KR102353488B1

KR102353488B1 - 목질화 관련 유전자 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102353488B1
Application number: KR1020190152069A
Authority: KR
Inventors: 신정섭; 신진석
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2019-11-25
Filing date: 2019-11-25
Publication date: 2022-01-20
Also published as: KR20210063667A

Abstract

본 발명은 목질화(lignification) 관련 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따른 형질전환체는 목질 생산이 없거나 감소되어 사료 원료로 사용하거나 바이오 매스로 사용될 때 품질을 향상시킬 수 있고, 가공 과정을 용이하게 해주는 효과를 갖는다.

Description

목질화 관련 유전자 및 이의 용도 {A LIGNIFICATION RELATED GENE AND AN USE THEREOF}

본 발명은 목질화(lignification) 관련 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 식물체에서 목질화에 관여하는 유전자 및 상기 유전자의 용도에 관한 것이다.

GMO(Genetic Modified Organism)는 생물에서 분리한 DNA를 도입하여 생산되는 유전자변형 생물로, 생명공학 기술의 발달에 따라 각종 질병, 환경 스트레스에 저항성을 갖게 할 뿐만 아니라 수확 후 저장성을 증대시키고, 향, 영양학적 가치, 색소 등이 증대된 작물을 개발하는 데 응용되고 있다.

microRNA(miRNA)는 식물, 동물, 바이러스 등에서 발결되는 20 내지 25개의 뉴클레오타이드로 이루어진 작은 RNA 분자로, 특이적인 표적 서열을 가지는 mRNA의 발현을 조절하는데 응용되고 있다. 구체적인 실시예로서, 표적 서열을 가지는 microRNA를 제작하고, 이를 식물체 내에서 과발현시켜 표적 유전자의 발현을 감소 또는 침묵시키는데 사용할 수 있다.

사료작물의 가치는 수확량(yield)과 품질(quality)이 중요 결정 요소이다. 일정 생육단계까지 작물의 생체중(biomass)은 꾸준히 증가하지만, 목질(lignin) 함량도 같이 증가하기 때문에 사료로서의 품질은 급속히 저하된다. 이런 이유로 수확 시기가 이르면 사료 수확량이 감소되고, 늦으면 사료 품질이 낮아지는 문제가 발생하게 된다. 따라서, 작물의 수확시기를 늦추면서도 리그닌 함량을 낮추는 것은 고수확량의 고품질 사료 개발에 매우 중요하다.

바이오에너지를 경제적으로 생산하기 위해서는 원재료가 되는 바이오매스의 품질과 생산성이 중요하다. 목질계 바이오에탄올 생산에 사용되는 일반적인 바이오매스에 난분해성 리그닌이 약 30% 정도 포함되는데, 이러한 리그닌은 전처리 공정에서 여러 가지 문제점을 야기하기 때문에, 바이오매스에서 리그닌의 함량을 줄이는 것은 중요환 과제이다.

본 발명은 상기한 문제를 해결하기 위해서, 본 발명의 발명자는 목질화에 관여하는 유전자를 새롭게 발굴하고, 그 용도를 확인한데 기술적 특징이 있다. 구체적으로 본 발명의 발명자는 CBSX3 유전자가 식물체에서 목질화에 관여함을 실험적으로 확인하였고, 상기 CBSX3 유전자의 발현을 억제하는 miRNA를 설계하여, CBSX3 유전자의 발현을 억제한 결과 식물체에서 목질 생산이 낮아짐을 실험적으로 입증하였다. 따라서, CBSX3 유전자 발현 억제를 통해서 목질화 생산성이 억제되고, 목질의 함량이 낮은 형질전환체, 구체적으로 목질이 감소된 식물체를 제공할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

상기한 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 목질화에 관여하는 유전자 CBSX3를 제공한다.

상기 CBSX3 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 구성될 수 있다.

본 발명은 CBSX3 유전자 또는 이에 의하여 코딩되는 단백질의 발현을 억제하는 제제를 제공한다.

본 발명은 CBSX3 유전자 또는 이에 의하여 코딩되는 단백질의 발현을 억제하는 제제의 뉴클레오티드 서열 또는 상기 제제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 제공한다.

본 발명은 CBSX3 유전자 또는 이에 의하여 코딩되는 단백질의 발현을 억제하는 제제의 뉴클레오티드 서열 또는 상기 제제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 포함하는 목질화 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명은 CBSX3 유전자 또는 이에 의하여 코딩되는 단백질의 발현을 억제하는 제제의 뉴클레오티드 서열 또는 상기 제제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 포함하는 식물 목질화 억제용 키트를 제공한다.

상기 CBSX3 유전자의 발현을 억제하는 제제는 안티센스 뉴클레오타이드, 마이크로RNA(microRNA, miRNA), 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA)로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

상기 CBSX3 유전자의 발현을 억제하는 제제는 마이크로RNA일 수 있다. 상기 마이크로RNA는 서열번호 2 또는 서열번호 3의 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 것 일 수 있다.

구체적인 예로, 상기 마이크로RNA는 서열번호 5의 서열을 포함하는 구조체로부터 발현될 수 있다.

