KR102491094B1 - 암반응 하배축 길이 증진 또는 내건성 강화용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 식물체의 암반응 하배축 길이 증진용 또는 내건성 강화용 조성물 및 암반응 하배축 길이 증진 또는 내건성 강화된 식물체의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 조성물 및 식물체의 제조 방법을 이용하면 암반응시 하배축 길이가 증진되거나 내건성이 강화된 신기능 식물체를 제조할 수 있다.

Description

암반응 하배축 길이 증진 또는 내건성 강화용 조성물{COMPOSITION FOR ELONGATING OF HYPOCOTYL LENGTH UNDER DARKNESS OR STRENGTHENING OF DROUGHT RESISTANCE}

본 발명은 암반응 하배축 길이 또는 내건성 관련 유전자 및 상기 유전자의 발현이 억제된 식물체에 관한 것이다.

프롤린(Pro)은 염분, 가뭄, 냉해, 산화 및 생물학적 스트레스와 같은 다양한 비생물적 스트레스에 반응하여 식물을 조절하는 호환 가능한 용질이다. 비생물적 스트레스 조건에서 Pro는 탈수를 완화하고 터거 압력(turgor pressure)의 균형을 맞추고, 단백질 구조를 안정화시키며, 세포 산화 환원 전위 균형을 유지하고, 자유 라디칼 수준을 제어하는 데 중요한 역할을 한다. Arabidopsis thaliana Ring Zinc Finger 1 (AtRZF1)은 C3H2C3 유형 E3 유비퀴틴 리가제를 인코딩한다. 처음에는 Pro 축적 억제자로 보고되었다. atrzf1 돌연변이는 다양한 비생물적 스트레스 하에서 둔감한 표현형을 보였다. 또한 AtRZF1은 ABA 신호 전달 경로를 모델링하여 비생물적 스트레스 반응을 조절하여 ABA 관련 성분임을 시사한다. 최근 수십 년 동안 BES1 / BZR1 (BRI1 EMS SUPPRESSOR 1 / BRASSINAZOLE RESISTANT 1) 및 BRs(Brassinosteroids) 반응 및 BRs 생합성을 조절하는 다운 스트림 전사 인자를 포함한 BR 신호 및 관련 구성 요소가 확인되고 특성화되었다. 여러 연구에서 외인성 BR이 식물의 가뭄 스트레스에 대한 내성을 향상시킬 수 있음을 암시했다. 일부 BR-결핍 돌연변이가 가뭄 내성 표현형을 나타낸다고도 보고됐다.

한국공개특허 제2011-0090349호

본 발명은 식물체의 암반응 하배축 길이 증진용 또는 내건성 강화용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 암반응 하배축 길이 증진 또는 내건성 강화된 식물체를 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

1. BEH3 (BES1/BZR1 homolog 3) 유전자의 발현 결손 또는 저해제를 포함하는 암반응 하배축 길이 증진용 또는 내건성 강화용 조성물.

2. 위 1에 있어서, 상기 발현 결손 또는 저해제는 T-DNA(transfer-DNA), siRNA(small interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 리보자임(ribozyme), PNA(peptide nucleic acids) 또는 CRISPR/Cas9뉴클레아제((Clustered　Regularly　Interspaced　Short　Palindromic　Repeats/ CRISPR-associated　sequences9 nuclease)인, 암반응 하배축 길이 증진용 또는 내건성 강화용 조성물.

3. 위 1에 있어서, 옥수수, 토마토, 콩, 수박, 고추 또는 배추의 내건성을 개선하는, 암반응 하배축 길이 증진용 또는 내건성 강화용 조성물.

4. 위 1에 있어서, 콩나물의 암반응 하배축 길이를 증진시키는, 암반응 하배축 길이 증진용 또는 내건성 강화용 조성물.

5. 위 1에 있어서, 대상 식물은 십자화과 식물인, 암반응 하배축 길이 증진용 또는 내건성 강화용 조성물.

6. 식물 세포의 BEH3 유전자를 결손 또는 억제시키는 단계; 및 상기 식물 세포로부터 식물체를 수득하는 단계;를 포함하는 암반응 하배축 길이 증진 또는 내건성 강화된 식물체를 제조하는 방법.

7. 위 6에 있어서, 상기 BEH3 유전자의 결손 또는 억제는 T-DNA, siRNA, shRNA, 리보자임, PNA 또는 CRISPR/Cas9 뉴클레아제를 식물 세포에 주입하여 수행되는, 암반응 하배축 길이 증진 또는 내건성 강화된 식물체를 제조하는 방법.

8. 위 6에 있어서, 상기 식물은 십자화과 식물인, 암반응 하배축 길이 증진 또는 내건성 강화된 식물체를 제조하는 방법.

본 발명은 식물체가 어두운 조건에서 성장할 때 하배축 길이를 증진하여 식물의 성장을 변화시키는 효과가 있으며 수분이 부족한 조건에서 성장할 때 식물의 내건성을 강화하는 효과가 있다.

