CN106117327B - 合成类黄酮相关的人工合成转录因子及其促进类黄酮合成和调控植物花青素中的应用 - Google Patents

合成类黄酮相关的人工合成转录因子及其促进类黄酮合成和调控植物花青素中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种合成类黄酮相关的人工合成转录因子及其调控植物花青素/类黄酮合成中的应用转录因子的人工合成、功能验证及应用，属于植物基因工程技术领域。所述的DNA片段包含转录因子Deep Purple Red，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，其对应的蛋白质的序列如SEQ ID NO：2所示。该基因片段能够改变植物的叶色，花色,将该基因片段直接转化植物，使转基因植物的叶色，花色发生改变，类黄酮类物质种类和含量均增加，为今后代谢工程中提高多种天然类黄酮类物质和含量提供参考。

Description

合成类黄酮相关的人工合成转录因子及其促进类黄酮合成和 调控植物花青素中的应用
技术领域
本发明涉及类黄酮相关基因，具体地指一种合成类黄酮相关的人工合成转录因子Deep Purple Red及其调控植物花青素/类黄酮合成中的应用。
背景技术
类黄酮类化合物是植物中一类重要的多酚类次生代谢产物，广泛分布于植物界且具有较强的生物活性。目前发现的类黄酮类物质大约有6000多种，主要分为黄酮、花青素、黄酮醇、原花青素等。其中黄酮醇主要分为杨梅素、槲皮素、山奈酚等，花青素主要分为矢车菊素、天竺葵素、飞燕草素、芍药素等。
类黄酮在植物体内具有重要的生理学意义，它们控制着生长素的运输，根系发育分支和向重性，种子萌发，与共生微生物的信号作用，和抵御紫外线损伤等作用(夏涛等，2009；乔小燕等，2009)。除此之外，研究证实类黄酮类化合物对人类健康也具有重要作用，作为抗氧化剂和自由基清除剂，广泛应用于心血管疾病及老年性痴呆防治等疾病(涂华等，2011)。
目前随着类黄酮代谢路径的不断探究，类黄酮合成相关的酶基因和调控基因被不断的发掘，为类黄酮类物质的应用提供了重要的理论基础。花青素是植物花瓣中的主要色素，而DFR是花青素合成过程中的限速酶，催化二氢黄酮醇合成无色花青素，之后再经过ANS,UFGT等酶的加工最终形成稳定的花青素。在这个合成路径中，转录因子起到了积极的作用。从拟南芥中分离出的PAP1,PAP2与花青素的积累有关，直接参与花青素的合成。此外，大家也从苹果，草莓，葡萄等不同物种中不断挖掘出花青素合成和积累相关的转录因子。这些转录因子的发现，为花青素代谢工程的应用提供了分子基础。Pandey et al,(2013)将拟南芥中促进黄酮醇合成的转录因子AtMYB12和大豆中的GmIFS1基因共转化烟草，实现了异黄酮含量的大幅度提高，因此通过在烟草中异源表达与类黄酮合成相关的转录因子，并提高花青素及其它类黄酮的物质种类和含量用于应用是可行的。
发明内容
本发明的目的提供了一种合成类黄酮相关的人工合成转录因子Deep Purple Red及其调控植物花青素/类黄酮合成中的应用，将该基因拼接后的完整翻译区与花椰菜花叶病毒启动子结合后直接转入一般植物体内，转基因植株的花色，叶色发生变化，且提高了类黄酮的种类和含量。
为实现上述目的，本发明提供的一种合成类黄酮相关的人工合成转录因子DeepPurple Red，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明提供了一种上述转录因子编码的蛋白Deep Purple Red，其氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。
本发明还提供了一种用于获得上述人工合成转录因子Deep Purple Red的引物对，所述引物对为：
Deep Purple Red1正向引物：
5’-ATGGAGGGTTCGTCCAAAGGGCTGCGAAAAGGAGCCTGGACTGCTCA-3’
Deep Purple Red1反向引物：
5’–TTCATGTTTCTTACTTATGGTAGAATTCCAATAGT-3’；
Deep Purple Red2正向引物：
5’-TGGAATTCTACCATAAGTAAGAAACATGAACCG-3’，
Deep Purple Red2反向引物：
