlJUL 유전자 녹다운 식물체 TRV-SlJUL은 과실 수확량이 증가된 토마토 품종으로 유용하게 활용될 수 있다.

Claims (15)

  1. SlJUL 단백질 또는 SlJUL 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 억제제를 포함하는, 식물의 영양 저장 조직(sink tissue)의 영양 저장 능력(sink strength) 증진용 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 발현 억제제는 (a) SlJUL 단백질 또는 SlJUL 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 VIGS(virus-induced gene silencing) 벡터;
    (b) SlJUL 돌연변이 단백질 또는 SlJUL 돌연변이 유전자를 포함하는 벡터; 및
    (c) SlJUL 단백질 또는 SlJUL 단백질을 코딩하는 유전자를 편집하는 CRISPR/Cas9 벡터로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것인, 조성물.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 발현 억제제는 SlJUL 단백질 또는 SlJUL 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 VIGS 벡터인 것인, 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 SlJUL 단백질은 SlSMXL5(SUPPRESSOR OF MAX2 1-LIKE5) mRNA의 5'UTR(Untranslated region)에 결합하여 상기 SlSMXL5의 발현을 억제하는 것인, 조성물.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 SlJUL 단백질은 상기 SlSMXL5 mRNA의 5’UTR에 결합하여 RNA G-사중체(quadruplex)를 형성하는 것인, 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 식물의 체관부(phloem) 세포 수를 증가시키는 것인, 조성물.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 SlAPL 유전자의 발현을 증가시키는 것인, 조성물.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 식물의 체관 수송 속도를 증가시키는 것인, 조성물.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 SlSUT1, SlSUT2, SlSUT4 및 SlSWEET1a로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현을 증가시키는 것인, 조성물.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 식물의 과실 수확량을 증가시키는 것인, 조성물.
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 식물의 과실 당도를 증가시키는 것인, 조성물.
  12. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 식물 뿌리의 총 생 중량 및 건조 중량을 증가시키는 것인, 조성물.
  13. 청구항 1에 있어서, 상기 식물은 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량작물류;
    애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소작물류;
    인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용작물류;
    사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류;
    고구마, 돼지감자, 카사바, 마, 야콘을 포함하는 서류;
    장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류; 및
    라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 조성물.
  14. 청구항 1의 조성물을 식물체에 처리하는 단계;를 포함하는, 식물의 영양 저장 조직(sink tissue)의 영양 저장 능력(sink strength)을 증진시키는 방법.
  15. 청구항 14의 방법에 따라, 식물의 영양 저장 조직(sink tissue)의 영양 저장 능력(sink strength)이 증진된 식물체.
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