KR101549147B1

KR101549147B1 - 고도불포화지방산 생합성을 위한 재조합 벡터 및 이를 이용하여 제작된 형질전환 효모

Info

Publication number: KR101549147B1
Application number: KR1020130134133A
Authority: KR
Inventors: 김종범; 강한철; 노경희; 김현욱; 이경렬; 김정봉; 김광수; 박종석; 김순희; 이은영; 김소연
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2013-11-06
Filing date: 2013-11-06
Publication date: 2015-09-02
Also published as: KR20150052904A

Abstract

본 발명은 고도불포화지방산 생합성에 관한 것으로, 보다 상세하게는 pAO815 벡터를 이용한 세 개의 유전자 McD6DES와 AsELOVL5, PtD5DES가 동시에 발현되도록 다중발현 벡터를 만들어 진핵세포의 단백질의 생산에 이용되는 유용한 시스템인 메탄이용 효모인 Pichia pastoris에 형질전환함으로써 효모가 생산해 내는 기질 linoleic acid (LA, C18:2 n-6) 또는 a-linolenic acid (ALA, C18:3 n-3)로부터 고도불포화지방산인, gamma-linolenic acid (GLA, C18:3 n-6), stearidonic acid (STA, C18:4 n-3), di-homo-linolenic acid (DGLA, 20:3n-6), eicosatetraenoic acid (ETA, 20:4n-3), arachidonic acid (ARA; 20:4n-6), eicosapentaenoic acid (EPA, 20:5n-3), docosatetraenoic acid (DTA, 22:4n-6) 또는 docosapentaenoic acid (DPA, 222:5n-3)로의 전환을 가스크로마토그래피로 분석하여 3개 유전자의 동시 발현 기능을 검정하였으므로, 이를 고도불포화지방산 생산 자원으로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

고도불포화지방산 생합성을 위한 재조합 벡터 및 이를 이용하여 제작된 형질전환 효모{Recombinant vector for polyunsaturated fatty acids biosynthesis and yeast transformed by the same}

본 발명은 고도불포화지방산 생합성에 관련된 일련의 효소를 암호화하는 유전자들을 이용하여 효모에서 고도불포화지방산을 생산하는 것에 대한 것이다.

불포화지방산(Unsaturated fatty acid)은 한 분자 속에 하나 이상의 이중결합을 가지는 사슬 모양 화합물로 동식물 속에 널리 분포하며, 일반적으로 탄소수 12 내지 20개 정도의 짝수 개로 구성되어 있다. 지방산 분자가 단 하나의 이중결합을 갖고 있으면 단일불포화지방산이라고 하며, 두 개 이상의 이중결합을 갖고 있으며 다가불포화지방산이라고 부른다. 불포화지방산은 이중결합 바로 다음의 수소원자가 결합된 형태에 따라 시스 형(cis configuration)과 트랜스 형(trans configuration)으로 나뉜다. 시스 형은 인접한 수소원자가 이중결합과 같은 방향에 있는 것을 말하며, 트랜스 형은 다음 2개의 수소원자가 이중결합과 반대의 방향으로 결합한 것을 말한다. 지방산 사슬에서 이중결합이 형성되면 수소원자가 제거되어야 하는데, 이 때문에 포화지방산에서 '포화'라는 용어는 수소원자가 포화되었다는 것을 의미한다. 세포내 대사에서 수소-탄소 결합은 에너지 생산을 위해 결합이 깨지거나 산화된다. 따라서 불포화지방산은 같은 크기의 포화지방산에 비해 에너지를 더 적게 함유한다. 또한, 불포화지방산은 더 낮은 녹는점을 갖고 있어서 세포막의 유동성을 증가시키는 작용도 하는 것으로 알려졌다.

포화지방산의 섭취는 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia), 동맥경화(atherosclerosis) 등과 같은 심혈관계 질환(cardiovascular disease)의 위험성과 관련이 깊은 반면, 불포화지방산의 섭취는 혈중 콜레스테롤의 감소 및 동맥경화의 발병 위험 감소와 관련이 있는 것으로 잘 알려져 있다. 불포화지방산의 예로는 팔미톨레익산(palmitoleic acid), 올레익산(oleic acid), 미리스톨레익산(myristoleic acid), 리놀레익산(linoleic acid), 아라키도닉산(arachidonic acid), 에이코사펜타에노익산(eicosapentaenoic acid, EPA), 도코사헥사에노익산(docosahexaenoic acid, DHA) 등이 있다. 이러한 불포화지방산을 함유하는 식품으로는 아보카도, 견과류, 카놀라유나 올리브유와 같은 식물성 기름 등이 있다. 비록 불포화지방산이 포화지방산보다는 건강에 유익하지만, 미 식품의약국(FDA)에서는 불포화지방산의 섭취량이 하루 칼로리 섭취량의 30%를 넘지 않도록 권고한다.

오메가6(ω6) 및 오메가3(ω3) 계통의 고도불포화지방산(Polyunsaturated fatty acids: PUFA)인 아라키도닉산(arachidonic acid, ARA, C20:4 ω6)와 에이코사펜타에노익산(eicosapentaenoic acid, EPA, C20:5 ω3), 도코사펜타에노익산(docosahexaenoic acid, DHA, C22:6 ω3)는 동물 세포막의 필수 구성성분으로 포스포파티딜콜린(phosphatidylcholine)과 결합한 형태로 세포막의 인지질 층에 삽입되어 세포막의 유동성을 좋게 하고, 혈중 콜레스테롤을 감소시키며, 암 증식을 억제하는 등의 질병예방 효과가 뛰어나다. 특히 DHA는 뇌 기능 강화와 기억력 증진을 통한 영, 유아의 뇌 기능 성장발달과 학습기능 향상, 통증을 알려주는 프로스타글란딘(prostaglandin)과 같은 호르몬의 전구체로서 호르몬 조절 작용 등의 중요한 기능이 규명되었다. 최근 식품첨가제와 화장품 원료 및 의약품 분야에서 큰 시장을 형성하고 있다. 포유동물은 ω6/Δ12 및 ω3/Δ15 불포화효소(desaturase)가 발현되지 않아 PUFA의 de novo 합성을 할 수 없으며, 정상적인 성장과 발달을 위하여 리놀레익산(linoleic acid, LA, C18:2 ω6)와 알파-리놀레익산(α-linolenic acid, ALA, C18:3 ω3)를 반드시 음식물로 섭취해야만 한다.

