KR101773338B1 - 중쇄지방산 생산에 이용되는 신규 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

중쇄지방산 생산에 이용되는 신규 유전자 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR101773338B1
KR101773338B1 KR1020150129738A KR20150129738A KR101773338B1 KR 101773338 B1 KR101773338 B1 KR 101773338B1 KR 1020150129738 A KR1020150129738 A KR 1020150129738A KR 20150129738 A KR20150129738 A KR 20150129738A KR 101773338 B1 KR101773338 B1 KR 101773338B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
fatty acid
chain fatty
gene
heavy chain
delete delete
Prior art date
Application number
KR1020150129738A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20170032013A (ko
Inventor
노경희
강한철
김종범
김현욱
이경렬
Original Assignee
대한민국
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 대한민국 filed Critical 대한민국
Priority to KR1020150129738A priority Critical patent/KR101773338B1/ko
Publication of KR20170032013A publication Critical patent/KR20170032013A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101773338B1 publication Critical patent/KR101773338B1/ko

Links

Images

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8247Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A01AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01HNEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8209Selection, visualisation of transformants, reporter constructs, e.g. antibiotic resistance markers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

본 발명의 쿠페아(Cuphea paucipetala) 유래 유전자로 형질전환된 식물체 및 이의 종자는 중쇄지방산의 함량이 증대되어 고부가성 오일을 생산할 수 있으므로 상기 유전자는 유지작물 육종소재 개발에 유용하게 이용할 수 있다.

