JP5477619B2 - デルフィニウム(Delphiniumspp.)から単離された配糖体化酵素とその利用 - Google Patents
デルフィニウム(Delphiniumspp.)から単離された配糖体化酵素とその利用 Download PDFInfo
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Description
(a) 配列番号2に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
(b) 配列番号2に示すアミノ酸配列において1〜複数個のアミノ酸の置換、付加、欠失若しくは挿入を含みかつ配糖体化フラボノイドの生成を触媒する活性を有するポリペプチド、
(c) 配列番号2に示すアミノ酸配列に対して少なくとも70%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりかつフラボノイドの配糖体化を触媒する活性を有するポリペプチド
(d) 配列番号1に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドにコードされ、かつフラボノイドの配糖体化を触媒する活性を有するポリペプチド
(2) 上記(1)記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
(4) 上記(2)又は(3)記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
(5) 上記(4)記載の組換えベクターで形質転換された形質転換宿主細胞。
(6) 上記(5)記載の形質転換宿主細胞を、前記組換えベクターにコードされるポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養すること、及び該ポリペプチドを回収することを含む、上記(1)記載のポリペプチドの製造方法。
(8) 非配糖体化フラボノイドはアントシアニジンである、上記(7)記載の製造方法。
(9) 上記(2)又は(3)記載のポリヌクレオチドを開花植物の細胞若しくは組織培養物に導入することを含む、変異体植物の製造方法。
(10) 開花植物はデルフィニウム(Delphinium spp.)である上記(9)記載の製造方法。
デルフィニウムを上記特許文献5記載の方法で栽培し、花(がく片)を供試した。予め、パシフィックジャイアントを交配し、得られたF1種子を2006年8月にシャーレ内で播種した。シャーレ内は予め脱脂綿を引き、種が半分沈む程度に水を吸わせた。種を播いたシャーレを15℃の冷蔵庫に約7日〜10日暗黒条件下で発芽させた。発芽したものから順次セルトレイに移植した。移植したセルトレイを温室内で25〜32℃の高温度で育苗し、11月上旬にビニルハウスへ定植した。生育促進のため、12月下旬から暖房による加温をはじめ、ビニルハウス内の温度を15℃に保温した。花芽分化促進のため、2007年1月中旬から4月下旬の開花期まで、電照による長日処理を行った。電照の条件は以下の通りである。畝からの高さ1.1m、9平米の広さに100ワット白熱球1個を割り当て、午後9時〜午前3時の6時間の間、照明した。2007年4月〜5月に開花に至った。
3GT(3-O-グルコシルトランスフェラーゼ)のクローニング
全RNAは、RNeasyマキシキット(Qiagen)を用いて、1gのデルフィニウムの青紫色系統のがく弁(花)から抽出した。ポリ(A)+RNAは、Oligotex-dT30<Super>(タカラバイオテック)のキットを用いて全RNAから精製し、mRNAを得た。cDNAは、GeneRacerキット(Invitrogen)を用いてmRNAから合成した。いずれも製品に添付されたプロトコールに従って実験を行った。
デルフィニウム3GTタンパク質のE.coliによる組換え生産と抽出
デルフィニウム3GTの全長cDNAのクローンをpET vector (Promega)に組み込むことによりコード領域の全長cDNAのクローンを発現するベクターを得た。次いで、このベクターをE.coli BL21(DE3)(Novagen)に導入し、デルフィニウム3GTタンパクを発現する組み換え体E. coli BL21(DE3)を、カナマイシン(50μg/ml)を含む2YT液体培地中、37℃で一晩培養した後、引き続き、IPTG(400μM)を加え30℃で6時間培養した。E.coli細胞を遠心分離(10,000g, 30秒間)で回収し、50mM K-Pi緩衝液(pH7.0、500μl)に懸濁し、再び同条件で遠心分離した。ペレット試験管に同様の緩衝液(300μl)と2-メルカプトエタノール14mMを加え懸濁し、超音波破砕機(Brandson Sonifier Model 250, BRANDSON ULTRASONICS, Danbury, CT. USA )を用いて大腸菌細胞を溶解させた。細胞残片を遠心分離(12,000g、20分間、4℃)で除去し、粗たんぱく溶液を得た。得られた粗たんぱく溶液は、-20℃で保存した。
酵素(粗たんぱく)の機能性検定
粗たんぱく溶液の酵素活性検定は以下の方法に従った。1.5mlの遠心分離用チューブを用意し、これに0.1M Tris-HCl(pH8)、0.5mM 基質(デルフィニジン及びシアニジン)及び粗たんぱく溶液(30μl)を加えて全量を50μlとした。溶液を30℃で30分間反応させた。反応後、溶液にクロロホルム混液(CHCl3:ethanol/1MHCl, 2:1)を10μl加え、反応を停止した。遠心分離(10,000g、3分間)行い、上層部(50μl)を新しいチューブに移し替え、高速液体クロマトグラフィーにて色素を同定した。
Claims (10)
- 以下の(a)〜(d)のいずれか記載のポリペプチド。
(a) 配列番号2に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b) 配列番号2に示すアミノ酸配列において1〜10個のアミノ酸の置換、付加、欠失若しくは挿入を含みかつ配糖体化フラボノイドの生成を触媒する活性を有するポリペプチド、
(c) 配列番号2に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつフラボノイドの配糖体化を触媒する活性を有するポリペプチド、
(d) 配列番号1に示すヌクレオチド配列に対して90%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにコードされ、かつフラボノイドの配糖体化を触媒する活性を有するポリペプチド。 - 請求項1記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 配列番号1に示すヌクレオチド配列からなる、請求項2記載のポリヌクレオチド。
- 請求項2又は3記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
- 請求項4記載の組換えベクターで形質転換された形質転換宿主細胞。
- 請求項5記載の形質転換宿主細胞を、前記組換えベクターにコードされるポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養すること、及び該ポリペプチドを回収することを含む、請求項1記載のポリペプチドの製造方法。
- 非配糖体化フラボノイドを含む溶液を、請求項1記載のポリペプチドを用いて酵素処理することを含む、配糖体化フラボノイドの製造方法。
- 非配糖体化フラボノイドはアントシアニジンである、請求項7記載の製造方法。
- 請求項2又は3記載のポリヌクレオチドを開花植物の細胞若しくは組織培養物に導入することを含む、変異体植物の製造方法。
- 開花植物はデルフィニウム(Delphinium spp.)である請求項9記載の製造方法。
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