WO2012039159A1 - 塊茎生産能または匍匐枝形成能が野生株に比して向上している匍匐枝形成植物の作製方法、当該方法によって作製された匍匐枝形成植物 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明にかかる匍匐枝形成植物の作製方法(「本発明の作製方法」という)は、Ran遺伝子を導入する工程(「Ran遺伝子導入工程」という)を含むことを特徴としている。また、本発明にかかる匍匐枝形成植物の作製方法には、上記Ran遺伝子導入工程に加えて、フルクトース-1,6-ビスホスファターゼ/セドヘプツロース-1,7-ビスホスファターゼをコードするポリヌクレオチド(FBPase/SBPase遺伝子)を導入する工程(「FBPase/SBPase遺伝子導入工程」)が含まれていてもよい。さらに上記導入工程の他、匍匐枝形成植物の作製において含まれ得るその他の工程が含まれていてもよい。上記その他の工程としては、例えば、導入工程後に匍匐枝形成植物を培養する工程が挙げられる。
上記Ran遺伝子導入工程では、匍匐枝形成植物にRan遺伝子を導入することで塊茎生産能が野生株に比して向上した匍匐枝形成植物を作製できる。
(A)配列番号1または2に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(B)配列番号1または2に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ塊茎生産能を向上する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
(C)配列番号3または4に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(D)配列番号3または4に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて1または数個のアミノ酸が置換、欠失、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ塊茎生産能を向上する活性を有するポリペプチド。
本発明にかかる作製方法は、ラン藻由来のFBPase/SBPaseをコードするポリヌクレオチドを、匍匐枝形成植物に導入する工程をさらに含むものであってもよい。
(E)配列番号5に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(F)配列番号5に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつFBPase/SBPaseの活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
(G)配列番号6に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(H)配列番号6に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて1または数個のアミノ酸が置換、欠失、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつFBPase/SBPaseの活性を有するポリペプチド。
本発明にかかる匍匐枝形成植物は、上記本発明の作製方法により作製されてなる、塊茎生産能が野生株に比して向上した匍匐枝形成植物であることを特徴としている。ここで「塊茎生産能が野生株に比して向上する」とは、本発明の作製方法により取得された形質転換植物の塊茎重量および/または塊茎数が、本発明の作製方法が実施されていない匍匐枝形成植物(野生株)のそれらに比して増加することを意味する。塊茎生産能が野生株に比して向上したかどうかは、複数個体の野生株と形質転換植物とについて塊茎重量および/または塊茎数を検討し、1個体当たりの平均塊茎重量および/または平均塊茎数を比較し、後者が前者を上回っていれば塊茎生産能が野生株に比して向上したと判断することができる。
本発明にかかるキットは、匍匐枝形成植物の塊茎生産能を向上させるためのキットであり、Citrullus lanatus由来のRan遺伝子、およびラン藻由来のFBPase/SBPaseをコードするポリヌクレオチドを含むことを特徴としている。
本発明は以下の発明を包含する。
(A)配列番号1または2に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(B)配列番号1または2に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ塊茎生産能を向上する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
(C)配列番号3または4に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(D)配列番号3または4に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて1または数個のアミノ酸が置換、欠失、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ塊茎生産能を向上する活性を有するポリペプチド。
(E)配列番号5に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(F)配列番号5に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつフルクトース-1,6-ビスホスファターゼ/セドヘプツロース-1,7-ビスホスファターゼの活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
(G)配列番号6に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(H)配列番号6に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて1または数個のアミノ酸が置換、欠失、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつフルクトース-1,6-ビスホスファターゼ/セドヘプツロース-1,7-ビスホスファターゼの活性を有するポリペプチド。
(A)配列番号1または2に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド。
(B)配列番号1または2に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ匍匐枝形成能を向上する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
(C)配列番号3または4に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(D)配列番号3または4に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて1または数個のアミノ酸が置換、欠失、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ匍匐枝形成能を向上する活性を有するポリペプチド。
<1-1.FS形質転換ベクターの構築>
pBI101ベクター(クロンテック社)のHindIIIとSacI制限酵素サイトに、5’末端にHindIIIと3’末端にSphIとの制限酵素サイトを付加したトマトrbcS(Ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase small subunit遺伝子)プロモーターおよびトランジットペプチドのコード領域、ならびに5’末端にSphIと3’末端にSacIとの制限酵素サイトを付加したラン藻Synechococcus PCC7942由来のFBPase/SBPase遺伝子を連結したDNA断片をpBI101ベクターのβ-グルクロニダーゼ遺伝子と置換する形で挿入した。以上のようにして、FS形質転換ベクターを作製した(図2中「FS」で表記)。
