CN110819603A - Rap基因的应用以及改变草莓果实颜色的育种方法 - Google Patents

Rap基因的应用以及改变草莓果实颜色的育种方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110819603A
CN110819603A CN201911206509.0A CN201911206509A CN110819603A CN 110819603 A CN110819603 A CN 110819603A CN 201911206509 A CN201911206509 A CN 201911206509A CN 110819603 A CN110819603 A CN 110819603A
Authority
CN
China
Prior art keywords
rap
strawberry
gene
color
fruit
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201911206509.0A
Other languages
English (en)
Inventor
康春颖
高绮
骆慧枫
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Huazhong Agricultural University
Original Assignee
Huazhong Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Huazhong Agricultural University filed Critical Huazhong Agricultural University
Priority to CN201911206509.0A priority Critical patent/CN110819603A/zh
Publication of CN110819603A publication Critical patent/CN110819603A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
    • C12N9/1088—Glutathione transferase (2.5.1.18)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/825—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving pigment biosynthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y205/00—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5)
    • C12Y205/01—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5) transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5.1)
    • C12Y205/01018—Glutathione transferase (2.5.1.18)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及RAP基因过表达在改变草莓果实颜色中的应用,通过在白果草莓植株中过表达RAP基因得到红果草莓。本发明还提供了一种改变草莓果实颜色的育种方法，包括在白果草莓植株中过表达RAP基因的步骤。本发明提供了RAP基因在草莓颜色育种中的新应用，并且利用RAP基因过表达开发了一种促进草莓果实着色的新方法。

Description

RAP基因的应用以及改变草莓果实颜色的育种方法
技术领域
本发明涉及草莓育种技术领域，具体的，涉及RAP基因的应用以及改变草莓果实颜色的育种方法。
背景技术
草莓(Fragaria ananassa)为蔷薇科草莓属多年生草本植物，具有丰富的营养价值，位居世界小浆果生产之首。果实色泽是草莓育种的重要目标之一，而花青素是草莓果实变红的主要色素。植物细胞以苯丙氨酸为前体，在细胞质中经多步酶促反应合成花青素并储存于液泡中。花青素生物合成受两类基因的控制，分别称为结构基因和调节基因，其中结构基因在花青素合成途径中编码了一系列生物合成酶，且合成途径在各物种中非常保守，大致分为以下阶段：第一阶段前体苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸-4-羟化酶(C4H)、4香豆酰辅酶A连接酶(4CL)的作用下转化成4-香豆酰CoA；第二阶段是4-香豆酰CoA和丙二酰CoA在查尔酮合成酶(CHS)、查尔酮异构酶(CHI)、黄烷酮3-羟化酶(F3H)和黄烷酮3’-羟化酶(F3’H)的作用下合成二氢黄烷醇；第三阶段是在二氢黄酮醇还原酶(DFR)、花青素合成酶(ANS)、类黄酮糖基转移酶(UFGT)的作用下生成花青素。其中黄酮醇合酶(FLS)作为一个分支途径可将二氢黄烷醇形成黄酮醇，无色花色素还原酶(LAR)和花青素还原酶(ANR)可催化原花青素的形成。
