CN101712718B - 一种与植物抗旱相关的蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与植物抗旱相关的蛋白及其编码基因与应用。该蛋白，是如下1)或2)的蛋白质：1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗旱相关的由1)衍生的蛋白质。将与植物抗旱相关蛋白的编码基因导入烟草的转基因实验证明，转入BhDoh-b561基因的烟草抗旱性明显提高，说明BhDoh-b561是与植物抗旱相关的蛋白。本发明的培育抗旱性提高的转基因植物的方法具有重要的理论及实际意义，可用于农牧业和生态环境治理所需的抗性植物品种的培育与鉴定。
Description
技术领域
本发明涉及一种与植物抗旱相关的蛋白及其编码基因与应用。
背景技术
植物在干旱胁迫条件下引起的伤害与活性氧(ROS)的累积有关，许多实验证明，干旱可导致植物体内ROS含量上升，从而破坏细胞正常的氧化还原状状态，造成DNA和蛋白质受到伤害，膜脂被氧化，从而使生物体代谢失常。作为对逆境的适应，植物进化出各种ROS清除机制，其中抗坏血酸、谷胱甘肽和NAD(P)H是细胞主要的ROS清除剂。比较特殊的是细胞质外体部分不含谷胱甘肽和NAD(P)H，因此抗坏血酸在质外体抗氧化保护过程中尤为重要(Moran J，Becaca M，1994；Foyer C，Noctor G，2005)。
绝大多数植物(包括主要农作物品种和模式植物)不能忍受严重的干旱和盐胁迫。复苏植物被发现可以忍受极度干旱的条件，待水份充足时又能很快恢复正常的生命活动，因此被认为是研究耐旱机制和提供耐旱基因的极好的植物资源。已知被子植物中的更苏植物很少，且主要分布在南非、南美和澳大利亚。旋蒴苣苔(Boeahygrometrica)是在我国分布的一种苦苣苔科复苏植物，该植物的叶片具有很强的耐旱复苏能力，在室温、相对空气湿度为0的条件下生长72小时后，叶片相对含水量降为3％左右，叶片面积皱缩至原叶片面积的1/3以下，光合作用基本停止。只要重新给水，叶片就可以吸水伸展，并恢复成未处理前的叶片表观状态和生理状态(包括光合作用的恢复)(Deng X，Wang H，Hu Z，mRNA differential displayvisualized by silver staining tested on gene expression in resurrection plant Boeahygrometrica.Plant Moecular Biology Reporter17：279.1999；Deng X，Hu Z，Wang H，Wen X，Kuang T.A comparison of photosynthetic apparatus of the detached leaves ofthe resurrection plant Boea hygrometrica with its non-tolerant relative Chiritaheterotrichia in response to dehydration and rehydration.Plant Science.165：851-861.2003)。
发明内容
本发明的目的是提供一种与植物抗旱相关的蛋白及其编码基因。
本发明所提供的与植物抗旱相关的蛋白名称为BhDoh-b561，来源于苦苣苔科的旋蒴苣苔(Boea hygrometrica)，是如下1)或2)的蛋白质：
1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗旱相关的由1)衍生的蛋白质。
为了使1)中的BhDoh-b561便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1.标签的序列
| 标签 | 残基 | 序列 |
| Poly-Arg | 5-6(通常为5个) | RRRRR |
| Poly-His | 2-10(通常为6个) | HHHHHH |
| FLAG | 8 | DYKDDDDK |
| Strep-tag II | 8 | WSHPQFEK |
| c-myc | 10 | EQKLISEEDL |
上述2)中的BhDoh-b561可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述2)中的BhDoh-b561的编码基因可通过将序列表中序列1自5′末端第28-1224位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
上述与植物抗旱相关蛋白的cDNA基因也属于本发明的保护范围。
与植物抗旱相关蛋白的cDNA基因具体可为如下1)-4)中任一所述的基因：
1)其编码序列是序列表中序列1的自5′末端第28-1224位脱氧核糖核苷酸；
2)其核苷酸序列是序列表中的序列1；
3)在严格条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交且编码上述与植物抗旱相关蛋白的DNA分子。
4)与1)或2)的基因具有90％以上的同源性，且编码上述与植物抗旱相关蛋白的DNA分子。
