CN102268415A

CN102268415A - 与植物生长相关的蛋白cyp724a及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN102268415A
Application number: CN 201110202541
Authority: CN
Inventors: 佩德罗萨尔瓦多卡尔蒂阿杜费雷拉达罗杰; 张如佳
Original assignee: Institute of Subtropical Agriculture of CAS
Current assignee: Institute of Subtropical Agriculture of CAS
Priority date: 2011-07-19
Filing date: 2011-07-19
Publication date: 2011-12-07
Anticipated expiration: 2031-07-19
Also published as: CN102268415B

Abstract

本发明公开了一种与植物生长相关的蛋白CYP724A及其编码基因与应用。本发明提供的的蛋白，是如下(a)或(b)或(c)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物生长相关的由序列2衍生的蛋白质；(c)任何其它多核苷酸序列，其编码的蛋白与ID No.1所述氨基酸序列组成的蛋白质具有相同功能，且所编码的蛋白质序列与ID No.1所述氨基酸序列具有85％以上一致性。本发明的实验证明，本发明获得CYP724A1基因过量表达的拟南芥。分别对转基因拟南芥和野生型拟南芥中的CYP724A1的表达量进行比较分析，发现转基因拟南芥中CYP724A1基因的表达量远远高于野生型。这对于培育优良的作物品种具有重要的理论和实际意义。

Description

与植物生长相关的蛋白CYP724A及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种与植物生长相关的蛋白CYP724A及其编码基因与应用。

背景技术

植物中，油菜素内酯类物质自然存在至少70种类固醇形式，其中包括重要的信号分子及其前体和代谢产物。BRs对植物的生长发育起着非常重要的作用，能够调节植物的生长发育过程，影响细胞分裂和伸长、细胞分化、光形态建成、暗形态建成、植株构象、花期、衰老和种子萌发。当植物中缺少BR合成或BR感知时，植物将表现出矮化等表型特征。

BRs在植物体内的合成积累受限于BR的生物合成速率。BR合成是通过一个复杂的代谢框架实现的，其中包含平行和相互交叉的路径，这些路径将甾醇前体转化成具有生物活性的BRs，如栗甾酮和油菜素内酯。其中，C-22羟基化反应是BRs生物合成关键的限速步骤，而此反应受到编码BR C-22羟化酶基因转录水平的调控。

植物中，细胞色素酶P450的两个亚族CYP90B和CYP724B能够催化BRs的C-22羟化反应。拟南芥(Arabidopsis thaliana(L.)Heynh.)中，基因DWF4编码的CYP90B催化BRs的C-22羟化反应，其无义突变体dwf4植株表现出油菜素内酯类物质缺失的典型症状：植株严重矮小、叶圆厚且呈深绿色、去顶端优势、衰老延迟、生殖力减退等。这些表明，拟南芥中DWF4基因是控制BR生物合成的主要基因。而在水稻(Oryza sativa)中，DWF4的同源基因OsDWF4的无义突变体仅表现出叶片直立的症状，除此并未表现出任何其他不正常的形态表型。这是由于其与编码OsCYP724B1的基因OsDWF4L1/D11的部分功能冗余所致。且水稻中，d11突变体植株表现出半矮化症状，说明OsCYP724B1为水稻主要的C-22羟化酶。相似的，在西红柿(Solanum lycopersicum)中，SlCYP90B3和SlCYP724B2均表现出具有C-22羟化酶活性，且所对应的基因在几个组织器官中的表达量水平相当。

激素和其他信号分子调节植物的生长发育和生理反应。由于其在调节过程中的重要性以及其潜在的经济价值，包括BRs在内的植物信号分子的代谢和作用模式，越来越受到研究者的关注。

BRs广泛参与调节植物的生长发育过程和生理反应，对植物的生长发育、形态建成、生物量及作物产量等方面都有十分重要的影响。当前，在农业和园艺上施加外源BRs或调节作物中内源BRs的含量已被引起重视。大量的BR C-22羟化酶被用于控制BRs的生物活性和作用水平，因此确定编码此酶的新基因就具有非常大的意义。单独或重组后利用这些新基因，创制转基因植株，这些转基因植株将根据不同的情况(如组织或器官特异性、发育阶段特异性、或对生物或非生物胁迫的响应)对BRs的水平进行调控。

发明内容

本发明的目的是提供一种与植物生长相关的蛋白CYP724A及其编码基因与应用，尤其提供与植物生长和/或植物油菜素内酯合成相关的蛋白及其编码多核苷酸。

本发明提供的蛋白，是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物生长和/或植物油菜素内酯合成相关的蛋白；

(c)与a)或b)限定的氨基酸序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同一性且与植物生长和/或植物油菜素内酯合成相关的蛋白。

所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

序列表中的序列1由479个氨基酸残基组成。为了使蛋白CYP724A1便于纯化，可在由序列表中序列1所示氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tagII	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述1)中的CYP724A1蛋白可人工合成，也可以先合成其编码多核苷酸，再进行生物表达得到。上述2)中的CYP724A1衍生蛋白可人工合成，也可通过将序列表中序列2所示的DNA序列缺失和/或增加一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签序列得到编码多核苷酸，再进行生物表达得到。

