CN110894502A

CN110894502A - 番茄SlCYP90B3基因及其应用

Info

Publication number: CN110894502A
Application number: CN201911103684.7A
Authority: CN
Inventors: 汪俏梅; 胡松申; 刘丽红; 李硕; 邵志勇; 孟凡亮; 刘浩然; 梁冬怡
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2019-11-13
Filing date: 2019-11-13
Publication date: 2020-03-20
Anticipated expiration: 2039-11-13
Also published as: CN110894502B

Abstract

本发明公开了一种提高番茄果实冷害抗性的基因SlCYP90B3，该基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。本发明还同时公开了上述基因在提高番茄果实对冷害抗性中的应用，用于构建转基因番茄，所述转基因番茄能够提高果实对冷害的抗性。

Description

番茄SlCYP90B3基因及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及番茄SlCYP90B3基因在提高番茄果实抗冷害中的应用。

背景技术

冷藏是采后保持蔬菜和水果品质的最常用的手段之一。然而，低温敏感型水果的蔬菜在低温贮藏条件下极易发生冷害，番茄是研究果实冷害发生的很典型的模式植物。发生冷害的番茄果实表现出各种症状，包括果实表面损伤，病害以及不能完全变红。这些变化降低了果实的品质以及消费者的接受度。导致严重的浪费和经济损失。

多年来，人们采用了多种策略来减轻番茄果实冷害发生率，包括化学处理或物理方法，如茉莉酸甲酯、水杨酸、赤霉素、褪黑素、草酸、丁香酚(食品化学)、气调包装。通过这些措施来减轻冷害的可能机制通常包括调节SlCBF1基因表达、诱导脯氨酸积累、增强精氨酸途径、调节能量代谢、改变氧气和二氧化碳的比例。随着科技的不断发展，生物技术和基因工程不断应用到农作物品质改良和抗逆研究中。因此，通过生物技术和常规育种相结合的方法研究番茄果实对冷害的适应性及其机制，对解决冷害引起的番茄果实的生理失调和商品性丧失具有重要的意义。

SlCYP90B3基因属于番茄P450家族，可以催化C27，C28，C29油菜素甾醇的羟基化，是番茄中油菜素内酯生物合成的关键酶。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种能够提高番茄抗冷害的基因以及用途。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种提高番茄果实抗冷害的基因SlCYP90B3，该基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。

本发明还同时提供了上述基因编码的蛋白质，该蛋白质的氨基酸序列如SEQ IDNo：2所示。

本发明还同时提供了含有上述基因的质粒和植物表达载体，该植物表达载体为过表达载体pGWB17::SlCYP90B3。

本发明还同时提供了一种宿主细胞，该宿主细胞含有SEQ ID No：1所示的基因序列；该细胞为大肠杆菌细胞或农杆菌细胞。

本发明还同时提供了上述基因在提高番茄果实对冷害抗性中的应用。

该基因的用途是：用于构建转基因番茄，所述转基因番茄能够提高果实对冷害的抗性。

本发明经研究发现，通过克隆SlCYP90B3基因以及通过转基因技术培育内源油菜素内酯含量升高的番茄材料，在提高番茄果实冷害抗性方面，具有很好的应用前景。

本发明首次构建了番茄SlCYP90B3基因过表达转基因植株，并进行功能研究。通过低温胁迫处理，发现SlCYP90B3基因在提高番茄果实对冷害的胁迫中起到正向调控作用。本发明利用基因工程技术，通过过量表达SlCYP90B3基因可以显著提高番茄果实采后对冷害的抗性，在农业生产过程中，不需要额外的经济投入，直接对果实进行低温储藏，果实并无皱缩等冷害损伤，可以达到较好的抗冷害的效果。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是SlCYP90B3基因过表达载体pGWB17::SlCYP90B3载体图谱。

图2是SlCYP90B3基因过表达的株系中SlCYP90B3基因的表达量。

图3是低温胁迫中SlCYP90B3过表达提高冷害抗性表型图片；

图4是SlCYP90B3基因过表达和野生型番茄果实在冷害条件下冷害发生指数。

图5是SlCYP90B3基因过表达和和野生型番茄果实在冷害条件下电导率变化。

图6是SlCYP90B3基因过表达和野生型番茄果实在正常和冷害胁迫下SlCBF1基因的表达量。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