Description

중쇄지방산 생산에 이용되는 신규 유전자 및 이의 용도{Novel gene for producing medium chain fatty acids and their uses}
본 발명은 중쇄지방산 생산에 이용되는 신규 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.
식물에서 생성되는 중쇄지방산은 상온에서 굳는 성질이 있어 화장품에서는 보습력 유지 화장품 원료로 사용되며, 탄소길이가 짧아 세척력이 뛰어난 특성이 있어 샴푸, 비누, 윤활제 등의 원료로 이용되는 등 상업적 이용범위가 넓고 희소성이 높아 고부가성 오일로 알려져 있다.
또한, 중쇄지방산은 건강기능성이 매우 뛰어난 식물성 지방산으로 섭취 즉시 세포에너지원으로 사용될 정도로 에너지 효율이 높아 심근증 예방 효과가 높다고 알려져 있다.
중쇄지방산은 주로 아열대작물인 쿠페아에서 생산되는데, 쿠페아는 포복성 덩굴성 작물로 기계화작업이 어렵고, 종자가 익기도 전에 꼬투리가 벌어져 종자가 땅에 떨어지기 때문에 작물재배가 매우 어려운 실정이다. 이 외에도 중쇄지방산은 코코아 등 열대성 나무 열매에서 생산되는데 재배지역적 한계가 있어 수요에 비해 공급량이 절대적으로 부족한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 중쇄지방산 생산에 관여하는 유전자를 탐색하였으며 쿠페아(Cuphea paucipetala)로부터 이를 발견하였다. 상기 유전자를 기후적응성이 넓고 기계화 재배가 가능한 유지작물(예: 유채 등)에 형질전환할 경우 중쇄지방산 함유 고부가성 오일 생산이 가능하므로 농가소득창출 및 종자로열티로 신소득원 창출에 기여할 것이다.
한국공개특허 제10-2015-0052904호
본 발명의 목적은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는, 중쇄지방산 생산에 이용되는 쿠페아(Cuphea paucipetala) 유래의 폴리펩타이드를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환 식물체를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 중쇄지방산 함량이 증대된 형질전환 식물체를 제조하는 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 식물체 내 중쇄지방산 함량을 증대하는 방법을 제공하기 위한 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는, 중쇄지방산 생산에 이용되는 쿠페아(Cuphea paucipetala) 유래의 폴리펩타이드를 제공한다.
쿠페아(Cuphea)란, 쌍떡잎식물 도금양목 부처꽃과의 한 속으로 아메리카 대륙이 원산지이고 열대와 아열대 지방에 약 200종이 분포하고 있다.
상기 폴리펩타이드는 쿠페아(Cuphea paucipetala)로부터 분리된 것이 바람직하며 특히, 쿠페아(Cuphea paucipetala)의 미숙종자에서 분리되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
중쇄지방산이란 탄소수가 8-12개로 구성된 포화지방산으로, 장쇄지방산과 달리 인체내 흡수가 빠르고 분해가 빨리 일어나 체지방으로 축적되지 않으면서 열효율이 높아 소화장애환자의 식이요법에 이용된다. 또한 최근 의료분야의 위장침투향상기술에 중쇄지방산 또는 중쇄지방산 유도물질이 사용되며, 이 기술은 최첨단 약물전달시스템 분야에 매우 중요하게 적용되고 있다.
상기 중쇄지방산은 카프산(Caprate, C10:0), 라우린산(Laurate, C12:0), 미리스틱산(Myristate, C14:0)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.
본 발명은 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자 및 이의 DNA cDNA를 모두 포함한다.
본 발명에서 상기 유전자는 쿠페아(Cuphea paucipetala) 유래의 중쇄지방산 생산 유전자로서, 유전정보 검색 결과 엽록체내에서 지방산 사슬 연장을 중단시키는 지방산 싸이오에스테라아제(Fatty acid thioesterase) 유전자와 상동성이 높은 것으로 확인하였으므로, Thioesterase5-3로 명명하였다. 구체적인 내용은 하기 실시예에서 자세히 설명한다.
상기 유전자는 서열번호 2의 염기 서열로 이루어지는 유전자인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 서열번호 2의 염기 서열로 이루어지는 유전자 또는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 외에도 상기 서열들의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 본다. 변이체는 염기 서열 또는 아미노산 서열은 변화되지만, 서열번호 2의 염기 서열 또는 서열번호 1의 아미노산 서열과 유사한 기능적 특성을 갖는 염기 서열로 이루어진 유전자 또는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드이다. 구체적으로, 본 발명에 따른 유전자는 서열번호 2의 염기 서열과 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있으며, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "발현 벡터"는 흔히 "재조합 벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "재조합 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.