花青素合成途径的结构基因主要受到调节基因在转录水平上的调控，其中研究最透彻的是R2R3-MYB转录因子、bHLH转录因子和WD40重复蛋白三者组成的复合体，称为“MBW”(MYB-bHLH-WD40)复合体。例如，R2R3-MYB转录因子MYB10在苹果、桃、油桃、樱桃和梨中均调控了果实颜色。在草莓中，多篇文章证实Fa/FvMYB10是正向调控果实颜色的关键转录因子，并且FvMYB10与FvbHLH33可能形成复合体促进结构基因的转录。最新研究发现因自然突变引起FvMYB10第12位氨基酸从W变为S，导致不同草莓生态型间红果(如Ruegen)和白果(如YellowWonder、Hawaii 4)的差异。具体来说，野生型白果森林草莓‘YellowWonder’(YW)和‘Hawaii4’(H4)均有红色叶柄、淡黄色的果皮、白色的果肉和瘦果；相反，野生型红果森林草莓‘Ruegen’具有红色叶柄、红色的果皮、白色的果肉和红色的瘦果，且果皮和瘦果着色是从果实发育后期的转色期开始的。对于FveMYB10来说，Ruegen是一个真正的野生型，而YellowWonder相当于该基因的缺失突变体。
除受合成途径的调控外，花青素的修饰和运输也直接影响了花青素最终的积累水平。花青素的稳定性受到糖基化、甲基化和乙酰化等修饰的调控。花青素在细胞质合成后需要运输到液泡中储存，因此花青素的运输也是调控花青素积累的重要环节。以玉米ZmMRP3为代表的MRP，以拟南芥TT12为代表的MATE，以及谷胱甘肽S-转移酶(GST，glutathione S-transferase)都具有运输花青素的作用。不同物种中的GST蛋白都可作为搬运蛋白(carrier)介导花青素的运输过程，如矮牵牛的AN9基因、玉米的BZ2基因以及拟南芥的TT19基因，其功能缺失后植株所有组织的花青素含量都显著下降。在桃中，GST编码基因Riant调控了桃花杂色。此前，Luo et al.，通过ENU诱变YellowWonder获得一个具有绿叶叶柄的突变体rap，但它实际上是rap myb10双突变体。基因克隆结果表明RAP编码GST蛋白，是草莓营养器官和果实着色的关键转运蛋白。现有结果表明，在草莓果实成熟过程中，FveMYB10诱导花青素合成酶和RAP基因大量表达，从而引起花青素积累，使果实着色；据此推断在FveMYB10缺失情况下，由于花青素合成受阻，RAP基因过表达也不会使白果草莓着色。
发明内容
发明人意外地发现将RAP基因连接到过表达载体PK7WG2D上，并稳定转化于RAP基因突变的白果森林草莓突变体中，果实颜色变红。
基于此，本发明提供了RAP基因过表达在改变草莓果实颜色中的应用，通过在白果草莓植株中过表达RAP基因得到红果草莓。
进一步，所述草莓为森林草莓。
本发明还提供了一种改变草莓果实颜色的育种方法，包括在白果草莓植株中过表达RAP基因的步骤。
进一步，具体步骤为在白果草莓的愈伤组织中过表达RAP基因，并将所述愈伤组织培育成植株。
进一步，在白果草莓的愈伤组织中过表达RAP基因的方法为：通过gateway反应将RAP基因整合到过表达载体pK7WG2D中，并将整合有RAP基因的过表达载体pK7WG2D-RAP转入白果草莓的愈伤组织中。
进一步，通过农杆菌转化法将所述整合有RAP基因的过表达载体pK7WG2D转入白果草莓的愈伤组织中。
进一步，所述草莓为森林草莓。
本发明的有益效果是：本发明提供了RAP基因在草莓颜色育种中的新应用，并且利用RAP基因的过表达开发了一种促进草莓果实着色的新方法。
附图说明
图1为本发明不同森林草莓的植株、花和心皮的形态，其中(a)、(b)(c)、(d)分别为YW5AF7、rap、RAP-ox；rap和Ruegen的植株、花和心皮的形态，其中心皮的标尺为20μm，图(e)为rap以及RAP-ox；rap叶柄的表皮和横切图；
图2为本发明不同森林草莓果实照片，其中(a)、(b)(c)、(d)分别为YW5AF7、rap、RAP-ox；rap和Ruegen成熟果实的表型，标尺为3mm；
图3为本发明YW5AF7、rap、RAP-ox；rap和Ruegen的叶柄以及果实中花青素的含量图；
图4为本发明YW5AF7和RAP-ox；rap叶柄和果实中花青素的HPLC色谱图，其中图4(a)为叶柄中花青素的色谱图，图4(b)为果实中花青素的色谱图，其中x轴表示时间，y轴表示在510nm处的吸光度，峰1为矢车菊素-3,5-二葡萄糖苷，峰2为芍药素-3,5-二葡萄糖苷，峰3为矢车菊素-3-葡萄糖苷，峰4为天竺葵素-3-葡萄糖苷，峰5为芍药素-3-葡萄糖苷，峰6为矢车菊素衍生物，峰7为天竺葵素衍生物，峰8为芍药素衍生物，峰9未知；
图5为RAP-ox；rap和Ruegen不同发育阶段花或果实的颜色，其中图5(a)Ruegen不同发育阶段花和果实的纵切图，图5(b)RAP-ox；rap不同发育阶段花和果实的纵切图，其中分别有阶段9(S9)、10(S10)、12(S12)及开花期(Anthesis)、授粉后第6天(6d)、第10天(10d)、第13天(13d)及转色期(Turning)的果实，比例尺分别为250μm(S9，S10，S12，Anthesis)，1mm(6d，10d，13d)及1cm(Turning)；
图6为在YW5AF7果实中瞬时过表达RAP后果实的颜色，其中图6(a)为在YW5AF7果实中注射缓冲液的对照组,图6(b)为在YW5AF7果实注射含有RAP过表达载体的农杆菌重悬液；
图7为RAP-ox；rap和Ruegen植株开花期和转色期的转录组分析结果，其中图7(a)为Venn图显示RAP-ox；rap和Ruegen果实转色期与开花期(S1)相比的上下调基因数量，图7(b)为在开花期(S1)RAP-ox；rap与Ruegen相比上调和下调的基因数量，Fold change>2,padj<0.05，图7(c)为RNA-seq数据显示RAP和其他7个花青素生物合成相关基因的表达水平，其中Ruegen-S1代表Ruegen的开花期，RAP-ox；rap-S1代表RAP-ox；rap的开花期，Ruegen-Turning代表Ruegen的转色期，RAP-ox；rap-Turning代表RAP-ox；rap的转色期。