编码所述蛋白的多核苷酸也是本发明保护的范围，所述编码所述蛋白的多核苷酸也可以为编码所述蛋白的基因。

所述多核苷酸是如下1)-4)中任一所示的DNA分子：

1)序列表中序列2所示的DNA分子；

2)序列表中序列3所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码与植物生长和/或植物油菜素内酯合成相关的蛋白的DNA分子；

4)与1)或2)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码与植物生长和/或植物油菜素内酯合成相关的蛋白的DNA分子。

所述严格条件为在6×SSC，0.5％ SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％ SDS和1×SSC，0.1％ SDS各洗膜一次。

序列表中的序列2由1440个核苷酸组成，为编码蛋白CYP724A1的一个完整的cDNA，序列表中的序列3由2985个核苷酸组成，为CYP724A1的基因组DNA。

含有所述多核苷酸的重组结构、重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。

所述重组载体为将所述多核苷酸插入pCAMBIA1301载体中，得到表达所述蛋白的重组载体，具体为：将所述多核苷酸插入的pCAMBIA1301载体Nco I和PmaC I位点间，替换掉原有的gusA基因，得到的载体。

扩增所述多核苷酸全长或其任意片段的引物对也是本发明保护的范围，所述引物对中的一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列4，所述引物对中的另一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列5。

所述的蛋白或所述多核苷酸或所述重组结构或所述重组载体在合成油菜素内酯中的应用也是本发明保护的范围。

所述的蛋白或所述多核苷酸或所述重组结构或所述重组载体在促进植物生长中的应用也是本发明保护的范围。

所述促进植物生长表现为如下中的至少一种：增加莲座叶直径、提高株高、增加果荚柄长度、增加种子千粒重和增加单株种子重量。

所述植物为双子叶或单子叶植物，所述双子叶植物为拟南芥。

所述应用具体为将所述多核苷酸通过所述重组载体导入所述目的植物的突变体中，得到T1代转基因植物，所述T1代转基因植物中的恢复目的植物表型的T1代转基因植物的比率大于所述目的植物突变体自交后得到恢复目的植物表型T1代植物的比率。

所述比率为恢复目的植物表型T1代植物占总的T1代植物的数量比率。

本发明也保护一种DNA重组结构，通过编码油菜素内酯合成酶基因CYP724A1、启动子序列和植物表达载体可操作地连接而构建。为了筛选和表达的需要，还可选在DNA重组结构中包含筛选基因序列、报告基因序列以及其它为基因工程操作所需要而插入的各种内切酶位点，筛选基因和报告基因可以从本领域中常用的基因序列中选择。例如，可以在所述的重组结构中加入在植物或微生物中能表达的编码可以发生颜色变化的酶或发光化合物的基因，如GUS基因、GFP基因、荧光素酶等；具有抗性的抗生素标记物，如抗庆大霉素标记物，抗卡那霉素标记物等；抗化学试剂标记基因，如抗除草剂基因等。

用于构建本发明的DNA重组结构的启动子可以是任意一种启动子，包括增强型启动子、组成型启动子、组织特异性启动子、器官特异性启动子、诱导型启动子、发育调节型启动子、生理调节型启动子、或胁迫调节型启动子，如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、泛素(Ubiquitin)基因启动子(pUbi)、Actin启动子等。构建DNA重组结构时，所述启动子可以单独使用，可以和其它植物启动子或微生物启动子结合使用。用于构建本发明植物表达的启动子优选组成型启动子或组织特异性启动子，更优选来源于花椰菜花叶病毒的植物组成型启动子CaMV35S。通常，将CYP724A1基因构建在CaMV35S的下游。

此外，构建本发明的DNA重组结构时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

用于构建本发明的植物表达载体的出发载体可以是任意一种双元农杆菌载体或者可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN、pBY505或其它衍生植物表达载体。

本发明提供的培养转基因植物的方法，通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物或微生物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导或农杆菌介导等常规生物学方法，将含有本发明CYP724A1基因的DNA重组结构转染植物或微生物宿主而获得转化体。被转化的植物宿主可以是水稻、小麦、大麦、大豆、玉米、油菜、烟草、高粱、棉花、苜蓿、杨树、番茄、麻等具有经济价值的植物。被转化的微生物宿主可以是酵母、大肠杆菌、农杆菌、各种丝状真菌以及其它有潜在利用价值的微生物。

本发明的实验证明，本发明获得CYP724A1基因过量表达的拟南芥。分别对转基因拟南芥和野生型拟南芥中的CYP724A1的表达量进行比较分析，发现转基因拟南芥中CYP724A1基因的表达量远远高于野生型。将转基因和野生型拟南芥进行表型比较分析，发现过量表达CYP724A1基因的转基因拟南芥植株其植物叶片面积、株高以及果实千粒重都有所增加，这对于培育优良的作物品种具有重要的理论和实际意义。