도 1은 WT, atrzf1 및 pca41 식물에서 가뭄으로 인한 생리학적 매개변수의 비교 분석을 나타낸 것이다. 도 1A는 정상 또는 가뭄 스트레스 조건 하에서 각 유전자형 식물의 프롤린 축적을 나타낸 것이다. 도 1B는 2주 된 각 유전자형 식물을 14일 간 물을 주지 않고 성장시킨 후, 다음 7일 동안 다시 물을 준 경우에 pca41 식물이 가뭄 조건에서 WT 및 atrzf1 식물보다 더 잘 성장한다는 것을 나타낸다. 도 1C는 도 1B의 경우 살아남은 묘목의 수를 나타낸다. 도 1D는 4주 된 각 유전자형 식물의 수분 손실률을 나타낸다. 도 1E는 4주 된 식물을 물을 주지 않은 상태로 14일 동안 재배한 후의 각 유전자형 식물의 MDA 축적을 나타낸다.
도 2는 삼투 스트레스 또는 ABA 처리된 WT, atrzf1 및 pca41의 발아율, 녹화(greening)율 및 생중량을 나타낸다. 도2A는 각 유전자형의 종자를 MS 플레이트에 파종하고 7일 동안 성장한 후, pca41이 WT 및 atrzf1 식물과 유사한 성장(growth)과 녹색 떡잎을 가진다는 것을 나타낸다. 도 2B 및 2C는 400 mM 만니톨(B) 또는 0.7 μM ABA(C)에서 발아한 종자율을 나타낸 것이다. 도 2D는 종자를 400 mM 만니톨을 함유하는 MS 플레이트에 파종하고 9일 또는 11일 동안 성장시킨 경우, pca41이 삼투 스트레스 조건에서 WT 및 atrzf1 식물보다 더 잘 성장함을 나타낸다. 도 2E 및 2F는 400 nM 만니톨(E) 또는 0.7 μM ABA(F)가 보충된 MS 플레이트에 종자를 파종 후 떡잎의 녹화(greening)율을 나타낸다. 도 2G는 종자를 0.7 μM ABA를 포함하는 MS 플레이트에 파종하고 8일 또는 10일 동안 성장시킨 경우, pca41이 ABA 조건 하에서 WT 및 atrzf1 식물보다 더 잘 자란다는 것을 나타낸다. 도 2H 및 2I는 12일 동안 400 mM 만니톨(H) 또는 10일 동안 0.7 μM ABA(I)가 보충된 MS 플레이트에서 자란 각 유전자형 묘목의 생중량(fresh weight)을 측정한 것으로, 탈수 및 ABA 노출에 의해 생중량이 억제되는 것을 나타낸다.
도 3은 pca41에서 T-DNA 위치 확인 및 애기장대에서 BEH3의 발현 패턴을 나타낸다. 도 3A는 pca41에서 At4g18890 유전자의 3'-UTR에 T-DNA가 삽입되는 것을 나타낸다. 도 3B는 WT, atrzf1 및 pca41 식물의 genomic DNA-PCR 기반 유전형 분석 결과를 나타낸다. 도 3C는 WT, atrzf1 및 pca41 묘목의 총 RNA를 사용한 AtRZF1 전사체 축적의 RT-PCR 분석 결과를 나타낸다. 도 3D는 WT, atrzf1 및 pca41에서 At4g18880, At4g18890 및 At4g18900 전사의 RT-PCR 분석 결과를 나타낸다. 도 3E는 BEH3의 보존된 도메인 영역을 나타낸다. 도 3F는 뿌리(Rt), 줄기(St), 잎(Lv) 및 꽃(F1)에서 추출된 총 RNA를 사용하여 qPCR에 의해 BEH3의 발현 수준을 분석한 결과이다. 도 3G는 3일된 형질 전환 애기장대 뿌리 세포에서 GFP에 융합된 BEH3의 subcellular localization 분석 결과를 나타낸다. 도 3H 및 3I는 400 mM 만니톨(H) 또는 100 μM ABA(I)로 보충된 14일된 묘목에서 얻은 총 RNA를 사용하여 qPCR에 의해 분석된 삼투 스트레스 및 ABA 하의 애기장대 묘목에서 BEH3 발현 수준을 나타낸 것이다. 도 3J는 정상, 삼투 스트레스 및 ABA 하에서 2주된 BEH3 PRO-GUS 트랜스제닉 라인에서 BEH3의 발현 패턴을 나타낸다.
도 4는 BEH3 유전자는 탈수 및 ABA 반응을 음성 조절한다는 것을 나타낸다. 도 4A 및 4B는 pca41 및 atrzf1/BEH3 RNAi 계통이 삼투압 스트레스(A) 및 ABA(B) 조건 하에서 WT, atrzf1 및 pca41/BEH3 과발현 식물보다 더 나은 성장을 보이는 것을 나타낸다. 도 4C는 만니톨 및 ABA 존재 또는 부재 하에 MS 플레이트에 종자를 파종하고 녹색 떡잎을 가진 묘목을 세어 삼투압 스트레스와 ABA가 상보적 라인의 떡잎 녹화(greening)에 미치는 영향을 나타낸 것이다. 도 4D 및 4E는 BEH3 및 BEH3 RNAi 계통이 삼투 스트레스(D) 및 ABA(E) 조건에서 WT 및 BEH3 과발현 식물보다 더 나은 성장을 보이는 것을 나타낸다. 도 4F는 만니톨 및 ABA 존재 또는 부재 하에 MS 플레이트에 종자를 파종하고 녹색 떡잎을 가진 묘목을 세어 BEH3 형질 전환 계통에서 떡잎 녹화(greening)에 대한 삼투 스트레스 및 ABA의 효과를 나타낸 것이다.
도 5는 WT, atrzf1, pca41, beh3 및 BEH3-과발현 묘목에서 삼투압 스트레스 유발 과산화수소 함량 및 항산화 효소 활성 분석 결과이다. 도 5A 및 5B는 6시간 동안 400 mM 만니톨 미처리 또는 처리된 각 14일된 전체 묘목에서 과산화수소 축적을 DAB 염색으로 나타낸 것이다. 도 5C 내지 5E는 각 묘목에서 항산화 효소의 활성을 나타낸 것으로, 400 mM 만니톨의 미처리 또는 처리된 각 4주된 분리된 rosette 잎에서 APX(C), CAT(D) 및 Guaiacol POX(E) 활성을 측정한 것이다.
도 6은 beh3 및 atrzf1은 BR 수준을 조절하여 어두운 조건에서 자란 묘목의 하배축 신장을 조절한다는 것을 나타낸다. 도 6A 및 6B는 3일된 어두운 조건에서 자란 묘목 및 이를 사용한 하배축 신장 분석 결과이다. 도 6C 및 6D는 0.5 nM eBL의 존재 하에 3일된 어두운 조건에서 자란 묘목 및 이를 사용한 하배축 신장 분석 결과이다. 도 6E 및 6F는 1 μM BRZ의 존재 하에 3일된 어두운 조건에서 자란 묘목 및 이를 사용한 하배축 신장 분석 결과이다. 도 6G는 3일된 어두운 조건에서 자란 묘목의 BR 농도 분석 결과이다. 도 6H 및 6I는 3일된 어두운 조건에서 자란 묘목의 하배축 신장 조절 유전자인 ARF4(H) 및 ARF8(I)의 전사 수준을 qPCR에 의해 분석한 결과이다.
도 7은 탈수 조건에서 WT, atrzf1, pca41, beh3 및 BEH3 과발현 식물에서 BR에 대한 떡잎 녹화(greening) 반응 및 BR 관련 유전자의 발현을 나타낸 것이다. 도 7A 내지 7F는 6시간 동안 400 mM 만니톨 미처리 또는 처리된 2주된 각 유전자형 묘목에서 얻은 총 RNA 샘플을 이용하여 삼투 스트레스 반응에 관여하는 BR6OX2(A), CPD(B), DWF4(C), BAS1(D), SAUR9(E) 및 TCH4(F)의 발현 수준에 대한 qPCR 분석 결과이다. 도 7G 및 7H는 삼투 스트레스 조건 하에서 eBL 또는 BRZ 처리에 대한 떡잎 녹화(greening) 반응을 나타낸 것이다. 도 7G는 atrzf1, pca41 및 beh3 돌연변이가 삼투 스트레스 조건에서 0.1 μM eBL 또는 2 μM BRZ의 존재 하에 WT 및 BEH3-OE 식물보다 더 잘 성장하는 것을 나타낸다. 도 7H는 탈수 조건에서 자란 묘목의 떡잎 녹화(greening)에 대한 BR 또는 BRZ의 효과를 녹색 떡잎을 가진 묘목을 세어 나타낸 것이다.
도 8은 WT, atrzf1 및 pca41 식물에서 삼투 스트레스 유도 유전자의 발현 수준을 나타낸 것이다. 도 8A 내지 8F는 6시간 동안 400 mM 만니톨 미처리 또는 처리된 2주된 각 유전자형 묘목에서 얻은 총 RNA 샘플을 이용하여 삼투 스트레스 반응과 관련된 RD29A(A), RD29B(B), AtMYB2(C), AtOZF2(D), P5CS1(E) 및 P5CR(F)의 발현 수준에 대한 qPCR 분석 결과이다.
도 9는 BEH3 및 애기장대 상동체의 full-length 아미노산 서열 정렬을 나타낸 것이다. 도 9A는 WT, atrzf1 및AtRZF1-과발현(OE) 식물에서 At4g18890 유전자의 발현 수준을 2주된 묘목에서 추출한 총 RNA를 사용하여 qPCR에 의해 분석한 결과이다. 도 9B는 BEH3(At4g18890), BEH1(At3g50750), BEH2(At4g36780), BEH4(At1g78700), BES1(At1g19350) 및 BZR1 (At1g75080)의 아미노산 서열을 나타낸다. 도 9C는 애기장대 BEH3 members 간의 상동 관계를 나타내는 계통 발생 트리를 나타낸다.
도 10은 트랙스제닉 애기장대 라인에서 BEH3 promoter-GUS expression을 나타낸다. 도 10A 내지 10D는 각 1주된 묘목(A), 2주된 묘목(B), 꽃(C) 및 silique(D)에서 GUS발현을 나타낸다.
도 11은 빛이 있는 정상 조건에서 상보적 트랜스제닉 라인의 표현형을 나타낸다. 도 11A의 WT, atrzf1, pca41, beh3, 3개의 독립적인 atrzf1/BEH3 RNAi(atrzf1/ri2-4, atrzf1/ri4-7, atrzf1/ri6-8) 및 pca41/BEH3-OE(pca41/OX1-3, pca41/OX5-2, pca41/OX7-4) 상보적 트랜스제닉 라인은 2주된 묘목에서 추출한 총 RNA를 사용하여 qPCR에 의해 결정된 것이다. 도 11B는 WT, atrzf1, pca41 및 빛이 있는 조건에서 자란 상보적 트랜스제닉 식물의 표현형을 나타낸 것이다.
도 12는 WT, beh3, BEH3 RNAi 및 BEH3 과발현 식물에서 삼투압 스트레스 유발 Pro(proline) 및 MDA 축적을 비교 분석한 것이다. 도 12A는 2주된 묘목에서 추출된 총 RNA를 사용하여 WT, beh3, 2개의 독립적인 BEH3 RNAi(ri8-7, ri9-1) 및 BEH3 과발현(OE3-8, OE5-3) 트랜스제닉 라인에서 BEH3의 발현 수준을 qPCR에 의해 결정한 것이다. 도 12B는 2주된 묘목에서 추출된 총 RNA를 사용하여 WT, beh3, BEH3 RNAi(ri8-7) 및 BEH3 과발현(OE3-8) 트랜스제닉 라인에서 AtRZF1의 발현 수준을 qPCR에 의해 결정한 것이다. 도 12C는 빛이 있는 조건에서 성장한 WT, beh3 및 BEH3 트랜스제닉 식물의 표현형을 나타낸다. 도 12D 및 12E는 정상 또는 삼투 스트레스 조건 하에서 각 유전자형 식물의 Pro 및 MDA 축적을 나타낸 것으로, 빛이 있는 조건에서 성장한 4주된 묘목에서 분리된 rosette 잎을 400 mM 만니톨 없이 또는 12시간 동안 만니톨 처리하여 Pro(D) 및 MDA(E) 함량을 측정한 것이다.
도 13은 WT, atrzf1, pca41, beh3 및 BEH3 과발현 식물의 표현형을 나타낸 것이다. 도 13A는 5일된 빛이 있는 조건에서 성장한 묘목이고, 도 13B는 이를 사용해 하배축 신장을 분석한 결과이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 BEH3 (BES1/BZR1 homolog 3) 유전자의 발현 결손 또는 저해제를 포함하는 암반응 하배축 길이 증진용 또는 내건성 강화용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 "BEH3 유전자"는 식물에서 브라시노스테로이드(brassinosteroid, BR) 매개 신호 전달 경로와 전사 조절 등에 관여하는 유전자로 대부분의 식물체에 존재한다. 그 서열은 식물의 종류에 따라 일부 상이할 수 있으며, 예를 들면, 애기장대의 경우는 서열번호 1로 이루어진 서열을 갖는 것일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "발현 결손 또는 저해"는 그 유전자(DNA 또는 mRNA) 또는 단백질의 발현을 저해(발현량 감소)시키거나 그 발현을 완전히 제거하는 것을 의미하며, "완전히 제거하는 것"은 유전자 또는 단백질 발현이 탐지 불가능해지거나 무의미한 수준으로 존재하게 되는 것을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "가뭄 스트레스" 또는 "건조 스트레스"란 식물 성장에 있어서 정상적인 수분 공급이 되지 않는 상태로 식물 성장 및 생존에 피해 효과를 나타내는 모든 종류의 비생물적인(예를 들어, 여러 화학물질을 처리 또는 건조 조건에 노출) 및 생물적인(여러 감염원에 의한 감염) 스트레스 조건들을 포함하는 매우 일반적인 용어로 사용된다.

본 명세서에서 스트레스에 "저항성", "내성" 또는 "내건성" 가진다는 용어는 상기와 같은 스트레스에 대하여 그것의 야생형(Wild type, WT)의 손상에 비하여 검출 가능한 강한 저항성을 가지는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "암반응 하배축 길이 증진"이란 어두운 조건에서 식물의 하배축의 길이를 증진시켜 어린 식물의 성장을 변화시킨다는 의미이다.

본 발명의 BEH3 (BES1/BZR1 homolog 3) 유전자의 발현 결손 또는 저해제는 BEH3 유전자의 발현을 결손 또는 저해할 수 있는 모든 물질로서 물질의 타입이나 종류에 국한되지 않으며, 예를 들면 T-DNA(transfer-DNA), siRNA(small interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 리보자임(ribozyme), PNA(peptide nucleic acids) 또는 CRISPR/Cas9 뉴클레아제(nuclease) 등일 수 있다. 상기 예시한 핵산들의 경우 대상 식물의 BEH3 서열에 맞추어 설계되어, 그 발현을 저해 또는 결손 시킬 수 있는 서열을 갖는 것일 수 있다.

본 명세서에서 용어 "T-DNA"는 Agrobacterium 종의 Ti(tumor-inducing) 플라스미드의 전달(transfer) DNA로서 숙주 식물세포의 핵으로 전달되는 DNA 절편을 말한다. T-DNA의 양 끝 가장자리에는 25 bp의 반복서열이 존재하며, 전달은 왼쪽 경계(left border)에서 전달이 시작되어 오른쪽 경계(right border)에서 종료된다. 박테리아 T-DNA는 약 20,000 bp 길이로서 이들의 삽입에 의하여 타겟 유전자를 붕괴시킴으로써 삽입 돌연변이(insertional mutagenesis)를 일으키는 데에 사용되며, 삽입된 T-DNA 서열은 돌연변이를 일으킬 뿐 아니라 타겟 유전자를 표지하기도 한다. 목적으로 하는 유전자로의 T-DNA의 삽입은 T-DNA 콜렉션(The SAIL collection)으 로부터 특정 T-DNA를 선정하여 이용함으로써 유도할 수 있다. 각각의 T-DNA 콜렉션에 대한 염색체 삽입 위치가 알려져 있으므로 특정 유전자로의 T-DNA 삽입이 가능하다.

본 명세서에서 용어 "siRNA"는 특정 mRNA의 절단(cleavage)을 통하여 RNAi(RNA interference) 현상을 유도할 수 있는 짧은 이중사슬 RNA를 의미한다. 타겟 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥으로 구성된다. siRNA는 타겟 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉-다운 방법으로서 또는, 유전자 치료(gene therapy)의 방법으로 제공된다.

siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음)등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 전체 길이는 10 내지 100 염기, 바람직하게는 15 내지 80 염기, 가장 바람직하게는 20 내지 70 염기이다. siRNA 말단 구조는 타겟 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3 말단 돌출한 구조와 5 말단 쪽이 돌출한 구조 모두 가능하다. 돌출하는 염기 수는 한정되지 않는다. 예를 들어, 염기 수로는 1 내지 8 염기, 바람 직하게는 2 내지 6 염기로 할 수 있다. 또한, siRNA는 타겟 유전자의 발현억제 효과를 유지할 수 있는 범위에서 예를 들어, 한 쪽 말단의 돌출 부분에 저분자 RNA(예를 들어, tRNA, rRNA, 바이러스 RNA와 같은 천연의 RNA 분자 또는 인공의 RNA분자)를 포함할 수 있다. siRNA 말단구조는 양측 모두 절단 구조를 가질 필요는 없고, 이중사슬 RNA의 일방의 말단 부위가 링커 RNA에 의하여 접속된 스템 루프형 구조일 수도 있다. 링커의 길이는 스템 부분의 쌍을 이루는 데 지장이 없는 길이면 특별히 한정되지 않는다.

본 명세서에서 용어 "shRNA"는 단일 가닥으로 50-70개로 구성된 뉴클레오타이드를 의미하며, in vivo상에서 스템-루프(stem-loop) 구조를 이루고 있다. 5-10개의 뉴클레오타이드의 루프 부위 양쪽으로 상보적으로 19-29개의 뉴클레오타이드의 긴 RNA가 염기쌍을 이루어 이중가닥의 스템을 형성한다.