5’-CTTCTTCTTGTTGGTATATGATACTATTGTCACAA-3’；
Deep Purple Red3正向引物：
5’-CAATAGTATCATATACCAACAAGAAGAAGGA-3’，
Deep Purple Red3反向引物：
5’-TCATTCAAAATTCCAAAAGT-3’。
上述人工合成转录因子Deep Purple Red的获得方法，包括以下步骤：
1)根据SEQ ID No.3所示RrMYB10序列设计Deep Purple Red1引物对：
Deep Purple Red1正向引物：
5’–ATGGAGGGTTCGTCCAAAGGGCTGCGAAAAGGAGCCTGGACTGCTCA-3’
Deep Purple Red1反向引物：
5’TTCATGTTTCTTACTTATGGTAGAATTCCAATAGT3’；
并以RrMYB10序列为模板和上述Deep Purple Red1引物对，进行PCR，纯化得到扩增产物A1；
2)根据SEQ ID No.4所示AtPAP1序列设计Deep Purple Red2引物对：
Deep Purple Red2正向引物：
5’-TGGAATTCTACCATAAGTAAGAAACATGAACCG-3’，
Deep Purple Red2反向引物：
5’-CTTCTTCTTGTTGGTATATGATACTATTGTCACAA-3’；
并以AtPAP1序列为模板和上述Deep Purple Red2引物对，进行PCR，纯化得到扩增产物B1；
3)根据SEQ ID No.5所示EsMYBA1序列设计Deep Purple Red3引物对：
Deep Purple Red3正向引物：
5’-CAATAGTATCATATACCAACAAGAAGAAGGA-3’，
Deep Purple Red3反向引物：
5’-TCATTCAAAATTCCAAAAGT-3’；
并以EsMYBA1序列为模板和上述Deep Purple Red3引物对，进行PCR，纯化得到扩增产物C1；
4)以上述扩增产物A1、B1和C1共同作为模板，并用引物对，
Deep Purple Red1正向引物：
5’-ATGGAGGGTTCGTCCAAAGGGCTGCGAAAAGGAGCCTGGACTGCTCA-3’
Deep Purple Red3反向引物：
5’-TCATTCAAAATTCCAAAAGT-3’；
进行PCR，纯化得到人工合成转录因子Deep Purple Red。
作为优选方案，所述步骤1)、2)和3)中，
PCR体系：
10×Buffer 2μl
10mM dNTP 0.4μl
正向引物 1μl
反向引物 1μl
Taq DNA polymerase 0.2μl
模板 1μl
ddH<sub>2</sub>O 14.4μl
合计 20
PCR的条件：
所述步骤4)中，
PCR体系：
10×Buffer 2μl
10mM dNTP 0.4μl
Deep Purple Red1正向引物 1μl
Deep Purple Red3反向引物 1μl
Taq DNA polymerase 0.2μl
扩增产物A1 1μl
扩增产物B1 1μl
扩增产物C1 1μl
ddH<sub>2</sub>O 12.4μl
合计 20μl
PCR的条件：
本发明还提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体含有权利要求1所述人工合成转录因子Deep Purple Red的植物表达载体，其中，所述植物表达载体为pCAMBIA2300s。
上述重组表达载体的构建方法，包括以下步骤：
将目的片段导入克隆载体18T中，然后进行将含目的基因的克隆载体DeepPurple18T和pCAMBIA2300s用KpnⅠ和SalⅠ双酶切进行双酶切，再将得到的目的片段连接到酶切过的pCAMBIA2300s载体上即得到重组表达载体pCAMBIA2300s-DeepPurple Red。
本发明还提供了一种上述重组表达载体的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞为农杆菌EHA105。
下述各项之一在促进类黄酮合成和调控植物花青素中的应用，包括
(1)上述的人工合成转录因子Deep Purple Red；
(2)上述的重组表达载体；
(3)上述农杆菌EHA105。