附图说明

图1为CYP724A1基因的PCR扩增产物电泳结果

图2为酶切鉴定CYP724A1克隆

图3为p35S::CYP724A1表达载体酶切鉴定

图4为p35S::CYP724A1双元表达载体结构图

图5为潮霉素抗性筛选的T1代转化植株中T-DNA的鉴定

图6为在BR缺失突变体dwf4-102中过量表达CYP724A1基因进行功能互补验证

图7为抽薹期野生型和转基因拟南芥莲座叶直径统计

图8为野生型和转基因拟南芥成熟植株的株高统计

图9为野生型与转基因拟南芥果荚柄长度统计

图10为野生型与转基因拟南芥种子千粒重统计

图11为野生型和转基因拟南芥单株收获种子重量统计

图12为在转基因植株中利用RT-PCR检测CYP724A1基因过量表达

图13为dwf4-102转基因株系中CYP724A1的相对表达量

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实例中的试剂药品未做具体说明的均以普通市售，材料方法未做具体说明的均参考《分子克隆实验指南》(Sambrook和Russell，2001)。

实施例1、CYP724A1基因(多核苷酸)的克隆

一、拟南芥基因组DNA的获得

1、拟南芥基因组DNA的提取

取100mg拟南芥(Arabidopsis thaliana(L.)Heynh.)Col-0(购于美国拟南芥生物资源中心(the Arabidopsis Biological Resource Center，USA)，其编码为CS6000)新鲜植物组织，在液氮中迅速研磨成精细粉末状，装入1.5ml离心管中，然后按照DNase PlantMini Kit(QiaGen)的使用说明书提取拟南芥基因组DNA。

2、CYP724A1基因序列的扩增

根据GenBank搜索到的核苷酸序列设计该基因特异性PCR扩增引物：CYP724A1-F1(序列4)和CYP724A1-R1(序列5)。

引物CYP724A1-F1：5’-CCATGGTCTTATCCATCTTCTTGTCGTTAG-3’(序列4)

引物CYP724A1-R1：5’-GCAGCTAATCTTCAAGGAATTTTGTTGG-3’(序列5)

以上述拟南芥Col-0的基因组DNA作为模板，采用保真性较高的LA Taq聚合酶(TaKaRa)进行PCR扩增。扩增体系如下：2.5μl 10×PCR Buffer，0.5μl 10mmol/L dNTPs，0.5μl10μmol/L CYP724A1-F1，0.5μl 10μmol/L CYP724A1-R1，0.2μl LA Taq聚合酶，0.5μl拟南芥Col-0基因组DNA，20.3μl ddH₂O，总反应体积25μl。扩增程序：94℃预变性2min；94℃变性50sec，60℃退火50sec，72℃延伸5min，34个循环，反应结束。

3、PCR扩增产物的回收、连接及转化大肠杆菌DH5α

(1)PCR产物的纯化

将PCR扩增产物在1％(W/V)琼脂糖凝胶中进行电泳分离(如图1，其中M：D2000 plusmarkers；G：CYP724A1基因扩增产物；neg：PCR阴性对照。)，得到2988bp的PCR产物。

电泳结束后，在紫外光照射下进行切胶回收，利用凝胶回收试剂盒(天根)回收目的基因片断，并将回收片段在琼脂糖凝胶上电泳定量。

(2)DNA连接反应

参照pMD18-T Vector(TaKaRa)说明书，按试剂盒要求建立连接反应体系：pMD18-T Vector0.5μl，Solution I 4.5μl，回收基因片断2μl，ddH₂O 3μl，总反应体积10μl。16℃过夜连接。

(3)克隆与测序

将连接产物转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆。对阳性克隆提取质粒(pMD18::CYP724)用EcoRV(基因组上)和Xba I酶切鉴定，结果如图2所示，A为CYP724A1的基因组DNA插入pMD18-T载体的质粒图谱，B为酶切结果，其中，M：D2000 plus marker；1-4：分别代表pMD18::CYP724A1#1-#4的酶切产物，可以看出得到1958bp的为酶切阳性质粒，其中#2中目的片段为正确插入，为酶切阳性质粒。

将酶切阳性质粒送去测序，结果为该质粒含有PCR产物，该PCR产物的基因具有序列表中序列3所示的核苷酸序列，该基因命名为CYP724A1(基因组)，该基因编码的蛋白命名为CYP724A1，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列1，将该质粒命名为pMD18-CYP724A1(基因组)。

二、CYP724A1的cDNA验证

1、拟南芥总RNA的提取

根据TRIzol(Invitrogen)试剂提取法，选取由后面的实施例2得到的编号为J*的阳性T1代转CYP724A1拟南芥的新鲜幼苗，在液氮中研磨成精细粉末状，取约100mg粉末状材料置于盛有1.0ml TRIzol的1.5ml离心管中，充分混匀；12000g 4℃离心10min，取上清液，静止10min；加入200μl氯仿，振荡混匀，10000g 4℃离心15min，小心取出上层水相，转入另一离心管中；加入500μl异丙醇，室温(25℃)沉淀10min，10000g 4℃离心10min分离出RNA，再经75％酒精洗涤，室温微干后，加入适当体积的RNase-free的水，充分溶解。所提RNA经DNAase(Fermentas)处理。