본 명세서에서 용어 "miRNA(microRNA)"는 유전자 발현을 조절하며, 전장 20-50개 뉴클레오타이드, 바람직하게는 20-45개 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 20-40개 뉴클레오타이드, 보다 더욱 더 바람직하게는 20-30개 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 21-23개의 뉴클레오타이드로 구성된 단일 가닥 RNA분자를 의미한다. miRNA는 세포 내에서 발현되지 않는 올리고뉴클레오타이드이며, 짧은 스템-루프 구조를 가진다. miRNA는 1 또는 2이상의 mRNA(messenger RNA)와 전체 또는 부분적으로 상동성을 가지며, 상기 mRNA와 상보적인 결합을 통하여 타겟 유전자 발현을 억제시킨다.

본 명세서에서 용어 "리보자임(ribozyme)"은 RNA의 일종으로 특정한 RNA의 염기 서열을 인식하여 자체적으로 이를 절단하는 효소와 같은 기능을 가진 RNA 분자를 의미한다. 리보자임은 타겟 전령 RNA 가닥의 상보적인 염기서열로 특이성을 가지고 결합하는 영역과 타겟 RNA를 절단하는 영역으로 되어 있다.

본 명세서에서 용어 "PNA(Peptide nucleic acid)"는 핵산과 단백질의 성질을 모두 가지고 있는 분자로서, DNA 또는 RNA와 상보적으로 결합이 가능한 분자를 의미한다. PNA는 핵산염기(nucleobase)가 펩티드 결합으로 연결 된 유사 DNA로 1999년에 처음 보고되었다(문헌 [Nielsen PE, Egholm M, Berg RH, Buchardt O, "Sequenceselective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide", Science 1991, Vol. 254: pp1497-1500]). PNA는 자연계에서는 발견되지 않고 인공적으로 화학적인 방법으로 합성된다. PNA는 상보적인 염기 서열의 천연 핵산과 혼성화(hybridization) 반응을 일으켜서 이중가닥을 형성한다. 길이가 같은 경우 PNA/DNA 이중가닥은 DNA/DNA 이중가닥보다, PNA/RNA 이중가닥은 DNA/RNA 이중가닥보다 안정하다. 펩티드 기본 골격으로는 N-(2-아미노에틸) 글리신이 아미드 결합에 의해 반복적으로 연결된 것이 가장 흔히 쓰이며, 이 경우 펩티드 핵산의 기본골격(backbone)은 음전하를 띠는 천연 핵산의 기본골격과 달리 전기적으로 중성이다. PNA에 존재하는 4개의 핵산염기는 공간적 크기와 핵산염기 사이의 거리가 천연 핵산의 경우와 거의 같다. PNA는 화학적으로 천연 핵산보다 안정할 뿐 아니라 핵산분해효소(nuclease)나 단백질분해효소(protease)에 의해 분해되지 않아 생물학적으로도 안정하다.

본 명세서에서 용어 "CRISPR/Cas9"은 크리스퍼(clustered regularly interspaced short palindromic repeat, CRISPR) 유전자 가위라 불리는 게놈(genome) 편집 방법으로, 표적 염기 서열에 특이적으로 결합하는 RNA(guide RNA, gRNA)와 해당 염기 서열을 자르는 가위 역할인 Cas9 단백질로 구성된다. 단일 가닥 가이드 RNA(sgRNA)에 의해 표적 DNA의 표적 염기가 인식되고, Cas9 단백질이 함유한 뉴클레아제(nuclease) 활성에 의해 DNA 이중 가닥 절단(double strand break, DSB)을 일으킨다. 이중 가닥 절단이 형성되면, 잘린 DNA는 크게 비상동 말단 접합(non-homologous end joining, NHEJ) 또는 상동 재조합(homologous recombination, HR)의 두 가지 경로에 의해 수선되는데, 이때 표적 특이적인 돌연변이 및 유전자 변형이 일어나게 된다.

본 발명의 조성물은 옥수수, 토마토, 콩, 수박, 고추 또는 배추의 내건성을 개선하는, 암반응 하배축 길이 증진용 또는 내건성 강화용 조성물일 수 있다.

본 발명의 조성물은 콩나물의 암반응 하배축 길이를 증진시키는, 암반응 하배축 길이 증진용 또는 내건성 강화용 조성물일 수 있다.

본 발명의 조성물은 대상 식물이 십자화과 식물인, 암반응 하배축 길이 증진용 또는 내건성 강화용 조성물일 수 있다.

본 발명의 조성물의 적용 대상인 '식물'은 특별히 한정되지 않으며, 상치, 배추, 감자 및 무를 포함하는 대부분의 쌍자엽 식물(dicotyledonous plant) 또는 벼, 보리, 바나나 등의 단자엽 식물 (monocotyledonous plant)을 모두 이용될 수 있으며, 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채를 포함하는 특용 작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료 작물류로 구성된 군으로부터 선택되는 식물체에 적용될 수 있고, 특히 토마토와 같이 과피가 얇아 노화에 따른 품질 저하가 급격히 나타나는 식용 채소 또는 과일 그리고 잎이 주된 상품으로 거래되는 식물 등에 적용할 경우 저장 효율을 높이는 데 효과적이다.

본 발명의 용어 "십자화과"(Cruciferae 또는 brassicaceae) 식물은 쌍떡잎식물 양귀비목의 채소류를 총칭하는 의미이며, 배추과 또는 겨자과라고도 한다. 대부분의 십자화과의 식물들의 잎은 홑잎 또는 겹잎이며, 턱잎은 없다. 꽃은 양성이고, 4개의 꽃잎이 십자 모양을 이룬다. 전세계적으로 약 350 속, 약 3,000 종이 알려져 있다. 본 발명에 따른 십자화과 식물의 예로는 특별히 제한되지 않으며, 애기장대, 무, 브로콜리, 콜리플라워, 케일, 상추, 배추, 적양배추, 양배추, 방울양배추, 콜라비 및 복초이(bok choy) 등을 포함한다.

본 발명은 또한, 식물 세포의 BEH3 유전자를 결손 또는 억제시키는 단계; 및 상기 식물 세포로부터 식물체를 수득하는 단계;를 포함하는 암반응 하배축 길이 증진 또는 내건성 강화된 식물체를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 '식물'의 종류는 특별히 한정되지 않으며, 전술한 '식물'의 범위 내일 수 있다.

본 발명의 '식물 세포'의 종류는 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양기관 또는 전체 식물이다. "식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.

BEH3 유전자의 결손 또는 억제는 당 분야에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있으며, 예를 들면 T-DNA, siRNA, shRNA, 리보자임, PNA 또는 CRISPR/Cas9 뉴클레아제 등을 사용하여 수행될 수 있다.

이들의 개별 구체적인 예시는 하기와 같다.

본 발명의 "BEH3 유전자를 결손 또는 억제시키는 단계"는 식물의 BEH3 유전자(서열번호 1)에 T-DNA를 삽입(insertion)하여 실시할 수 있다. 상기 T-DNA는 대상 식물의 BEH3 서열에 맞추어 설계되어, 그 발현을 저해 또는 결손 시킬 수 있는 서열을 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 "BEH3 유전자를 결손 또는 억제시키는 단계"는 타겟 유전자인 BEH3 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 sense RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 antisense RNA 가닥으로 구성된 siRNA를 상기 식물 세포에 주입하여 실시할 수 있다. 상기 siRNA는 대상 식물의 BEH3 유전자의 mRNA 서열에 맞추어 설계되어, 그 발현을 저해 또는 결손 시킬 수 있는 서열을 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 "BEH3 유전자를 결손 또는 억제시키는 단계"는 shRNA를 상기 식물 세포에 주입하여 실시할 수 있다. 상기 shRNA는 대상 식물의 BEH3 유전자의 mRNA 서열에 맞추어 설계되어, 그 발현을 저해 또는 결손 시킬 수 있는 서열을 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 "BEH3 유전자를 결손 또는 억제시키는 단계"는 BEH3 유전자의 mRNA 가닥의 상보적인 염기서열로서 BEH3 유전자의 mRNA에 특이성을 가지고 결합하는 영역과 해당 mRNA를 절단하는 영역으로 구성된 리보자임(ribozyme)을 상기 식물 세포에 주입하여 실시할 수 있다.

본 발명의 "BEH3 유전자를 결손 또는 억제시키는 단계"는 BEH3 유전자의 RNA와 상보적으로 결합이 가능한 PNA(peptide nucleic acid)를 상기 식물 세포에 주입하여 실시할 수 있다.

본 발명의 "BEH3 유전자를 결손 또는 억제시키는 단계"는 BEH3 유전자의 DNA에 특이적으로 결합하는 gRNA(guide RNA) 및 Cas9 뉴클레아제를 ribonucleoprotein(RNP) complex 형태로 상기 식물 세포에 주입하여 실시할 수 있다.

본 발명의 명세서에서 용어 "T-DNA", "siRNA", "shRNA", "리보자임", "PNA" 및 "CRISPR/Cas9 뉴클레아제"는 전술한 의미와 같다.

이후, 식물 세포로부터 식물체를 수득한다.

이는 당 분야에 공지된 재분화 방법에 의해 수득될 수 있으며, 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 다양한 공지된 기술이 적용될 수 있다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.

실시예

실험재료 및 방법

1. 식물 성장, 발달 및 스트레스 유도

Arabidopsis thaliana(애기장대) ecotype Columbia-0 (Col-0), atrzf1, pca41, beh3 및 BEH3 transgenic plants(형질 전환 식물)을 표준 챔버(22 ° C, 60% 상대 습도 및 16시간의 일광)에서 성장시켰다. ABA 및 삼투 스트레스의 경우, 2주 된 식물을 100 μM ABA 또는 400 mM 만니톨을 함유하는 용액에 넣고 부드럽게 섞었다. 이들 샘플을 ABA 또는 만니톨로 처리한 후 0, 3, 6, 12 및 24 시간에 수확하였다. 각각의 경우에, 수득된 묘목을 액체 질소에서 동결시킨 후 -80 ℃에서 저장하였다. 건조 스트레스의 경우, 식물은 2주까지 같은 화분에서 재배되었다. 이 식물들을 두 그룹으로 나누었다. 한 그룹은 정상적인 상태에서 4일마다 물을 충분히 공급받는 반면 다른 그룹은 14 일 동안 물을 주지 않고 건조 스트레스 처리했다. 7 일의 재급수(re-watering) 처리 후 생존 식물을 계수하였다.

2. TAIL(Thermal Asymmetric Interlaced)-PCR에 의한 genomic DNA의 T-DNA 위치 식별

genomic DNA를 pca41로부터 분리하였다. TAIL-PCR은 arbitrary degenerate 2 (AD2) 및 T-DNA left border-specific (LB) primers를 사용하여 수행되었다(표 1). 3차(tertiary) TAIL-PCR로부터 수득된 PCR 단편을 DNA 서열 분석을 위해 pGEM T-easy vector(Promega, Madison, WI, USA)에 삽입하였다. 수득된 서열에 NCBI BLAST 검색을 수행하였다. 유전자 특이적 프라이머를 설계하고(표 1), LB3 primer와 함께 사용하여 DNA 단편을 증폭시켰다. 이어서, DNA 단편을 서열 분석하여 T-DNA 위치를 결정하였다.

TAIL-PCR, qPCR, RT-PCR 및 gene cloning에 이용된 유전자 특이적 프라이머는 표 1과 같다.