상기 단백질의 발현을 억제하는 제제는 단백질에 CBSX3 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 특이적으로 결합하는 펩티드 미메틱스, 앱타머, 및 항체로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

본 발명은 CBSX3 유전자 또는 이의 단백질의 발현을 억제하는 것을 포함하는 식물의 목질 생성을 감소시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 CBSX3 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현을 억제하는 제제를 식물세포, 식물조직, 종자 또는 식물체에 처리하는 것; 또는 CBSX3 유전자의 발현을 억제하는 제제의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 식물세포, 식물조직, 종자 또는 식물체에 도입하여 CBSX3 유전자의 발현을 억제하는 것을 포함한다.

본 발명은 CBSX3 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현을 억제하는 제제를 식물세포, 식물조직, 종자 또는 식물체에 처리하는 것; 또는 CBSX3 유전자의 발현을 억제하는 제제의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 식물세포, 식물조직, 종자 또는 식물체에 도입하여 형질전환하는 것을 포함하는 목질이 감소된 형질전환체 제조하는 방법을 제공한다.

상기 형질전환은 CBSX3 유전자의 발현을 억제하는 제제의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 식물 세포에 도입하여 형질전환된 식물 세포를 제조하는 것; 및 상기 형질전환된 식물 세포로부터 식물체를 제조하는 것을 포함할 수 있다.

상기 형질전환체는 식물세포, 식물조직, 종자 또는 식물체 일 수 있다.

상기 식물은 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오 이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용 작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알팔파, 톨페스큐, 페레 니얼라이그라스를 포함하는 사료 작물류로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명은 식물의 목이 감소된 식물을 제공함으로써, 이를 응용한 사료용, 바이오매스 작물 제작에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 애기장대 산화적 스트레스 처리시 AtCBSX3 유전자의 발현량 변화를 나타낸 도이다.
도 2는 AtCBSX3 유전자를 표적으로 하는 인공 microRNA의 클로닝에 사용되는 pFAST 벡터의 레프트보더와 라이트보더 카세트를 나타내는 도이다.
도 3은 AtCBSX3 유전자를 표적으로 하는 microRNA 전사체의 서열을 나타낸 도이다.
도 4는 AtCBSX3 유전자 저발현 돌연변이체에서 AtCBSX3 유전자의 발현량을 real-time PCR로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 AtCBSX3 유전자 저발현 돌연변이체가 줄어든 활성산소를 가지는 것을 확인한 도이다.
도 6은 AtCBSX3 유전자 저발현 돌연변이체가 줄어든 목질을 가지는 것을 확인한 도이다.
도 7은 AtCBSX3 유전자 저발현 돌연변이체의 수술 내피가 정상적으로 발생하지 않음을 확인한 도이다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

다만, 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 이하에서 기술하는 특정 실시예 및 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니다. 본 발명의 범위는 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명은 일 양대로서, 식물의 목질화 또는 목질 생산을 조절하는 신규한 유전자 CBSX3를 제공한다.

목질화(lignification)는 목화라고도하며, 고등식물이 생장에 따라 리그닌이 세포벽에 퇴적되어 세포막질이 2차적으로 변화하여 막을 견고하게하는 현상을 의미하는 것이다. 목질화에 의해 셀룰로오스의 분해억제, 수분의 통과가 억제되는데, 목질화가 심화된 식물체의 경우 사료 또는 바이오 매스 활용을 위해서 가공하는데 많은 어려움이 있다.

상기 CBSX3 유전자는 CBSX3 단백질(CBS domain-containing protein CBSX3, mitochondrial)을 코딩하는 유전자로, 본 발명의 발명자는 식물의 목질화, 구체적으로 리그닌 생산에 관여하는 유전자로 CBSX3를 이용해서, 상기 CBSX3 유전자의 발현 억제를 통해 식물에서 목질의 생산을 감소시킬 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다. 구체적으로, 본 발명의 CBSX3의 발현을 억제시키면, 식물체 내에서 활성산소가 줄어들고, 이에 따라 식물체 내의 목질화가 줄어들어, 목질이 감소된 식물체를 제공할 수 잇다.

본 발명의 일 실시예에서는 애기장대의 5번 염색체(Chromosome 5: 3,428,842-3,430,492 reverse strand)에 존재하는 애기장대 유래의 CBSX3 유전자 At5g10860(또는 본 발명에서 'AtCBSX3'로 기재)를 이용하여, AtCBSX3 유전자가 활성산소에 반응하여 발현이 감소함을 확인하고, AtCBSX3 유전자 저발현 돌연변이체에서는 활성산소의 생성량 감소를 통해서 식물체에서 목질 생성이 감소됨을 확인하였다.

본 발명의 CBSX3의 목질 생성 조절능은 쌍자엽 식물 모델인 애기장대 유래의 서열번호 1의 AtCBSX3 유전자를 통해서 확인하였고, 모델식물인 애기장대 외에 다른 식물에도 CBSX3 유전자가 존재하며, CBSX3 유전자의 기능성이 상이한 정도의 변이를 포함하지 않는 한, 모델식물인 애기장대와 동일하게 목질화에 관여하는 CBSX3 유전자의 기능은 그 식물의 종에 의해 제한되지 않는다. 따라서, NCBI, UniProt 등 데이터베이스를 참고하여, 애기장대 유래의 AtCBSX3 유전자와 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 이상의 상동성을 가진 유전자라면 모두 모두 본 발명에 포함될 수 있고, 이를 억제하면 목질화를 억제하는 효과를 동시에 얻을 수 있다.