2、cDNA合成和CYP724A1基因cDNA的序列PCR扩增

(1)cDNA一链合成

取上述获得的总RNA 1μg进行反转录，加入1μl 0.5μg/μL Oligo(dT)，加DEPC处理的水至终体积12μl，65℃温浴5min后，立即冰浴3min。然后依次加入4μl 5×RT buffer，1μl 20u/μL RNase抑制剂，2μl 10mmol/L dNTP，1μl 200u/μl M-MLV反转录酶，混匀，42℃反应60min，70℃加热5min终止反应。程序结束后，将一链产物于-20℃冻存，得到cDNA。

(2)PCR体外扩增

以拟南芥cDNA作为模板，采用保真性较高的LA Taq聚合酶(TaKaRa)进行PCR扩增。50μl扩增体系如下：5.0μl 10×PCR Buffer，1.0μl 10mmol/L dNTPs，1.0μl 10μmol/LCYP724A1-F1(序列4)，1.0μl 10μmol/L CYP724A1-R1(序列5)，0.4μl LA Taq聚合酶，2.0μl拟南芥cDNA，39.6μl ddH₂O。扩增程序：94℃预变性2min；94℃变性50sec，60℃退火50sec，68℃延伸3min，26个循环；70℃延伸5min，反应结束。

3、cDNA片段回收、连接及测序鉴定

将1443bp的PCR产物回收纯化。纯化后的片段连接到pMD18-T克隆载体(TaKaRa)上，得到重组载体，然后将该重组载体转化大肠杆菌，筛选阳性克隆，对阳性克隆进行EcoR I与Hind III双酶切鉴定，得到461bp，501bp，and 540bp的为酶切阳性质粒。

将酶切阳性质粒送去测序，结果为该质粒含有PCR产物，该PCR产物的基因具有序列表中序列2所示的核苷酸序列，该基因命名为CYP724A1，该基因编码的蛋白命名为CYP724A1，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列1，将该质粒命名为pMD18-CYP724A1(cDNA)，将序列2翻译后与序列1相比，结构区相同，证明序列2为cDNA。

实施例2、转CYP724A1拟南芥的获得及其功能研究

一、转CYP724A1拟南芥的获得

1、过量表达载体的构建

以CYP724A1基因(基因组DNA)取代表达载体pCAMBIA1301上的gusA基因，获得p35S::CYP724A1双元表达载体，具体方法如下：

1)用Nco I和Sma I酶切由实施例1得到的pMD18-CYP724A1(基因组)，回收3005bp目的片段，

2)用Nco I和PmaC I(PmaC I和Sma I为平末端)酶切双元质粒载体pCAMBIA1301(购于澳大利亚CAMBIA)，得到载体大片段(不含gusA基因的载体片段，9801bp)；

3)将步骤1)得到的目的片段与步骤2)得到的载体大片段连接，得到的连接产物转化大肠杆菌DH5α，在含有50μg/ml的卡那霉素的培养基上筛选，得到转化子提取质粒，用限制性内切酶EcoR I酶切质粒，结果如图3A，其中，M：D2000 plus marker；1-10：代表不同编号质粒的酶切产物。p35S::CYP724A1质粒完全酶切将得到10.1kb、1.8kb和0.9kb三种大小的目的片段，可以看出，其中克隆#4、#5、#8和#9中目的片段正向插入，图中所示酶切产物除三条目的片段外，在2.7kb处还存在一条较弱的条带，此条带为片段1.8kb和0.9kb间的EcoR I位点未充分酶切造成的。将阳性质粒送去测序，结果为该质粒为将序列表中的序列3插入载体pCAMBIA1301的Nco I和PmaC I位点间得到的质粒，将该质粒命名为p35S::CYP724A1(p35S-CYP724A1)，其结构示意图如图4所示，如图所示pCAMBIA1301载体包括以下几个特征：受花椰菜花叶病毒(CaMV)double 35S启动子(2x CaMV35S)操纵的筛选标记hptII、CaMV 35S转录终止子、T-DNA左边界(LB)和右边界(RB)。图中载体还包括受到CaMV 35S启动子调控的CYP724A1基因nos转录终止子(nos Term)。

2、转CYP724A1拟南芥(dwf4-102)的获得

用冻融法将构建的植物过量表达载体p35S::CYP724A1质粒导入农杆菌GV3101(pMP90)，具体步骤如下：从-70℃超低温冰箱中取出保存的农杆菌GV3101(pMP90)(Koncz C.；SchellJ.，(1986)The promoter of T_L-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression ofchimaeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary vector.Mol.Gen.Genetics，204：383-396，公众可从中国科学院亚热带农业生态研究所获得。)感受态细胞，冰浴融化；取10-20μl上述获得的p35S::CYP724A1质粒DNA(约1-2μg)，加入到200μl融化的农杆菌感受态细胞中，用灭菌枪头快速搅匀，静置数分钟；置于液氮中1min，37℃水浴5min，加入1ml LB液体培养基，28℃ 200rpm振荡活化4h；然后1000g离心30sec，去部分上清液，保留100-200μl的上清液，用枪头反复轻轻吸打使其菌落重新悬浮，再将悬浮的菌液均匀涂布于含50mg/L卡那霉素、100mg/L利福平、34mg/L氯霉素的LB平板上，28℃倒置培养2d。