TAIL-PCR	프라이머 서열 (5' to 3')	서열번호
LB1	ATACGACGGATCGTAATTTGTC	2
LB2	TAATAACGCTGCGGACATCTAC	3
LB3	TTGACCATCATACTCATTGCTG	4
AD2	NGTCGASWGANAWGAA	5
T-DNA region for pca41	프라이머 서열 (5' to 3')	서열번호
F1(정방향)	GTGAAGCTTTTTGATATCTCTTT	6
R1(역방향)	ACCATTCTCTATCAAAGCTAAA	7
beh3 genotype	프라이머 서열 (5' to 3')	서열번호
F1	ATGACGTCGGGGACTAGAAC	8
R1	TCATCTGGTTCTTGAGTTTC	9
atrzf1 genotype	프라이머 서열 (5' to 3')	서열번호
F1	TCTAGAATGTCAAGTATTCGGAATAC	10
LB1	GCGTGGACCGCTTGCTGCACCT	11
qPCR	프라이머 서열 (5' to 3')	서열번호
P5CS1 (At2g39800)	정방향: CGACGGAGACAATGGAATTGT역방향: GATCAGAAATGTGTAGGTAGC	12
AtOZF2 (At4g29190)	정방향: ATGATGATCGGAGAAACTCG역방향: ACACGGCTGAGTACGGTAAC	13
RD29A (At5g52310)	정방향: GACGGGATTTGACGGAGA역방향: CCGCCACATAATCTCTACCC	14
RD29B (At5g52300)	정방향: CGTCCTTATGGTCATGAGC역방향: GCCTCATGTCCGTAAGAGG	15
RAB18 (At5g66400)	정방향: CGATCCAGCAGCAGTATGAC역방향: TTCGAAGCTTAACGGCCACC	16
MYB2 (At2g47190)	정방향: ATGGAAGATTACGAGCGAAT역방향: CCACTAATCTCGGCATCCA	17
BEH3 (At4g18890)	정방향: CCTCGTGCTTCCTACAATCC역방향: GACTTAATGATAGCAAACGAC	18
AtRZF1 (At3g56580)	정방향: GAATTCATGTCAAGTATTCGGAATAC역방향: GTCGACATAGTCAAAAGGCCATCCAC	19
BR6OX2 (At3g30180)	정방향: CAACATAGCTGCGGTTCATG역방향: GTAACCCAACATGTCTGTGA	20
CPD (At5g05690)	정방향: CGAAGATCGGGTACCGTTTCTG역방향: CAAAGATGCTCGCACTTTCAAC	21
DWF4 (At3g50660)	정방향: GCTGAGATCACCGGTAACAC역방향: CTCTCGCTATCTTCTTCTTGC	22
BAS1 (At2g26710)	정방향: GTAGCAGCTGGTTCATTCCA역방향: CAGGATCGGCTACCGTTAAC	23
ARF4 ( At5g60450)	정방향: GCACACATGGAGGCTTCTCT역방향: ACCGAGGGATCAATCTCCCA	24
ARF8 (At5g37020)	정방향: GCAGCAGCAATCAGAGATGC역방향: ATTCTGCGGATTTCCGGGTT	25
SAUR9 (AT4G36110)	정방향: AAGAAGTCGAACAAAGCGGC역방향: TTGGGACCACATAGCGACTT	26
TCH4 (At5g57560)	정방향: ACGAGAGGTGGTTTGGTCAA역방향: CTCTGCACCCATCTCATCCT	27
RT-PCR	프라이머 서열 (5' to 3')	서열번호
BEH3 (At4g18890)	정방향: CCTCGTGCTTCCTACAATCC역방향: GACTTAATGATAGCAAACGAC	28
At4g18880	정방향: GATGGATGAGAATAATCATGG역방향: AGATGAGGTTGACCTCTCAC	29
At4g18900	정방향: CTGATGAACTTCCTTCTAAGG역방향: CTCTTGAGATATGGATCCATC	30
AtRZF1 (At3g56580)	정방향: GAATTCATGTCAAGTATTCGGAATAC역방향: GTCGACATAGTCAAAAGGCCATCCAC	31
ACT1 (At1g49240)	정방향: CATCAGGAAGGACTTGTACGG역방향: GATGGACCTGACTCGTCATAC	32
Gene cloning	프라이머 서열 (5' to 3')	서열번호
BEH3 (At4g18890)for overexpression and GFP transgenic line	정방향: GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCAT GACGTCGGGGACTAGAAC 역방향: GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCAT CTGGTTCTTGAGTTTC	33
BEH3 (At4g18890)for RNAi transgenic line	정방향: GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCG A TGGCTCAAG AACCTCTCTT 역방향: GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCATT CCATCAGCCATTGGCA	34
BEH3 (At4g18890)for GUS transgenic line	정방향: GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGG AGTAGGACGAATTGAGTC 역방향: GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCTC AGATCACCGGAATTTGG	35

3. bioactive endogenous BR 수준의 측정

신선한 조직 샘플을 인산 환충 식염수(PBS) 완충액에서 균질화(homogenized)하였다. 이어서, 균질물(homogenate)을 제조사의 지시에 따라 Plant Brassinosteroids ELISA kit(MyBiosource, San Diego, USA)를 사용하여 enzyme-linked immune-sorbent assay를 통해 분석했다. 450 nm에서 광흡광도(optical absorbance)를 측정하였다. 이어서, BR의 농도를 검량선(calibration curve)에 따라 계산하였다.

4. Pro (proline)축적, MDA 함량 및 물 손실률 결정

Bates et al.에 따라 Pro 축적이 추정되었다. (1973). 간단히 말하면, 잎(0.5 g)을 5 ml의 3% 설포 살리실산(sulfosalicylic acid)에서 분쇄하였다. 이어서, 250 ㎕의 추출물을 사용하여 150 ℃의 닌히 드린 시약 완충 용액(ninhydrin reagent buffer solution)(80% 빙초산(glacial acetic acid), 6.8% 인산(phosphoric acid), 70.17 mM 닌히 드린)과 90℃에서 1시간 동안 반응시키고, 빠르게 냉각시키고, 4℃에서 20분 동안 5,000 rpm으로 원심 분리하였다. 상청액(supernatant)을 수집하고 400 ㎕의 톨루엔을 첨가한 후 가볍게 소용돌이쳤다(swirling). 톨루엔 층의 흡광도 값을 UV/VIS spectrophotometer(JASCO, Tokyo, Japan)로 520 nm의 파장에서 측정하였다. 표준 곡선(standard curve)를 기준으로 pro 농도를 측정하였다.

MDA 함량은 thiobarbituric acid(TBA) 반응에 의해 결정되었다. 간단히 말하면, 잎 샘플(2-5 g)을 2-5 mL의 0.1% 트리클로로 아세트산(trichloroacetic acid, TCA)으로 분쇄하고 10,000 rpm에서 15분 동안 원심 분리하였다. 이어서, 2-5 mL의 상청액을 0.6% TBA와 혼합하고, 뜨거운 물(90 ℃) 용기(hot water bath)에서 15분 동안 배양하고, 얼음 위에서 즉시 냉각시키고, 15분 동안 5,000 rpm에서 원심 분리하였다. 착색된 상청액(colored supernatant)의 흡광도 값은 532 nm, 450 nm 및 600 nm의 파장에서 측정되었다. 착색된 상청액은 532 nm, 450 nm 및 600 nm의 파장에서 측정되었다. MDA 농도는 532 nm에서의 흡광도와 비교하여 450 nm 및 600 nm에서의 비특이적 흡광도를 빼서 추정되었다.

물 손실률은 분리된 잎을 어두운 곳에서 60% 습기의 실온에서 뚜껑이 열린 플라스틱 접시에 놓은 후 측정하였다. 각 샘플의 무게는 다른 시간에 측정되었다. 잎의 수분 함량은 잎의 초기 생중량(fresh water)을 기준으로 계산되었다.

4. ABA, 만니톨, eBL 및 BRZ 처리 조건 하의 생리적 표현형 분석

표현형 분석 및 비생물적 스트레스 실험을 위해, 모든 유전자형의 종자를 400 mM 만니톨 또는 0.7 μM ABA의 존재 또는 부재 하에 MS medium plates 상에서 성장시켰다. 종자 파종 후 6일까지 발아율을 평가하였다. 씨앗을 뿌린 후 7-12 일에 떡잎 녹화율(greening rate)을 기록하였다. 하배축 길이 분석을 위해, 모든 유전자형의 종자를 0.5 nM eBL 또는 1 μM BRZ가 있거나 없는 동일한 MS plate에서 성장시켰다. 이 plate들은 어두운 조건에서 수직 방향으로 향했다. 각 실험은 각 유전자형의 씨앗 50개로 구성되었다. 실험은 3회 수행되었다.

6. 총 RNA 추출, qPCR 및 RT-PCR 분석

식물 RNeasy Extraction Kit(Qiagen, Valencia, CA, USA)를 사용하여 동결된 샘플로부터 총 RNA를 추출하였다. 전체 RNA 추출 동안, 제조사의 지시에 따라 RNase-free DNase I(Qiagen)으로 처리함으로써 genomic DNA를 결손시켰다. RNA의 농도는 분광 광도 측정에 의해 정확하게 정량화되었다. 이어서, 총 RNA(5 μg)를 1.2% 포름 알데히드 겔에 로딩하여 농도 및 완전성(integrity)을 결정하였다. qPCR은 Rotor-Gene 6000 장비(Corbett Research, Mortlake, NSW, Australia)로 수행되었다. 결과는 RG 6000 1.7 소프트웨어(Corbett Research)를 사용하여 분석되었습니다. qPCR은 SensiMix One-Step(Quantance, London, UK)을 사용하여 구현되었습니다. 애기장대 액틴1(ACT1)을 표준화를 위한 내부 대조군으로 사용하였다. Delta-delta CT 방법(Livak and Schmittgen, 2001)을 사용하여 정량 분석을 수행하였다. 각 샘플을 3회 반복하였다. qPCR에 사용된 프라이머는 표 1에 나열되어 있다. RT-PCR을 사용하여 묘목에서 다양한 유전자의 발현 수준을 측정하였다. 총 RNA(300 ng)를 표 1에 열거된 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 RT-PCR에 대한 주형으로 사용하였다.

7. BEH3 형질 전환 라인(transgenic line)의 구축 및 GUS 발현의 분석

BEH3-overexpressing transgenic lines을 생성하기 위해, specific primers를 이용하여 BEH3 cDNA의 full-length을 증폭시켰다(표 1). PCR 산물을 공여자 벡터(donor vector) pDONR/ZEO(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 클로닝하고 DNA sequencing에 의해 확인하였다. 과발현 제작물(overexpression construct)은 constitutive 35S promoter의 제어 하에 식물 발현 벡터 pGWB514에서 서브 클로닝되었다. 이어서 BEH3-과발현 제작물을 planta vacuum infiltration을 통해 애기장대 WT 또는 pca41 돌연변이체로 형질 전환시켰다(BEchtold and Pelletier, 1998). 이어서, T2 형질 전환 식물의 Hygromycin B (A.G.Science, San Diego, CA, USA) 저항성을 단일 유전자좌로 분리하였다. T3 또는 T4 동형 접합 형질 전환 계통을 사용하여 다양한 스트레스 반응을 평가하였다.

BEH3 RNAi lines을 생성하기 위해, BEH3 cDNA 단편을 specific primer를 사용하여 증폭시켰다(표 1). PCR 산물을 공여자 벡터(donor vector) pDONR/ZEO에 클로닝하고 DNA sequencing에 의해 확인하였다. RNAi 제작물은 constitutive 35S promoter의 제어 하에 식물 발현 벡터(plant expression vector) p87GWIWG2ii로 서브 클로닝되었다. BEH3 RNAi 제작물을 애기장대 WT 또는 atrzf1 돌연변이체로 형질 전환시켰다. T2 형질 전환 식물의 phosphinothricin(Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Netherlands) 저항성을 단일 유전자좌로 분리하였다. T3 또는 T4 동형 접합 형질 전환 계통을 사용하여 다양한 스트레스 반응을 평가하였다.