次に、Citrullus lanatusのRAN全長cDNAから、5’-aaaaagcaggctccttttccaatggctt-3’(配列番号7)と5’-agaaagctgggttttttactcgaacgcg-3’(配列番号8)とを用いて、ORF全長をPCRにより増幅した。
次に、RAN形質転換ベクターをテンプレートにして、それぞれEcoRIサイトを導入した5'-gaattcgcatgcctgcaggt-3'(配列番号9)と5'-gaattcccgatctagtaaca-3'(配列番号10)とを用いてPCRを行い、RAN遺伝子を含む35SプロモーターからNPTIIターミネーターまでの領域のDNA断片を増幅した(上記塩基配列における「gaattc」はEcoRI部位)。
pBI121(コントロールベクター)、FS形質転換ベクター、RAN形質転換ベクター、およびFS/RAN形質転換ベクターを、それぞれエレクトロポレーション法によりアグロバクテリウム(Agrobacterium tumefaciens)EHA105株へ導入し、形質転換を行った。
pBI121(コントロールベクター)、FS形質転換ベクター、RAN形質転換ベクター、およびFS/RAN形質転換ベクターで各遺伝子導入を行ったコントロールジャガイモ塊茎、RAN形質転換ジャガイモ塊茎、FS形質転換ジャガイモ塊茎、およびFS/RAN形質転換ジャガイモ塊茎を、それぞれ室温において萌芽させた。その後、土を満たした3Lポットに移し、16時間明期/8時間暗所の条件で18℃に保って5週間生育させた。
実施例および比較例で取得した各形質転換ジャガイモについて、各遺伝子導入をPCRにより確認したアガロースゲル電気泳動図を図3に示す。図3中「RAN」と表記されたレーンはRan遺伝子のみが導入されたジャガイモ(実施例1)の結果、「FS」と表記されたレーンはFBPase/SBPase遺伝子のみが導入されたジャガイモ(比較例)の結果、「FS/RAN」と表記されたレーンはRan遺伝子およびFBPase/SBPase遺伝子が導入されたジャガイモ(実施例2)の結果である。また図3中「M」は分子量マーカー、「+」は陽性対照、「Wt」は野生株の結果、「CV」はコントロールであるベクターのみが導入されたジャガイモの結果を示す。また図3中「NPTII」はベクター由来のDNAを検出した結果、「CLRan1」はRan遺伝子を検出した結果、「FBP/SBP」はFBPase/SBPase遺伝子を検出した結果を示す。
Claims (13)
- Citrullus lanatus由来のRan遺伝子を、匍匐枝形成植物に導入する工程を含むことを特徴とする塊茎生産能が野生株に比して向上した匍匐枝形成植物の作製方法。
- 上記Ran遺伝子が、以下の(A)または(B)であることを特徴とする請求項1に記載の作製方法:
(A)配列番号1または2に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(B)配列番号1または2に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ塊茎生産能を向上する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。 - 上記Ran遺伝子が、以下の(C)または(D)のいずれかのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項1に記載の作製方法:
(C)配列番号3または4に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(D)配列番号3または4に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて1または数個のアミノ酸が置換、欠失、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ塊茎生産能を向上する活性を有するポリペプチド。 - ラン藻由来のフルクトース-1,6-ビスホスファターゼ/セドヘプツロース-1,7-ビスホスファターゼをコードするポリヌクレオチドを、匍匐枝形成植物に導入する工程をさらに含むことを特徴とする請求項1ないし3のいずれか1項に記載の作製方法。
- 上記ラン藻由来のフルクトース-1,6-ビスホスファターゼ/セドヘプツロース-1,7-ビスホスファターゼをコードするポリヌクレオチドが、以下の(E)または(F)であることを特徴とする請求項4に記載の作製方法:
(E)配列番号5に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(F)配列番号5に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつフルクトース-1,6-ビスホスファターゼ/セドヘプツロース-1,7-ビスホスファターゼの活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。 - 上記ラン藻由来のフルクトース-1,6-ビスホスファターゼ/セドヘプツロース-1,7-ビスホスファターゼをコードするポリヌクレオチドが、以下の(G)または(H)のいずれかのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項4に記載の作製方法:
(G)配列番号6に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(H)配列番号6に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて1または数個のアミノ酸が置換、欠失、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつフルクトース-1,6-ビスホスファターゼ/セドヘプツロース-1,7-ビスホスファターゼの活性を有するポリペプチド。 - 請求項1ないし6のいずれか1項に記載の作製方法により作製されてなる、塊茎生産能が野生株に比して向上した匍匐枝形成植物。
- Citrullus lanatus由来のRan遺伝子、およびラン藻由来のフルクトース-1,6-ビスホスファターゼ/セドヘプツロース-1,7-ビスホスファターゼをコードするポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、匍匐枝形成植物の塊茎生産能を向上させるためのキット。
- Citrullus lanatus由来のRan遺伝子を、匍匐枝形成植物に導入する工程を含むことを特徴とする匍匐枝形成能が野生株に比して向上した匍匐枝形成植物の作製方法。
- 上記Ran遺伝子が、以下の(A)または(B)であることを特徴とする請求項9に記載の作製方法:
(A)配列番号1または2に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(B)配列番号1または2に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ匍匐枝形成能を向上する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。 - 上記Ran遺伝子が、以下の(C)または(D)のいずれかのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項9に記載の作製方法:
(C)配列番号3または4に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(D)配列番号3または4に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて1または数個のアミノ酸が置換、欠失、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ匍匐枝形成能を向上する活性を有するポリペプチド。 - 請求項9ないし11のいずれか1項に記載の作製方法により作製されてなる、匍匐枝形成能が野生株に比して向上した匍匐枝形成植物。
- Citrullus lanatus由来のRan遺伝子を含むことを特徴とする、匍匐枝形成植物の匍匐枝形成能を向上させるためのキット。
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