所述的植物为烟草或玫瑰。
本发明通过农杆菌介导常规的生物技术方法将Deep Purple Red的编码基因导入植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。使用本发明的基因片段构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前面可加上任意一种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或者植株进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入具有抗性的抗生素标记物(例如卡那霉素或潮霉素等)。被转化的宿主是包括烟草和玫瑰等植物种类。
本发明的有益效果在于：
本发明人工合成转录因子，命名为Deep Purple Red。通过构建超量表达载体pCAMBIA2300s-Deep Purple Red，导入到早花烟草和玫瑰中，使烟草和玫瑰的叶色均由粉红色变为紫红色，黄酮醇含量和花青素含量均显著增加。人工合成转录因子，为我们通过植物基因工程的手段调控园艺花卉中黄酮类化合物的含量，增加合成黄酮类化合物的种类，改善植物品质，培育新品种提供了分子生物学基础。
附图说明
图1：原始超量植物表达载体pCAMBIA2300s结构示意图(载体大小为11630bp)；
图2：对照早花烟草，转A基因早花烟草与转化Deep Purple Red基因的早花烟草的花色及叶色比较图；
图中：图2A是对照早花烟草叶色及花色；图2B是本发明转Deep Purple Red早花烟草的叶色及花色；图2C是对照玫瑰叶色；图2D是转化Deep Purple Red玫瑰叶色；
图3：转基因烟草，玫瑰抗性苗阳性检测；
图中：图3A为早花烟草转Deep Purple Red基因阳性苗PCR检测；图3B为玫瑰转Deep Purple Red基因阳性苗PCR检测；
图4：转化Deep Purple Red基因的早花烟草及玫瑰的叶片代谢物HPLC图；
图中：图4A为早花烟草花瓣520nm下的HPLC图，
图4B为早花烟草花瓣360nm下的HPLC图，
图4C为转Deep Purple Red早花烟草花瓣520nm下的HPLC图，
图4D为转Deep Purple Red早花烟草花瓣360nm下的HPLC图，
图4E为对照玫瑰叶片520nm下的HPLC图，
图4F为对照玫瑰叶片360nm下的HPLC图，
图4G为转Deep Purple Red玫瑰叶片520nm下的HPLC图，
图4H为转Deep Purple Red玫瑰叶片360nm下的HPLC图；
图5：转化Deep Purple Red基因的早花烟草及玫瑰叶片代谢物含量图；
图中：图5A为烟草叶片花青素，黄酮醇含量比较图；图5B为玫瑰叶片花青素，黄酮醇含量比较图；
图6：表达载体pCAMBIA2300s-RrFLS1构建图(插入片段大小为774bp)。
具体实施方式
为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。
实施例1：人工合成Deep Purple Red基因
分别从拟南芥，丰华玫瑰中分离获得的RrMYB10(玫瑰转录因子MYB10)、AtPAP1(拟南芥转录因子MYB75)和EsMYBA1(淫羊藿转录因子MYBA1)，其序列如SEQ ID No.3～5所示，以含这些基因的质粒为模板扩增所需片段，最后将三个片段进行融合，扩增得到所需目的片段，即人工合成转录因子Deep Purple Red，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；其具体步骤如下：
1)根据SEQ ID No.3所示RrMYB10序列设计Deep Purple Red1引物对：
Deep Purple Red1正向引物：
5’–ATGGAGGGTTCGTCCAAAGGGCTGCGAAAAGGAGCCTGGACTGCTCA-3’
Deep Purple Red1反向引物：
5’TTCATGTTTCTTACTTATGGTAGAATTCCAATAGT3’；
并以RrMYB10序列为模板和上述Deep Purple Red1引物对：进行PCR，
PCR体系：
10×Buffer 2μl
10mM dNTP 0.4μl
Deep Purple Red1正向引物 1μl