DHA는 주로 참치와 같은 등 푸른 생선으로부터 생산하고 있으나, 다량의 DHA를 식품에 첨가하게 되면 물고기 특유의 비린내 때문에 상품성에 문제가 되어 그 냄새를 제거하기 위한 순수 분리, 정제가 관건이 되고 있다. 해양 조류를 통해서도 DHA 생산이 가능하나, 낮은 성장률로 말미암아 DHA의 대량 생산을 위해서는 고가의 장비를 필요로 한다. 최근 이러한 문제점들을 해결하고 저비용 고효율의 DHA를 생산하고자 식물 종자에서의 발현 시스템을 이용한 PUFA 생산에 대한 관심이 높아지고 있다. PUFA은 전구체인 LA와 ALA로부터 일련의 불포화화(desaturation)와 2탄소 사슬 연장(elongation) 과정을 통해 생합성 된다 (도 4 참고). 식물은 PUFA를 생합성 하지 못하며, LA와 ALA로부터 PUFA를 생합성 하기 위해서는 Δ6 불포화효소(Δ6 desaturase, Δ6DES), Δ6 사슬 연장효소(Δ6 elongase, Δ6ELS), 그리고 Δ5 불포화효소(Δ5 desaturase, Δ5DES)의 도입이 필요하다.

현재까지 자연계에는 3 종류의 PUFA 생합성의 경로가 알려져 있다[Qiu X (2003) Biosynthesis of docosahexaenoic acid (DHA, 22:6-4, 7, 10, 13, 16, 19): two distinct pathways. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids 68, 181-186.]. (1) 물 곰팡이류에 속하는 Saprolegnia는 전구물질인 ALA에 대하여 Δ6 불포화, 연장 및 Δ5 불포화 반응을 통하여서 EPA를 합성하는 경로를 이용하는 반면[Pereira SL 등 (2004a) A novel omega 3-fatty acid desaturase involved in the biosynthesis of eicosapentaenoic acid. Biochem J 378, 665-671.], (2) Euglena 등의 원생생물은 Δ9 연장, Δ8 불포화 및 Δ5 불포화에 의해 EPA를 생합성 한다[Wallis과 Browse, (1999) The Delta8-desaturase of Euglena gracills: an alternate pathway for synthesis of 20-carbon polyunsaturated fatty acids. Arch Biochem Biophys 365, 307-316.]. 위의 두 경로를 통해서 생합성 된 EPA는 Δ5 연장과 Δ4 불포화에 의해 최종적으로 DHA를 생합성 한다[Pereira 등, 2004b]. 포유동물은 EPA로부터 4단계의 더 복잡한 경로 즉, β-산화에 의한 역전환(retro-conversion) 과정을 거쳐 DHA를 생합성 하게 된다[Sprecher 등(1995) Reevaluation of the pathways for the biosynthesis of polyunsaturated fatty acids. J Lipid Res 36, 2471-2477., 1995; Wallis 등, Polyunsaturated fatty acid synthesis: what will they think of next Trends Biochem Sci 27, 467-473.]. (3) 해양 조류(Schizochytrium)와 해양 미생물(Shewanella)은 PKSe(polyketide synthas) 경로를 이용하여 DHA를 생합성 한다[Metz 등, (2001) Production of polyunsaturated fatty acids by polyketide synthases in both prokaryotes and eukaryotes. Science 293, 290-293.]. 이와 같은 다양한 PUFA 생합성 경로에 사용되는 효소들을 재구성하여 유전자원으로 활용할 경우 주로 생선을 통해서만 섭취하던 EPA와 DHA을 효모에서 손쉽게 생산할 수 있는 유전공학적 기반을 구축하기 위한 연구가 진행되어 왔으나, 이미 알려진 유전자들이라고 해도 서로 다른 유래의 유전자들을 조합하여 효모에서 실제로 고도불포화지방산을 생산하는 것이 용이하지 않았다.

이에 본 발명자들은 고등생물 체내에서 혈액순환계, 호르몬 분비계 및 면역계 등 여러 가지 생리활성을 갖는 고도불포화지방산을 합성하는 데 관여하는 갯장어로부터 분리한 Δ6 불포화화 효소(desaturase) 유전자 McD6DES, 조류 유래 Δ5 불포화화 효소(desaturase) 유전자 PtD5DES 및 돔으로부터 분리한 지방산 사슬연장효소(elongase) 유전자 AsELOVL5가 동시에 발현되도록 벡터를 제작하였으며, 이의 효모에서의 고도불포화지방산의 생합성 활성을 확인함으로써 그 기능을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

한국특허등록 제0316068호 한국특허등록 제0606612호

본 발명의 목적은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 McD6DES, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 PtD5DE 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 AsELOVL5를 포함하는 재조합 벡터를 제공하기 위한 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환한 효모에 관한 것이다.