转化子鉴定：从含有卡那霉素、利福平、氯霉素3种抗生素的LB平板上挑取转化子，并接种到含50mg/L卡那霉素、100mg/L利福平、34mg/L氯霉素的5ml LB液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养40h。提取转化子的质粒，用EcoR I酶切质粒，结果如图3B，其中，Ec：源于E.coli克隆#4p35S::CYP724A1质粒(图3A的4对应的克隆)EcoR I酶切产物；1-6：源于农杆菌质粒的酶切产物；M：D2000 plus marker，p35S::CYP724A1质粒完全酶切将得到10.1kb、1.8kb和0.9kb三种大小的目的片段，可以看出，均为阳性质粒，将阳性质粒送去测序，结果为该质粒为p35S::CYP724A1，确认p35S::CYP724A1已成功导入。含有该质粒的转化子命名为GV3101(pMP90)/p35S::CYP724A1。

采用农杆菌浸染花序法(Clough，SJ；Bent AF(1998).Floral dip：a simplified methodfor Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.Plant J.16：735-743)转化表型正常的dwf4-102杂合体拟南芥(株系SALK_020761，购买于美国拟南芥生物资源中心(Arabidopsis Biological Resource Center，USA)，其基因型为DWF4/dwf4)，得到T1代转CYP724A1拟南芥。

表型正常的dwf4-102杂合体拟南芥自交得到F1代，根据孟德尔经典遗传学可知，其表型发生3:1分离，即基因型为DWF4/DWF4的dwf4-102野生型植株(即为野生型拟南芥)和基因型为DWF4/dwf4的dwf4-102杂合体，其表型均为正常；而基因型为dwf4/dwf4的dwf4-102纯合突变体(株系SALK_020761，美国拟南芥生物资源中心(Arabidopsis Biological ResourceCenter，USA))，则表现出油菜素内酯缺失的典型症状，植株严重矮小、叶圆厚且呈深绿色、去顶端优势、衰老延迟、生殖力减退、不育。

3、T1代转CYP724A1拟南芥的鉴定

在含有35μg/ml潮霉素的1/2MS培养基上对T1代转CYP724A1拟南芥进行筛选。将对潮霉素具有抗性的转化植株移入普通1/2MS培养基上进行培养，待长到4叶期时移入土壤中。待T1代转CYP724A1拟南芥移栽存活，取20mg叶片提取基因组DNA，以pC13-hyg-F(序列9，5’tttagcgagagcctgacctattgc 3‘)和pC13-hyg-R(序列10，5’cgtcaaccaagctctgatagagttg 3‘)为引物进行扩增，利用PCR扩增检测HPt II基因(表达载体上的筛选标记，HPt II基因的插入片段(595bp))。扩增体系如下：2.5μl 10×PCR Buffer，0.5μl 10mmol/L dNTPs，0.5μl 10μmol/L pC13-hyg-F，0.5μl 10μmol/LpC13-hyg-R，0.2μl Taq聚合酶，0.5μl基因组DNA，20.3μl ddH₂O，总反应体积25μl。扩增程序：94℃预变性2min；94℃变性50sec，60℃退火50sec，72℃延伸45sec，36个循环，反应结束。

将PCR扩增产物进行凝胶电泳，结果如图5所示，其中，M：D2000 plus marker；1-16：初步筛选的T1代转CYP724A1拟南芥的PCR产物；neg：PCR阴性对照，得到595bp的为阳性T1代转CYP724A1拟南芥，确认获得转基因植株，共得到14株阳性T1代转CYP724A1拟南芥。

二、CYP724A1基因的功能验证分析

1、转基因拟南芥与野生拟南芥及突变体dwf4-102的表型比较

将上述14株阳性T1代转CYP724A1拟南芥与dwf4-102杂合体拟南芥进行表型比较分析。拟南芥纯合突变体dwf4-102表现典型的BR缺陷型症状，如矮小。如果恢复突变体中BR合成途径上的C-22羟化酶活性，那么这些症状将消失。

所获得的14株T1代转基因植株的基因型包括DWF4野生型、纯合(dwf4)和杂合dwf4-102突变型，但是这14株T1代转基因植株并未出现矮化等BR缺陷型症状。