구체적인 예로 다음 표 1에 나타낸 식물은 모두 본 발명에 포함되는 것으로 이해되며, 표 1에 기재된 각 식물의 CBSX3 유전자 ID 와 단백질 ID와 관련하여 미국 국립생물정보센터(NCBI), UNIPROT 등 공지된 데이터베이스에서 검색되는 모든 서열은 본 발명의 유전자 및 단백질 서열로서 포함된다. 다만, 표 1에 기재된 식물은 일 예로 기재된 것이므로, 본 발명 식물의 종류는 이에 제한되지 않는다.

학명	식물명	단백질 ID	유전자 ID
Elaeis guineensis	기름야자	XP_010909683.1	LOC105035712
Ipomoea nil	나팔꽃	XP_019166963.1	LOC109162733
Daucus carota subsp. sativus	당근	XP_017254175.1	LOC108224121
Ziziphus jujuba	대추나무	XP_015865937.1	LOC107403547
Arachis hypogaea	땅콩	XP_025609560.1	LOC112702648
Prunus mume	매실나무	XP_008246548.1	LOC103344703
Raphanus sativus	무	XP_018471761.1	LOC108843151
Brassica oleracea var. oleracea	배추	XP_013618347.1	LOC106324892
Cicer arietinum	병아리콩	XP_004490742.1	LOC101501243
Prunus persica	복숭아	XP_007207482.1	LOC18772669
Brassica rapa	순무	XP_009122018.1	LOC103846773
Arachis duranensis	아라키스	XP_015949402.1	LOC107474290
Medicago truncatula	알팔파	XP_024640168.1	LOC11423443
Fragaria vesca subsp. Vesca	야생딸기	XP_004294863.1	LOC101311551
Olea europaea var. sylvestris	야생올리브	XP_022882378.1	LOC111399349
Papaver somniferum	양귀비	XP_026436925.1	LOC113334917
Prunus avium	양벚나무	XP_021806876.1	LOC110750817
Nelumbo nucifera	연꽃	XP_010251493.1	LOC104593392
Citrus sinensis	오렌지	XP_006464969.1	LOC102626823
Brassica napus	유채	XP_013678945.2	LOC106383374
Rosa chinensis	장미	XP_024157040.1	LOC112164918
Sesamum indicum	참깨	XP_011080593.1	LOC105163809
Manihot esculenta	카사바	XP_021597889.1	LOC110604098
Theobroma cacao	카카오	XP_007046407.2	LOC18610617
Coffea arabica	커피나무	XP_027091827.1	LOC113712543
Hevea brasiliensis	파라고무나무	XP_021640804.1	LOC110635683
Carica papaya	파파야	XP_021895727.1	LOC110813046
Vitis vinifera	포도	XP_002262902.1	LOC100265678
Ricinus communis	피마자	XP_002526389.1	LOC8286049
Pistacia vera	피스타치오	XP_031248080.1	LOC116105813
Helianthus annuus	해바라기	XP_021978035.1	LOC110873424
Juglans regia	호두나무	XP_018831854.1	LOC108999413
Cucurbita maxima	호박	XP_022986939.1	LOC111484529
Oryza sativa	쌀	XP_015631769.	LOC4334035
Zea mays	옥수수	NP_001150216.1	LOC100283846
Solanum tuberosum	감자	XP_006344361.1	LOC102599569
Solanum lycopersicum	토마토	NP_001294933.1	LOC101250246

본 발명의 CBSX3 단백질은 애기장대의 AtCBSX3 단백질 또는 예로 표 1에 나타낸 식물의 단백질 외에 이의 기능적 동등물을 포함할 수 있다. 상기 기능적 동등물이란 아미노산의 부가, 치환, 또는 결실의 결과 적어도 60% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 애기장대 CBSX3 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 의미한다.

일 양태로, 본 발명은 CBSX3 유전자 또는 이에 의하여 코딩되는 단백질의 발현을 억제하는 제제를 제공한다.

또한, 본 발명은 CBSX3 유전자의 발현 또는 이에 의하여 코딩되는 단백질의 발현을 억제하는 제제의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 CBSX3 유전자 또는 이에 의하여 코딩되는 단백질의 발현을 억제하는 제제 또는 상기 제제를 발현하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 포함하는 목질화 억제용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 CBSX3 유전자 또는 이에 의하여 코딩되는 단백질의 발현을 억제하는 제제; 또는 상기 제제를 발현하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 포함하는 식물 목질화 억제용 키트를 제공한다.

상기 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA)로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

본 발명에서 용어 “유전자의 mRNA에 상보적으로 결합”하는 것은, 표적 유전자인 CBSX3의 mRNA에 혼성화할 수 있도록, CBSX3 유전자의 서열 중 연속하는 10개 내지 30개의 뉴클레오티드에 대한 상보적인 서열을 포함하거나, 상기 서열을 포함하는 것을 의미한다.