아울러, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환 효모에 메탄올을 처리하는 단계를 포함하는 고도불포화지방산을 생산하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 McD6DES, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 PtD5DE 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 AsELOVL5를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환한 효모를 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 형질전환 효모에 메탄올을 처리하는 단계를 포함하는 고도불포화지방산을 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 고도불포화지방산 생합성에 관련된 일련의 효소를 암호화하는 delta-6 불포화효소 유전자 (McD6DES)와 지방산 탄소사슬 연장 효소 유전자 (AsELOVL5), delta-5 불포화효소 유전자 (PtD5DES)가 동시에 발현되는 재조합 벡터로 형질전환된 효모를 고도불포화지방산 생산에 활용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 McD6DES, AsELOVL5 및 PtD5DES유전자가 각각 도입된 재조합 벡터의 모식도이다.
도 2는 본 발명의 McD6DES, AsELOVL5 및 PtD5DES유전자가 도입된 재조합 벡터의 모식도이다.
도 3은 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 효모에 처리한 메탄올의 % 및 메탄올 처리 후 각각의 유전자의 발현을 시간대별로 Real-time PCR을 이용하여 확인한 그래프이다.
도 4는 고도불포화지방산 생합성 경로인 오메가-6 및 오메가-3 경로를 나타내는 도이다.
도 5는 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환한 피키아 파스토리스에 0.5% 메탄올을 처리한 뒤 고도불포화지방산 생합성 경로의 생성물들을 가스크로마토그래피로 확인한 도이다;
pAO815-McD6D-AsELOVL5-PtD5D: 본 발명의 재조합 벡터로 형질도입된 효모;
pAO815: 공벡터(대조군); 및
0.5% MEOH: 0.5% 메탄올을 처리한 군.
도 6은 0.5% 메탄올에 의해 유도된 형질전환 효모에서의 기질에 대한 새로운 생성물로의 전환 %를 나타낸 도이다;
A: 오메가-6 경로의 기질에 대한 생성물 전환 %; 및
B: 오메가-3 경로의 기질에 대한 생성물 전환 %.
도 7은 1% 메탄올에 의해 유도된 형질전환 효모에서의 기질에 대한 새로운 생성물로의 전환 %를 나타낸 도이다;
A: 오메가-6 경로의 기질에 대한 생성물 전환 %; 및
B: 오메가-3 경로의 기질에 대한 생성물 전환 %.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서 나타내는 지방산의 표기에서 "16:0"을 예로 들면, 16은 탄소사슬의 개수, 뒤의 번호는 불포화도를 나타낸다. 즉, 0은 포화지방산, 1,2 등은 불포화지방산을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "고도불포화지방산(polyunsaturated fatty acid, PUFA)"은, 지방산 중에 이중결합을 4개 이상 포함하는 것을 말한다. 오메가 6 및 오메가 3 지방산 등이 포함되며, 이 기술분야에 고도불포화지방산의 종류는 널리 알려져 있다. 본 발명에서는 특히, DGLA(dihomo-gamma-linolenic acid), ARA(arachidonic acid), DTA(docosatetraenoic acid), STA(stearidonic acid), ETA(eicosatetraenoic acid), EPA(eicosapentaenoic acid), DPA(docosapetaenoic acid) 및 DHA(docosahexaenoic acid)가 포함된다.

본 발명에서 사용되는 용어 "n-3 지방산" 또는 "오메가 3(ω3) 지방산"은 지방산의 메틸기 말단부터 세어서 3번째의 탄소가 이중결합을 갖는 일련의 지방산을 말한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "n-6 지방산" 또는 "오메가 6(ω6) 지방산"은 지방산의 메틸기 말단부터 세어서 6번째의 탄소가 이중결합을 갖는 일련의 지방산을 말한다.

본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자(McD6DES), 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 유전자(PtD5DE) 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 ㅇ유전자(AsELOVL5)를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

상기 유전자 McD6DES는 갯장어 유래의 델타6 불포화화 효소(Δ6 desaturase)를 암호화하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 유전자 PtD5DE는 조류 유래의 델타5 불포화화 효소(Δ5 desaturase)를 암호화하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 유전자 AsELOVL5는 돔 유래의 지방산 사슬연장효소(elongase)를 암호화하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 서열번호 1, 2 또는 3으로 표시되는 유전자는 단백질을 코딩하는 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함한다.

또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1, 2 또는 3의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

상기 재조합 벡터는 바람직하게는 효모 재조합 벡터일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 도 1에 기재된 pAO815::D6ELD5 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 벡터에 사용된 프로모터는 Alcohol Oxidase이며, 본 발명의 세 유전자는 도 1에서와 같이 상기 프로모터와 터미네이터 사이에 각각 한 개씩 순차적으로 존재하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주세포로서 대장균(E. coli)이 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위, 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pLλ프로모터)가 조절 부위로서 이용될 수 있다.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 통상의 기술분야에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예: λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다. 본 발명의 벡터를 원핵세포에 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 효모가 바람직하다.

상기 효모는 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지에(Sacharomyce cerevisiae), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 또는 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)이며, 가장 바람직하게는 피키아 파스토리스이다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

또한, 본 발명은 형질전환 효모에 메탄올을 처리하는 단계를 포함하는 고도불포화지방산을 생산하는 방법을 제공한다.

상기 고도불포화지방산은 DGLA(dihomo-gamma-linolenic acid), ARA(arachidonic acid), DTA(docosatetraenoic acid), STA(stearidonic acid), ETA(eicosatetraenoic acid), EPA(eicosapentaenoic acid) 및 DPA(docosapetaenoic acid)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 생산되는 GLA(gamma-linolenic acid), DGLA(dihomo-gamma-linolenic acid), ARA(arachidonic acid) 및 DTA(docosatetraenoic acid)는 숙주세포인 피키아 파스토리스가 생산하는 Linoleic acid (LA; C18:2n-6)를 기질로 이용하여 생산된 불포화지방산이며, STA(stearidonic acid), ETA(eicosatetraenoic acid), EPA(eicosapentaenoic acid), DPA(docosapetaenoic acid) 및 DHA(docosahexaenoic acid)는 숙주세포인 피키아 파스토리스가 생산하는 α-linolenic acid (ALA; C18:3n-3)를 기질로 이용하여 생산된 불포화지방산이다.