본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 재조합 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예: T7 프로모터, pL프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예: pCAMBIA 시리즈, pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지(예: gt4xue, -Charon, z1 및 M13 등) 또는 바이러스(예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 벡터는 중쇄지방산 생산용인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 Bn12S, CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.
본 발명의 일실시예에서는 본 발명에 따른 중쇄지방산 생산 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제작하였다. 상기 재조합 벡터는 제초제 저항성 Bar 유전자가 포함되고 Bn12S 프로모터가 중쇄지방산 생산 유전자의 5- 말단 앞에 위치하는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다. 더욱 바람직하게는 도 4에 기재된 pCAM3300-Bn12S-Thioesterase5-3 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.
본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신, 테트라사이클린 및 바스타(BASTA) 제초제에 대한 내성 유전자가 있다.
본 발명의 일실시예에서는 바스타 제초제에 저항성을 갖는 중쇄지방산 생산 유전자가 형질전환된 식물체를 선발하였다.
본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환 식물체를 제공한다.
본 발명에 따른 상기 식물체는 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근으로 이루어진 군에서 선택된 채소작물류; 유채, 들깨, 콩으로 이루어진 군에서 선택된 유지작물류; 벼, 밀, 보리, 옥수수, 대두, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수로 이루어진 군에서 선택된 식량작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우로 이루어진 군에서 선택된 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나로 이루어진 군에서 선택된 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립으로 이루어진 군에서 선택된 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스로 이루어진 군에서 선택된 사료작물류일 수 있다.
상기 식물체는 중쇄지방산 생산 유전자 발현에 의해 중쇄지방산 함량이 증가한 것이 바람직하며, T1 종자인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환 식물체 제조 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 재조합 발현 벡터는 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 식물체 내로 도입할 수 있다. 예를 들면, 아그로박테리움(Agrobacterium sp.) 매개에 의한 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 전기천공법(electroporaion), PEG-매게 융합법, 미세사출법, 미세주입법, 리포좀 매개법, 진공침윤법 및 화아침지법(floral dipping)을 사용할 수 있으며, 이에 한정되지 않으나, 바람직하게는 아그로박테리움 매개에 의한 방법을 사용할 수 있으며 문헌에 예시된 방법을 사용할 수 있다(Horsch et al., Science 227:1229-1231, 1985; An et al., EMBOJ. 4:227-288, 1985).
본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개에 의한 방법을 포함하며, 특히 바람직한 것은 화아침지법을 이용하는 것이다. 상기 방법들은 이 기술분야에 널리 공지되어 있다.
본 발명은
(1) 본 발명에 따른 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계;
(2) 상기 벡터를 아그로박테리움을 이용하여 식물체에 형질전환하는 단계; 및
(3) 제초제를 살포하여 형질전환체를 선별하는 단계;
를 포함하는 중쇄지방산 함량이 증대된, 형질전환 식물체 제조 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은
(1) 본 발명에 따른 형질전환 식물체로부터 T1 종자를 수득하는 단계;
(2) 상기 단계 (1)의 T1 종자 중에 중쇄지방산의 함량이 증가한 계통을 선발하는 단계;
를 포함하는 중쇄지방산 함량 증대 방법을 제공한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 중쇄지방산 생산에 이용되는 중쇄지방산 생산 유전자를 쿠페아(Cuphea paucipetala)의 미숙종자로부터 분리하였고, 중쇄지방산 생산 유전자를 Bn12S 프로모터와 결합 후 애기장대 식물체에 형질전환하였다. 그 결과, 애기장대 비형질전환체(대조구)는 중쇄지방산이 0 mol%로 전혀 생산되지 않은 것에 비해 애기장대 형질전환체는 중쇄지방산이 생산되어 전체 지방산 중 9 mol%를 차지하는 것을 확인하였다(도 7).
따라서, 본 발명의 중쇄지방산 생산 유전자가 포함된 벡터로 형질전환된 식물체가 중쇄지방산의 함량이 유의적으로 향상되었으므로, 상기 유전자를 이용하여 다양한 식물체에서 중쇄지방산을 생산 또는 이의 함량을 증대시키는데 유용하게 이용할 수 있다.
본 발명의 쿠페아(Cuphea paucipetala) 유래 유전자로 형질전환된 식물체의 종자에서 중쇄지방산의 함량이 증대되었으므로 상기 유전자를 이용하여 유지작물 육종소재 개발에 유용하게 이용할 수 있다.