BEH3 PRO-GUS 제작물을 생성하기 위해, BEH3 translation start codon으로부터의 1939-bp upstream genomic DNA 단편을 specific primer를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다(표 1). 이 생성물을 DNA 서열 분석을 위해 pDONR/ZEO vetor(Invitrogen)에 클로닝하였다. 결과물을 식물 발현 벡터 pBGWFs7.0으로 서브 클로닝하였다. BEH3 PRO-GUS 제작물을 애기장대 WT로 형질 전환시켰다. T2 형질 전환 식물의 phosphinothricin 저항성을 단일 유전자좌로 분리하였다. T3 또는 T4 동형 접합 형질 전환 라인을 사용하여 GUS 발현을 평가하였다. GUS 활성에 대한 BEH3 PRO-GUS 형질 전환 식물에서의 histochemical staining은 후술할 바와 같이 수행되었다. 다음, 묘목을 1 mM 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-glucuronic acid(X-Gluc), 100 mM sodium phosphate, pH 7.0, 0.5 mM potassium ferrocyanide, 0.5 mM potassium ferricyanide, 10 mM EDTA 및 0.1% Triton X-100 완충 용액에 4시간 동안 37℃에서 배양하였다. 클로로필을 75% 에탄올에 담가 샘플 조직에서 제거하였다. 전체 묘목 또는 식물 조직을 GUS 발현을 위해 염색하였다.

8. pca41로부터 beh3 단일 돌연변이 라인의 분리

pca41(atrzf1/beh3) 돌연변이체로부터 beh3 단일 돌연변이 라인을 분리하기 위해, pca41을 애기장대 WT와 교차시켰다. 발아하는 동안 Basta 내성에 대한 F1 및 F2 자손(progeny)의 반응을 분석하였다. 모든 F1 자손은 Basta에 내성이 있었다. F2 자손은 Basta 저항성 발아 종자 대 Basta 민감성 발아 종자의 비가 3:1의 분리비를 나타냈다 (χ² 3:1 ^{= 0.022, P ≤ 0.05; 표} 2). F3 progeny의 모든 Basta 저항성 식물로부터, beh3 단일 동형 접합성 돌연변이체를 각각 특정 영역 또는 beh3 또는 atrzf1 돌연변이체의 T-DNA 삽입 부위 프라이머(표 1 및 3)를 사용하여 genomic DNA-PCR에 의해 분리하였다.

Basta의 존재 하에 수행된 pca41의 유전자 분석은 표 2와 같다.

Generation	Number of germinations			χ2 3:1
	Total analyzed	Resistance to Basta (as beh3a)	Sensitive to Basta (as WT or atrzf1)
F1 WT x pca41	54	54	0	0.022
F2 WT x pca41	2,140	1,608	532
P = 0.05, aResistance to Basta(30 mg/L)

WT과 pca41을 교배한 경우 부모 및 자손의 유전자형 및 표현형은 표 3과 같다.

WT(col-0) x pca41
Generation	Genotype	Phenotype of Basta Resistance	Genomic DNAPCR product
			Specific region of beh3	T-DNA of atrzf1
P	WT: AABB	S
	pca41: aabb	R
F1	AaBb	R
F2	AABB	S	Yes	No
	AABb	R	Yes	No
	AaBB	S	Yes	Yes
	AbBb	R	Yes	Yes
	AAbb(beh3)	R	No	No
	Aabb	R	No	Yes
	aaBB(atrzf1)	S	Yes	Yes
	aaBb	R	Yes	Yes
	Aabb(pca41)	R	No	Yes
S, sensitive; R, resistance

9. 과산화수소 측정

과산화수소 축적은 3,3'-diaminobenzidine(DAB) 염색법을 사용하여 검출되었다(Daudi and O'Brien, 2012). 간단히, DAB를 증류수에 용해시키고 KOH로 pH 3.8로 조정하였다. 이어서 400 mM 만니톨 처리된 14일 된 묘목을 12시간 동안 DAB 염색 용액과 함께 배양하였다. 염색된 묘목 샘플을 세척 완충제(wash buffer)(에탄올, 아세트산 및 글리세롤) (3 : 1 : 1, v : v : v)로 표백하였다. Junglee 등(2014)에 의해 기술된 바와 같이, 요오드화 칼륨을 사용하는 비색법(colorimetric method)으로 각각의 샘플의 과산화수소 함량을 측정하였다. 간단히 말하면, pH 8에서 0.1 % 트리클로로 아세트산 (TCA), 1 M KI 및 10 mM 포타슘 포스페이트 완충액을 함유하는 2 mL의 완충액 중의 300 mg의 동결된 샘플을 4 ℃에서 15분 동안 균질화(homogenized)시켰다. 균질물(homogenate)을 4 ℃에서 20분 동안 10,000 g에서 원심 분리하였다. 이어서, 상청액을 350 nm에서 분광 광도계로 측정하였다. 0.1% TCA에서 제조된 과산화수소 용액으로 얻은 보정 표준 곡선을 정량에 사용하였다.

10. 항산화 효소의 활동 측정

항산화 효소의 활성은 Venisse et al.(2001)에 의해 분석했다. 간단히 말하면, 400mM 만니톨 처리된 14일 된 묘목을 3 mL 추출 완충제(extraction buffer)(50 mM 인산 나트륨 완충제, pH 7.5, 1 mM 폴리에틸렌 글리콜(polyethyleneglycol), 1 mM 페닐 메틸 술 포닐 플루오 라이드(phenylmethylsulfonyl fluoride), 8 % 폴리 비닐 폴리피롤 리돈(polyvinylpolypyrolydone) 및 0.01 % 트리톤(Triton) X-100)에서 균질화하였다. 균질물을 4℃에서 30분 동안 12,000 rpm에서 원심 분리하여 상청액을 수집하였다. Ascorbatep peroxidase(APX) 활성은 290 nm에서 분광 광도계로 측정되었다. 반응 혼합물은 1 mL 완충제 (0.2 M Tris/HCl, pH 7.8, 0.25 mM 아스코르브 산 및 0.5 mM 과산화수소)를 함유하였다. 퍼옥시다제(Peroxidase, POX) 활성은 470 nm에서 분광 광도계로 측정되었다. 반응 혼합물은 2 mL 완충액 (50 mM 아세트산 나트륨, pH 7, 25 mM 구 아이 아콜 및 25 mM 과산화수소)을 함유하였다. 카탈라제 (CAT) 240 nm에서 분광 광도계를 사용하여 측정하였다. 반응 혼합물은 3 mL 완충제 (50 mM 포타슘 포스페이트, pH 7.0 및 11 mM 과산화수소)를 함유하였다.

11. 형질 전환 식물에서 BEH3-GFP fusion proteins의 제작 및 세포 내 위치

BEH3의 세포 내 위치를 결정하기 위해, full-length의 BEH3 cDNA를 RT-PCR에 의해 증폭시켰다. 반응 프라이머는 표 1에 제시되어있다. BEH3 cDNA 단편을 pDONR/ZEO 벡터(Invitrogen)로 클로닝하고 DNA 시퀀싱에 의해 확인하였다. 이 제작물은 constitutive 35S 프로모터와 융합된 식물 발현 벡터 pEarlyGate103으로 서브 클로닝되었다. 형질 전환 식물 뿌리 세포에서 BEH3-GFP 단백질의 세포 내 위치를 결정하기 위해, 3일 또는 4일 된 묘목을 현미경 슬라이드 상에 장착하고 Olympus FluoView1000 공 초점 현미경 (Olympus, Tokyo, Japan)으로 모니터링 하였다. 각 GFP 이미지는 FV10-ASW 1.7A (Olympus) 소프트웨어로 수집 및 처리되었다.

12. 통계 분석

one-way variance analysis (ANOVA) 및 Duncan's multirange test를 포함한 모든 통계 분석은 SPSS 23.0 software (IBM Co, Armonk, NY, USA)를 사용하여 수행되었다. 그래프의 다른 문자는 평균이 P <0.05일 때, 통계적으로 다르다는 것을 나타낸다.

결과

1. pca41의 건조에 대한 반응으로 atrzf1의 내성 표현형의 추가 증가 효과

atrzf1의 Pro(proline) 및 수분 함량은 애기장대(Arabidopsis)에서 탈수 스트레스(dehydration stress) 내성 증가와 일관되게 고도로 축적되는 것으로 밝혀졌다. 비생물적 스트레스에 반응하여 Pro 대사 및 가교된 분자(cross-linked molecule)에서 atrzf1의 역할을 추가로 분석하기 위해, pca 돌연변이체를 만들었다. 건조 스트레스(drought stress) 하에서 둔감한 표현형인 atrzf1의 인핸서(enhancer)에 대한 후보 분자를 찾기 위해, 프롤린의 축적은 5주된 T1 형질 전환 식물의 절개된 잎 및 건조 스트레스(drought stress) 처리된 atrzf1에서 평가되었다. atrzf1보다 프롤린 축적이 더 많은 후보 인핸서 돌연변이체를 분리하였다. 이들 인핸서 돌연변이체 중 하나인 proline content alterative 41 (pca41)이 도 1A에 제시되어있다. 도 1A에 도시된 바와 같이, 건조 스트레스 후 프롤린 함량은 야생형(wild-type, WT), atrzf1 및 pca41에서 상향 조절되었다. 그 중에서도 pca41은 WT과 atrzf1보다 프롤린 함량이 상당히 높았다. 건조 스트레스에 대한 pca41의 반응을 추가로 관찰하기 위해, 건조 스트레스 처리된 WT, atrzf1 및 pca41 식물의 생존 분석(survival analysis)을 수행하였다. 도 1B에 도시된 바와 같이, 수분이 많은 토양 상태 하의 2주된 식물 WT, atrzf1 및 pca41 식물 간에 표현형의 차이는 없었다. 그러나, 14일 동안 물 공급이 중단되었을 때, WT 및 atrzf1은 pca4보다 더 시들해졌다. 7일의 재급수(re-watering) 후, atrzf1 및 pca41은 WT보다 더 푸르고 건강한 표현형을 나타냈고, 반면 pca41은 atrzf1 돌연변이체보다 더 정상적인 표현형을 가졌다. 또한 7일 동안 재급수 후의 WT, atrzf1 및 pca41 식물의 생존율을 추정했다. pca41의 생존율은 대략 82.3%였다. WT의 경우 44.2%, atrzf1의 경우 63%였다(도 1C). 본 발명자는 WT, atrzf1 및 pca41의 건조 내성, 수분 손실률 및 MDA(malondialdehyde) 함량을 추가로 조사했다. 도 1D-E에 도시된 바와 같이, pca41의 수분 손실률 및 MDA 함량은 건조 조건에서 WT 및 atrzf1 식물보다 낮았다. 이러한 결과는 pca41이 건조 스트레스에 대한 반응으로 atrzf1의 내성 표현형(tolerance phenotype)이 향상되었음을 나타낸다.