상기 메탄올은 0.3 내지 1.5% 메탄올인 것이 바람직하며, 상기 %는 %농도를 의미한다.

본 발명 일 실시예에서는 갯장어 유래의 Δ6 불포화화 효소(desaturase) 유전자 McD6DES, 조류 유래의 Δ5 불포화화 효소(desaturase) 유전자 PtD5DES 및 돔 유래의 지방산 사슬연장효소(elongase) 유전자 AsELOVL5를 하나의 벡터에 도입하여 고도불포화지방산 생산용 재조합 벡터를 제작하였으며, 이를 메탄올에 의해 LA 및 ALA를 생산하는 효모인 피키아 파스토리스에 형질전환하고, 메탄올을 처리시 효모에서 고도불포화지방산 생합성 경로에 존재하는 고도불포화지방산들을 성공적으로 생산함을 GC로 확인하였다. 이를 통해 본 발명의 McD6DES, PtD5DES 및 AsELOVL5를 함께 포함하는 재조합 벡터로 형질전환한 효모는 오메가-6 경로와 오메가-3 경로를 통해 포유동물에게 유용한 고도불포화지방산들을 생산하여 제공할 수 있음을 알 수 있었다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> McD6DES , PtD5DES 및 AsELOVL5 유전자 발현 벡터 제작

Δ6 불포화화 효소(desaturase) 유전자 McD6DES, Δ5 불포화화 효소(desaturase) 유전자 PtD5DES 및 지방산 사슬연장효소(elongase) 유전자 AsELOVL5를 동시에 발현하는 벡터를 제작하였다. 구체적으로, 갯장어(Muraenesox cinereus)로부터 분리한 Δ6 불포화화 효소(desaturase) 유전자 McD6DES(서열번호 1), 미세 조류(Phaeodactylum ticornutum KMCC B-128) 유래 Δ5 불포화화 효소(desaturase) 유전자 PtD5DES(서열번호 2) 및 돔(Acanthopagrus schlegeli)으로부터 분리한 지방산 사슬연장효소(elongase) 유전자 AsELOVL5(서열번호 3)를 하기 표 1의 프라이머들(서열번호 4 내지 9)을 이용하여 메탄이용 효모인 Pichia pastoris에서 발현되는 벡터 pAO815의 알콜산화 효소(alcohol oxidase, AOX) 프로모터와 터미네이터 사이에 하나의 EcoRI 사이트를 이용하여 각각 ORF로 도입하여 각각의 유전자가 도입된 유전자 카세트 pAO815::McD6DES, pAO815::AsELOVL5 및 pAO815::PtD5DES를 제작하였다 (도 1). 상기 각각의 세 개의 발현 카세트를 하나의 재조합 벡터로 만들기 위하여, 첫 번째 발현 카세트가 장착된 pAO815::McD6DES 벡터를 BamHI 제한효소로 선형화시켰다. 선형화된 이 벡터에 삽입될 발현 카세트 pAO815::AsELOVL5를 표 2의 Infu-AsELO-BamH-F 및 Infu-AsELO-SnaB-R 프라이머 세트 (서열번호 10 및 11)와 In-Fusion^TM Advantage PCR Cloning Kits (Clontech, CA, USA)를 이용하여 클로닝한 결과 pAO815::McD6DES-AsELOVL5를 얻었다. 상기 pAO815::McD6DES-AsELOVL5를 SnaBI 제한효소를 이용하여 선형화하고, 세 번째로 장착될 발현 카세트 산물인 pAO815::PtD5DES를 표 2의 Infu-PtD5D-SnaB-F 및 Infu-PtD5D-Mlu-R 프라이머 세트(서열번호 12 및 13)를 이용하여 클로닝하여 세 유전자가 프로모터 Alcohol Oxidase와 터미네이터 사이에 각각 위치하도록 함께 도입된 최종 재조합 단백질 발현 벡터 pAO815::D6ELD5를 얻었다 (도 2).

서열번호	프라이머 이름	서열(5'->3')	Ta
4	pAO-Eco-McD6-F	CCG GAA TTC ACC ATG GGG GGC GGA GGT CAA	68℃
5	pAO-Eco-McD6-R	CCG GAA TTC TTA TTT ATG GAG ATA CGC ATC CA
6	pAO-Eco-AsELO-F	CCG GAA TTC AAA ATG GAG ACC TTC AAT CAC A
7	pAO-Eco-AsELO-R	CCG GAA TTC TCA ATC CAC TCT CAG TTT CTT
8	pAO-Eco-PtD5D-F	CCG GAA TTC ACC ATG GCT CCG GAT GCG GAT
9	pAO-Eco-PtD5D-R	CCG GAA TTC TTA CGC CCG TCC GGT CAA GGG A

서열번호	프라이머 이름	서열(5'->3')	Ta
10	Infu-AsELO-BamH-F	GAC GTT CGT TTG TGC GGA TCC AGA TCT AAC ATC CAA AGA CGA	68℃
11	Infu-AsELO-SnaB-R	GAT AAA CTA CCG CAT TAT ACG TAG CAC AAA CGA ACG TCT CAC T
12	Infu-PtD5D-SnaB-F	GAC GTT CGT TTG TGC TAC GTA AGA TCT AAC ATC CAA A
13	Infu-PtD5D-Mlu-R	GAT AAA CTA CCG CAT TAA CGC GTG CAC AAA CGA ACG TC