一、获得番茄SlCYP90B3基因以及该基因过表达载体的构建：

用Primer Premier 5.0设计该基因双向扩增引物，取种植在浙江大学华家池大棚野生型番茄AC(Ailsa Craig)叶片，提取RNA反转录成的cDNA为模版(cDNA的提取方式为常规方法，可参照专利CN104561025A)，上游特异性引物为SlCYP90B3-F下游引物为SlCYP90B3-R，用PrimerSTAR高保真酶扩增SlCYP90B3基因全长(SEQ ID No：1)。

引物序列为：SlCYP90B3-F：5’-ATGTCTGACTTAGAGTTTTTTCTTTTTCTTATTCC-3’

SlCYP90B3-R：5’-GTCATGTAATTTATTTAACGATCGA-3’

PCR扩增反应体系：2xPrimerSTAR buffer 25ul、dNTP Mixture 5ul、PrimerSTARDNA polymerase 1ul、ddH₂O 14ul、cDNA2ul、上下游引物各1.5ul，共50ul。PCR反应程序为：98℃预变性5分钟；98℃变性10秒，60℃退火10秒，72℃延伸90秒，35个循环；最后72℃终延伸5分钟，扩增出的基因全长连接到pQB-V3载体上，将重组质粒测序确认序列是否正确(例如可委托擎科公司测序)，然后通过同源重组的方法将目的片段转移到pGWB17终载体上，构建好的过表达载体命名为pGWB17-35S::SlCYP90B3(图1)。

SEQ ID No：2为去除了SEQ ID No：1中终止密码子TAG对应的氨基酸序列。

二、转基因材料的构建与检测：

将过表达载体pGWB17::SlCYP90B3转化农杆菌LBA4404菌株，用番茄子叶作为外植体，与菌液进行共培养，获得愈伤组织，愈伤组织经过分化培养基和生根培养基获得转基因阳性苗，利用PCR和RT-PCR验证阳性转基因植株。选取T2代符合3：1分离比且表达量较高的株系作为研究对象(图2)。

说明：种子在卡那霉素(50mg/L)的培养基上长侧根与未长侧根的分离比符合3：1，且基因表达量升高两倍以上的属于过表达。

图2中，WT代表野生型番茄AC(Ailsa Craig)Ailsa Craig，OE-4代表SlCYP90B3的一个过表达株系，OE-5代表SlCYP90B3基因的一个过表达株系。

说明：OE-4、OE-5为最佳的两个过表达株系。

三、转基因株系抗逆性研究

番茄果实抗冷害研究：

选取大小、颜色均一且无斑点和病害的野生型(AC)和过表达(OE)株系的绿熟期番茄果实，用1％(v/v)次氯酸钠表面消毒2分钟，贮藏在(4±1)℃和80-90％相对湿度(RH)的环境条件中，在储藏的第7、14、21和28天取样，在储藏的28天观察野生型(AC)、过表达(OE)株系番茄果实发生冷害的程度，根据图3显示，SlCYP90B3过表达(OE-4和OE-5)果实基部变黑程度即发生冷害的面积明显低于野生型(WT)。

根据冷害发生的程度对果实进行分类，1级：果实完整，没有明显冷害；2级：果实发生冷害面积小于10％；3级：果实发生冷害面积大于10％小于25％；4级：果实发生冷害面积大于25％小于50％；5级：果实发生冷害面积大于50％。冷害指数的计算公式：

冷害指数＝(S₁+2S₂+3S₃+4S₄+5S₅)/总果实数量×5。

由图4可以看出，低温处理后过表达(OE-4和OE-5)番茄果实冷害指数显著低于野生型(WT)。

分别从5个果实的中部获得5个果皮圆盘(3-4毫米厚，直径10毫米)，用蒸馏水漂洗3次，并在25℃的25mL蒸馏水中浸泡2小时。用电导仪(DDS-307A，中国上海)测定初始电导率(C₀)。然后煮沸15分钟，冷却至室温，并测量最终电导率(C₁)。相对电导率＝(C₀/C₁×100％)。由图5可以看出低温处理后过表达(OE-4和OE-5)番茄果实电导率显著低于野生型(WT)。