도 1은 중쇄지방산 생산 유전자의 분리 과정을 나타낸 도이다; (A) 쿠페아(Cuphea paucipetala)의 미숙종자에서 전체 RNA 분리, (B) PCR을 이용한 중쇄지방산 생산 유전자 분리.
도 2는 쿠페아(Cuphea paucipetala) 유래 중쇄지방산 생산 유전자의 염기 서열(서열번호 2) 및 아미노산 서열(서열번호 1)을 나타낸 도이다.
도 3은 중쇄지방산 생산 유전자와 다른 식물체로부터 분리된 FatB 유전자들과의 아미노산 유연관계를 나타낸 도이다; 가로축은 100개의 아미노산 당 서로 다른 아미노산의 개수를 의미.
도 4는 중쇄지방산 생산 유전자를 포함하는 식물 형질전환용 운반체의 모식도이다.
도 5는 중쇄지방산 생산 유전자로 형질전환된 애기장대 형질전환체 A7 계통의 지방산 조성별 분포도이다; 대조구: 애기장대 비형질전환체.
도 6은 중쇄지방산 생산 유전자로 형질전환된 애기장대 형질전환체 A7 계통의 중쇄지방산 및 장쇄지방산 분포도이다; 대조구: 애기장대 비형질전환체.
도 7은 중쇄지방산 생산 유전자로 형질전환된 애기장대 형질전환체 A7 계통의 GC 분석에 의한 지방산 조성 그래프를 나타낸 도이다; (위) 대조구, (아래) A10 계통. IS; Internal Standard.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
< 실시예 1> 쿠페아( Cuphea paucipetala )로부터 유전자 분리
쿠페아(Cuphea paucipetala)의 미숙종자를 재료로 식물 RNA 분리 트리졸® 시약(Plant RNA isolation TRIZOL® Reagen)(Invitrogen)을 이용하여 전체 RNA를 분리하였고(도 1A), 다이나비드® mRNA 정제 키트(Dynabeads® mRNA Purification Kit)(Invitrogen)를 이용하여 mRNA를 분리한 후, 진레이서TM 키트(GeneRacerTM Kit)(Invitrogen)를 이용하여 5’캡 구조를 가진 5’말단-cDNA 또는 3’폴리A 꼬리를 가진 3’말단-cDNA를 만든 후 FatB 특이 반응 프라이머(Forward: 5’-GTGGAATGACTTGGATGTCAATCAGCACGT-3’(서열번호 3); Reverse: 5’-ACGTGCTGAT TGACATCCAAGTCATTCCAC-3’(서열번호 4))를 이용하여 RACE(Rapid Amplication of cDNA Ends)-PCR 반응을 통해 유전자 일부를 분리하였다. 염기 서열분석을 통해 분리된 유전자의 개방형 해독틀(open reading frame, ORF)에 해당되는 프라이머를 제작하여 PCR로 유전자를 분리하였다(도 1B).
< 실시예 2> 유전자 동정
PCR반응에 의해 분리된 유전자 단편을 pGEM-TA-클로닝 키트(pGEM-TA-cloning kit)(Promega)를 이용하여 유전자를 pGEM-T-이지(pGEM-T-easy) 벡터로 옮긴 후, 시퀀싱(Sequencing)을 하여 1254 bp에 해당하는 유전자 염기 서열 정보를 획득하였으며, 이를 토대로 아미노산 서열을 추정하였다(도 2, 서열번호 1, 서열번호 2).
이러한 유전정보를 블라스트X(BlastX) 검색한 결과, 엽록체내에서 지방산 사슬 연장을 중단시키는 지방산 싸이오에스테라아제(Fatty acid thioesterase) 유전자와 상동성이 높은 것을 확인하여, Thioesterase5-3로 명명하였다. 또한, 분리된 중쇄지방산 생산 유전자와 NCBI에 등록된 FatB 또는 FatA 유전자의 아미노산과의 유전적 유연관계를 DNASTAR MegAlign 프로그램의 클러스탈W(ClustalW) 방법을 이용하여 살펴본 결과, 도 3과 같이 나타났으며, 블라스트X 검색 결과와 동일함을 알 수 있었다.
< 실시예 3> 중쇄지방산 생산 유전자 발현에 따른 중쇄지방산 함량 분석
<3-1> 중쇄지방산 생산 유전자 재조합 발현 벡터 제작
중쇄지방산 생산 유전자의 기능을 검정하기 위하여 식물 형질전환용 운반체를 제작하였다. 형질전환체 선발을 위해 바스타 제초제 저항성 Bar 유전자가 들어간 pCAMBIA 3300을 기본벡터로 이용하였고, Bn12S 프로모터를 중쇄지방산 생산 유전자의 5‘- 말단 앞에 오도록 운반체 pCAM3300-Bn12S-Thioesterase5-3를 제작하였다(도 4).
<3-2> 중쇄지방산 생산 유전자 애기장대 형질전환 식물체 제작
제작한 식물 형질전환용 운반체 pCAM3300-Bn12S-Thioesterase5-3를 아그로박테리움 EHA105에 형질전환하였다. 애기장대(Arabidopsis thaliana cv. Colombia)의 경우, 화아침지법(floral dipping)으로 형질전환한 후, 얻어진 종자를 파종고 본엽 2매를 가진 유묘기에 0.3% 바스타 제초제를 살포하여 살아남은 개체를 이식하여 실험을 수행하였다.
<3-3> 중쇄지방 생산 유전자 유채 형질전환 식물체 제작
제작한 식물 형질전환용 운반체 pCAM3300-Bn12S-Thioesterse5-3를 아그로박테리움 EHA105에 형질전환하였다. 유채(Brassica napus cv. Youngsan)의 경우, 파종 후 5일된 유묘에서 잎자루 달린 자엽(petiole-cotyledonary)과 하배축(hypocotyl) 부위를 잘라서 아그로박테리움 EHA105의 농도가 O.D.=0.5로 조정된 접종액에 담가 20분간 접종을 유도한 후, 2일간 암배양 조건에서 공동배양을 하고 선발배지에 옮겨 2주마다 계대배양을 하며 캘러스를 거쳐 완전 재분화가 이루어진 개체를 얻었다. 이 개체의 잎에서 단백질을 추출하여 바스타 제초제에 저항성을 갖는 Bar 유전자에 대한 Bar-스트립(strip)의 면역반응을 통해 형질전환체임을 확인한 후 온실로 옮겨 재배하였다. 수확한 T1 종자를 대상으로 지방산 분석을 실시하였다.
<3-4> 애기장대 형질전환체 T1 세대에서 중쇄지방산 함량 분석