Deep Purple Red1反向引物 1μl
Taq DNA polymerase 0.2μl
模板 1μl
ddH<sub>2</sub>O 14.4μl
合计 20μl
PCR的条件：
纯化得到扩增产物A1；
2)根据SEQ ID No.4所示AtPAP1序列设计Deep Purple Red2引物对：
Deep Purple Red2正向引物：
5’-TGGAATTCTACCATAAGTAAGAAACATGAACCG-3’，
Deep Purple Red2反向引物：
5’-CTTCTTCTTGTTGGTATATGATACTATTGTCACAA-3’；
并以AtPAP1序列为模板和上述Deep Purple Red2引物对：进行PCR，
PCR体系：
10×Buffer 2μl
10mM dNTP 0.4μl
Deep Purple Red2正向引物 1μl
Deep Purple Red2反向引物 1μl
Taq DNA polymerase 0.2μl
模板 1μl
ddH<sub>2</sub>O 14.4μl
合计 20μl
PCR的条件：
纯化得到扩增产物B1；
3)根据SEQ ID No.5所示EsMYBA1序列设计Deep Purple Red3引物对：
Deep Purple Red3正向引物：
5’-CAATAGTATCATATACCAACAAGAAGAAGGA-3’，
Deep Purple Red3反向引物：
5’-TCATTCAAAATTCCAAAAGT-3’；
并以EsMYBA1序列为模板和上述Deep Purple Red3引物对，
PCR体系：
10×Buffer 2μl
10mM dNTP 0.4μl
Deep Purple Red3正向引物 1μl
Deep Purple Red3反向引物 1μl
Taq DNA polymerase 0.2μl
模板 1μl
ddH<sub>2</sub>O 14.4μl
合计 20μl
PCR的条件：
进行PCR，纯化得到扩增产物C1；
4)以上述扩增产物A1、B1和C1共同作为模板，并用引物对，
Deep Purple Red1正向引物：
5’-ATGGAGGGTTCGTCCAAAGGGCTGCGAAAAGGAGCCTGGACTGCTCA-3’
Deep Purple Red3反向引物：
5’-TCATTCAAAATTCCAAAAGT-3’；
进行PCR，
PCR体系：
10×Buffer 2μl
10mM dNTP 0.4μl
Deep Purple Red1正向引物 1μl
Deep Purple Red3反向引物 1μl
Taq DNA polymerase 0.2μl
扩增产物A1 1μl
扩增产物B1 1μl
扩增产物C1 1μl
ddH<sub>2</sub>O 12.4μl
合计 20μl
PCR的条件：
纯化得到人工合成转录因子Deep Purple Red。
将扩增获得的人工合成转录因子Deep Purple Red连入18-T载体(购自宝生物工程大连有限公司)，筛选阳性克隆并测序，获得所需的全长基因。我们将该克隆被命名为18-Deep Purple Red质粒。
实施例2：Deep Purple Red基因超量表达载体的构建，转化
为了能更好地阐明该基因的功能，我们将该克隆的基因分别在烟草和玫瑰中超量表达，从转基因植株的表型来验证其功能。具体步骤是：
首先将实施例1中得到的阳性克隆18-Deep Purple Red质粒用KpnⅠ和SalⅠ双酶切回收目的片段；同时，用同样的方法酶切携带双烟草花叶病毒启动子35S的遗传转化载体pCAMBIA2300s(该遗传转化载体由华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室构建和赠送)。酶切完毕，用包含Deep Purple Red基因的酶切片段和酶切的pCAMBIA2300s(图1)载体做连接反应，转化大肠杆菌DH5α(大肠杆菌菌株购自宝生物工程大连有限公司)。通过酶切筛选阳性克隆，获得转化载体，将其命名为pCAMBIA2300s-Deep Purple Red。
通过农杆菌介导的烟草遗传转化方法分别将其导入到早花烟草和玫瑰中，经过侵染、共培养、筛选得到具有抗性的转化苗，再通过生根、练苗移栽等常规步骤，得到转基因植株。
遗传转化的主要步骤和应用试剂如下所述：
(1)试剂和溶液缩写