2. pca41은 삼투 스트레스와 ABA(abscisic acid)에 대해 atrzf1보다 초기 묘목 성장에서 더 둔감한 반응을 보인다

pca41이 탈수 및 ABA 반응에 관여하는지 여부를 평가하기 위해, 만니톨(mannitol) 또는 ABA에 반응하여 종자 발아율(seed germination percentage), 떡잎 녹색화율(cotyledon greening rate), 및 WT, atrzf1 및 pca41의 생중량(fresh weight)을 측정하였다. 정상 상태[Murashige and Skoog(MS) 배지]에서 WT, atrzf1 및 pca41 식물 간에 초기 묘목 성장에는 유의한 차이가 없었다(도 2A). 종자 발아 속도(seed germination percentage)는 제시된 날에(indicated days) WT, atrzf1 및 pca41 간에 유사하지만, WT는 400mM 만니톨을 함유하는 MS 배지에 종자 파종 후 2일째에 atrzf1 및 pca41보다 종자 발아 속도가 더 낮았다(도 2B). 그러나, pca41의 종자 발아 속도는 0.7 μM ABA를 함유하는 MS배지에 종자 파종 후 2일째 및 3일째에 WT 및 atrzf1 식물보다 현저히 높았다(도 2C). 이들 결과는 pca41 돌연변이체가 종자 발아 동안 탈수 반응을 나타내기보다는 ABA에 대한 atrzf1의 인핸서임을 나타냈다. atrzf1과 pca41의 비교는 400 mM 만니톨(도 2D 및 2E) 또는 0.7 μM ABA를 함유하는 MS배지에 종자 파종 후 제시된 날에 현저하게 짙은 녹색 떡잎을 나타냈다(도 2F 및 2G). 또한, pca41의 생중량(fresh weight)은 만니톨 또는 ABA 스트레스 조건 하에서 WT 및 atrzf1보다 상당히 높았다(도 2H 및 2I). 이러한 생리학적 결과는 pca41이 삼투압 스트레스 또는 ABA 하에서 WT 및 atrzf1보다 초기 묘목 성장에서 더 둔감한 반응을 나타냄을 입증한다.

3. pca41은 삼투 스트레스 관련 유전자에 음성으로(negatively) 작용한다.

삼투 스트레스 하에서 상향 조절되는 Responsive to Desiccation 29A (RD29A), RD29B, Arabidopsis thaliana MYB 2 (AtMYB2), Arabidopsis thaliana oxidation-related zinc finger 2 (AtOZF2), Delta 1-pyrroline-5-carboxylate synthase 1 (P5CS1) 및 Delta 1-Pyrroline-5-carboxylate reductase (P5CR) 유전자의 발현 수준은 WT에서 보다 atrzf1에서 더 높게 유도된다. WT 및 atrzf1과 비교하여 pca41 돌연변이체에서 이들 스트레스 유발성 유전자(stress-inducible genes)의 mRNA 수준을 분석하기 위해, quantitative real-time PCR(qPCR)을 수행하였다. 도 8A-F에 도시된 바와 같이, 만니톨 처리 후에 RD29A, RD29B, AtMYB2, AtOZF2, P5CS1 및 P5CR의 전사 수준이 높게 유도되었다. atrzf1 및 pca41의 모든 전사 수준은 WT보다 높았다. 이러한 관찰은 pca41 돌연변이체 및 atrzf1 돌연변이체에서 이들 스트레스 유발성 마커 유전자의 발현이 삼투 스트레스 조건 하에서 유사하게 조절됨을 나타낸다. AtRZF1 및 PCA41은 모두 탈수 관련 유전자에 대해 음성으로 작용할 수 있다. 따라서, PCA41은 삼투 스트레스에 반응하여 AtRZF1과 유사한 탈수 경로 기능을 공유할 수 있다.

4. single T-DNA fragment는 pca41 genomic DNA의 At4g18890 유전자의 3'-untranslated region에 가깝게 삽입된다.

pca41 genomic DNA 상의 T-DNA 삽입 부위 위치를 결정하기 위해, TAIL-PCR을 T-DNA specific LB3 및 임의의 AD2 프라이머(primer)를 사용하여 수행하였다(표 1). pca41에서의 T-DNA 삽입은 At4g18890 유전자의 3'-untranslated region에 가까운 영역에 위치하는 것으로 결정되었다(도 3A). pca41 genomic DNA로부터 T-DNA 삽입 부위의 위치를 보장하기 위해, genome specific primers (F1, forward 1; R1, reverse 1)를 준비하였다(도 3A). 도 3B에 도시된 바와 같이, F1-R1 DNA PCR fragment은 WT 및 atrzf1에서 수득되었다. 그러나, pca41 돌연변이체에서 PCR 생성물이 검출되지 않았다. LB3 및 R1 프라이머가 사용될 때, DNA PCR 단편은 pca41의 genome에서만 나타났다. 이러한 PCR-based genotyping(유전자형 분석) 결과는 T-DNA fragment 삽입이 pca41 표현형과 관련이 있음을 나타냈다.

activation-tagging vector에서 CaMV 35S 인핸서 요소의 4개의 카피가 T-DNA 삽입 부위에 인접한 이웃 유전자 좌(locus)에 영향을 미칠 수 있는지를 알기 위해, 이웃 유전자의 전사 수준을 RT-PCR에 의해 결정하였다. pca41에서의 At4g18880 및 At4g18900의 발현 수준은 WT 및 atrzf1의 발현 수준과 현저하게 다르지 않았지만, pca41에서의 At4g18890 유전자는 완전히 발현되지 않았다(도 3D). 흥미롭게도, At4g18890의 전사 수준은 WT의 전사 수준보다 atrzf1에서 유의하게 낮았다(도 3D). 그러나, At4g18890의 발현은AT 또는 atrzf1에서(도 9A)와 비교하여 AtRZF1-overexpressing transgenic line에서 현저히 높았는데, 이는 AtRZF1이 At4g18890유전자 발현을 조절할 수 있음을 암시한다. 따라서, At4g18890 유전자의 결손은 ABA 및 탈수 조건 하에서 pca41 표현형과 밀접한 관련이 있었다.

아미노산 정렬에 기초하면, At4g18890은 애기장대(Arabidopsis) genome에서 BES1/BZR1 homolog gene family(상동체 유전자 패밀리)에 속하였다(도 9B). BES1/BZR1 homolog 3(BEH3) 유전자로도 알려진 At4g18890은 BR(brassinosteroids) 신호 전달 반응을 조절할 수 있는 전사인자일 것으로 예상되었다. BEH3의 full-length cDNA는 BES1 N-terminal active Domain(BES1-ND)을 함유하는 284개 아미노산(aa)의 단백질을 암호화했다(31-104aa)(도 3E). BEH3는 애기장대에서 BES1/BZR1 homolg 단백질과 84% 이상의 동일성을 공유하였다. 서열 그룹들 사이의 거리를 나타내는 계통수(phylogenetic tree)를 cluster algorithms을 사용하여 구축하였다(도 9C).

BEH3의 기능을 조사하기 위해, BEH3의 발현 패턴을 qPCR 분석에 의해 초기에 평가하였다. 도 3F에 도시된 바와 같이, BEH3의 최고 발현 수준은 뿌리에서 검출되는 반면 꽃과 잎에서 중간 발현 수준을 나타냈다. 반면 줄기에서는 발현 수준이 낮았다. 또한, 본 발명자들은 1,939-bp BEH3 promoter(PRO)-glucuronidase(GUS) fusion construct를 갖는 애기장대 transgenic lines(형질 전환 라인)의 histochemical β-GUS 염색을 통해 기관 조직에서 BEH3 발현 수준을 결정하였다. BEH3 PRO-GUS transgenic lines(형질 전환 라인)의 분석은 뿌리, 떡잎, 장미 잎 및 꽃, 특히 꽃잎의 꽃밥 및 정맥에서 GUS 활성을 나타냈다(도 10A-C). silique(장각과)에서, 종자에서 GUS 염색은 검출되지 않았다. 그러나, silique의 하부 영역에서는 GUS 염색이 검출되었다(도 10D).

BEH3의 세포 내 위치를 평가하기 위해, BEH3와 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP) 사이의 translational fusion을 암호화하는 전이유전자(transgene)를 운반하는 형질 전환 식물(transgenic plant)을 조사함으로써 이의 축적을 결정하였다. BEH3-GFP의 형광은 주로 핵에서 검출되었고, 형질 전환 뿌리 세포의 세포질에서는 약하게 검출되었다(도 3G). 탈수 및 ABA 반응에 대한 애기장대에서 BEH3 발현 수준을 추가로 분석하기 위해, qPCR 및 GUS 염색 검정을 수행하였다. 도 3H 및 3I에 도시된 바와 같이, BEH3 전사체(transcript)는 각각 만니톨 또는 ABA 처리 후 12시간 또는 6시간 내에 최대 수준에 도달하였고, 나머지 처리 조건에서는 감소하였다. 비생물적 스트레스 유발성 Responsive to ABA 18(RAB18) 유전자는 만니톨 및 ABA 처리에 대한 기준으로 사용되었다. BEH3 PRO-GUS transgenic lines의 GUS 활성은 만니톨 또는 ABA 처리 동안 뿌리 및 rosette의 잎에서 강하게 유도되었다(도 3J). 종합하면, 이들 결과는 BEH3가 탈수 및 ABA에 의해 조절됨을 나타낸다.

5. BEH3의 결손(loss)은 atrzf1의 삼투 스트레스 및 ABA에 둔감한 특성을 개선시킬 수 있다

결손된 BEH3가 탈수 및 ABA 처리 동안 pca41 표현형을 담당하는지 여부를 확인하기 위해, 본 발명자들은 각각 CaMV 35S promoter를 atrzf1 또는 pca41 돌연변이체로 제어하여 BEH3-overexpressing(OX) construct를 사용하여 BEH3 RNA interference(ri) 또는 overexpressed BEH3을 수행하였다. 각 contruct에 대해, 15개의 homozygous lines(T3 generation)을 얻었다. 이들 중, 3개의 개별적인 atrzf1/beh3-ri construct complementary lines(atrzf1/ri2-4, atrzf1/ri4-7 및 atrzf1/ri6-8)은 BEH3 발현의 수준이 감소된 반면, 3개의 개별 pca41/BEH3-OX construct complementary lines(pca41/OX1-3, pca41/OX5-2 및 pca41/OX7-4)은 높은 수준의 BEH3 발현을 나타냈다. 이들은 표현형 특성 결정(phenotype characterization)을 위해 선택되었다(도 11A). 정상 조건 하에서 WT, atrzf1, pca41, 3개의 atrzf1/BEH3-ri 및 3개의 pca41/BEH3-OX complementary plants 간에 종자 발아 또는 초기 묘목 성장에 유의한 차이가 없었다(도 11B). pca41/BEH3-OX 라인과 pca41 돌연변이체의 비교는 종자 발아 후 12일 또는 10일에 각각 400 mM 만니톨 또는 0.7 μM ABA를 함유하는 MS plate에서 자랄 때 확대 및 녹화(greening)되는 떡잎이 현저히 적다는 걸 나타냈다(도 4A-C). 반대로, 떡잎이 녹화되는 비율(rate of cotyledon greening)은 atrzf1/BEH3-ri line과 pca41 돌연변이체 사이에서 유사한 반면, atrzf1/BEH3-ri line은 atrzf1 돌연변이체보다 떡잎 녹화(greening)에 현저하게 둔감했다(도 4A-C). 이러한 complementary experiments는 pca41 돌연변이체에서 BEH3의 억제가 atrzf1 돌연변이체의 삼투 스트레스와 ABA에 둔감한 특성을 개선시킬 수 있음을 나타낸다. 따라서, BEH3 및 atrzf1 이중 돌연변이는 비생물학적 스트레스(abiotic stress) 조건 하에서 pca41 표현형과 상관관계가 있다.