具体实施方式
以下结合附图及具体实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，如sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular cloning:a laboratory manual,2001),或按照生化试剂制造厂商的说明书建议的条件。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
本发明中使用的植物材料为：
野生型白果森林草莓(Yellow Wonder，YW5AF7，National Clonal GermplasmRepository:Corvallis,OR,USA,ID PI641092)；
野生型红果森林草莓(Ruegen，National Germplasm Repository ID PI666609)；
对野生型白果森林草莓的RAP基因突变得到的突变体rap，其RAP基因的第245位核苷酸由C突变为T，导致RAP提前终止，无法表达RAP蛋白。该突变体rap是由本实验室中通过ENU诱变得到，也可以通过基因编辑方法获得RAP基因突变的突变体rap。
用于实验的材料均在温度为22℃，光照为100μmol m-2s-1，光周期为16h light/8h dark的植物培养间中生长。
RAP基因编码一种谷胱甘肽S-转移酶(GST)，其为将合成的花青素从细胞质转移到液泡中的载体蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示：
atggtactgaaagtttatggtccagttagggcagcctgcccccagagggtgatggtttgccttttggagctaggggttgagtttgagattgtgcctgttgatcttcaagcaggagagcaaaagcaacctcacattcttgctcgacaggtaaatattaacagtctagcaacataattgcatcaaattacacacacatacatgtcggcatatatttgactgt ttgattaatttgcagccatttgggcaagttccagcaatcgaagatggcgatttcaagctttttggtatggggggat gatatgcatacatacatatacttgttactttcttaatttgggtcttttttggaagtccatgaaaaaagtagtcctt gcaaaaatggcaataacaatatcagcagttgaaattgtgaaccaagtccaaaatgttattgataattggttatcaa gagattaactagctaggtataactagtatagtaatactgtacgtatcttggaataagatgttcaaagttcttgttg ctgtatgccttcattaacccgatttctggctctcgctctgctacacagaatctagagctatcgtaagatactatgcggctaagtatgcagagcgtggtcctaacctgctaggaacaacactggaggagaaggcactggtggatcaatggctcgaagtcgaatcacacaacttcaacgacttggttttcactgtggtacttcaacttgtgatccttcccagcatgggccaacctggcgacttggccttggtgcgctcttgtgaagaaaaactgaaaaaggtattcgatgtgtatgaggagagactgtccaagagcacctatctggccggaaactacttcagtttggctgatctgagccatcttccggcgattcggtttctggttgacgagttcaaaatgggacatttgatcacggagaggaagaatgtgaatgcttggtggaaagatatttccaataggcctgcatggaagaaacttatgaagcttgctcaatactag
其中标下划线的为内含子。
1、RAP基因过表达载体构建
过表达载体构建：使用生工RNA提取试剂盒(B518661-0050，生工)提取野生型红果草莓Ruegen嫩叶的RNA,然后通过反转录试剂盒(PrimeScriptTM RT reagent Kit withgDNA Eraser)将RNA反转录成cDNA，以Ruegen cDNA为模板在RAP基因的开放编码框两端设计引物并加上接头序列，扩增引物为：
B1-Gene31672-F:ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctatggtactgaaagtttatggt(SEQID NO:2),
Gene31672-RFP-R:aggaggccatgtattgagcaagcttcataagt(SEQ ID NO:3)
扩增RAP的CDS序列(扩增体系为：KOD Plus Buf5μl、dNTP 5μl、MgSO43.5μl、Primer15μl、Primer25μl、KOD Plus 1μl、DMSO2.5μl、ddH2O 18μl、模板cDNA 5μl，反应条件：94℃5min，94℃35s，60℃35s，68℃x min，68℃5min，4℃5min)，通过overlapping PCR与RFP融合，RFP扩增引物序列为：