培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄氨基嘌呤)；NAA(Naphthalene acetic acid，萘乙酸)；Kan(Kanamycin，卡那霉素)；Cef(Cefotaxime，头孢霉素)；Hyg(Hygromycin，潮霉素)；AS(Acetosyringone，乙酰丁香酮)
(2)用于早花烟草，玫瑰遗传转化的培养基配方
表1和2列出了本发明的各种培养基的成分及其用量。
表1转基因早花烟草的相关培养基设计
表2转基因玫瑰的相关培养基设计
注：1/2MS，MS培养基的配制参见：Murashige T.and F.Skoog.Physiol.Plant,1962,15:473-497报道的方法。
表1，2中的Kan(Kanamycin，卡那霉素)、Cef(Cefotaxime，头孢霉素)，Hyg(Hygromycin，潮霉素)，AS(Acetosyringone，乙酰丁香酮)采用0.45μm滤膜过滤方法灭菌，在上述除Kan、Hyg、Cef成分以外的培养基经按常规方法即：121℃高压蒸汽灭菌20min后,待培养基冷却至50-60℃时，在超净工作台上加入上述Kan、Hyg、Cef、AS成分。
(1)农杆菌介导的遗传转化步骤
1)农杆菌的培养
首先，在带有对应抗性选择的固体LB培养基(10g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠、Kan100mg/L；琼脂1.5g/L)上预培养农杆菌EHA105 48小时，培养温度28℃；挑取预培养农杆菌单菌落，接种于对应抗性选择的液体LB培养基(10g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠、Kan100mg/L)中，于28℃200rpm摇床培养过夜，至菌液浓度OD600值大约为0.6。
2)农杆菌转化植物组织及抗性苗获得
2.1早花烟草--叶盘转化法
a.剪取转基因的早花烟草无菌苗上部完全展开的幼嫩叶片，将叶片剪成0.8cm×0.8cm大小小块，放入无菌烧杯中；
b.将准备好的菌液倒入烧杯，轻轻摇晃烧杯。叶片在菌液中浸泡10min；
c.将步骤b中的叶片取出，转移至灭好菌的滤纸上吸干；然后放置在如上所述的共培养培养基上暗培养三天，培养温度为28℃；
d.三天后，将叶片转入如表1所述的出芽选择培养基上，采用光照和暗培养交替培养(光照强度1000-1500lx，光照时间：16h/d，黑暗时间：8h/d)，进行Kan和Hyg抗性芽的筛选分化，培养温度为28℃；
e.抗性芽形成后，将其切下，转入如表1所述的壮苗选择培养基上，采用光照和暗培养交替培养(光照强度1000-1500lx，光照时间：16h/d，黑暗时间：8h/d)，进行Kan和Hyg抗性苗的筛选，培养温度为28℃；
f.将筛选得到的抗性苗转入表1所述的生根选择培养基上使其生根，采用光照和暗培养交替培养(光照强度1000-1500lx,光照时间：16h/d，黑暗时间：8h/d)，培养温度为28℃。
2.2玫瑰—体细胞胚转化法
a.取生长状态健康的次生体细胞胚，用镊子分离成约0.01g左右的小的体细胞胚；
b.将体细胞胚在准备好的菌液中浸泡60min；
c.将步骤b中的体胚取出，转移至灭好菌的滤纸上吸干；然后放置在如上所述的共培养培养基上暗培养三天，培养温度为28℃；
d.三天后，将体胚转入如表2所述的增殖选择培养基上，采用光照和暗培养交替培养(光照强度1000-1500lx，光照时间：16h/d，黑暗时间：8h/d)，进行Kan抗性体胚的筛选分化，培养温度为28℃，每4周更新培养基一次；
e.筛选1-2个月后将抗性体胚转入如表2所述的萌发选择培养基上，采用光照和暗培养交替培养(光照强度1000-1500lx，光照时间：16h/d，黑暗时间：8h/d)，进行Kan抗性芽的筛选，培养温度为28℃，每4周更新培养基一次；
f.抗性芽形成后，将其切下，转入如表2所述的壮苗选择培养基上，采用光照和暗培养交替培养(光照强度1000-1500lx，光照时间：16h/d，黑暗时间：8h/d)，进行Kan抗性苗的筛选，培养温度为28℃，每4周更新培养基一次；
g.将筛选得到的抗性苗转入表2所述的生根选择培养基上使其生根，采用光照和暗培养交替培养(光照强度1000-1500lx,光照时间：16h/d，黑暗时间：8h/d)，培养温度为28℃。