상기 제제의 구체적인 예로, 상기 CBSX3 유전자의 발현을 억제하는 제제는 마이크로RNA일 수 있다. 상기 마이크로RNA는 CBSX3 유전자의 서열 중 연속하는 10개 내지 30개의 뉴클레오티드를 표적으로하며, 이에 상보적으로 결합하는 서열을 포함하는 것으로, CBSX3 유전자에 특이적으로 결합하여 이의 발현을 억제할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 서열번호 4에 개시된 애기장대의 CBSX3 유전자의 서열을 표적하는 서열번호 5의 마이크로RNA(miRNA) 발현 구조체를 제조하여, 서열번호 3의 마이크로RNA가 식물체 내에 발현되도록 하여, 목질 생성에 관여하는 유전자 AtCBSX3의 발현을 저해할 수 있음을 확인하였다.

본 발명에서 용어 “벡터”는 목적 유전자의 코딩 서열과 특정 숙주 생물에서 발현하는 데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 상기 발현에 필수적인 핵산 서열은 프로모터, 인핸서, 종결신호 및/또는 폴리아데닐레이션 신호 서열을 포함하며, 진행세포에서 이용 가능한 이러한 서열의 구체적인 예는 본 발명의 기술분야에 공지되어 있다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같이 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP0116718B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용될 수 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히, 바람직한 형태는 EP0120516B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 상기 바이너리 벡터는 Ti(tumor inducible) 플라스미드에서 이동에 필요한 부분인 LB(left order)와 RB(right border)를 가지는 플라스미드와 타겟 뉴클레오타이드를 옮기는데 필요한 유전자를 가진 플라스미드를 두 개로 나누어 놓은 벡터를 말한다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 실시예에서는 식물 형질전환용 바이너리 벡터인 pFAST를 사용하였다.

상기 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 비아포스(bialophos), 글리포세이트(glyphosate), 포스피노트리신(phosphinothricin) 및 글루포시네이트(glufosinate)와 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(Kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(Hygromycin), 클로람페니콜(Chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 벡터의 프로모터와 목적 유전자의 염기서열은 발현 조절 서열에 작동할 수 있게 연결될 수 있으며, 상기 작동 가능하게 연결된 유전자 서열과 발현 조절 서열은 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함될 수 있다. "발현 조절 서열(expression control sequence)"이란, 특정한 숙주세포에서 작동할 수 있게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보 좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.

본 발명에서 용어 "프로모터"는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역에 존재하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. 상기 프로모터는 바람직하게 식물 프로모터일 수 있다. 상기 용어 "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터를 모두 포함하는 의미이다. 또한, 본 발명의 프로모터는 "상시발현(constitutive) 프로모터"를 포함할 수 있고, 상기 상시발현 프로모터는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화 하에서도 항시 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 프로모터의 종류는 본 발명에서 제한되지 않으며, 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 프로모터의 일 예로 CMV(Cauliflower Mosaic Virus) 35S 프로모터, CaMV 35S 프로모터, CMV 19S 프로모터, pEMU 프로모터, TaU6 프로모터, 히스톤 프로모터, 아그로박테리움 튜메파시엔스 Ti 플라스미드(Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid)의 nos(nopaline synthase) 프로모터, ocs(octopine synthase) 프로모터 및 mas(mannopine synthase) 프로모터, 그리고 이 외의 본 기술분야에 공지된 프로모터가 모두 본 발명에 포함될 수 있다.

본 발명의 식물 발현 벡터는 통상의 터미네이터를 포함할 수 있다. 상기 터미네이터의 일 예로, 노팔린 신타아제(nopaline synthase, NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다.

본 발명은 또한, 상기 CBSX3 유전자 또는 단백질의 발현을 억제하는 제제의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 용어 “형질전환”은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및/또는 조직배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 외래의 DNA를 적당한 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다.

구체적으로, 상기 형질전환은 식물 형질전환세포 및 형질전환 식물체를 제조하기 위하여 일반적으로 공지된 방법(Methods of Enzymology, Vol. 153, (1987))에 따라 실시될 수 있다. 외래성 폴리뉴클레오티드를 플라스미드나 바이러스 등과 같은 벡터 등의 운반체에 삽입하여 식물을 형질전환시킬 수 있고, 아그로박테리움 박테리아를 매개체로 사용할 수 있으며(Chilton et ai. Cell 11:263:271(1977)), 직접 외래성 폴리뉴클레오티드를 식물 세포 내로 도입시켜 식물을 형질전환시킬 수 있다(Lorz et ai. Mol. Genet. 199:178-182;(1985)). 예를 들어, T-DNA 부위를 포함하지 않는 벡터를 이용하는 경우에는 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens et al., 1982, Nature 296: 72-74; Negrutiu et al., 1987, Plant Mol. Biol. 8: 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito et al., 1985, Bio/Technol. 3: 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway et al.,1986, Mol. Gen. Genet. 202: 179-185), 각종 식물 요소의(DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(particle gun bombardment, Klein et al.,1987, Nature 327: 70), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication)를 이용할 수 있고, 일반적으로 식물을 형질전환시킴에 있어 많이 사용되는 외래성 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)로 식물 세포나 종자 등을 감염시키는 아그로박테리움(Agrobacterium GV3101)에 냉-해동(Freeze-thaw) 방법 (An, G. 1987, Methods in Enzymology), 식물의 침윤, 그리고 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서(비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP0301316호) 등으로부터 선택될 수 있다. 형질전환된 식물 세포나 종자는 공지된 적절한 조건 하에서 배양 또는 재배되어 완전한 식물로 발육될 수 있다.