Gene31672-RFP-F:tgctcaatacatggcctcctccgaggacgtc(SEQ ID NO:4)、
B2-RFP-R：ggggaccactttgtacaagaaagctgggtttaggcgccggtggagtggcgc(SEQ IDNO:5)
扩增片段总长1434bp，使用Cycle-Pure Kit(OMEGA)试剂盒纯化融合片段，通过BP反应(反应体系：PCR产物10ng、pDONR221中间载体质粒80ng、BP酶0.6μl、1×TE buffer补齐至3μl反应条件：25℃反应2h)将片段整合到中间载体pDONR221(质粒提取采用OMEGA的Plasmid Mini Kit I试剂盒)上，通过PCR(引物F:atggtactgaaagtttatggt(SEQ ID NO:6)、引物R:gtattgagcaagcttcataag(SEQ ID NO:7)，大小642bp，反应程序：2×ES TaqMasterMix 9μl、ddH2O 5μl、Primer11μl、Primer21μl、模板2μl，反应条件：95℃5min，95℃30s，55℃30s，72℃3min，72℃7min，4℃5min)、XbaI和KpnI-HF酶切(反应体系：Cutsmart 1μl、XbaI(酶1)0.3μl、KpnI-HF(酶2)0.3μl、Plasmid 5μl、ddH2O补齐至10μl，反应条件：37℃水浴3h)、测序(用擎科公司引物M13-F测序)鉴定阳性菌。通过LR反应(反应体系：RAP-pDONR221中间载体质粒50ng、pK7WG2D终载体质粒50ng、LR酶0.6μl、1×TE buffer补齐至3μl，反应条件：25℃反应2h)将片段整合到过表达载体pK7WG2D(质粒提取采用OMEGA的Plasmid Mini Kit I试剂盒)中，得到RAP基因过表达载体pK7WG2D-RAP，通过PCR(采用SEQID NO:6所示的引物F和SEQ ID NO:7所示的引物R)，大小642bp)验证、XbaI酶切(反应体系：Cutsmart 1μl、XbaI 0.6μl、Plasmid 5μl、ddH2O补齐至10μl，反应条件：37℃水浴3h)验证后提取质粒转到农杆菌株GV3101(维地生物CAT#：AC1001)中，PCR阳性鉴定(采用SEQ IDNO:6所示的引物F和SEQ ID NO:7所示的引物R)，大小642bp)后保存备用。
2、农杆菌介导的草莓稳定转化与鉴定
下列步骤中用到的MS为购自北京西美杰的M404 Murashige&Skoog ModifiedBasal Medium with GamborgVitamins(Phytotech，M404-100L)。其中1/2MS为添加量为说明书指示浓度的1/2。
采用农杆菌介导的森林草莓愈伤组织转化法，具体操作步骤如下：
1)无菌苗的准备
将突变体rap的种子放入试管中，加入无菌水，放入冰箱，4℃浸泡过夜，次日，吸去无菌水，加入70％酒精浸泡5min(摇晃)，用无菌水冲洗4-5次，将酒精去除干净，用2％的次氯酸钠，加一滴Tween20，浸泡10min(摇晃)，用无菌水冲洗3-4次，将种子播在含1/2MS培养基(1/2MS 2.22g/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L，pH 5.8)的培养皿上，在4℃下暗培养两周后转移到组培间发芽，当叶子长出2片真叶时移到1/2MS的瓶子中备用。
2)培养愈伤组织
在超净台中，用剪刀将无菌苗的叶片剪下，放在灭菌的空皿上，用手术刀切成若干小片(每小片叶子切3次)，放到5++培养基(MS 4.44g/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L+吲哚丁酸0.3mg/L+6-苄氨基嘌呤3.4mg/L，pH＝5.8)上，每板放20片左右，并且叶片正面朝下，22℃暗培养15-30d，直至切口长出愈伤组织。
3)准备菌液
蘸取-80℃保存的菌液于含有抗性的固体LB培养基(酵母膏5g/L+蛋白胨10g/L+NaCl 10g/L+琼脂15g/L+庆大霉素50μg/ml+利福平50μg/ml+壮观霉素50μg/ml)上，划线活化农杆菌，28℃培养2-3d，挑取单克隆抗体与4mL含有抗性的液体LB培养基(酵母膏5g/L+蛋白胨10g/L+NaCl 10g/L+庆大霉素50μg/ml+利福平50μg/ml+壮观霉素50μg/ml)中，28℃震荡过夜，PCR鉴定阳性菌液。
4)转化
将菌液倒入2mL离心管中，取3-4管，8000rpm离心2min，弃上清，取1mL Co-buffer(MS4.44 g/L+蔗糖20g/L,pH 5.8)重悬菌液，加入到含有20mL Co-buffer的三角瓶中，加入200μl浓度为50mg/ml的乙酰丁香酮(AS)溶液，室温遮光摇3h后，加入3板愈伤组织，室温遮光轻摇0.5-1h，用无菌水清洗愈伤组织2-3次，用镊子夹到滤纸上，将水吸干，放到5++培养基上，叶片正面朝下，放入培养箱，遮光共培养3d。
5)清洗愈伤组织
共培养3d后，部分愈伤组织附近产生农杆菌，将愈伤组织夹到含有无菌水的三角瓶中，清洗2-3次，用滤纸吸干水分，放到CT培养基(MS 4.44g/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L+吲哚丁酸0.3mg/L+6-苄氨基嘌呤3.4mg/L+羧苄青霉素250mg/L+特美汀250mg/L,pH 5.8)上，放入培养箱黑暗处理1周后转到正常培养条件培养(培养箱：光照16h，22℃，黑暗8h，19℃)。