3)移栽
洗掉转基因植株根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的一个周内保持水分湿润。
本实施例获得转基因株系经PCR检测为阳性的转入质粒pCAMBIA2300s-DeepPurple Red的T0代转基因烟草及转基因玫瑰。
实施例3：Deep Purple Red基因转基因T0代在田间的表型观测
转基因早花烟草及玫瑰植株下地移栽后，将转基因植株的花色，叶色与未转化植株(对照“CK”)的花色，叶色进行比较，发现转Deep Purple Red基因的烟草的叶色，花色均发生改变：未转化的早花烟草花色为粉红色；转Deep Purple Red基因的早花烟草花色变为紫红色；未转化的早花烟草叶片为绿色，转Deep Purple Red基因的早花烟草叶片为紫红色；未转化的玫瑰叶片为绿色，转Deep Purple Red基因的玫瑰叶片为紫红色。
实施例4:转Deep Purple Red基因植株次生代谢物的提取与测定
准确称取0.5g叶片，加入2.5mL提取液(甲醇︰盐酸︰水体积比＝70︰0.1︰29.9)于黑暗条件下4℃浸提24h，期间每隔6h用旋转振荡器振荡1min。12000rpm离心10min，取上清至新的离心管中，再用孔径0.22μm的尼龙微孔滤器过滤后，保存于–40℃冰箱中，用于花青苷与其他类黄酮的HPLC-DAD分析。使用日本岛津公司生产的岛津液相系统进行定性，包括：LC-20AT型二元梯度泵，SIL-20AC自动进样器，CTO-20AC色谱柱控温箱，SPD-20AC检测器,LC-Solution工作站；色谱柱为日本Tosoh株式会社生产的TSK gel ODS-80Ts QA反相硅胶柱(4.6mm×250mm，粒径5μm，日本Tosoh株式会社)。
分析条件：流速0.8mL·min-1，柱温35℃，进样体积10μL，200～800nm范围内全波长扫描吸收光谱。流动相组成为：A相，10％甲酸-超纯水(体积比)；B相，乙腈。分析时间35min。梯度洗脱程序为：0min，90％A，10％B；20min，70％A，30％B；25min，90％A，10％B。
运用HPLC-DAD方法，分别用520nm与360nm同时检测花瓣中花青苷和花黄素。采用标准品半定量法分别计算干花中含有的相对于标准品的花青苷和花黄素的含量(μg·g-1FW)(Wang et al.，2001)。其中花青苷标准品使用上海同田生物技术有限公司生产的矢车菊素–3–葡萄糖苷(cyanidin-3-O-glucoside，Cy3G)，花黄素的标准品为中国药品生物制品检定所生产的槲皮素–3–芸香糖苷(quercetin-3-O-rutinoside，Rutin)。
测量结果表明，转入Deep Purple Red的植株花青素和黄酮醇含量由图5可以看出得到了大幅度的提高，且由图4可以看出花青素和黄酮醇的种类也明显增多。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种合成类黄酮相关的人工合成转录因子Deep Purple Red，其核苷酸序列如SEQID No.1所示。
2.一种权利要求1所述转录因子编码的蛋白Deep Purple Red，其氨基酸序列为SEQ IDNo.2所示。
3.用于获得权利要求1所述的人工合成转录因子Deep PurpleRed的引物对，其特征在于：所述引物对为：
Deep Purple Red1正向引物：
5’-ATGGAGGGTTCGTCCAAAGGGCTGCGAAAAGGAGCCTGGACTGCTCA-3’
Deep Purple Red1反向引物：
5’–TTCATGTTTCTTACTTATGGTAGAATTCCAATAGT-3’；
Deep Purple Red2正向引物：
5’-TGGAATTCTACCATAAGTAAGAAACATGAACCG-3’，
Deep Purple Red2反向引物：
5’-CTTCTTCTTGTTGGTATATGATACTATTGTCACAA-3’；
Deep Purple Red3正向引物：
5’-CAATAGTATCATATACCAACAAGAAGAAGGA-3’，
Deep Purple Red3反向引物：
5’-TCATTCAAAATTCCAAAAGT-3’。