1)基因型鉴定

取14株编号分别为A-N的阳性T1代转CYP724A1拟南芥植株对DWF4基因进行基因型鉴定，具体方法如下：分别提取T1代转基因植株DNA，以DWF4-F(序列13，5’CCTGGAGAAGAAGAAACAGAGC3‘)和DWF4-R(序列14，5’GAACATCTTTGAGTGCTTTGCG 3‘)为引物，利用PCR扩增检测DWF4基因。扩增体系如下：2.5μl 10×PCR Buffer，0.5μl 10mmol/L dNTPs，0.5μl 10μmol/L DWF4-F，0.5μl 10μmol/L DWF4-R，0.2μl Taq聚合酶，0.5μl基因组DNA，20.3μl ddH₂O，总反应体积25μl。扩增程序：94℃预变性2min；94℃变性50sec，54℃退火50sec，72℃延伸1.5min，36个循环，反应结束。PCR产物片段大小为0.9kb。再以DWF4-F(序列13，5’CCTGGAGAAGAAGAAACAGAGC3‘)和LBc(序列15，5’GGAACAACACTCAACCCTATCTCG3’)为引物，PCR扩增检测dwf4基因。扩增体系如下：2.5μl 10×PCR Buffer，0.5μl 10mmol/L dNTPs，0.5μl 10μmol/L DWF4-F，0.5μl10μmol/L LBc，0.2μl Taq聚合酶，0.5μl基因组DNA，20.3μl ddH₂O，总反应体积25μl。扩增程序：94℃预变性2min；94℃变性50sec，56℃退火50sec，72℃延伸1.5min，36个循环，反应结束。PCR产物片段大小为1.0kb。将两次PCR产物分别进行凝胶电泳，结果显示：植株B、D、G以DWF4-F/R为引物时获得目的片段，而以DWF4-F/LBc为引物时未检测到目的片段，说明植株B、D、G的基因型为DWF4/DWF4；植株A、E、H、I、L、M、N以引物DWF4-F/R和DWF4-F/LBc进行检测，均获得目的片段，说明这7个转基因植株的基因型为DWF4/dwf4；而植株C*、F*、J*、K*以DWF4-F/R为引物未检测目的片段，而以DWF4-F/LBc为引物检测到目的片段，说明植株C*、F*、J*、K*的基因型为dwf4/dwf4。

2)表型鉴定

选取编号为D、K*、C*、J*、F*的阳性T1代转CYP724A1拟南芥株系、dwf4-102纯合突变体和野生型拟南芥(Col-0)种植于土壤中，并于22℃，光照16小时黑暗8小时的温室中培养五周，观察表型如图6A所示，可以看出，与dwf4-102纯合突变体相比，所获得的编号为D、K*、C*、J*、F*的阳性T1代转CYP724A1拟南芥株系并未出现矮化等BR缺陷型症状(dwf4-102具有的性状)，恢复野生型(Col-0)的表型。

成熟期，野生型植株(Col-0)、dwf4-102纯合突变体与编号为F*的阳性T1代转CYP724A1拟南芥的株高比较，如图6B所示，图中所示均为相同条件下同时培育的植株，培养10周后，当野生型植株处于衰老期时，dwf4-102突变体植株却处于营养生长期，而编号为F*的阳性T1代转CYP724A1拟南芥处于开花期。

结果表明CYP724A1过量表达能够促进植物生长。

在生长发育的各个时期，对编号为B、D、G、F*的阳性T1代转CYP724A1拟南芥、dwf4-102纯合突变体和野生型拟南芥(WT)的表型进行比较分析，主要比较分析了以下几个方面的参数：主茎的高度、莲座叶直径、果荚柄长度、种子的千粒重以及单株收获种子的重量等。结果如下表2所示，实验重复三次，结果取平均值：

表2 表型观察结果

nd表示未测量、na表示不可能进行测量(dwf4-102突变体为不育植株)，n为株数。

将抽薹期野生型和转基因拟南芥莲座叶直径统计作图如图7所示，图中所示为抽薹期(花径高度为0.5-1.0cm时)莲座叶的平均直径，其中误差条表示标准偏差，WT：野生型拟南芥col-0植株；B、D、G和F*分别代表阳性T1代转CYP724A1拟南芥，其中株系B、D、G中DWF4基因为野生型(即DWF4/DWF4)，株系F*为dwf4-102突变体纯合株系即基因型为dwf4/dwf4，具体数据参见表2。可以看出，转基因植株的莲座叶直径远远大于野生型植株和dwf4-102纯合突变体；

将野生型和转基因拟南芥成熟植株(均为在收种前统计)的株高统计作图如图8所示，图中所示为成熟植株的平均株高，其中误差条表示标准偏差。WT：野生型拟南芥植株；B、D、G和F*分别代表阳性T1代转CYP724A1拟南芥，其中株系B、D、G中DWF4基因为野生型(即DWF4/DWF4)，株系F*为dwf4-102突变体纯合株系即基因型为dwf4/dwf4，具体数据参见表2。可以看出，转基因拟南芥植株的株高明显高于野生型植株和dwf4-102纯合突变体；

将野生型与转基因拟南芥(均在果荚成熟期统计)果荚柄长度统计作图如图9所示，图中所示成熟果荚的果荚柄平均长度，其中误差条表示标准偏差。WT：野生型拟南芥植株；B、D、G和F*分别代表阳性T1代转CYP724A1拟南芥，其中株系B、D、G中DWF4基因为野生型(即DWF4/DWF4)，株系F*为dwf4-102突变体纯合株系即基因型为dwf4/dwf4，具体数据参见表2。可以看出，转基因植株的果荚柄长度也较野生型植株有所增长，而dwf4-102纯合突变体不育，没有果荚柄的形成；

将野生型与转基因拟南芥种子千粒重统计作图如图10所示，图为野生型和转基因拟南芥种子各1000粒的平均重量。WT：野生型拟南芥植株；B、D、G和F*分别代表阳性T1代转CYP724A1拟南芥，其中株系B、D、G中DWF4基因为野生型(即DWF4/DWF4，)，株系F*为dwf4-102突变体纯合株系即基因型为dwf4/dwf4，具体数据参见表2。可以看出，转基因植株的千粒重与野生型植株比较都有所增加；而dwf4-102纯合突变体不育，没有种子的形成。