6)继代培养
在CT培养基上培养2周后，将愈伤组织转到抗性培养基(MS 4.44g/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L+吲哚丁酸0.3mg/L+6-苄氨基嘌呤3.4mg/L+羧苄青霉素250mg/L+特美汀250mg/L+卡那霉素5mg/L,pH 5.8)上，以后每2周至一个月换一次培养基，直至愈伤分化出芽。
7)生根培养
愈伤产生芽后，将芽从组织上切下，转移到生根培养基(1/2MS 2.22g/L+葡萄糖20g/L+琼脂7g/L+吲哚丁酸0.1mg/L+羧苄青霉素200mg/L+特美汀200mg/L+卡那霉素5mg/L,pH 5.8)上培养，直至生根。
8)阳性苗鉴定
采用抗性培养基和GFP荧光筛选阳性愈伤和再生苗，小苗生根后种到土里，按照株系编号，采取嫩叶提取DNA，通过以卡那抗性基因引物Kam-F和Kam-R、GFP基因引物GFP-F和GFP-R以及目的基因引物RAP-F和RAP-R进行PCR鉴定得到稳定转化RAP基因的阳性苗。其中成功在突变体rap中过表达RAP基因的植株为RAP-ox；rap。
其中Kam-F、Kam-R、GFP-F、GFP-R、RAP-F和RAP-R的核苷酸序列如下所示：
Kam-F：tcagaagaactcgtcaagaaggcg(SEQ ID NO:8)
Kam-R：ggctgctattgggcgaagt(SEQ ID NO:9)
GFP-F：ggcaagctgaccctgaagttcat(SEQ ID NO:10)
GFP-R：ttgtggcggatcttgaagttcacc(SEQ ID NO:11)
RAP-F：如SEQ ID NO:6所示
RAP-R：如SEQ ID NO:7所示
3、实验数据测定
1)形态观察
分别对野生型白果森林草莓YW5AF7、野生型红果森林草莓Ruegen、突变体rap和在突变体rap中过表达RAP基因得到的植株RAP-ox；rap的表型进行观察，结果如图1所示，其中YW5AF7具有红叶叶柄，白色花瓣和淡黄色心皮，rap的叶柄为绿色，而在突变体rap中过表达RAP基因得到的植株RAP-ox；rap可以恢复野生型红色叶柄的表型，同时，RAP-ox；rap出现叶片有一些红褐色斑点和每个心皮的柱头变红的新表型，更进一步观察表明，RAP-ox；rap的叶柄表皮以及维管束及其周围花青素分布显著增加，表明RAP基因过表达可以恢复突变体rap中器官的着色，并导致心皮柱头变红。
由于在野生型白果森林草莓YW5AF7中，其FvMYB10发生突变导致花青素无法合成，因此YW5AF7以及rap中果肉的颜色均为白色，在突变体rap中过表达RAP后，预期果实颜色无法变红。但是对野生型白果森林草莓YW5AF7、野生型红果森林草莓Ruegen、突变体rap和在突变体rap中过表达RAP基因得到的植株RAP-ox；rap的果实颜色进行观察，结果如图2所示，RAP-ox；rap的果实成熟后，花托表皮和果肉均变红，且色泽与Ruegen的红色不同。另外，Ruegen果实成熟后花托表皮和瘦果虽为红色，果肉却呈白色，这与RAP-ox；rap的果实颜色具有明显差异。
2)花青素含量测定
分别取野生型白果森林草莓YW5AF7、野生型红果森林草莓Ruegen、突变体rap和在突变体rap中过表达RAP基因得到的植株RAP-ox；rap的新鲜草莓果实以及叶柄为样品，测定样品中花青素的含量。
花青素含量的具体测定方法为：用液氮将0.5g样品研磨至粉末状，加入5mL提取液(甲醇：水：甲酸：三氟醋酸＝70:27:2:1)，4℃冰箱中避光浸提12h，上清液用滤纸粗滤后备用，用紫外分光光度计(HoeferVision，SP-2001)检测滤液在530nm和657nm处的吸光值，花青素含量＝(A530–0.25*A657)/M，其中A530和A657分别指530nm和657nm的吸光值，M指果实或叶柄鲜重(Zhang et al 2009)。每个样品有三个生物学重复，显著性差异采用IBM SPSSStatistis 22软件分析，P<0.05。
其中叶柄中花青素的含量如图3(a)所示，其中RAP-ox；rap与rap相比，叶柄中的总花青素含量显著增加，与形态观察结果一致。
果实中花青素的含量如图3(b)所示，其中RAP-ox；rap果实的花青素含量显著高于YW5AF7或rap，但低于Ruegen，表明RAP基因过表达的植株RAP-ox；rap果实中花青素的积累并不依赖于MYB10。
3)花青素组分分析
分别取Ruegen和在突变体rap中过表达RAP基因得到的植株RAP-ox；rap的新鲜草莓果实以及叶柄为样品，测定样品中花青素组分。
具体的测定方法为：用液氮将0.5g样品研磨至粉末状，加入2.5mL盐酸甲醇溶液(甲醇：水：盐酸＝80:20:0.1)，4℃冰箱中避光浸提12h，取上清液于新的离心管中，10000rpm 4℃离心20min，采用0.45μm的微孔滤膜过滤，放在棕色进样瓶中备用，采用Develosil-ODS C18柱(5μm，4.6mm*250mm)，Daojing LC-20AT高效液相色谱仪进行检测，色谱条件：流动相A：1％甲酸水；流动相B：甲醇。进样量为20μl，流速为0.6ml/min。流动相B的线性梯度：0—10min，10％—25％；10—15min，25％—30％；15—50min，30％—50％；50—60min，50％—60％；60—68min，60％—10％；68—70min，10％。扫描波长：510nm。标准品为矢车菊素(Aladdin,27661-36-5)。