바스타 제초제 살포 후 살아남은 중쇄지방산 생산 유전자 함유 애기장대 형질전환체를 총 12 개체 획득하여 T1 종자에서 지방산 분석을 수행한 결과, 대부분의 형질전환체에서 중쇄지방산인 카프산(Caprate, C10:0), 라우린산(Laurate, C12:0) 그리고 미리스틱산(Myristate, C14:0)이 생성됨을 확인하였다(표 1). 또한, 전체 형질전환체 12 계통 중 A4, A7, A12 계통에서 중쇄지방산 생산 유전자 발현이 가장 높게 나타났으며(도 5), 이 외에도 모든 형질전환체에서 포화지방산인 팔미트산(C16:0) 함량이 증가하는 것이 관찰되었다. 중쇄지방산에 해당하는 카프산, 라우린산, 미리스틱산의 생성량을 살펴보면, 애기장대 비형질전환체(대조구)는 중쇄지방산 생성량이 0 mol%로 전혀 생성되지 않은 것에 비해 애기장대 형질전환체 A4, A7, A12 계통에서 중쇄지방산은 전체 지방산 중 9 mol%를 생산하는 것을 확인하였다(도 6). GC 분석에 의한 지방산 조성 분석 결과에서도 형질전환체에서 카프산, 라우린산, 미리스틱산이 생성된 것으로 나타나 도 5의 결과와 일치하였다(도 7).
(단위:mol%)
계통번호 중쇄지방산 장쇄지방산 중쇄지방산 장쇄지방산
C10:0 C12:0 C14:0 C16:0 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 C20:0 C20:1
대조구 0 0 0 8 3 17 29 19 2 21 0 100
A1 3 2 1 14 4 17 25 20 2 11 6 94
A2 4 1 1 15 3 14 26 20 3 12 6 94
A3 2 1 1 12 3 17 28 19 2 16 4 96
A4 5 3 1 14 3 18 23 17 2 12 9 91
A5 2 1 1 11 3 18 28 18 2 17 4 96
A6 5 2 1 14 3 15 25 20 2 12 8 92
A7 6 2 1 14 3 17 24 18 3 12 9 91
A8 2 1 1 12 3 17 26 17 2 18 4 96
A9 4 1 1 12 3 18 25 19 1 15 6 94
A10 4 1 1 14 3 15 26 19 3 13 6 94
A11 2 1 1 12 3 17 28 19 2 16 4 96
A12 5 2 1 14 3 17 24 18 2 12 9 91
<3-5> 유채 형질전환체 T1 세대에서 중쇄지방산 함량 분석
Bar-스트립(strip)을 통해 선발된 유채 형질전환체를 총 6개체 획득하여 T1 종자에서 지방산 분석을 수행한 결과, 애기장대 형질전환체와 마찬가지로 대부분의 형질전환체에서 중쇄지방산인 카프산(Caprate, C10:0), 라우린산(Laurate, C12:0) 그리고 미리스틱산(Myristate, C14:0)이 생성됨을 확인하였다(표 2). 또한, 전체 형질전환체 6 계통 중 B3 계통에서 중쇄지방산 생산 유전자 발현이 가장 높게 나타났다. 중쇄지방산에 해당하는 카프산, 라우린산, 미리스틱산의 생성량을 살펴보면, 유채 비형질전환체(대조구)는 중쇄지방산 생성량이 0 mol%로 전혀 생성되지 않은 것에 비해 유채 형질전환체 B3 계통에서 중쇄지방산은 전체 지방산 중 9 mol%를 생산하는 것을 확인하였으며, 이것은 애기장대 형질전환체에서와 일치하는 결과를 보여준다.
따라서, 본 연구결과를 통해 쿠페아(Cuphea psucipetala)로부터 분리한 유전자가 중쇄지방산 함량 증대에 관여함을 확인하였다.
(단위:mol%)
계통번호 중쇄지방산 장쇄지방산 중쇄지방산 장쇄지방산
C10:0 C12:0 C14:0 C16:0 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 C20:0 C20:1
대조구 0 0 0 5 2 66 19 6 1 1 0 100
B1 3 1 1 11 4 56 18 6 0 0 5 95
B2 4 1 1 9 3 57 17 5 1 1 6 94
B3 6 2 1 11 2 53 17 5 1 1 9 91
B4 3 1 1 10 3 58 16 4 1 1 5 95
B5 4 1 1 10 3 55 17 5 8 1 6 94
B6 4 1 0 10 4 57 15 5 2 1 5 95
<110> Republic of Korea <120> Thioesterase5-3 Gene for producing medium chain fatty acids and their uses <130> P15R12D0948 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 417 <212> PRT <213> Thioesterase5-3 amino acid <400> 1 Met Val Ala Ala Ala Ala Ser Ser Ala Phe Phe Pro Val Pro Ala Pro 1 5 10 15 Gly Thr Ser Pro Lys Pro Gly Lys Ser Gly Asn Trp Pro Ser Ser Leu 20 25 30 Ser Pro Ser Phe Arg Pro Lys Ser Ile Pro Asn Gly Gly Phe Gln Val 35 40 45 Lys Ala Asn Ala Ser Ala His Pro Lys Ala Asn Gly Ser Ala Val Asn 50 55 60 Leu Lys Ser Gly Ser Leu Asn Thr Gln Glu Asp Thr Ser Ser Ser Pro 65 70 75 80 Pro Pro Arg Ala Phe Leu Asn Gln Leu Pro Asp Trp Ser Met Leu Leu 85 90 95 Thr Ala Ile Thr Thr Val Phe Val Ala Ala Glu Lys Gln Trp Thr Met 100 105 110 Leu Asp Arg Lys Ser Lys Lys Pro Asp Met Leu Val Asp Ser Val Gly 115 120 125 Ser Lys Ser Ile Val Leu Asp Gly Leu Val Ser Arg Gln Ile Phe Ser 130 135 140 Ile Arg Ser Tyr Glu Ile Gly Ala Asp Arg Thr Ala Ser Ile Glu Thr 145 150 155 160 Leu Met Asn