6. BEH3의 과발현(overexpression)은 삼투압 스트레스와 ABA에 대한 애기장대의 민감성을 준다

BEH3의 생리적 역할을 추가로 결정하기 위해, 본 발명자는 각각 400 mM 만니톨 또는 0.7 μM ABA를 함유하는 MS plate에서 표현형을 시험하기 위해 2개의 독립적인 homozygous transgenic BEH3-overexpressing(OE3-8 및 OE5-3) 및 BEH3 RNAi(ri8-7 및 ri9-1) line을 각각 선택하였다. BEH3 발현은 qPCR에 의해 평가되었다. OE3-8 및 OE5-3 라인은 WT 식물과 비교하여 높은 수준의 BEH3 전이유전자(transgene) 발현을 나타냈고, ri8-7 및 ri9-1 라인은 낮은 수준의 BEH3 유전자 발현을 나타냈다(도 12A). 또한, pca41(atrzf1/BEH3) 돌연변이체로부터 BEH3 single homozygous mutant(단일 동형 접합성 돌연변이체)를 분리하기 위해, pca41을 WT 식물과 교배시켰다. 종자 발아 동안 Basta에 대한 F1(first filial cross) 및 F2(second filial cross) progeny(자손)의 반응을 분석하였다. F1 progeny는 선택표지(selectable marker) Basta에 대한 저항성을 나타냈다. F2 progeny에서의 종자 발아는 Basta 저항성 발아 종자 대 Basta 민감성 발아 종자가 3:1의 분리 비율을 나타냈다(χ² 3:1 ^{= 0.022, p<0.05; 도 9}). 본 발명자들은F2 progeny에서 BEH3 동형 접합 돌연변이 라인을 얻었다. 식물의 유전자형에 대한 상세한 설명은 표 3에 제시되어있다. 마지막으로, BEH3 단일 동형 접합 돌연변이체는 BEH3-specific site 프라이머 및 arzf1-specific T-DNA insertion site 프라이머를 사용하여 genome DNA PCR에 기초하여 분리되었다(표 1 및 3). BEH3 단일 동형 접합 돌연변이체가 형성되었다. BEH3 전사체의 부재는 qPCR에 의해 확인되었다(도 12A). BEH3 유전자 발현의 정도에 따른 atrzf1 유전자의 발현 수준을 분석하기 위해, 본 발명자들은 WT, BEH3, BEH3 RNAi(ri8-7) 및 BEH3-overexpressing(OE3-8) 식물로부터 총 RNA를 추출하였다. 도 12B에 나타낸 바와 같이, atrzf1의 전사 수준은 WT 보다 BEH3 및 ri8-7 계통에서 유의하게 더 낮았다. 그러나, atrzf1의 발현은 WT, BEH3 및 ri8-7 식물과 비교하여 OE3-8 형질전환 라인(transgenic line)에서 현저히 높았으며(도 S5B), BEH3는 atrzf1 유전자 발현을 조절할 수 있음을 암시한다. 따라서, atrzf1 및 BEH3 유전자의 전사 조절은 상호적으로 제어되었다.

삼투 스트레스와 ABA 스트레스 하에서 떡잎 녹화(greening)에 대한 BEH3 발현의 효과를 조사하기 위해, WT, BEH3 및 BEH3 형질 전환 식물의 종자를 400 mM 만니톨 또는 0.7 μM ABA가 보충된 MS plate에서 발아시켰다. 그런 다음 각각 12일 또는 10일 동안 자라게 했다. 아무런 처리가 없으면, WT, BEH3, BEH3 RNAi (ri8-7 및 ri9-1) 및 BEH3-overexpressing(OE3-8 및 OE5-3) 식물 간에 차이가 나타나지 않았다(도 12C). BEH3 돌연변이체, WT 및 BEH3-overexpressing 형질 전환 식물을 비교하면 식물이 400 mM 만니톨 또는 0.7 μM ABA를 함유하는 MS plate 상에서 성장할 때 떡잎의 녹색이 덜 변한 것으로 나타났다(도 4D-F). 반대로, 떡잎의 녹화(greening) 비율은 BEH3와 BEH3-ri 라인에서 비슷했다(도 4D-F). 이들 결과는 BEH3가 삼투 스트레스와 ABA 하에서 초기 묘목 성장을 제어하는데 필요한 분자임을 나타낸다. 본 발명자는 추가로 WT, BEH3 및 BEH3 형질 전환 식물에서 BEH3 및 BEH3-ri 라인, Pro 및 MDA 함량의 탈수에 둔감한 반응을 조사하였다. 도 12D 및 12E에 도시된 바와 같이, Pro 함량은 삼투 스트레스 조건 하에서 WT 및 BEH3-overexpressing 식물에서보다 BEH3 및 BEH3-ri 라인에서 더 높았던 반면, MDA 함량은 WT 및 BEH3-overexpressing 식물보다 BEH3 및 BEH3-ri 라인에서 훨씬 더 낮았다. 이러한 결과는 BEH3 돌연변이체가 삼투 스트레스에 대해 더 둔감함을 나타냈다는 것을 제시한다. 따라서, BEH3는 삼투 스트레스 하에서 lipid peroxidation를 유발하는 ROS(reactive oxygen species)를 활성화시키는 역할을 할 수 있다.

7. BEH3는 산화 신호 경로(oxidative signaling pathway)를 자극함으로써 삼투 스트레스에 과민하게 유도된 조절제로서 기능한다

이전의 연구는 ROS가 비생물학적 스트레스 방어와 관련된 다양한 생물학적 과정에서 중요한 분자 신호로 작용할 수 있다고 제안했다. 게다가, BR 신호는 비생물학적 스트레스 내성을 부여하기 위해 ROS 생산을 조절할 수 있다. BEH3는 삼투 스트레스에 반응하여 ROS를 조절할 수 있기 때문에(도 12E), WT, atrzf1, pca41, BEH3 및 BEH3-OE 묘목에서 과산화수소의 검출 및 정량화는 3, 3'-diaminobenzidine(DAB) 염색을 사용하여 400 mM 만니톨로 처리한 후에 수행되었다. 도 5A 및 5B에 도시된 바와 같이, 과산화수소 처리된 묘목은 만니톨 처리 후 묘목보다 훨씬 약한 과산화수소 수준을 나타냈다. 삼투 스트레스 조건 하에서, atrzf1, pca41 및 BEH3 전체 묘목에서 과산화수소 축적의 유의한 변화가 검출되지 않은 반면, 과산화수소 함량은 WT 및 BEH3-OE 전체 묘목에서 증가되었다(도 5A 및 5B). 이들 결과는 BEH3 및 atrzf1이 비생물학적 스트레스 하에서 초기 묘종 단계(early seedling stage)에서 과산화수소 생산을 조절하는데 필요하다는 것을 입증한다. 다음으로, 삼투 스트레스에 의한 항산화 효소의 조절을 분석하기 위해, 만니톨 없이 또는 만니톨 처리된 WT, atrzf1, pca41, BEH3 및 BEH3-OE 식물에서의 APX(ascorbate peroxidase), catalase(CAT) 및 guaiacol peroxidase(POX) 활성이 조사되었다. 도 5C-E에 도시된 바와 같이, 과산화수소 처리 후 WT, atrzf1, pca41, BEH3 및 BEH3-OE 식물 간에 APX, CAT 또는 POX 활성에 유의한 차이가 없었다. 모든 식물 샘플에서 APX, CAT 및 POX 활성은 만니톨 처리에 반응하여 유도되었다. 전반적으로, 이들 항산화 효소의 삼투스트레스 유도 활성 수준은 WT 및 BEH3-OE 식물보다 atrzf1, pca41 및 BEH3 돌연변이체에서 훨씬 더 높았다(도 5C-E). 또한, APX 및 CAT 활성은 삼투 스트레스 조건 하에서 atrzf1 및 BEH3 돌연변이체보다 pca41에서 더 높았다(도 5C-E). 이들 실험은 BEH3 및 atrzf1이 삼투 스트레스 하에서 이들 항산화 효소의 활성을 억제할 수 있다는 것을 강력하게 시사한다. 따라서, BEH3와 atrzf1 사이의 전사 공동 조절(transcriptional co-regulation)은 ROS 매개 신호 전달 경로(ROS-mediated signaling pathway)를 통한 건조, ABA 및 삼투 스트레스 반응에서 중요한 역할을 할 수 있다.

8. BEH3 및 atrzf1은 BR 수준을 조절함으로써 어두운 조건에서 자란 묘목의 하배축 신장(hypocotyl elongation)을 음성으로 조절한다.

BEH3는 BR 신호 조절 인자(BR signaling regulatory factor)로 확인되었다. 그러나 BR 신호 반응에서 BEH3의 메커니즘 조절은 여전히 불분명하다. BR에 대한 BEH3 발현의 영향을 결정하기 위해, WT, atrzf1, pca41, BEH3 및 BEH3-OE 식물의 종자를 밝거나 어두운 조건에서 MS plate에서 발아시켰다. 각각의 묘목의 하배축 길이는 각각 밝은 또는 어두운 성장 조건에서 발아시킨 후 5일 또는 3일에 측정하였다. 밝게 자란(light-grown) 조건 하에서, 하배축 길이는 MS plate 상에서 성장한 WT, atrzf1, pca41, BEH3 및 BEH3-OE 묘목들 사이에서 유의하게 다르지 않았다(도 13A 및 13B). 그러나, 어두운 조건 하에서 자란 묘목에서 atrzf1, pca41 및 BEH3 돌연변이체의 하배축 길이는 WT 및 BEH3-OE 묘목보다 훨씬 길었다(도 6A 및 6B). 또한, BEH3-OE 묘목의 하배축 길이는 WT의 것보다 훨씬 짧았지만, pca41 돌연변이체는 어두운 조건에서 가장 긴 하배축 길이를 가졌으며, 이는 BEH3가 어두운 조건에서 성장하는 경우 하배축의 신장(elongation)을 음성 조절할 수 있음을 암시한다(도 6A 및 6B). 이 유전자 실험은 BEH3 및 atrzf1 둘 다 어두운 조건에 반응하여 하배축 신장의 조절에 관여할 가능성이 있음을 시사한다. 도 6A 및 6B에 도시된 결과에 기초하여, 본 발명자들은 BEH3-OE 형질 전환 라인에서 내재 BR 수준(endogenous BR level)을 감소시키면 어두운 조건에서 짧은 하배축 길이로 이어질 수 있다는 가설을 세웠다. 24-epibrassinolide(eBL)를 외인적으로(exogenously) 적용한 후 어두운 조건에서 BEH3-OE 계통의 짧은 하배축 표현형을 구할 수 있는지 여부를 해결하기 위해, 본 발명자는 0.5 nM eBL의 존재 하에 WT, atrzf1, pca41, BEH3 및 BEH3-OE 묘목의 하배축 길이를 분석했습니다. 어두운 조건에서 BEH3-OE와 WT 묘목의 하배축 길이는 eBL에 따라 서로는 매우 유사했지만, eBL에 반응하여 atrzf1, pca41 및 BEH3 돌연변이보다는 짧았다(도 6C 및 6D). 또한, atrzf1, pca41 및 beh3 돌연변이체의 하배축 길이는 유의하게 다르지 않았다(도 6C 및 6D). 따라서, eBL은 어두운 조건에서 BEH3-OE 형질 전환 라인 BR에 의해 유도된 하배축 신장 결함을 구제할 수 있다. 우리는 그 후 BR-생합성 억제제(BR-biosynthesis inhibitor)인 브라시 나졸(brassinazole, BRZ)의 존재 하에 어두운 조건에서 자란 묘목의 하배축 신장을 관찰하였다. 1 μM BRZ로 처리된 BEH3-OE 묘목은 WT 묘목보다 약간 짧은 하배축 길이를 나타냈으며(도 6E 및 6F), BEH3-OE 형질 전환 계통은 상대적으로 약한 BR 결핍 표현형(BR-deficient phenotype)을 나타냈다. 대조적으로, atrzf1, pca41 및 BEH3 돌연변이체는 묘목을 1 μM BRZ로 처리할 때 WT와 비교하여 향상된 하배축 신장을 나타냈다(도 6E 및 6F). 이러한 유전자 실험은 BEH3 및 atrzf1이 BR 수준을 조절함으로써 어두운 조건에서 자란 묘목의 하배축 신장을 음성 조절할 수 있음을 시사한다.