其中叶柄中的花青素组分如图4(a)所示，叶柄中RAP-ox；rap与Ruegen的花青素组成成分相同，均含有芍药素-3,5-二葡萄糖苷(峰2)、矢车菊素-3-葡萄糖苷(峰3)和芍药素-3-葡萄糖苷(峰5)，但这三种物质在RAP-ox；rap叶柄中的含量有所增加。
在果实中，Ruegen含有丰富的矢车菊素-3-葡萄糖苷(峰3)和天竺葵素-3-葡萄糖苷(峰4)，而芍药素-3-葡萄糖苷(峰5)含量较低，与此相反，RAP-ox；rap的果实具有较高的矢车菊素-3-葡萄糖苷(峰3)和芍药素-3-葡萄糖苷(峰5)，而天竺葵素-3-葡萄糖苷(峰4)含量很低。这些结果表明RAP过表达改变了果实中花青素的组成。
4)花青素积累时间测定
分别观察RAP-ox；rap和Ruegen不同时期的花和果实的形态，根据Hollender,C.A.,Geretz,A.C.,Slovin,J.P.and Liu,Z.(2012)Flower and early fruitdevelopment in a diploid strawberry,Fragaria vesca.Planta 235,1123-1139这篇文章将草莓花发育从分生组织到花期分为13个连续的阶段，分别为S1-S13，根据Fait,A.,Hanhineva,K.,Beleggia,R.,Dai,N.,Rogachev,I.,Nikiforova,V.J.,Fernie,A.R.andAharoni,A.(2008)Reconfiguration of the achene and receptacle metabolicnetworks during strawberry fruit development.Plant physiology 148,730-750将草莓后期果实发育分为绿熟期、白熟期，转色期、粉熟期和红熟期5个阶段。
结果如图5所示，Ruegen花的心皮和花托呈现黄色，在转色期时瘦果和花托皮才开始变红，而RAP-ox；rap的心皮柱头在第9时期之前就变红了，授粉6天后果实花托积累大量的花青素，由于观察RAP-ox；rap在果实发育后期花托颜色不会加深，我们预测在果实发育后期，花青素不再产生。
为了验证上述假设，将RAP过表达载体pK7WG2D-RAP通过农杆菌瞬时转化到YW5AF7白熟期的果实中，具体操作步骤如下：
①蘸取-80℃保存的pK7WG2D-RAP农杆菌液于含有抗性的固体LB培养基(酵母膏5g/L+蛋白胨10g/L+NaCl 10g/L+琼脂15g/L+庆大霉素50μg/ml+利福平50μg/ml+壮观霉素50μg/ml)上，划线活化农杆菌，28℃培养2-3d，挑取单克隆到6ml含有抗性的液体LB(酵母膏5g/L+蛋白胨10g/L+NaCl 10g/L+庆大霉素50μg/ml+利福平50μg/ml+壮观霉素50μg/ml)，28℃震荡培养过夜，直到菌液OD达到0.8-1.0；
②取2ml菌液到离心管中，5000rpm离心5min；
③用含有2％蔗糖的液体MS(MS4.44 g/L+蔗糖20g/L,pH 5.8)重悬菌液，使菌液OD值达到0.8；
④选择白熟期果实，用1ml注射器吸取菌液，注射到果实中，1ml菌液可注射5-8个果实，做好标记，注射后一周左右观察结果。
⑤每个基因注射10个以上的果实。
观察果实颜色的变化，结果如图6所示，直至成熟果实仍不会变红，表明花青素在发育后期没有产生。
4)分子水平花青素积累
为研究RAP-ox；rap果实花青素积累的分子机制，分别取Ruegen和RAP-ox；rap开花期的花托和转色期果实进行RNA-seq并进行差异表达分析，具体实验方法为：使用RNA提取试剂盒(生工)分别提取RAP-ox；rap和Ruegen开花期和转色期果实(包括花托和心皮)的RNA，每个样品有三个生物学重复，每个生物学重复都含有3-6个果实，采用PE150方法构建RNA序列库并采用Illumina HiSeq X Ten进行序列测定。在2-PASS模式下使用STAR程序将每个样品中的数据(大约8G)比对到F.vesca基因组并使用V2.0.a2注释。FeatureCounts用于计算每个基因的读取次数。差异表达基因通过R package DE Seq2分析。
结果如图7(a)所示，转色期与开花期相比，Ruegen中有4831个基因上调，6534个基因下调；RAP-ox；rap中有4470个基因上调，6177个基因下调，共同上调的基因有3787个基因，下调的基因有5442个基因，这表明两种材料在果实发育过程中的转录情况相似。
由于在开花期RAP-ox；rap与Ruegen花托的颜色不同，我们比较了RAP-ox；rap和Ruegen在开花期花托的基因表达水平，结果如图7(b)所示，与Ruegen相比，RAP-ox；rap中只有453个基因显著上调，363个基因下调。
由于果实的颜色发生变化，我们分析了花青素生物合成途径中的结构基因的表达水平，发现在Ruegen中，与开花期相比RAP在转色期时大量表达。此外，由于35S组成型启动子载体表达RAP，导致在RAP-ox；rap中的RAP表达水平更高，与发育阶段无关。
随后，对开花期与花青素合成相关的15个结构基因(PAL1、PAL2、C4H、4CL1、4CL2、CHS1、CHI、F3H、F3'H、DFR2、ANS、UFGT、FLS、LAR、ANR)的表达水平进行分析发现与Ruegen相比这些基因在RAP-ox；rap果实中的表达水平均未超过2倍，表明花青素生物合成途径处于非活跃状态。