His Leu Gln Glu Thr Ser Ile Asn His Cys Lys Ser Leu 165 170 175 Gly Leu Leu Asn Asp Gly Phe Gly Arg Thr Pro Gly Met Cys Lys Asn 180 185 190 Asp Leu Ile Trp Val Leu Thr Lys Met Gln Ile Met Val Asn Arg Tyr 195 200 205 Pro Thr Trp Gly Asp Thr Val Glu Ile Asn Thr Trp Phe Ser His Ser 210 215 220 Gly Lys Ile Gly Met Ala Ser Asp Trp Leu Ile Thr Asp Cys Asn Thr 225 230 235 240 Gly Glu Ile Leu Ile Arg Ala Thr Ser Val Trp Ala Met Met Asn Gln 245 250 255 Lys Thr Arg Arg Phe Ser Arg Leu Pro Tyr Glu Val Arg Lys Glu Leu 260 265 270 Thr Pro His Tyr Val Asp Ser Pro His Val Ile Glu Asp Asn Asp Arg 275 280 285 Lys Leu His Lys Phe Asp Val Lys Thr Gly Asp Ser Ile Arg Lys Gly 290 295 300 Leu Thr Pro Arg Trp Asn Asp Leu Asp Val Asn Gln His Val Ser Asn 305 310 315 320 Val Lys Tyr Ile Gly Trp Ile Leu Glu Ser Met Pro Ile Glu Val Leu 325 330 335 Glu Thr Gln Glu Leu Cys Ser Leu Thr Val Glu Tyr Arg Arg Glu Cys 340 345 350 Gly Met Asp Ser Val Leu Glu Ser Val Thr Ala Met Asp Pro Ser Glu 355 360 365 Asp Glu Gly Leu Ser Gln Tyr Lys His Leu Leu Arg Leu Glu Asp Gly 370 375 380 Thr Asp Ile Val Lys Gly Arg Thr Glu Trp Arg Pro Lys Asn Ala Gly 385 390 395 400 Thr Asn Gly Ala Ile Ser Thr Ala Lys Pro Ser Asn Gly Asn Ser Val 405 410 415 Ser <210> 2 <211> 1254 <212> DNA <213> Thioesterase5-3 DNA <400> 2 atggtggctg ctgcagcaag ttctgcattc ttccctgttc cagccccggg aacctcccct 60 aaacccggga agtccggcaa ctggccatcg agcttgagcc cttccttcag gcccaagtca 120 atccccaacg gcggatttca ggttaaggca aatgccagtg cccatcctaa ggctaacggt 180 tctgcagtaa atctaaagtc tggcagcctc aacactcagg aggacacttc gtcgtcccct 240 cctcctcggg ctttccttaa ccagttgcct gattggagta tgcttctgac tgcaatcacg 300 actgtctttg tggcggcaga gaagcagtgg actatgcttg atcggaaatc taagaagcct 360 gacatgctcg tggactcggt tgggtcgaag agtattgttc tggatgggct cgtgtccaga 420 cagatttttt cgattaggtc ttatgaaata ggcgctgatc gaacagcctc tatagagacg 480 ctgatgaacc acttgcagga aacatctatc aatcattgta agagtttggg tcttctcaat 540 gacggctttg gtcgtactcc tgggatgtgt aaaaacgacc tcatttgggt gcttacaaaa 600 atgcagatca tggtgaatcg ctacccaact tggggcgata ctgttgagat caatacctgg 660 ttctcccatt cggggaaaat cggtatggct agcgattggc taataactga ttgcaacaca 720 ggagaaattc ttataagagc aacgagcgtg tgggccatga tgaatcaaaa gacgagaaga 780 ttctcaagac ttccatatga ggttcgcaag gagttaacgc ctcattatgt ggactctcct 840 catgtcattg aagataatga tcggaaattg cataagtttg atgtgaagac tggtgattcc 900 attcgtaagg gtctaacgcc gaggtggaat gacttggatg tcaatcagca cgtaagcaac 960 gtgaagtaca ttgggtggat tctcgagagt atgccaatag aagttttgga gacccaggag 1020 ctatgctctc tcaccgttga atataggcgg gaatgcggaa tggacagtgt gctggagtcc 1080 gtgactgcta tggatccttc ggaagatgaa ggcctgtctc agtacaagca ccttctgcgg 1140 cttgaggatg ggactgacat cgtgaagggc agaactgagt ggcgaccgaa gaatgcagga 1200 actaatgggg caatatcaac agcaaagcct tcaaatggaa actcggtctc ttag 1254 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TEase primer_Forward <400> 3 gtggaatgac ttggatgtca atcagcacgt 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TEase primer_Reverse <400> 4 acgtgctgat tgacatccaa gtcattccac 30