< 실시예 2> 형질전환 효모 제작

고도불포화지방산 생산을 위한 기질인 Linoleic acid (LA; C18:2n-6)와 α-linolenic acid (ALA; C18:3n-3)을 생산하는 메탄올 자화성 효모인 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에 상기 <실시예 1>의 재조합 발현 벡터인 pAO815::D6ELD5를 형질전환시키기 위해, pAO815::D6ELD5를 AatII 제한효소로 선형화시킨 뒤 Pichia Easy Transformation Kit (Invitrogen)를 사용하여 Pichia pastoris GS115 균주의 크로모좀 속으로 형질전환하였다. 형질전환된 형질전환체는 30 ℃의 조건으로 고형 선택 배지인 Regeneration Dextrose Medium (1M sorbitol, 1% dextrose, 1.34%YNB, 4X10^-5% biotin, 0.005% amino acids except histidine)에서 콜로니가 형성될 때까지 배양되었다. 그 후 형질전환체는 Minimal Glycerol liquid Medium (MGY; 1.34% YNB, 1% glycerol, 4X10^-5% biotin, 0.004% amino acids except histidine)에서 온도 20 ℃에서 3일, 15 ℃에서 3일 동안 배양되었다. 이렇게 배양된 배양체들은 원심분리기 속도 4000×g에서 5분 동안 모아졌고, 멸균수로 2번 씻겨져 -80 ℃에서 동결건조되었다.

< 실시예 3> 형질전환 효모에서의 세 유전자의 발현 유도 확인

상기 <실시예 2>에서 제작한 형질전환 효모가 고도불포화지방산의 생합성 경로에 관여하는 Δ6 불포화화 효소(desaturase), Δ5 불포화화 효소(desaturase) 및 지방산 사슬연장효소(elongase)를 암호화하는 McD6DES, PtD5DES 및 AsELOVL5 유전자를 온전히 발현하는지 확인하였다.

구체적으로, <실시예 2>의 형질전환 효모 피키아 파스토리스를 Minimal Methanol Medium (MGY 배지 조성에서 1% glycerol 대신에 0.5% Methanol를 첨가)에서 배양하여 단백질 발현을 유도하였다. 단백질 유도 배양은 메탄올 0.5%와 1%에 의해 각각 유도되었고, 온도 20 ℃에서 0h, 24h, 48h 또는 72h 동안, 온도 15 ℃에서 96h, 120h 또는 144h 동안 배양되었다. 효모의 배양 후, Cultured Cell Total RNA Purification Kit (FAVORGEN, Taiwan)를 이용하여 재조합 형질 전환체로부터 전체 RNA를 추출하였다. 1 ug의 전체 RNA를 PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser (TaKaRa, Japan)를 이용하여 cDNA로 합성한 뒤, 하기 표 3의 프라이머들 및 SYBR Premix Ex Taq ^TM II (TaKaRa, Japan)을 이용하여 메탄올 0.5%와 1%에 따른 시간대 별 각각 세 유전자의 발현량을 7300 real-time PCR detection system (Applied Biosystems, Foster, CA, USA)로 정량적 실시간 PCR을 수행하여 확인하였다. 상기 qPCR은 95 ℃에서 30초 동안 초기변성, 95 ℃에서 5초 동안 40 사이클, 60 ℃에서 34초 동안 수행되었으며, 모든 샘플들은 3 반복 실험하였다. 모든 mRNA의 상대적인 발현량은 C_T (User Bulletin #2, Applied Biosystems) 방법을 이용하여 확인하였으며,내재적 유전자 ACTIN을 이용하여 mRNA의 발현량을 표준화시켰다.

그 결과, 0.5% 메탄올과 1% 메탄올에 의한 McD6DES, AsELOVL5 및 PtD5DES 유전자 각각에 대한 시간대별(0h, 24h, 48h, 72h, 96h, 120h 및 144h) 발현량 패턴은 비슷했으며, 1% 메탄올 유도에 의한 발현량이 발현 유도 24시간 내지 72시간까지는 0.5% 메탄올 유도에 의한 발현량보다 50배 정도 더 많이 유도되었고, 96시간 이후부터는 0.5% 메탄올 유도보다 2배 정도 낮은 발현량을 보였다. 또한, 0.5% 및 1.0% 메탄올 유도 모두 24시간째에 세 유전자 발현량이 가장 높게 나타났으며 PtD5DES 유전자의 발현 유도가 가장 높았다 (도 3).

서열번호	프라이머 이름	서열(5'->3')	Ta
14	ACT1 764F	TAC CGG ATA GTG AGA CGG AAA	60℃
15	ACT1 913R	TGT ATG GCT CTG ACG GAT TG
16	McD6D 223F	TTC CAT CCA GAG CCT GAC TT
17	McD6D 371R	CCC TCC CTC TCT ACC TCC TC
18	AsELO 720F	CAC GCT AAT TTT CCT GTT CTC A
19	AsELO 871R	GTT TCT TGT GTG CAG TGT GCT
20	PtD5D 782F	GAT ACT GGT TGT CCG CTG TCT
21	PtD5D 935R	ATC ACG TTC ACC GCA ATG TA

< 실시예 4> 형질전환 효모의 메탄올 농도 및 배양 시간에 따른 고도불포화지방산 생산 확인

McD6DES, AsELOVL5 및 PtD5DES 유전자가 삽입되어 delta 6-desaturase, fatty acid elongase 및 delta 5-desaturase를 발현하는 형질전환 효모에서 피키아 파스토리스가 생산하는 LA 및 ALA를 기질로 이용하여 고도불포화지방산을 생합성하는지 확인하기 위하여, 상기 <실시예 2>에서 제작한 형질전환 효모 또는 5 ml MeOH:CHCl₃ (2:1, v/v) 및 내부 표준물질 1 mg PDA (pentadecanoic acid in MeOH)를 50 ml 튜브에 첨가한 후 60분 동안 소니케이션을 수행한 뒤, 5 ml 0.58% NaCl 용액을 추가하고 다시 10분 동안 소니케이션을 수행하였다. 그 후 용액을 2000 rpm에서 20분 동안 원심분리를 하여 하층액에 있는 지질을 새로운 튜브에 옮긴 뒤 0.5 ml toluene 및 2 ml 0.5N NaOH와 함께 잘 섞어 끓는 물에 5분 동안 반응시키고 냉각한 뒤 2.5 ml 14% BF₃를 첨가하여 끓는 물에서 5분 동안 더 반응시켰다. 그 후, 10 ml petroleum ether와 15 ml 멸균수를 넣고 2000 rpm에서 20분 동안 원심분리하여 순수한 지질층만 있는 상층액을 얻었다. 그 결과 얻은 메틸에스테르화 된 지방산을 상업화된 지질 표준물질 (Sigma, St. Louis, MO)를 기초로 하여 가스크로마토그래피(GC)를 통해 물질이 피크로 나온 시간대를 비교하여 생성물을 확인하였고, 이들에 대해 GC-MS를 분석하여 메탄올 농도에 의한 시간대별 지방산 생성물을 총 지방산 생성물에 대한 각각의 지방산 함량을 %로 표시하였다 (표 4).