此外，由于缺乏功能性FveMYB10，与Ruegen相比RAP-ox；rap在转色期时果实中有7个基因显著下调，结果如图7(c)所示，且花青素调控基因FveMYB10和FvebHLH3的表达水平没有显著变化。
相关基因的表达水平如下表所示：
Figure BDA0002297049160000151
RNA-seq显示花青素途径基因的表达水平。表达值由RNA-seq三个生物学重复中获得的平均TPM表示。
本发明实施例中，为了在白果森林草莓中过表达RAP基因，采用了野生型白果森林草莓的RAP基因突变得到的突变体rap作为实验材料，野生型红果森林草莓Ruegen花的心皮和花托呈现黄色，在转色期时瘦果和果皮开始变红，花青素开始积累；而在突变体rap(rapmyb10双突变体)中过表达RAP基因后，心皮柱头在第9时期之前已经变红，授粉6天后果实花托积累大量的花青素，果实发育后期，花青素不再产生，且在果实中Ruegen与RAP-ox；rap的花青素组成不同，Ruegen含有丰富的矢车菊素-3-葡萄糖苷和天竺葵素-3-葡萄糖苷，芍药素-3-葡萄糖苷含量较低，而RAP-ox；rap的果实具有较高的矢车菊素-3-葡萄糖苷和芍药素-3-葡萄糖苷，而天竺葵素-3-葡萄糖苷含量很低。这些结果表明，RAP-ox；rap果实在未成熟前即可变红，且花青素的积累不依赖MYB10，这不同于野生型红果草莓Ruegen着色机制。证明在野生型白果森林草莓YW5AF7中过表达RAP基因，也可以改变果实的颜色，因此RAP可作为草莓颜色育种中的候选基因，且为花青素形成机制的研究提供了新的思路。本发明提供了RAP基因在草莓颜色育种中的新应用，并且利用RAP基因过表达开发了一种促进草莓果实着色的新方法。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.RAP基因过表达在改变草莓果实颜色中的应用，其特征在于，通过在白果草莓植株中过表达RAP基因得到红果草莓。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述草莓为森林草莓。
3.一种改变草莓果实颜色的育种方法，其特征在于，包括在白果草莓植株中过表达RAP基因的步骤。
4.根据权利要求3所述的一种改变草莓果实颜色的育种方法，其特征在于，在白果草莓的愈伤组织中过表达RAP基因，并将所述愈伤组织培育成植株。
5.根据权利要求4所述的一种改变草莓果实颜色的育种方法，其特征在于，在白果草莓的愈伤组织中过表达RAP基因的方法为：通过gateway反应将RAP基因整合到过表达载体pK7WG2D中，并将整合有RAP基因的过表达载体pK7WG2D-RAP转入白果草莓的愈伤组织中。
6.根据权利要求5所述的一种改变草莓果实颜色的育种方法，其特征在于，通过农杆菌转化法将所述整合有RAP基因的过表达载体pK7WG2D-RAP转入白果草莓的愈伤组织中。
7.根据权利要求3-6任一项所述的改变草莓果实颜色的育种方法，其特征在于，所述草莓为森林草莓。
CN201911206509.0A 2019-11-29 2019-11-29 Rap基因的应用以及改变草莓果实颜色的育种方法 Pending CN110819603A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911206509.0A CN110819603A (zh) 2019-11-29 2019-11-29 Rap基因的应用以及改变草莓果实颜色的育种方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911206509.0A CN110819603A (zh) 2019-11-29 2019-11-29 Rap基因的应用以及改变草莓果实颜色的育种方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110819603A true CN110819603A (zh) 2020-02-21

Family

ID=69543638

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911206509.0A Pending CN110819603A (zh) 2019-11-29 2019-11-29 Rap基因的应用以及改变草莓果实颜色的育种方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110819603A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113186196A (zh) * 2021-03-04 2021-07-30 江苏省农业科学院 草莓MYB10AG-insert基因及其应用
NL2032124B1 (en) * 2022-06-10 2023-12-18 Univ Sichuan Agricultural FRAGARIA ANANASSA TRANSCRIPTION FACTOR FaBBX21, PROTEIN ENCODED THEREBY, AND USE THEREOF