在低温下2h、4h、6h、8h、16h、24h取样，用qRT-PCR测定基因表达量，结果显示过表达(OE)番茄果实SlCBF1基因表达量显著高于野生型(WT)(图6)。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 番茄SlCYP90B3基因及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1476

<212> DNA

<213> 番茄(Solanum lycopersicum)

<400> 1

atgtctgact tagagttttt tctttttctt attcctccaa tcttagcagt acttataatt 60

cttaatctat tcaaaagaaa acacaacttt caaaatcttc caccagggga tatgggttgg 120

ccttttcttg gtgaaactat tggttatttg agaccttatt cagctactac tattggagat 180

ttcatgcaag atcatatttc taggtatggg aaaattttca agtcaaattt gtttggagag 240

ccaacaatag tttcagcaga tgcagggcta aacagataca ttctgcagaa tgaagggaga 300

ttatttgagt gtaattatcc aagaagtata ggtgggatac ttggtaaatg gtctatgtta 360

gttcaagttg gacaaatgca tagagatatg aggatgattc ctctgaattt tttgagcaat 420

gctaggctaa ggaatcaact tttaagtgaa gttgaaaagc atactttgct tgttcttggc 480

tcttggaaac aggattctgt tgtttgtgca caagatgaag caaagaagtt aacattcaac 540

tttatggcag agcatatcat gagtctacaa cctggaaatc cagagacaga gaagctgaaa 600

aaagagtaca tcacatttat gaaaggagtg gtttctgctc cattgaattt tccaggaaca 660

gcttacagaa aggccttaca gtctcgatca acaattcttg gatttattga gagaaaaatg 720

gaggagaggc ttaaggaaat gaacagaaac gaaaacgacc ttctaggttg ggttctgaag 780

aattcaaatc tctcaaaaga gcaaattctt gatttgctac tgagtttgct ctttgctggc 840

catgaaactt catcagtagc aatagctctg tctattttct tactcgaaag ctgtcctgct 900

gctgttcaac aattaacaga agagcacttg gagatttccc gggcaaaaaa acagtcagga 960

gaaacagaat taaattggga tgactacaag aaaatggaat tcacccaatg tgttattaat 1020

gagactctaa gacttgggaa tgtagtgagg tttctgcaca ggaaagctgt gaaagatgtt 1080

cgatataaag gttatgatat tccatgtgga tggaaagtgt tgccggtgat ttcagcagcg 1140

catttagatc cttcactttt cgaccgacct cacgactttg atccttggag atggcagaac 1200

gcagaagagt cgccttcagg taaaggagga agcacaggca caagcagcac aacaaaaagt 1260

agtaataatt tcatgccatt tgggggaggt ccacgtctat gtgcaggatc tgaactggcc 1320

aaacttgaga tggccatttt cattcactat cttgttctta attttcactg gaaattagct 1380

gcaactgatc aggcttttgc ctatccttac gtagattttc ccaatgccct acctatcaat 1440

atccaacatc gatcgttaaa taaattacat gactag 1476

<210> 2

<211> 491

<212> PRT

<213> 番茄(Solanum lycopersicum)