Claims (13)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. (1) 서열번호 3 및 4로 표시되는 프라이머 세트를 이용하여, 쿠페아(Cuphea paucipetala)의 미숙종자로부터 지방산 싸이오에스테라아제(Fatty acid thioesterase) 신규 유전자를 분리하는 단계;
    (2) 상기 단계 (1)에서 분리된, 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 지방산 싸이오에스테라아제(Fatty acid thioesterase) 신규 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계;
    (3) 상기 재조합 벡터를 아그로박테리움을 이용하여 애기장대 식물체 또는 유채 식물체에 형질전환하는 단계;
    (4) 바스타 제초제를 살포하여 상기 지방산 싸이오에스테라아제(Fatty acid thioesterase) 신규 유전자가 발현된 애기장대 형질전환 식물체 또는 유채 형질전환 식물체를 선별하는 단계;
    (5) 상기 선별된 형질전환 식물체로부터 T1 종자를 수득하는 단계; 및
    (6) 상기 단계 (5)의 T1 종자 중에 카프산(Caprate, C10:0), 라우린산(Laurate, C12:0) 및 미리스틱산(Myristate, C14:0)의 함량이 증가한 계통을 선발하는 단계;를 포함하는, 종자 내 카프산(Caprate, C10:0), 라우린산(Laurate, C12:0) 및 미리스틱산(Myristate, C14:0) 함량이 증가된 애기장대 형질전환 식물체 또는 유채 형질전환 식물체로부터 카프산(Caprate, C10:0), 라우린산(Laurate, C12:0) 및 미리스틱산(Myristate, C14:0)을 생산하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 지방산 싸이오에스테라아제(Fatty acid thioesterase) 신규 유전자는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 암호화하는 것인 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 지방산 싸이오에스테라아제(Fatty acid thioesterase) 신규 유전자는 싸이오에스테라아제5-3(Thioesterase5-3)으로 명명된 것인 방법.
KR1020150129738A 2015-09-14 2015-09-14 중쇄지방산 생산에 이용되는 신규 유전자 및 이의 용도 KR101773338B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020150129738A KR101773338B1 (ko) 2015-09-14 2015-09-14 중쇄지방산 생산에 이용되는 신규 유전자 및 이의 용도