다음으로 본 발명자는 enzyme-linked immune-sorbent assay (MyBiosource, San Diego, CA, USA)를 사용하여 어두운 조건에서 자란 묘목에서 내재 활성 BR(endogenous active BR) 수준을 측정했습니다. 도 6G에 도시된 바와 같이, BR 수준은 어두운 조건 하에서 WT에서보다 BEH3-OE 형질 전환 계통에서 유의하게 더 낮았지만, BR 수준은 WT 및 BEH3-OE 묘목에서보다 atrzf1, pca41 및 BEH3 돌연변이체에서 유의하게 더 높았다. 또한, pca41 및 beh3 돌연변이체보다 atrzf1에서 약간 더 낮은 BR 수준이 관찰되었다(도 6G). 이들 결과는 BEH3 및 atrzf1 둘 다 어두운 조건 하에서 BR 생합성(biosynthesis)의 조절에 직접적으로 또는 간접적으로 관여한다는 것을 나타낸다.

BEH3 및 AtRZF1이 어두운 조건에서 하배축 신장의 조절과 관련될 수 있는지 여부를 추가적으로 확인하기 위해, 하배축 신장과 관련된 Auxin Response Factor 4(ARF4) 또는 ARF8 mRNA의 축적은 qPCR을 사용하여 어두운 조건에서 자란 묘목에서 평가되었습니다. qPCR 결과는 ARF4 및 ARF8 mRNA의 축적이 WT, atrzf1, pca41 또는 BEH3 식물에 비해 BEH3-OE 라인에서 유의하게 더 증가한 반면, ARF4 및 ARF8의 전사 수준은 atrzf1, pca41 및 BEH3 돌연변이체에서 WT에 비해 더 감소된 것으로 나타났다(도 6H 및 6I). 이들 두 유전자의 발현 수준은 atrzf1 돌연변이체에서보다 pca41 및 BEH3에서 더 낮았다(도 6H 및 6I). 이들 결과는 BEH3 및 atrzf1 둘 다 어두운 조건 하에서 이들 하배축 신장 관련 유전자의 발현 수준을 조절할 수 있음을 나타낸다. 종합적으로, 도 6에 도시 된 데이터는 BEH3와 atrzf1 유전자 사이의 협동(coordination)이 어두운 조건에서 BR 신호 전달을 통해 하배축 신장을 조절하는데 결정적인 역할을 한다는 것을 시사한다.

9. BEH3 및 AtRZF1은 삼투 스트레스 조건 하에서 BR 합성, 이화 및 반응성 관련 유전자(BR synthesis-, catabolic- and responsive-related genes)의 발현을 조절한다

BR-대사 및 반응성 유전자(BR-metabolic and -responsive genes)는 식물 발달 및 성장을 조절하는 비생물적 스트레스 신호의 이펙터(effector)인 것으로 비교적 잘 보고되어있다. 본 발명자의 연구는 또한 어두운 조건 하에서 WT, atrzf1, pca41, BEH3 및 BEH3-OE 묘목 사이에서 내재 BR 함량의 뚜렷한 차이를 보여주었다(도 6G). 삼투압 스트레스에 대한 떡잎 녹화(greening) 실험에서 atrzf1, pca41, BEH3 및 BEH3-OE 식물의 다른 민감도를 확인하기 위해, Brssinosteroid-6-Oxidase 2(BR6OX2), Constitutive Photomorphogenic Dwarf(CPD), Dwarf 4(DWF4) 및 Phyb-4 Activation-tagged Suppressor 1(BAS1) 유전자는 400 mM 만니톨 없이 또는 만니톨 처리한 후에 WT, atrzf1, pca41, BEH3 및 BEH3-OE 묘목에서 내재 BR 함량을 모니터링 하도록 qPCR에 의해 선택되었다. 정상 조건 하에서 WT, atrzf1, pca41, beh3 및 BEH3-OE 묘목의 BR-biosynthesis BR6OX2, CPD, DWF4 또는 BR-catabolic BAS1 유전자의 발현 수준은 매우 유사한 것으로 나타났다(도 7A-D). 도 7A-D에서 보이는 바와 같이, 삼투 스트레스로 처리된 모든 묘목은 처리되지 않은 샘플보다 BR-이화 유전자(BR-catabolic gene)가 아닌 3개의 BR-생합성 유전자(BR-biosynthesis gene)의 전사체 수준이 감소된 것으로 나타났는데, 이는 삼투 스트레스가 묘목 단계에서 BR 내인성 수준(BR endogenous level)을 조절할 수 있음을 암시한다. 삼투 스트레스 조건 하에서, BR6OX2, CPD 및 DWF4 mRNA의 발현 수준은 WT 및 BEH3-OE 식물보다 atrzf1, pca41 및 beh3 돌연변이체에서 더 높았지만, 이들 3 가지 유전자의 전사 수준은 WT와 BEH3-OE 식물 사이에서 크게 다르지 않았다(도 7A-D). 반대로, BR-이화 유전자(BR-catabolic gene)인 BAS1의 전사 수준은 WT 또는 BEH3-OE 식물보다 atrzf1, pca41 및 BEH3 돌연변이에서 낮았다(도 7D). 또한, BAS1 유전자의 축적은 탈수(dehydration) 조건 하에서 WT보다 BEH3-OE에서 더 높았다(도 7D). 이러한 결과는 BEH3 및 AtRZF1 유전자가 애기장대에서 탈수에 의해 유도된 민감도의 BR 조절에 필요하다는 것을 입증한다.

또한 탈수 스트레스와 관련된 BR-반응성 유전자 변화를 조사하기 위해, 우리는 두 가지 유전자인 Small Auxin Up RNA 9(SAUR9)와 Touch 4(TCH4)를 평가했는데, 둘 다 다양한 비생물적 스트레스와 관련이 있는 유전자이다. SAUR9 및 TCH4를 포함한 BR-유도성 유전자의 전사 수준은 삼투 스트레스 조건 하의 WT 및 BEH3-OE식물보다 atrzf1, pca41 및 BEH3에서 유의하게 높았지만, 이 두 유전자의 전사 수준은 WT 식물보다 BEH3-OE에서 약간 낮았다(도 7E 및 7F). 이러한 관찰은 AtRZF1 및 BEH3가 삼투 스트레스 조건 하에서 이들 BR-유도성 마커 유전자의 발현을 조절한다는 것을 나타낸다.

10. 삼투 스트레스 조건 하에서 BR에 대한 떡잎 녹화(greening)의 반응

BR-생합성 유전자(BR-biosynthesis genes)의 발현은 탈수 조건에서 BEH3 돌연변이체에 비해 BEH3-OE에서 유의하게 낮았으므로(도 7A-C), BEH3-OE의 만니톨에 의해 유도된 민감한 표현형은 외인적인 BR 적용(exogenous BR application)에 의해 구제될 수 있음을 추가로 조사하였다. 외인성 eBL(0.1 μM)의 존재 하에, 삼투 스트레스 조건 하에서 WT 및 BEH3-OE 식물에서 떡잎의 녹색화(greening) 속도가 증가하였다(도 7G 및 7H). WT와 비교하여, BEH3-OE 라인은 감소된 만니톨 반응을 나타냈다(도 7H). eBL이 돌연변이체에 적용되었을 때, 탈수 조건에서 atrzf1, pca41 및 beh3의 떡잎 녹색화 속도는 거의 유의하게 다르지 않았으며(도 7H), BEH3-OE 라인의 만니톨에 의해 유도된 민감한 표현형은 외인성 BR 적용에 의해 역전됨을 시사한다. 우리는 다음 삼투 스트레스 조건 하에서 BRZ(2 μM) 처리를 사용하여 떡잎 녹화를 조절하는 BEH3의 역할을 조사했습니다. 탈수 조건에서, atrzf1, pca41 및 BEH3 돌연변이체는 떡잎 녹화(greening)에 기초한 WT 및 BEH3-OE 묘목보다 BRZ 처리에 덜 민감하였다(도 7G 및 7H). 또한, BRZ로 처리된 BEH3-OE 라인은 WT 묘목보다 떡잎 녹화(greening)에 더 민감한 것으로 나타났습니다(도 7H). 이것으로부터, BEH3가 삼투 스트레스에서 BR에 의해 조절되는 떡잎 녹화(greening)에 관여한다고 결론 내렸다.

<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> COMPOSITION FOR ELONGATING OF HYPOCOTYL LENGTH UNDER DARKNESS OR STRENGTHENING OF DROUGHT RESISTANCE <130> 20P07046 <160> 59 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 2045 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 ataaaagcag cttgatagtc ttgacctttg aattctcaaa atgtaaacac aaactgtgtc 60 gcatttcgat tttcctgctt tattaaaaaa gcctgagcac gtgttaacac atatgggaca 120 tccttgtaaa ttacaacata ctttaagggt aatttcgtct tttcacaatc agacttcttt 180 tttcttcacc ctgttaagtg cttcttcatt tattactcca ccagaaaaaa ctcagaacca 240 gaaaaaggaa caaaacaaaa ataaagcgcg aaattagttt tcaccggcga gattttttat 300 cctctctacg agataacact tagaagaaga ggcagttaaa acagagagac gacgtcgtgt 360 tatttttcca aattccggtg atctgagaat gacgtcgggg actagaacgc cgacttggaa 420 agagagagag aacaacaaac ggcgagagcg gcgaagacga gcgattgcgg ctaagatctt 480 cgcaggacta aggattcatg gaaacttcaa gctccctaaa cactgcgaca acaatgaagt 540 cctcaaagct ttatgcaatg aagctggttg gactgtagaa gacgacggaa ctacttaccg 600 caaggtaaac 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Claims (8)

1. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 BEH3 (BES1/BZR1 homolog 3) 유전자의 발현 결손 또는 저해제를 포함하는 암반응 하배축 길이 증진용 또는 내건성 강화용 조성물.
   
2. 청구항 1에 있어서, 상기 발현 결손 또는 저해제는 T-DNA(transfer-DNA), siRNA(small interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 리보자임(ribozyme), PNA(peptide nucleic acids) 또는 CRISPR/Cas9뉴클레아제((Clustered　Regularly　Interspaced　Short　Palindromic　Repeats/ CRISPR-associated　sequences9 nuclease)인, 암반응 하배축 길이 증진용 또는 내건성 강화용 조성물.
   
3. 청구항 1에 있어서, 옥수수, 토마토, 콩, 수박, 고추 또는 배추의 내건성을 개선하는, 암반응 하배축 길이 증진용 또는 내건성 강화용 조성물.
   
4. 청구항 1에 있어서, 콩나물의 암반응 하배축 길이를 증진시키는, 암반응 하배축 길이 증진용 또는 내건성 강화용 조성물.
   
5. 청구항 1에 있어서, 대상 식물은 십자화과 식물인, 암반응 하배축 길이 증진용 또는 내건성 강화용 조성물.
   
6. 식물 세포의 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 BEH3 유전자를 결손 또는 억제시키는 단계; 및
   상기 식물 세포로부터 식물체를 수득하는 단계;를 포함하는 암반응 하배축 길이 증진 또는 내건성 강화된 식물체를 제조하는 방법.
   
7. 청구항 6에 있어서, 상기 BEH3 유전자의 결손 또는 억제는 T-DNA, siRNA, shRNA, 리보자임, PNA 또는 CRISPR/Cas9 nuclease를 식물 세포에 주입하여 수행되는, 암반응 하배축 길이 증진 또는 내건성 강화된 식물체를 제조하는 방법.
   
8. 청구항 6에 있어서, 상기 식물은 십자화과 식물인, 암반응 하배축 길이 증진 또는 내건성 강화된 식물체를 제조하는 방법.

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