将野生型和转基因拟南芥单株收获种子重量统计作图如图11所示，图为野生型和转基因拟南芥各株系单株平均收获种子重量。WT：野生型拟南芥植株；B、D、G和F*分别代表阳性T1代转CYP724A1拟南芥。B、D、G和F*分别代表阳性T1代转CYP724A1拟南芥，其中株系B、D、G中DWF4基因为野生型(即DWF4/DWF4)，株系F*为dwf4-102突变体纯合株系即基因型为dwf4/dwf4，具体数据参见表2。可以看出，B、D、G阳性T1代转CYP724A1拟南芥的单株所收获种子的重量显著增加，而dwf4-102纯合突变体不育，没有种子的形成。

采用相同的方法检测其他株编号为A、E、H、I、L、M、N、C*、J*、K*的阳性T1代转CYP724A1拟南芥的表型，结果为编号为A、E、I、L、M、N的阳性T1代转CYP724A1拟南芥的莲座叶直径(cm)、植株株高(cm)、果荚柄长度(cm)、种子千粒重(mg)、种子/果荚、单株种子重量(mg)的结果均与编号为B阳性T1代转CYP724A1拟南芥的结果无显著差异，编号为C*、J*、K*的阳性T1代转CYP724A1拟南芥的的莲座叶直径(cm)、植株株高(cm)、果荚柄长度(cm)、种子千粒重(mg)、种子/果荚、单株种子重量(mg)的结果均与编号为F*的阳性T1代转CYP724A1拟南芥的结果无显著差异。

从上述可以看出，对所有阳性T1代转CYP724A1拟南芥进行表型分析，发现这些植株的BR缺陷型症状(植株严重矮小、不育)都得到了恢复，相比与dwf4-102杂合突变体自交后的T1代，其表型发生3:1分离，仅3/4的表型为正常；可以看出，表明CYP724A1基因的过量表达能够恢复dwf4-102纯合突变体植株中的BR C-22羟化酶的活性，从而恢复合成BR。说明，这些表型由于过量表达CYP724A1基因的转基因植株中BR合成途径上的C-22羟化酶活性增强引起BR水平增加导致的。

2、检测CYP724A1基因在转基因拟南芥中的表达水平

提取编号为A-N的阳性T1代转CYP724A1拟南芥和野生型拟南芥(col-0)幼苗(生长12天)的总RNA，反转录得到cDNA。

用RT-PCR检测野生型拟南芥和转基因拟南芥中CYP724A1的转录子。所用引物为CYP724A1-F1(序列4)和CYP724A1-R1(序列5)，反应体系如下：2.5μl 10×PCR Buffer，0.5μl 10mmol/L dNTPs，0.5μl 10μmol/L CYP724A1-F1，0.5μl 10μmol/L CYP724A1-R1，0.2μl LA Taq聚合酶，0.5μl拟南芥cDNA，20.3μl ddH₂O，总反应体积25μl。扩增程序：94℃预变性2min；94℃变性50sec，60℃退火50sec，72℃延伸5min，34个循环，反应结束。将野生型拟南芥Col-0为模板进行扩增所得的PCR产物进行稀释一百被为模板进行二次PCR扩增，引物为CYP724A1-F2(序列6，5’caatctcaca aagtcgaaac ctg 3’)和CYP724-R3(序列7，5’cctcagaaat cacacattga gtgaa3’)，反应体系如下：2.5μl10×PCR Buffer，0.5μl 10mmol/L dNTPs，0.5μl 10μmol/L CYP724A1-F2，0.5μl 10μmol/L CYP724A1-R3，0.2μl LA Taq聚合酶，0.5μl一次PCR产物(稀释100倍)，20.3μl ddH₂O，总反应体积25μl。扩增程序：94℃预变性2min；94℃变性50sec，56℃退火50sec，72℃延伸45sec，28个循环，反应结束。

结果如图12所示，利用引物CYP724A1-F1和CYP724A1-R1进行PCR扩增，在编号为A-N的阳性T1代转CYP724A1拟南芥均得到1443bp的目的片段(序列2)(图12B)，但在Col-0中未得到，表明在转基因株系中能够稳定检测到CYP724A1转录子。以上述Col-0的PCR产物稀释数倍后作为模板，利用引物CYP724A1-F2和CYP724-R3进行PCR扩增，得到620bp的目的片段，表明在Col-0中也能检测到CYP724A1转录子(图12A左)。

为了确保Col-0和转基因株系反转录时所用于RNA总量一致，选择At2g33150基因作为参照基因进行RT-PCR，检测参照基因的转录子。以At2g33150-F(序列11，5’ccttcttcttcttcttcgca caa3’)和At2g33150-R(序列12，5’cagatgagca ctgtctattc acag3’)为引物，参照基因cDNA为模板，部分结果如图12A右所示，扩增得到374bp的目的片段。

利用引物CYP724A1-F2和CYP724A1-R3，检测野生型植株(Col-0)和转基因株系(A-N)中CYP724A1基因的过量表达，结果如图12B所示，(*)：dwf4-102纯合的转基因植株；(+)：反转录反应加入反转录酶；(-)：反转录反应未加入反转录酶的阴性对照；M：D2000 plusmarker，结果看出，在编号为A-N的阳性T1代转CYP724A1拟南芥均得到1443bp的目的片段，但在Col-0中未得到，表明在转基因株系中能够稳定检测到CYP724A1转录子。