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020150129738A KR101773338B1 (ko) 2015-09-14 2015-09-14 중쇄지방산 생산에 이용되는 신규 유전자 및 이의 용도

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20170032013A KR20170032013A (ko) 2017-03-22
KR101773338B1 true KR101773338B1 (ko) 2017-09-01

Family

ID=58497509

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020150129738A KR101773338B1 (ko) 2015-09-14 2015-09-14 중쇄지방산 생산에 이용되는 신규 유전자 및 이의 용도

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101773338B1 (ko)

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101549147B1 (ko) 2013-11-06 2015-09-02 대한민국 고도불포화지방산 생합성을 위한 재조합 벡터 및 이를 이용하여 제작된 형질전환 효모

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GenBank Accession Number CAB60830 (2006.11.14.)*
GenBank Accession Number GU225690 (2012.12.24.)*

Also Published As

Publication number Publication date
KR20170032013A (ko) 2017-03-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5519192B2 (ja) 種子のタンパク質含量を増産させる遺伝子及びその利用方法
WO2009110466A1 (ja) 植物の油脂を増産させる遺伝子及びその利用方法
CN112322644B (zh) 番茄SlSPY基因在控制番茄果实成熟进程中的应用
KR101416506B1 (ko) 비생물학적 스트레스 내성 및 생장 촉진 관련 유전자 및 그의 용도
KR101803500B1 (ko) 식물의 냉해 스트레스 내성과 관련된 신규 유전자 및 그의 용도
CN101514346A (zh) 生菜γ-生育酚甲基转移酶蛋白编码序列
CN101712718B (zh) 一种与植物抗旱相关的蛋白及其编码基因与应用
KR101773338B1 (ko) 중쇄지방산 생산에 이용되는 신규 유전자 및 이의 용도
WO2012039159A1 (ja) 塊茎生産能または匍匐枝形成能が野生株に比して向上している匍匐枝形成植物の作製方法、当該方法によって作製された匍匐枝形成植物
US9297020B2 (en) Gene for increasing the production of plant biomass and method of use thereof
KR101594985B1 (ko) 피마자 유래의 RcLPAT299 유전자 및 이의 용도
CN104017781B (zh) 百子莲赤霉素合成双加氧酶APGA20ox蛋白及其编码基因和探针
KR101594988B1 (ko) 피마자 수술 특이적 RcLPAT376 유전자 및 이의 용도
KR101618263B1 (ko) 포화지방산 함량 증대에 관여하는 유전자 및 이의 용도
KR101874192B1 (ko) 식물병 저항성을 증가시키는 OsTat1 유전자 및 이의 용도
KR102369344B1 (ko) 불포화지방산 비율이 조절된 종자를 제조하기 위한 조성물 및 이로부터 제조된 종자
CN114214341B (zh) 番茄SlSERAT1;1基因或其片段在植物发育过程中的应用
JP6229967B2 (ja) 植物の病害抵抗性及び/又は分枝を増強する組成物
KR20190052557A (ko) 식물의 키다리병 저항성을 증진시키는 방법
KR101438738B1 (ko) 비생물학적 스트레스 내성 및 생장 촉진 관련 유전자 및 그의 용도
KR101446253B1 (ko) 비생물학적 스트레스 내성 및 생장 촉진 관련 유전자 및 그의 용도
KR20150005749A (ko) 피마자 수술 특이적 RcLPAT376 유전자 및 이의 용도
AU2023264878A1 (en) Methods and compositions for modifying seed composition
KR20150005750A (ko) 피마자 유래의 RcLPAT299 유전자 및 이의 용도
EP3091077A2 (en) Gene implicated in abiotic stress tolerance and growth accelerating and use thereof

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
PA0109 Patent application

Patent event code: PA01091R01D

Comment text: Patent Application

Patent event date: 20150914

PA0201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event date: 20161202

Patent event code: PE09021S01D

PG1501 Laying open of application
E701 Decision to grant or registration of patent right
PE0701 Decision of registration

Patent event code: PE07011S01D

Comment text: Decision to Grant Registration

Patent event date: 20170626

GRNT Written decision to grant
PR0702 Registration of establishment of national patent

Patent event code: PR07021E01D

Comment text: Registration of Establishment of National Patent

Patent event date: 20170825

PR1002 Payment of registration fee

Payment date: 20170825

End annual number: 20

Start annual number: 1

PG1601 Publication of registration