본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함하며, 본 발명의 형질전환용 아그로박테리움은 뉴클레오타이드 서열의 발현에 적합한 것이면 어느 것이라도 좋고, 본 발명의 실시예에서는 식물 형질전환용 아그로박테리움 균주로 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) GV3101을 사용하였다.

본 발명에서 식물의 형질전환에 이용되는 "식물세포"는 식물의 모든 부위 유래의 세포를 모두 포함하는 의미로, 식물 세포는 비성숙 배, 배양 세포, 배양 조직, 배양기관을 모두 포함하며, 본 발명에 적용 가능하다.

본 발명에서 "식물조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 배(종자와 식물 모두 포함), 배젖(종자와 식물 모두 포함), 종피, 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.

본 발명에서 용어 “종자”는 겉씨식물과 속씨식물에서 수정한 밑씨가 발달, 성숙한 식물기관을 의미하는 것으로, 씨앗이라고도 한다. 상기 종자는 그 종류에 제한되지 않으며, 물리, 화학적으로 가공처리된 것도 모두 본 발명에 포함된다.

본 발명에서 용어 “식물체”는 완전한 식물체 또는 완전한 식물체로부터 분리된 일부를 의미한다.

본 발명에서 “식물”로 지칭되는 경우, 달리 언급하지 않는 한, 식물세포, 식물조직, 종자 또는 식물체를 모두 포함하는 의미로 해석된다.

본 발명에서 "식물"은 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수 박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용 작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나 나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알팔파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스 등을 포함하는 사료 작물류로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 본 발명은 CBSX3 유전자 또는 이의 단백질의 발현을 억제하는 것을 포함하는 식물의 목질 생성을 감소시키는 방법을 제공한다.

상기 방법은 CBSX3 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현을 억제하는 제제를 식물세포, 식물조직, 종자 또는 식물체에 처리하는 것; 또는 CBSX3 유전자 또는 이의 단백질의 발현을 억제하는 제제를 발현하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 식물세포, 식물조직, 종자 또는 식물체에 도입하여 CBSX3 유전자의 발현을 억제하는 것을 포함한다.

본 발명의 일 실시예에서는 서열번호 3의 마이크로RNA가 식물체 내에 발현되도록 하여, 서열번호 3의 염기서열로 구성되는 마이크로RNA를 발현하는 포함하는 벡터를 제조하여, 상기 벡터를 식물체에 도입하여 마이크로RNA에 의해 AtCBSX3의 발현을 감소시키는 단계를 포함하여, 상기 식물체에서 목질의 생산량이 감소되는 것을 확인하였다.

본 발명의 식물체의 목질을 감소시키는 방법에 따르면, CBSX3 유전자의 저발현에 의해 식물 내 활성산소의 생성이 저해되며, 이는 목질 생성에 필요한 활성산소를 줄여 최종적으로 목질의 생성이 감소하게 된다.

또한, 본 발명은 CBSX3 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현을 억제하는 제제를 식물세포, 식물조직, 종자 또는 식물체에 처리하는 것; 또는 CBSX3 유전자의 발현을 억제하는 제제의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 식물세포, 식물조직, 종자 또는 식물체에 도입하여 형질전환하는 것을 포함하는 목질이 감소된 형질전환체 제조하는 방법을 제공한다.

상기 형질전환체는 바람직하게는 목질이 감소된 식물체일 수 있다.

상기 형질전환은 CBSX3 유전자 또는 이의 단백질의 발현을 억제하는 제제를 발현하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 식물 세포에 도입하여 형질전환된 식물 세포를 제조하는 것; 및 상기 형질전환된 식물 세포로부터 식물체를 제조하는 것을 포함할 수 있다.

상기 형질전환된 식물 세포의 선별은 형질전환 배양물을 선택제(예: 대사 억 제제, 항생제 및 제초제)에 노출시켜 실시될 수 있다. 형질전환되고 선택제 내성을 부여하는 표지 유전자를 안정되게 포함하고 있는 식물 세포는 상기한 배양물에서 성장하고 분할한다. 예시적인 표지는, 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 유전자, 글리코포스페이트 내성 유전자 및 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 (nptII) 시스템을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 식물 세포 또는 캘러스로부터 완전한 식물체로 발달 또는 재분화시키는 방법은 잘 알려져 있다. 벡터에 의해 도입된 외래 유전자를 포함하는 식물 세포의 발달 또는 재분화는 당 업계에 공지된 방법에 따라 달성될 수 있다.

본 발명의 키트는 핵산 또는 항체 이외에 유전자 발현량이나 유전자 발현 패턴의 분석 방법 또는 단백질 존재량이나 존재 패턴의 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다.