序列表中的序列1由1389个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为自5′末端第28-1224位碱基，编码具有序列表中序列2的氨基酸序列的BhDoh-b561。
上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA gel blot实验中65℃下杂交并洗膜。
扩增上述BhDoh-b561基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。
含有上述与植物抗旱相关蛋白编码基因的重组载体、转基因细胞系和重组菌也属于本发明的保护范围。
可用现有的植物表达载体构建含有BhDoh-b561基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。
使用BhDoh-b561基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛生素基因Ubiquitin启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
所述重组表达载体具体可为在植物表达载体pBin19的多克隆位点间插入上述与植物抗旱相关蛋白的编码基因得到的重组表达载体，如pBin19-BhDoh-b561。
本发明的另一个目的是提供一种培育抗旱性提高的转基因植物的方法。
本发明所提供的培育抗旱性提高的转基因植物的方法，是将上述与植物抗旱相关蛋白的编码基因BhDoh-b561导入植物中，得到抗旱性提高的转基因植物。
所述与植物抗旱相关蛋白的编码基因BhDoh-b561是通过所述重组表达载体导入植物中的。
携带有本发明的与植物抗旱相关蛋白编码基因BhDoh-b561的植物表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。被转化的植物宿主既可以是水稻、小麦、大豆、烟草、玉米、油菜、高粱、棉花等农作物，也可以是苜蓿、三叶草、冰草等牧草以及草莓、西红柿等果蔬花卉植物。
所述植物具体可为烟草。
本发明从复苏植物旋蒴苣苔(Boea hygrometrica)中筛选到一个受干旱诱导表达的BhDoh-b561基因，将该基因导入烟草的转基因实验证明，转入BhDoh-b561基因的烟草抗旱性明显提高，说明BhDoh-b561是与植物抗旱相关的蛋白。与植物抗旱相关蛋白BhDoh-b561及其编码基因对于培育抗旱性提高的作物、林草等新品种具有重要的理论及实际意义，可用于农牧业和生态环境治理所需的抗性植物品种的培育与鉴定。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
附图说明
图1为RT-PCR检测BhDoh-b561的诱导表达结果
图2为BhDoh-b561基因过表达载体的物理图谱
图3为转入pBin19-BhDoh-b561的T2代阳性转基因烟草的RT-PCR检测结果
图4为BhDoh-b561基因过表达的转基因烟草的抗旱能力鉴定
具体实施方式
下述实施例中所述方法如无特别说明均为常规方法，所用引物及探针均由上海生工合成。
实施例1、BhDoh-b561基因的克隆
提取经干旱胁迫处理8小时的旋蒴苣苔(Boea hygrometrica)叶片的总RNA，利用
文库构建试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)构建cDNA文库。从中随机挑选4800个基因，用BioGrid robot(BioRobotics Ltd，Cambridge，UK)自动化点样在Hybond-N+尼龙膜(Amersham Biosciences，Freiburg，Germany)上，制成cDNA微阵列(cDNA芯片)。将该cDNA芯片分别与未经干旱处理正常生长的旋蒴苣苔叶片和经干旱胁迫处理8小时的旋蒴苣苔叶片的polyA-RNA所制备的33P标记的探针进行杂交，分析它们在正常条件及干旱诱导后基因表达的动态变化。结果发现，有1个经干旱诱导上调的基因。
提取经干旱胁迫处理8小时的旋蒴苣苔(Boea hygrometrica)叶片的总RNA并以其为模板，用基因特异性引物GSP-Race1：5’-gggcaaacgaagaatc-3’进行反转录。反应体系为：总RNA(2μg/μl)1.0μl，GSP-Race1(1μM)2μl，dNTP(2mM)5μl，DEPC-H2O6.0μl，5×M-MLV buffer4μl，RNase抑制剂(5u/μl，购自Takara公司)1μl，M-MLV(购自Promega公司)1μl。37℃反应1h后再65℃10min，纯化回收(三博PCR产物回收试剂盒)后加C尾。反应体系为：cDNA5μl，DEPC-H2O13.5μl，5×buffer5μl，dCTP(10mm)0.5μl。75℃反应5min后加入1μl TdT(购自takara公司)，再37℃反应1h，得到加C尾的cDNA序列。
以上述获得的加C尾的cDNA序列为模板，以基因特异性引物Race2：5’-cggatccgaatccggcttctt-3’和多聚G锚定引物:5’-GGCCACGCGTCGACTAGTACG14-3’进行PCR扩增。PCR反应体系为：加C尾的cDNA1μl，10×PCR buffer1μl，dNTP(2mm)1μl，Race2引物(10μm)0.5μl，多聚G锚定引物(10μm)0.5μl，Taq酶(购自takara公司)0.1μl。反应条件为：先95℃预变性4min，然后94℃变性30秒，55℃退火30秒，再72延伸2分钟，共35个循环；最后72℃延伸10分钟。