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110396519A (zh) * 2019-06-27 2019-11-01 西北农林科技大学 野生草莓黑龙江-3果实成熟基因FvTCP9及其应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110396519A (zh) * 2019-06-27 2019-11-01 西北农林科技大学 野生草莓黑龙江-3果实成熟基因FvTCP9及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HUIFENG LUO 等: "Reduced Anthocyanins in Petioles codes for a GST anthocyanin transporter that is essential for the foliage and fruit coloration in strawberry", 《J EXP BOT》 *
NCBI: "PREDICTED Fragaria vesca subsp. vesca glutathione S-transferase F11-like (LOC101294111), mRNA", 《GENBANK》 *
骆慧枫: "森林草莓花青素下降突变体RAP基因的克隆与功能解析", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113186196A (zh) * 2021-03-04 2021-07-30 江苏省农业科学院 草莓MYB10AG-insert基因及其应用
CN113186196B (zh) * 2021-03-04 2023-09-19 江苏省农业科学院 草莓MYB10AG-insert基因及其应用
NL2032124B1 (en) * 2022-06-10 2023-12-18 Univ Sichuan Agricultural FRAGARIA ANANASSA TRANSCRIPTION FACTOR FaBBX21, PROTEIN ENCODED THEREBY, AND USE THEREOF

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101100930B1 (ko) 꽃의 색상이 변경된 장미의 제조 방법
Chen et al. Downregulation of putative UDP-glucose: flavonoid 3-O-glucosyltransferase gene alters flower coloring in Phalaenopsis
US7880059B2 (en) Production of proanthocyanidins to improve forage quality
US20100016565A1 (en) Identification and characterization of an anthocyanin mutant (ant1) in tomato
WO2023103580A1 (zh) SlBIN2基因在调控番茄果实成熟和类胡萝卜素合成中的应用
JP2010517526A (ja) アントシアニンとフラボノールを大量に含む果物を生産する手段および方法
CN116004657B (zh) 粉蕉成熟相关基因MbGRF1及其应用
CN112391398A (zh) 一种苹果黄酮糖基转移酶基因MdGT1及其应用
CN110819603A (zh) Rap基因的应用以及改变草莓果实颜色的育种方法
EP1330517B1 (en) Identification and characterization of an anthocyanin mutant (ant1) in tomato
KR20090127408A (ko) 표층 키메라 형질 전환 식물의 작출 방법
CN115851765B (zh) 粉蕉成熟相关基因MaMYC2-10及其应用
CN114752607B (zh) 香蕉MtLUT5基因、克隆方法、表达载体及应用
US7304207B2 (en) Identification and characterization of an Anthocyanin mutant (ANT1) in tomato
AU2004235352A1 (en) Genes upregulated in a tomato plant having an increased anthocyanin content phenotype
JP6296465B2 (ja) フラボノイドｏ−メチルトランスフェラーゼ（ｆｏｍｔ）に関連する新規なタンパク質及び遺伝子並びにそれらの使用
CN110878310B (zh) 调控植物花色的转录因子、重组真核表达载体及应用
KR101351265B1 (ko) 안토시아닌 함량이 증가된 형질전환 알팔파 식물체의 제조 방법 및 그에 따른 알팔파 식물체
Wang et al. Establishment of genetic transformation system of peach callus
KR101386190B1 (ko) 꽃잎에서 기능하는 차조기 유래의 프로모터
KR100663669B1 (ko) 배유 내에 높은 농도의 플라보노이드를 생산하는 형질전환쌀
CN113957079A (zh) MtBGLU17基因在调控植物类黄酮合成中的应用
CN117070526A (zh) 月季RhMYB28在调控植物原花青素合成和增强植物抗逆性方面的应用
MXPA06001621A (es) Proceso para producir rosas con color modificado

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20200221