본 발명은 식물의 목질화에 관여하는 신규 유전자 CBSX3의 기능을 확인하고, 이를 통해서, 목질이 감소된 형질전환체를 제공 및 이를 제조하는 방법을 제공하기 위한 것으로, 상기 CBSX3의 발현 억제는 식물체의 종류에 따라 표적 부위가 다르게 설정될 수 있으나, CBSX3의 발현 억제를 통해서 식물체 내의 활성산소 생산량을 감소하고, 이를 통해서 식물의 목질 생산을 감소시키는 효과는 동일하게 얻을 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

이하 실시예에서는 다음 서열의 유전자와 microRNA를 사용하였다.

서열번호 1: AtCBSX3 유전자

ATGCAAGGTGTGATTCGATCCTTCGTCTCCGGTGGAAATGTTGTGAAAGGCTCTGTGCTGCAACATCTCCGTGTGATTAACCCGGCGATTCAGCCTTCTGTGTTTTGTTCACGCTCTGAATCAACTCAACCTGCACGTATGGAGGAATCTGGATTCGAGAGCACAACTATTTCCGATGTCATGAAATCCAAAGGCAAAAGTGCTGATGGATCTTGGCTTTGGTGTACTACTGATGACACTGTTTATGATGCTGTTAAATCCATGACACAACACAATGTTGGTGCCTTGGTGGTTGTGAAACCTGGTGAGCAACAAGCTCTTGCTGGTATCATTACAGAGAGAGATTATCTACGGAAGATCATTGTGCAAGGGAGATCATCCAAATCAACAAAAGTTGGAGACATTATGACTGAAGAGAATAAGCTTATCACTGTGACACCGGAGACCAAGGTCTTGCGTGCTATGCAACTGATGACAGATAACCGAATCAGGCATATTCCGGTAATCAAAGACAAGGGCATGATTGGAATGGTGTCCATAGGAGATGTTGTCCGTGCAGTGGTTCATGAGCATAGAGAGGAGCTTCAACGCCTAAATGCGTATATTCAGGGAGGTTACTAG

서열번호 2: microRNA 전사체 서열

TGAATATACGCATTTCGGCGT

서열번호 3: microRNA 서열

UGAAUAUACGCAUUUCGGCGU

서열번호 4: 표적서열

ACGCCTAAATGCGTATATTCA

서열번호 5: microRNA 발현 구조체

GGTACCGGGCCCCCCCTCGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCCTGCAGCCCCAAACACACGCTCGGACGCATATTACACATGTTCATACACTTAATACTCGCTGTTTTGAATTGATGTTTTAGGAATATATATGTAGAACACCGAAATGCGAATATTCTTCACAGGTCGTGATATGATTCAATTAGCTTCCGACTCATTCATCCAAATACCGAGTCGCCAAAATTCAAACTAGACTCGTTAAATGAATGAATGATGCGGTAGACAAATTGGATCATTGATTCTCTTTGATGAATATACGCATTTCGGCGTTCTCTCTTTTGTATTCCAATTTTCTTGATTAATCTTTCCTGCACAAAAACATGCTTGATCCACTAAGTGACATATATGCTGCCTTCGTATATATAGTTCTGGTAAAATTAACATTTTGGGTTTATCTTTATTTAAGGCATCGCCATGGGGGGATCC

실시예 1. 활성산소 스트레스 처리시 AtCBSX3 유전자의 발현 양상 확인

활성산소 스트레스 처리를 위해서, 2주 정도 된 애기장대(Columbia-0 ecotype)를 MS 배지(Mursahige and SKoog medium, M0222, Duchefa Biochemie, 동인바이오텍)에서 생장시켰다. 활성산소 스트레스 처리를 위해서상기와 같이 생장한 식물체에 스프레이 분사 방식으로 10 mM의 과산화수소(30 % (w/w) in H₂O, Sigma Aldrich)를 처리하고, 확보된 식물체에서 RNA를 추출하여 시료를 얻었고 상기 시료에서 AtCBSX3 유전자의 발현 패턴을 real-time PCR(LightCycler® 480 Instrument II, LifeScience)을 통해서 확인하여 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, AtCBSX3 유전자는 과산화수소 처리시 30% 정도 빠르게 발현이 감소하다가 시간이 흘러가며 차차 발현이 복귀되는 경향을 보임을 확인하였다.

따라서, AtCBSX3 유전자가 활성산소에 반응하여 그 발현이 감소함을 확인하였다.

실시예 2. AtCBSX3 유전자를 목적으로 하는 microRNA의 제작 및 클로닝

프라이머	서열	서열번호
A	CTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAAC	서열번호 6
B	GCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAG	서열번호 7
I	GATGAATATACGCATTTCGGCGTTCTCTCTTTTGTATTCC	서열번호 8
II	GAACGCCGAAATGCGTATATTCATCAAAGAGAATCAATGA	서열번호 9
III	GAACACCGAAATGCGAATATTCTTCACAGGTCGTGATATG	서열번호 10
IV	GAAGAATATTCGCATTTCGGTGTTCTACATATATATTCCT	서열번호 11

microRNA제작에 쓰이는 RS300 벡터(Plasmid #22846, addgene)를 주형으로 하여 A + IV, III + II, I + B의 프라이머 조합을 이용하여 PCR 기법을 이용하여 핵산을 얻었다. 그 후, 상기한 3가지의 핵산을 다시 주형으로 하여 A+B 프라이머 조합을 PCR 기법을 통해 증폭시켜 microRNA 전사체 구조를 확보하였다.