将上述PCR产物稀释100倍后作为模板，利用基因特异引物Race3：5’-aggatccatgtcaaagcttcc-3’与锚定引物：5’-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3’进行巢式PCR扩增。PCR反应体系为：稀释100倍后的上述PCR产物1μl，Race3引物(10μm)0.5μl，锚定引物(10μm)0.5μl，Taq酶(购自takara公司)0.1μl。反应条件为：先95℃预变性4min，然后94℃变性30秒，55℃退火30秒，再72延伸2分钟，共35个循环；最后72℃延伸10分钟。
将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果得到1100bp左右的条带；回收该1100bp左右的条带，与载体pGEM-T(购自promega公司)连接后进行测序。根据测序结果设计引物5’-GCTCGAGCCAGGTATTTGAAGG-3’和5’-CGGATCCGAATCCGGCTTCTT-3’，进行PCR扩增，PCR反应体系为：上述扩增得到的1100bp左右的条带1μl，10×PCR buffer1μl，dNTP(2mm)1μl，引物各0.5μl，Taq酶(购自takara公司)0.1μl。反应条件为：95℃预变性4min，94℃变性45秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共27个循环；最后再72℃延伸10分钟。结果得到BhDoh-b561基因全序列，其核苷酸序列如序列表中序列1所示，分析发现该序列包含完整的BhDoh-b561基因的开放阅读框(ORF)、5’-UTR(5’-非翻译区)和3’-UTR，其ORF为自5′末端第28-1224位的脱氧核糖核苷酸，编码的氨基酸残基序列如序列表中序列2所示。该氨基酸残基序列属于DoH-b561蛋白家族。
实施例2、BhDoh-b561基因的诱导表达分析
取未经干旱胁迫正常生长的旋蒴苣苔叶片、经干旱胁迫0.5h、8h和48h的旋蒴苣苔叶片、经干旱胁迫48h后又重新给水8h和48h后的旋蒴苣苔叶片，分别提取其总RNA并以其为模板，以BhDoh-b561基因特异性引物5’-GCTCGAGCCAGGTATTTGAAGG-3’和5’-CGGATCCGAATCCGGCTTCTT-3’进行RT-PCR扩增，PCR扩增程序为：95℃预变性4min，94℃变性45秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共27个循环；最后再72℃延伸10分钟；同时以18s rRNA基因做为内参，PCR扩增程序为：95℃预变性4min，94℃变性45秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共18个循环；最后再72℃延伸10分钟。通过上述RT-PCR体系检测BhDoh-b561基因在经上述处理后的旋蒴苣苔中的表达情况，每组样品至少重复3次。具体检测结果如图1所示。其中，泳道1为未经干旱胁迫正常生长的旋蒴苣苔叶片中BhDoh-b561的mRNA的表达情况，泳道2为干旱胁迫0.5h后旋蒴苣苔叶片中BhDoh-b561的mRNA的表达情况，泳道3为干旱胁迫8h后旋蒴苣苔叶片中BhDoh-b561的mRNA的表达情况，泳道4为干旱胁迫48h后旋蒴苣苔叶片中BhDoh-b561的mRNA的表达情况，泳道5为干旱胁迫48h后又重新给水8h后旋蒴苣苔叶片中BhDoh-b561的mRNA的表达情况，泳道6为干旱胁迫48h后又重新给水48h后旋蒴苣苔叶片中BhDoh-b561的mRNA的表达情况。
结果表明，BhDoh-b561的mRNA在未经干旱胁迫处理的旋蒴苣苔叶片中的表达量比较低，经干旱胁迫处理后，BhDoh-b561的mRNA的表达量升高，说明BhDoh-b561基因经干旱胁迫诱导表达。
实施例3、转BhDoh-b561基因烟草的抗旱性分析
1、转BhDoh-b561基因烟草的获得
将上述实施例1中扩增得到的BhDoh-b561产物进行回收并连接到pEasy-blunt载体(北京全式金公司)上，将获得重组载体命名为pBhDoh-b561。将重组载体pBhDoh-b561用BamHI和SalI(购自大连宝生物公司)双酶切后，回收1200bp的片段与CaMV35Sq启动子、polyA序列一同连接到载体pBin19(D.A.Frisch，L.W.Harris-Haller，N.T.Yokubaitis，T.L.Thomas，S.H.Hardin，T.C.Hall，Complete sequence ofthe binary vector Bin19，Plant Mol.Biol.27(1995)405-409.)的BamHI和SalI酶切位点间，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有10μg/ml硫酸卡那霉素的LB培养基筛选出重组子并进行测序分析，把经过测序鉴定含有BhDoh-b561基因ORF的重组质粒命名为pBin19-BhDoh-b561，该重组质粒受35S启动子控制。重组质粒pBin19-BhDoh-b561的物理图谱如图2所示。利用电击法将pBin19-BhDoh-b561转化到农杆菌LAB4404(北京拜尔迪公司)细胞中，用含有50μg/ml硫酸卡那霉素、30μg/ml链霉素和50μg/ml利福平的YEB培养基进行筛选，获得携带35S启动子和BhDoh-b561基因的农杆菌菌株LAB-pBin19-BhDoh-b561，将LAB-pBin19-BhDoh-b561采用叶盘法转化烟草(Nicotiana tabacum cv.SR-1)，将上述转基因烟草移至温室培养，自交、收集转基因烟草的种子。