Fatty acid	pAO815	pAO-D6ELD5 (0.5% MeOH)				pAO-D6ELD5 (1% MeOH)
Fatty acid	pAO815	24h	48h	72h	144h	24h	48h	72h	144h
16:0	11.8±0.3	21.6±0.3	18.3±0.2	18.9±0.2	16.7±0.2	20.2±0.2	17.5±0.1	15.0±0.2	15.8±0.3
16:1	4.5±0.2	3.0±0.2	3.6±0.3	3.3±0.1	2.5±0.3	3.1±0.3	3.1±0.1	3.2±0.3	2.0±0.2
18:0	4.8±0.5	9.2±0.4	6.2±0.2	7.9±0.2	5.8±0.2	8.8±0.4	6.3±0.1	5.5±0.2	7.7±0.3
18:1 (n-9)	45.6±0.3	17.3±0.3	22.9±0.3	19.7±0.2	14.7±0.4	23.1±0.3	23.7±0.2	26.0±0.2	19.1±0.2
18:1 (n-7)	0.8±0.3	1.4±0.2	4.1±0.3	4.7±0.2	6.2±0.1	1.0±0.2	0.0±0.2	4.5±0.3	3.9±0.2
18:2 (LA, n-6)	22.3±0.5	26.3±0.3	30.4±0.1	28.2±0.2	36.8±0.3	25.8±0.2	34.1±0.2	30.1±0.2	37.0±0.2
18:3 (GLA, n-6)	ND	0.4±0.4	0.5±0.2	0.7±0.1	0.6±0.2	0.5±0.2	0.6±0.1	0.8±0.2	0.8±0.2
20:3 (DGLA, n-6)	ND	ND	1.4±0.3	3.9±0.2	5.2±0.3	0.1±0.3	1.6±0.1	5.3±0.2	5.3±0.3
20:4 (ARA, n-6)	ND	ND	0.1±0.4	0.1±0.4	0.5±0.3	ND	0.1±0.2	0.2±0.3	0.5±0.2
22:4 (DTA, n-6)	ND	ND	ND	ND	0.1±0.2	ND	ND	0.1±0.2	0.1±0.4
18:3 (ALA, n-3)	3.2±0.4	10.4±0.2	4.1±0.3	2.1±0.3	5.2±0.4	9.4±0.2	4.4±0.2	1.6±0.2	2.2±0.2
18:4 (STA, n-3)	ND	0.03±0.2	0.04±0.3	0.03±0.2	0.1±0.3	0.03±0.3	0.04±0.3	0.1±0.2	0.1±0.2
20:4 (ETA, n-3)	ND	ND	1.0±0.2	1.2±0.3	1.0±0.4	0.2±0.2	1.0±0.3	1.3±0.2	0.6±0.2
20:5 (EPA, n-3)	ND	ND	0.03±0.2	0.1±0.3	0.1±0.3	ND	0.1±0.3	0.1±0.1	0.04±0.2
22:5 (DPA, n-3)	ND	ND	ND	0.1±0.3	0.1±0.3	ND	0.04±0.3	0.1±0.2	0.1±0.3
Total lipid	18.0±0.5	4±0.4	9.0±0.4	18.0±0.5	25.0±0.3	8.0±0.4	7.0±0.5	18.0±0.5	21.0±0.3

Each value is the mean ± SD from three independent experiments.

ND, not detected.

Total lipid is mg lipid g^-1 dry cells

그 결과, 본 발명의 벡터로 형질전환한 효모에서 오메가-6 지방산 합성 경로(도 4)에 따라, linoleic acid (LA; 18:2n-6)가 delta 6-desaturase에 의해 이중결합이 형성되어 gamma-linolenic acid (GLA; 18:3n-6)로 전환되고, 전환된 GLA가 fatty acid elongase에 의하여 탄소 사슬이 2개 연장되어 di-homo--linolenic acid (DGLA, 20:3n-6)로 전환되었으며, 전환된 DGLA는 delta 5-desaturase에 의하여 이중결합이 형성되어 arachidonic acid (ARA; 20:4n-6)로 전환되고, 상기 ARA는 다시 fatty acid elongase에 의하여 탄소 사슬 2개가 연장되어 docosatetraenoic acid (DTA, 22:4n-6)로 전환되었음을 확인하였다 (도 5의 갈색 피크). 또한, 형질전환 효모에서 오메가-3 지방산 합성 경로(도 4)에 따라, α-linolenic acid (ALA; 18:3n-3)가 상기에서와 같이 stearidonic acid (STA, 18:4n-3), eicosatetraenoic acid (ETA, 20:4n-3), eicosapentaenoic acid (EPA, 20:5n-3) 및 docosapentaenoic acid (DPA, 222:5n-3)로 전환되었음을 확인하였다 (도 5의 녹색 피크).

아울러, 상기와 같이 0.5% 또는 1%의 메탄올에 의해 유도된 고도불포화 지방산들의 기질에 대한 전환 %를 확인하였다 (도 6 및 도 7).