상기 microRNA 전사체 구조를 KpnI, BamH 제한 효소로 절단한 후, 레프트 보더(left boarder)와 라이트 보더(right boarder) 사이에 CaMV(Cauline flower mosaic virus) 35S 프로모터를 가지는 식물 형질전환용 바이너리 벡터(binary vector)인 pFAST 벡터에 클로닝 하였고, 이러한 클로닝 제작의 모식도를 도 2에 나타내었다.

상기 제조한 클론을 시퀀싱(sequencing)한 결과, 정확한 염기서열이 클로닝 되었음을 확인하였다. microRNA 전사체 서열을 도 3에 나타내었다.

실시예 3. AtCBSX3 유전자 저발현 돌연변이체의 구축

상기 실시예 2에서 제작된 벡터를 아그로박테리움(Agrobacterium GV3101)에 냉-해동(Freeze-thaw) 방법 (An, G. 1987, Methods in Enzymology)으로 도입하였다. 형질전환된 아그로박테리움을 이용해 꽃침지방법(flower dipping, Clough and Bent, 1998, The Plant Journal)으로 애기장대를 형질전환시켰다. 형질전환시킨 애기장대를 3 세대에 거쳐 선발(screening)하여 T₃ line을 확보하였다.

선발된 AtCBSX3 유전자 저발현 식물체에서의 AtCBSX3의 발현량을 확인하기 위해서 AtCBSX3 프라이머(정방향 프라이머_서열번호 6: TCATTGTGCAAGGGAGATCAT; 역방향 프라이머_서열번호 7: GCGTTGAAGCTCCTCTCTATG)를 이용해 Real-time PCR을 수행하였고 그 결과를 도 4에 나타내었다. elF4a는 내적 대조군으로 사용하였다.

도 4에 나타낸 바와 같이, AtCBSX3 유전자 저발현 돌연변이체의 경우 야생형에 비해서 AtCBSX3의 발현이 줄어드는 것을 확인하였고 이후 실시예에 사용하였다.

실시예 4. AtCBSX3 유전자 저발현 돌연변이체의 활성산소 생성억제 확인

상기 실시 예 3에서 구축한 AtCBSX3 유전자 저발현 돌연변이체의 활성산소 생성억제를 확인하기 위해서, 야생형, AtCBSX3 유전자 저발현 돌연변이체의 종자를 흙에서 2주 정도 키운 뒤, 갈아서 Amplex^TM Red Hydrogen Peroxide/Peroxidase Assay Kit(Thermo Fisher)를 이용해서 활성산소의 생성을 확인하였다.

도 5에 나타낸 바와 같이, AtCBSX3 유전자 저발현 돌연변이체는 야생형보다 활성산소의 생성이 줄어드는 것을 확인하였다.

따라서 AtCBSX3 유전자의 발현이 줄어들 경우 활성산소 생성이 억제되는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 5. AtCBSX3 유전자 저발현 돌연변이체의 목질 감소 확인

상기 실시 예 3에서 구축한 AtCBSX3 유전자 저발현 돌연변이체의 목질 감소를 확인하기 위해서, 야생형과 AtCBSX3 유전자 저발현 돌연변이체의 종자를 흙에서 4주 정도 키운 뒤, 목질 형성이 대표적으로 들어나는 수술과 줄기를 목질을 특이적으로 염색하는 phloroglucinol 시약(Sigma Aldrich)으로 염색하였다.

도 6에서 나타낸 바와 같이, AtCBSX3 유전자 저발현 돌연변이체는 야생형에 비하여 상대적으로 phloroglucinol 염색이 되지 않는 것을 확인할 수 있었다. 즉, AtCBSX3 유전자 저발현 돌연변이체는 야생형보다 목질 형성이 억제됨을 알 수 있다.

실시예 6. AtCBSX3 유전자 저발현 돌연변이체의 웅성불임 표현형 확인

목질화가 제한된 식물체는 수술의 꽃밥(anther) 내피가 정상적으로 발생하지 않아 웅성 불임의 표현형을 가지는 경우가 많이 보고 되어있다.

도 7에서 보여준 것처럼, 수술의 꽃밥을 cross-section하여 관찰한 결과, AtCBSX3 유전자 저발현 돌연변이체는 꽃밥 내피가 정상적으로 발생하지 않는 것을 확인하였다.

꽃밥을 표백하여 측면에서 관찰한 결과, 같은 결과를 얻을 수 있었다. AtCBSX3 유전자 저발현 돌연변이체의 꽃밥 내피는 정상으로 발생하지 않았으며, 따라서 꽃밥이 열개되지 않아, 꽃가루가 이미 수술로부터 터져 나온 야생형과는 달리, 수술에 갇혀있는 것을 확인할 수 있었다.