将上述转基因烟草的种子播种于含有100μg/ml硫酸卡那霉素的MS培养基上，将在上述含有100μg/ml硫酸卡那霉素的MS培养基上抗性分离比为3：1的T1代转基因烟草的成活幼苗移至温室培养，收集T1代转基因烟草的种子。取100粒T1代转基因烟草种子播种于含100μg/ml硫酸卡那霉素的MS培养基中，结果共获得四个T2代转基因烟草株系：1-1、8-10、16-11和17-1。
提取一个月苗龄的上述四个株系的T2代转基因烟草的总RNA并以其为模板，以5’-GCTCGAGCCAGGTATTTGAAGG-3’和5’-CGGATCCGAATCCGGCTTCTT-3’为引物进行RT-PCR，同时以未转基因的野生型烟草作为对照。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，每组样品进行2次重复，具体结果如图3所示。结果表明，未转基因的野生型烟草(Wt)中没有扩增出条带，转基因烟草株系1-1、8-10和16-11中，BhDoh-b561基因表达量较高，转基因烟草株系17-1中，BhDoh-b561基因表达量较低。结果共获得4个株系的RT-PCR检测结果为阳性的转入重组质粒pBin19-BhDoh-b561的T2代转基因烟草纯合体。
2、检测转BhDoh-b561基因烟草的抗旱性
将上述步骤1获得的4个株系的转入质粒pBin19-BhDoh-b561的T2代转基因烟草和未转基因的野生型烟草栽培在25℃、50％湿度、光照16h和黑暗8h的条件下，每三天给水1L。当上述T2代转基因烟草和未转基因的野生型烟草长至六叶期时停止供水，一周后观察烟草叶片的萎蔫情况并照相。实验共设三次重复，结果如图4所示。其中，图4A为干旱处理前的照片，图4B为干旱处理一周后的照片，图4A和图4B中，1为未转基因的野生型烟草的照片，2为转入质粒pBin19-BhDoh-b561的T2代转基因纯合体烟草株系17-1、16-11和8-10的照片。从图中可以看出，转BhDoh-b561基因烟草的抗旱性明显提高。干旱处理一周后，未转基因的野生型烟草的萎蔫率为73.3％；转入质粒pBin19-BhDoh-b561的T2代转基因纯合体烟草株系17-1、16-11和8-10的萎蔫率分别为16.7％、6.7％和6.7％。结果表明，BhDoh-b561基因过表达植株的抗旱性明显优于未转基因的野生型烟草，说明BhDoh-b561是与植物抗旱相关的蛋白。
序列表
<160>2
<210>1
<211>1389
<212>DNA
<213>旋蒴苣苔属旋蒴苣苔(Boea hygrometrica)
<400>1
<210>2
<211>398
<212>PRT
<213>旋蒴苣苔属旋蒴苣苔(Boea hygrometrica)
<400>1
Claims (9)
1.一种蛋白，是由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
2.权利要求1所述蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述蛋白的cDNA基因为如下1)或2)所述的基因：
1)其编码序列是序列表中序列1的自5′末端第28-1224位脱氧核糖核苷酸；
2)其核苷酸序列是序列表中的序列1。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、转基因细胞系或重组菌。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为在pBin19的多克隆位点间插入权利要求2或3所述基因得到的重组表达载体。
6.一种培育抗旱性提高的转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述的编码基因转入植物中，得到抗旱性提高的转基因植物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：权利要求2或3所述的编码基因是通过权利要求4所述的重组表达载体导入植物中。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述植物为水稻、小麦、大豆、烟草、玉米、油菜、高粱、棉花、苜蓿、三叶草、冰草、草莓或西红柿。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述植物为烟草。
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