이상 살펴본 바와 같이, 고도불포화지방산 생합성에 관련된 일련의 효소를 암호화하는 유전자들 McD6DES, AsELOVL5 및 PtD5DES을 메탄올에 의해 발현이 유도되는 효모 벡터에 형질도입하여 동시 발현 형질운반체(pAO815::D6ELD5)를 제작하여 효모에 형질전환하고 0.5% 메탄올 및 1% 메탄올 처리시 효모 자체에서 생산한 LA 또는 ALA을 기질로 이용하여 고도불포화지방산인 GLA(gamma-linolenic acid), DGLA(dihomo-gamma-linolenic acid), ARA(arachidonic acid), DTA(docosatetraenoic acid), STA(stearidonic acid), ETA(eicosatetraenoic acid), EPA(eicosapentaenoic acid) 및 DPA(docosapetaenoic acid)를 성공적으로 생합성함을 확인하였다.

<110> republic of Korea <120> Recombinant vector for polyunsaturated fatty acids biosynthesis and yeast transformed by the same <130> p130901 <160> 21 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1335 <212> DNA <213> Muraenesox cinereus <400> 1 atggggggcg gaggtcaaca gacggagtcg gaatcgagct gtgggcgagg aggcggcgtt 60 ttcacctggg aagaggtgca gcggcattcc cacaaggggg accagtggtt ggtaatcgac 120 agaaaggtgt gcaacatcac cgactgggtg aaaagacatc caggcggcgc ccgggtcatc 180 agccactatg ccggggagga cgccacggat gcttttgctg cattccatcc agagcctgac 240 tttgtgcgca agtttctgaa gccactgctg attggtgagc ttgcaacctc tgagcccaac 300 caggaccggg acaaaaattc tgtgttgaca caggctttcc gcgaactgcg cgaggaggta 360 gagagggagg gcctcttcag gactcagccg ctgttctttt gcctccacct ggggcatatt 420 cttctcctgg aggccctggc ttacttgctg atttgggtgt atggaacagg ctggctccag 480 accctgctgt gtgcagtaat actggccacc tcacagtctc aggccggatg gctccagcat 540 gacttcggcc acctttccgt cttcaaaaag tcccgctgga accacctgct gcacaagttt 600 gtcatcggac accttaaggg tgcttcggct aactggtgga accatcggca tttccagcac 660 catgcaaaac ccaacatctt cagtaaagac cctgatgtca acatgctcca cacctttgtg 720 ctaggaaaga cccagccagt ggagtatgga ataaagaaga tcaagtacat gccttacaac 780 caccagcacc agtacttctt cctcattgga cctcctatgc ttatcccagt gtatttccac 840 atccagatca tgcaaaccat gttctttcga cgtgattggg tggacctcgt ctggtcaatg 900 agctactacc tgcgctactt cacctgctac acgccctttt acggagtttt tggagctgtg 960 gcgctcatca gcttcgttag gtttctggag agccactggt ttgtgtgggt gacccaaatg 1020 aaccacattc ccatggacat tgaccacgag aagcacgagg attggctgac catgcagctg 1080 aaggccacct gcaacattga gcagtcattc ttcaacgact ggttcagcgg acacctcaac 1140 ttccaaatcg aacaccatct gtttcccaca atgccccggc acaactactg ccgcgtggcc 1200 cctctggtgc gcaaggtgtg tgagaagcat ggcgtcacct accaggagaa gaccctgtgg 1260 agcggcttca gagacgtggt cagctctcta cgggagtctg gagatctgtg gctggatgcg 1320 tatctccata aataa 1335 <210> 2 <211> 1410 <212> DNA <213> Phaeodactylum tricornutum <400> 2 atggctccgg atgcggataa gcttcgacaa cgccagacga ctgcggtagc gaagcacaat 60 gctgctacca tatcgacgca ggaacgcctt tgcagtctgt cttcgctcga cggcgaagaa 120 gtctgcatcg acggaatcat ctatgacctc caatcattcg atcatcccgg gggtgaaacg 180 atcaaaatgt ttggtggcaa cgatgtcact gtacagtaca agatgattca cccgtaccat 240 accgagaagc atttggaaaa gatgaagcgc gtcggcaagg tgacggattt cgtctgcgag 300 tacaagttcg ataccgaatt tgaacgcgaa atcaaacgag aagtcttcaa gattgtgcga 360 cgaggcaagg atttcggtac tttgggatgg ttcttccgtg cgttttgcta cattgccatt 420 ttcttctacc tgcagtacca ttgggtcacc acgggaacct cttggctgct ggctgtggcc 480 tacggagtct cccaagcgat gattggcatg aatgtccagc acgatgccaa ccacggggcc 540 acctccaagc gtccctgggt caacgacatg ctaggcctcg gtgcggattt tattggtgga 600 tccaagtggc tctggcagga acaacactgg acccaccacg cttacaccaa tcacgccgag 660 atggatcccg atagctttgg tgccgaacca atgctcctat tcaacgactg tcccttggat 720 catcccgctc gtacctggct acatcgcttt caagcagtct tttacatgcc cgtcttggct 780 ggatactggt tgtccgctgt cttcaatcca caaattcttg acctccagca acgcggcgca 840 ctttccgtcg gtatccgtct cgacaacgct ttcattcact cgcgacgcaa gtatgcggtt 900 ttctggcggg ccgtgtacat tgcggtgaac gtgattgctc cgttttacac caactccggc 960 ctcgaatggt cctggcgtgt ctttggaaac attatgctca tgggtgtggc ggaatcgctc 1020 gcgctggcgg tcctgttttc gttgtcgcac aatttcgaat ccgccgatcg cgatccgacc 1080 gccccactga aaaagacggg agaaccagtc gactggttca agacacaggt cgaaacttcc 1140 tgcacttacg gtggattcct ttccggttgc ttcacgggag gtctcaactt tcaggttgaa 1200 caccacttgt tcccacgcat gagcagcgcc tggtacccct acattgcccc caaggtccgc 1260 gaaatttgcg ccaaacacgg cgtgcactac gcctactacc cgtggatcca ccaaaacttt 1320 ctctccaccg tccgctacat gcacgcggcc gggaccggtg ccaactggcg ccagatggcc 1380 agagaaaatc ccttgaccgg acgggcgtaa 1410 <210> 3 <211> 885 <212> DNA <213> Acanthopagrus schlegeli <400> 3 atggagacct tcaatcacaa actgaacgtt tacttcgaga catggatggg tccccgagat 60 cagcgggtgc ggggatggct actgctcgac aactacccac caacctttgc actcacagtc 120 atgtaccttc tgatcgtgtg gatggggccc aagtacatga aacaccggca gccgtacccc 180 tgcagaggcc tcctggtgct ctacaatctg ggcctcacac tcctctcctt ctacatgttc 240 tatgagcttg ttactgctgt gtggtatggc ggctacaatt tctactgcca ggacactcac 300 agtgcacagg aagtggataa taagatcata aatgtccttt ggtggtacta cttctccaag 360 ctcattgagt tcatggacac ctttttcttc atactacgga agaataatca ccagatcacc 420 tttcttcaca cctaccacca cgccagcatg ctgaatatct ggtggtttgt tatgaactgg 480 gtaccctgcg gccactcgta cttcggtgcc tccctaaaca gcttcgtcca cgtcgtgatg 540 tattcttact acggcctctc agccatccca gccatgcggc cgtacctttg gtggaagaag 600 tacatcacac agttccagct gatccagttc tttttaacca tgtcccagac aatatttgca 660 gtcatatggc cgtgtggctt ccccgacgga tggctttact tccaaatagg ttacatggtc 720 acgctaattt tcctgttctc aaacttctac attcagacct acaacaagca cagtgcatct 780 ctaaggaagg agcaccagaa cggctctcct ctatcaacaa atggacatgc aaacgggacg 840 ccatcgatgg agcacactgc acacaagaaa ctgagagtgg attga 885 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pAO-Eco-McD6-F primer <400> 4 ccggaattca ccatgggggg cggaggtcaa 30 <210> 5 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pAO-Eco-McD6-R primer <400> 5 ccggaattct tatttatgga gatacgcatc ca 32 <210> 6 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pAO-Eco-AsELO-F primer <400> 6 ccggaattca aaatggagac cttcaatcac a 31 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pAO-Eco-AsELO-R primer <400> 7 ccggaattct caatccactc tcagtttctt 30 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pAO-Eco-PtD5D-F primer <400> 8 ccggaattca ccatggctcc ggatgcggat 30 <210> 9 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pAO-Eco-PtD5D-R primer <400> 9 ccggaattct tacgcccgtc cggtcaaggg a 31 <210> 10 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Infu-AsELO-BamH-F primer <400> 10 gacgttcgtt tgtgcggatc cagatctaac atccaaagac ga 42 <210> 11 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Infu-AsELO-SnaB-R primer <400> 11 gataaactac cgcattatac gtagcacaaa cgaacgtctc act 43 <210> 12 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Infu-PtD5D-SnaB-F primer <400> 12 gacgttcgtt tgtgctacgt aagatctaac atccaaa 37 <210> 13 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Infu-PtD5D-Mlu-R primer <400> 13 gataaactac cgcattaacg cgtgcacaaa cgaacgtc 38 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACT1 764F primer <400> 14 taccggatag tgagacggaa a 21 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACT1 913R primer <400> 15 tgtatggctc tgacggattg 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> McD6D 223F primer <400> 16 ttccatccag agcctgactt 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> McD6D 371R primer <400> 17 ccctccctct ctacctcctc 20 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AsELO 720F primer <400> 18 cacgctaatt ttcctgttct ca 22 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AsELO 871R primer <400> 19 gtttcttgtg tgcagtgtgc t 21 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PtD5D 782F primer <400> 20 gatactggtt gtccgctgtc t 21 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PtD5D 935R primer <400> 21 atcacgttca ccgcaatgta 20