用定量实时PCR方法检测12天生长期的阳性T1代转CYP724A1拟南芥幼苗中CYP724A1转录子的相对水平，PCR在Applied Biosystems 7900上进行，反应体系中包括1x reactionmixture(SYBR Green I PCR Master Mix，由Applied Biosystems公司提供)、各0.5μM的上下游引物和相当于40ng RNA的拟南芥cDNA模板。CYP724A1基因用引物CYP724A1-F3(序列8，5’aggaagaaca tgcagccatt aga3’)和CYP724A1-R3(序列7，5’cctcagaaatcacacattga gtgaa3’)进行扩增。扩增程序：50℃ 2min；95℃ 10min；95℃ 15sec，60℃ 1min，40个循环；其中以编号为F*的阳性T1代转CYP724A1拟南芥做为参照标准1(100％)，其它株系以此相比所占的百分比。以野生型拟南芥(WT)为对照。

部分结果如图13所示，编号为K*、C*、J*、F*的阳性T1代转CYP724A1拟南芥株系的CYP724A1基因相对表达量为12％、21％、34％、100％；WT的CYP724A1基因相对表达量为0.01％。结果表明转基因株系(K*、C*、J*、F*)中CYP724A1的表达量远远高于野生型，并且各个株系间的表达量也存在差异。从整体上看，各个转基因株系中CYP724A1的表达水平与其正常生长发育的程度直接相关。误差条表示标准偏差。

实施例3、转基因拟南芥叶片中油菜素内酯BRs的提取和活性测定

为了了解在过量表达CYP724A1的转基因拟南芥中，高生理活性的BRs的含量是否提高，提取了转基因拟南芥和dwf4-102纯合突变体叶片中的BRs，检测提取物的生理活性。结果表明，转基因拟南芥叶片中BRs的生理活性明显高于突变体，说明CYP724A1表达水平的提高增加了拟南芥叶片中高生理活性BRs的含量，具体如下：

1、拟南芥叶片中高生理活性BRs的提取

拟南芥中BRs的提取参照标准程序进行(Gupta D，Bhardwaj R，Nagar PK，Kaur S(2004).Isolation and characterization of brassinosteroids from leaves of Camelia sinensis(L.)0.Kuntze，Plant Growth Regulation 43：97-100.)：

分别取50g生长5周的编号为F*、J*的阳性T1代转CYP724A1拟南芥和dwf4-102纯合突变体拟南芥叶片，在液氮中研磨成精细粉末，加入150ml提取液(甲醇∶氯仿＝4∶1)在4℃下浸泡过夜。然后过滤，再在残渣中加入提取液(提取液和叶片的比例为150ml∶50g)，重复抽提三次，并将浸提液合并，10000g，5℃离心30min，取上清35℃真空浓缩。加入1∶1体积的水和氯仿，混匀，静置待分层，以除去水中杂质。再用Na₂SO₄干燥氯仿相，并在5℃减压真空条件下过滤蒸干。用正己烷和80％的甲醇(体积比为1∶1)对提取物萃取三次，取甲醇相浓缩蒸干。最后将提取物溶于300μl甲醇中，于-20℃中保存备用，分别得到转基因提取物和突变体提取物。

2、提取物中活性BR的含量比较

按照Takatsuto方法(Takatsuto S，Yazawa N，Ikekawa N，Takematsu T，Takeuchi Y，Koguchi M(1983).Structure-activity relationship of brassinosteroids，Phytochemistry 22：2437-2441.)选取单粒重为11.0-11.9mg的野生型萝卜种子(浙大长，南京绿领种业有限公司)，将其置于含有饱和水的石英砂中萌发生长4天，然后用水轻轻漂洗除去萝卜苗及根周围的石英砂，避免伤根。将测量了下胚轴长度的幼苗水平放置在铺有滤纸的培养皿中，并分别在不同的培养皿中加入3ml的水(阴性对照)、2.97ml水+0.03ml株系F*的BR提取物、2.97ml水+0.03ml株系J*的BR提取物、2.97ml水+0.03ml dwf4-102纯合突变体的BR提取物、2.97ml水+0.03ml 10^-3M epi-BL(E-1641，Sigma-Aldrich，USA，阳性对照)。每个培养皿中放置4株幼苗作为一个处理，每个处理设置5个重复。培育48小时后，再次测量其下胚轴的长度，并计算出增长相对百分比(表3)。

表3 萝卜下胚轴相对增长百分比

处理液	48小时后下胚轴平均增长百分比(％)n 20
		水(阴性对照)	91.6±11.4
dwf4-102纯合突变体	88.2±12.9
		J*	109.6±9.8
F*	147.1±16.6
		epi-BL(10^-3M)	138.6±17.1

从表3可知，与dwf4-102突变体相比，从相同质量的过量表达CYP724A1的转基因拟南芥叶片中提取的BRs，更能促进萝卜幼苗下胚轴的生长，表明转基因材料中生物活性的BRs含量高于dwf4-102纯合突变体。