<400> 2

Met Ser Asp Leu Glu Phe Phe Leu Phe Leu Ile Pro Pro Ile Leu Ala

1 5 10 15

Val Leu Ile Ile Leu Asn Leu Phe Lys Arg Lys His Asn Phe Gln Asn

20 25 30

Leu Pro Pro Gly Asp Met Gly Trp Pro Phe Leu Gly Glu Thr Ile Gly

35 40 45

Tyr Leu Arg Pro Tyr Ser Ala Thr Thr Ile Gly Asp Phe Met Gln Asp

50 55 60

His Ile Ser Arg Tyr Gly Lys Ile Phe Lys Ser Asn Leu Phe Gly Glu

65 70 75 80

Pro Thr Ile Val Ser Ala Asp Ala Gly Leu Asn Arg Tyr Ile Leu Gln

85 90 95

Asn Glu Gly Arg Leu Phe Glu Cys Asn Tyr Pro Arg Ser Ile Gly Gly

100 105 110

Ile Leu Gly Lys Trp Ser Met Leu Val Gln Val Gly Gln Met His Arg

115 120 125

Asp Met Arg Met Ile Ser Leu Asn Phe Leu Ser Asn Ala Arg Leu Arg

130 135 140

Asn Gln Leu Leu Ser Glu Val Glu Lys His Thr Leu Leu Val Leu Gly

145 150 155 160

Ser Trp Lys Gln Asp Ser Val Val Cys Ala Gln Asp Glu Ala Lys Lys

165 170 175

Leu Thr Phe Asn Phe Met Ala Glu His Ile Met Ser Leu Gln Pro Gly

180 185 190

Asn Pro Glu Thr Glu Lys Leu Lys Lys Glu Tyr Ile Thr Phe Met Lys

195 200 205

Gly Val Val Ser Ala Pro Leu Asn Phe Pro Gly Thr Ala Tyr Arg Lys

210 215 220

Ala Leu Gln Ser Arg Ser Thr Ile Leu Gly Phe Ile Glu Arg Lys Met

225 230 235 240

Glu Glu Arg Leu Lys Glu Met Asn Arg Asn Glu Asn Asp Leu Leu Gly

245 250 255

Trp Val Leu Lys Asn Ser Asn Leu Ser Lys Glu Gln Ile Leu Asp Leu

260 265 270

Leu Leu Ser Leu Leu Phe Ala Gly His Glu Thr Ser Ser Val Ala Ile

275 280 285

Ala Leu Ser Ile Phe Leu Leu Glu Ser Cys Pro Ala Ala Val Gln Gln

290 295 300

Leu Thr Glu Glu His Leu Glu Ile Ser Arg Ala Lys Lys Gln Ser Gly

305 310 315 320

Glu Thr Glu Leu Asn Trp Asp Asp Tyr Lys Lys Met Glu Phe Thr Gln

325 330 335

Cys Val Ile Asn Glu Thr Leu Arg Leu Gly Asn Val Val Arg Phe Leu

340 345 350

His Arg Lys Ala Val Lys Asp Val Arg Tyr Lys Gly Tyr Asp Ile Pro

355 360 365

Cys Gly Trp Lys Val Leu Pro Val Ile Ser Ala Ala His Leu Asp Pro

370 375 380

Ser Leu Phe Asp Arg Pro His Asp Phe Asp Pro Trp Arg Trp Gln Asn

385 390 395 400

Ala Glu Glu Ser Pro Ser Gly Lys Gly Gly Ser Thr Gly Thr Ser Ser

405 410 415

Thr Thr Lys Ser Ser Asn Asn Phe Met Pro Phe Gly Gly Gly Pro Arg

420 425 430

Leu Cys Ala Gly Ser Glu Leu Ala Lys Leu Glu Met Ala Ile Phe Ile

435 440 445

His Tyr Leu Val Leu Asn Phe His Trp Lys Leu Ala Ala Thr Asp Gln

450 455 460

Ala Phe Ala Tyr Pro Tyr Val Asp Phe Pro Asn Ala Leu Pro Ile Asn

465 470 475 480

Ile Gln His Arg Ser Leu Asn Lys Leu His Asp

485 490

Claims

1.一种提高番茄果实冷害抗性的基因SlCYP90B3，其特征在于：该基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。

2.如权利要求1所述的基因编码的蛋白质，其特征在于：该蛋白质的氨基酸序列如SEQID No：2所示。

3.一种含有如权利要求1所述基因的质粒。

4.一种含有如权利要求1所述基因的植物表达载体。

5.根据权利要求4所述的植物表达载体，其特征在于：为过表达载体pGWB17::SlCYP90B3。

6.一种宿主细胞，其特征在于：该宿主细胞含有权利要求1所述的基因序列。

7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于：该细胞为大肠杆菌细胞或农杆菌细胞。

8.如权利要求1所述基因在提高番茄果实对冷害抗性中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：用于构建转基因番茄，所述转基因番茄能够提高果实对冷害的抗性。