Claims

갯장어 유래의 델타6 불포화화 효소(Δ6 desaturase)를 암호화하는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자(McD6DES), 조류 유래의 델타5 불포화화 효소(Δ5 desaturase)를 암호화하는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 유전자(PtD5DES) 및 돔 유래의 지방산 사슬연장효소(elongase)를 암호화하는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 유전자(AsELOVL5)를 포함하는 재조합 벡터로서, 상기 재조합 벡터는 상기 유전자 McD6DES, PtD5DES 및 AsELOVL5를 동시에 발현하는 도 2의 개열지도를 가지는 벡터인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
삭제
삭제
삭제
제 1항의 재조합 벡터로 형질전환한 효모.
제 5항에 있어서, 상기 효모는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)인 것을 특징으로 하는 형질전환한 효모.
제 5항의 형질전환 효모에 메탄올을 처리하는 단계를 포함하는 폴리불포화지방산(polyunsaturated fatty acid)을 생산하는 방법.
제 7항에 있어서, 상기 폴리불포화지방산은 GLA(gamma-linolenic acid), DGLA(dihomo-gamma-linolenic acid), ARA(arachidonic acid), DTA(docosatetraenoic acid), STA(stearidonic acid), ETA(eicosatetraenoic acid), EPA(eicosapentaenoic acid) 및 DPA(docosapetaenoic acid)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 폴리불포화지방산을 생산하는 방법.
제 7항에 있어서, 상기 메탄올은 0.3 내지 1.5% 메탄올인 것을 특징으로 하는 폴리불포화지방산을 생산하는 방법.