4.一种权利要求1或3所述人工合成转录因子Deep Purple Red的获得方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)根据SEQ ID No.3所示RrMYB10序列设计Deep Purple Red1引物对：
Deep Purple Red1正向引物：
5’-ATGGAGGGTTCGTCCAAAGGGCTGCGAAAAGGAGCCTGGACTGCTCA-3’
Deep Purple Red1反向引物：
5’-TTCATGTTTCTTACTTATGGTAGAATTCCAATAGT-3’；
并以RrMYB10序列为模板和上述Deep Purple Red1引物对，进行PCR，纯化得到扩增产物A1；
2)根据SEQ ID No.4所示AtPAP1序列设计Deep Purple Red2引物对：
Deep Purple Red2正向引物：
5’-TGGAATTCTACCATAAGTAAGAAACATGAACCG-3’，
Deep Purple Red2反向引物：
5’-CTTCTTCTTGTTGGTATATGATACTATTGTCACAA-3’；
并以AtPAP1序列为模板和上述Deep Purple Red2引物对，进行PCR，纯化得到扩增产物B1；
3)根据SEQ ID No.5所示EsMYBA1序列设计Deep Purple Red3引物对：
Deep Purple Red3正向引物：
5’-CAATAGTATCATATACCAACAAGAAGAAGGA-3’，
Deep Purple Red3反向引物：
5’-TCATTCAAAATTCCAAAAGT-3’；
并以EsMYBA1序列为模板和上述Deep Purple Red3引物对，进行PCR，纯化得到扩增产物C1；
4)以上述扩增产物A1、B1和C1共同作为模板，并用引物对，
Deep Purple Red1正向引物：
5’-ATGGAGGGTTCGTCCAAAGGGCTGCGAAAAGGAGCCTGGACTGCTCA-3’
Deep Purple Red3反向引物：
5’-TCATTCAAAATTCCAAAAGT-3’；
进行PCR，纯化得到人工合成转录因子Deep Purple Red。
5.根据权利要求4所述人工合成转录因子Deep Purple Red的获得方法，其特征在于：所述步骤1)、2)和3)中，
PCR体系：
10×Buffer 2μl 10mM dNTP 0.4μl 正向引物 1μl 反向引物 1μl Taq DNA polymerase 0.2μl 模板 1μl ddH<sub>2</sub>O 14.4μl 合计 20μl
PCR的条件：
所述步骤4)中，
PCR体系：
PCR的条件：
6.一种重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体含有权利要求1所述人工合成转录因子Deep Purple Red的植物表达载体，其中，所述植物表达载体为pCAMBIA2300s。
7.一种权利要求6所述重组表达载体的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
将目的片段导入克隆载体18T中，然后进行将含目的基因的克隆载体DeepPurple18T和pCAMBIA2300s用Kpn Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切进行双酶切，再将得到的目的片段连接到酶切过的pCAMBIA2300s载体上即得到重组表达载体pCAMBIA2300s-DeepPurple Red。
8.含有权利要求6所述重组表达载体的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞为农杆菌EHA105。
9.下述各项之一在促进植物中类黄酮合成的应用，其特征在于：
(1)权利要求1所述的人工合成转录因子Deep Purple Red；
(2)权利要求6或7所述的重组表达载体；
(3)权利要求8所述的农杆菌EHA105；其中，所述的植物为烟草或玫瑰。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述类黄酮为植物花青素。
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