AtCBSX3 유전자 저발현 돌연변이체는 목질 형성에 주요한 활성산소의 생성을 억제하여 최종적으로 목질의 형성을 억제하는 표현형을 보인다.

비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시 예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한 첨부된 청구 범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함한다.

SEQUENCE LISTING <110> KOREA UNIVERSITY RESEARCH AND BUSINESS FOUNDATION <120> A LIGNIFICATION RELATED GENE AND AN USE THEREOF <130> P19U13C1536 <160> 11 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 621 <212> DNA <213> Arabidopsis arenosa <400> 1 atgcaaggtg tgattcgatc cttcgtctcc ggtggaaatg ttgtgaaagg ctctgtgctg 60 caacatctcc gtgtgattaa cccggcgatt cagccttctg tgttttgttc acgctctgaa 120 tcaactcaac ctgcacgtat ggaggaatct ggattcgaga gcacaactat ttccgatgtc 180 atgaaatcca aaggcaaaag tgctgatgga tcttggcttt ggtgtactac tgatgacact 240 gtttatgatg ctgttaaatc catgacacaa cacaatgttg gtgccttggt ggttgtgaaa 300 cctggtgagc aacaagctct tgctggtatc attacagaga gagattatct acggaagatc 360 attgtgcaag ggagatcatc caaatcaaca aaagttggag acattatgac tgaagagaat 420 aagcttatca ctgtgacacc ggagaccaag gtcttgcgtg ctatgcaact gatgacagat 480 aaccgaatca ggcatattcc ggtaatcaaa gacaagggca tgattggaat ggtgtccata 540 ggagatgttg tccgtgcagt ggttcatgag catagagagg agcttcaacg cctaaatgcg 600 tatattcagg gaggttacta g 621 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> microRNA for CBSX3 gene of Arabidopsis <400> 2 tgaatatacg catttcggcg t 21 <210> 3 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> microRNA for CBSX3 gene of Arabidopsis <400> 3 ugaauauacg cauuucggcg u 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target sequence for microRNA <400> 4 acgcctaaat gcgtatattc a 21 <210> 5 <211> 478 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Construct for expressing mircroRNA <400> 5 ggtaccgggc cccccctcga ggtcgacggt atcgataagc ttgatatcga attcctgcag 60 ccccaaacac acgctcggac gcatattaca catgttcata cacttaatac tcgctgtttt 120 gaattgatgt tttaggaata tatatgtaga acaccgaaat gcgaatattc ttcacaggtc 180 gtgatatgat tcaattagct tccgactcat tcatccaaat accgagtcgc caaaattcaa 240 actagactcg ttaaatgaat gaatgatgcg gtagacaaat tggatcattg attctctttg 300 atgaatatac gcatttcggc gttctctctt ttgtattcca attttcttga ttaatctttc 360 ctgcacaaaa acatgcttga tccactaagt gacatatatg ctgccttcgt atatatagtt 420 ctggtaaaat taacattttg ggtttatctt tatttaaggc atcgccatgg ggggatcc 478 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer A for preparing microRNA <400> 6 ctgcaaggcg attaagttgg gtaac 25 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer B for preparing microRNA <400> 7 gcggataaca atttcacaca ggaaacag 28 <210> 8 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer I for preparing microRNA <400> 8 gatgaatata cgcatttcgg cgttctctct tttgtattcc 40 <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer II for preparing microRNA <400> 9 gaacgccgaa atgcgtatat tcatcaaaga gaatcaatga 40 <210> 10 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer III for preparing microRNA <400> 10 gaacaccgaa atgcgaatat tcttcacagg tcgtgatatg 40 <210> 11 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer IV for preparing microRNA <400> 11 gaagaatatt cgcatttcgg tgttctacat atatattcct 40

Claims

삭제
서열번호 3의 염기서열로 구성되고, CBSX3 유전자의 발현을 억제하는 식물 목질화 억제용 miRNA.
삭제
삭제
서열번호 3의 염기서열로 구성되고, CBSX3 유전자의 발현을 억제하는 식물 목질화 억제용 miRNA의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 식물 목질화 억제용 벡터.
제5항에 따른 식물 목질화 억제용 벡터로 형질전환된 식물 목질화가 억제된 형질전환체.
서열번호 3의 염기서열로 구성되고, CBSX3 유전자의 발현을 억제하는 식물 목질화 억제용 miRNA를 이용하여 CBSX3 유전자의 발현을 억제하는 것을 포함하는 식물의 목질 생성을 감소시키는 방법.
서열번호 3의 염기서열로 구성되고, CBSX3 유전자의 발현을 억제하는 식물 목질화 억제용 miRNA를 발현하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 식물세포, 식물조직, 종자 또는 식물체에 도입하여 형질전환하는 것을 포함하는 목질이 감소된 형질전환체 제조하는 방법.
서열번호 3의 염기서열로 구성되고, CBSX3 유전자의 발현을 억제하는 식물 목질화 억제용 miRNA의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 포함하는 식물 목질화 억제용 조성물.
서열번호 3의 염기서열로 구성되고, CBSX3 유전자의 발현을 억제하는 식물 목질화 억제용 miRNA의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 포함하는 식물 목질화 억제용 키트.