JP6933409B2 - 新規タンパク質、新規遺伝子、形質転換体、形質転換体の製造方法、および新規蛍光タンパク質のスクリーニング方法 - Google Patents
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Description
(F1) 配列番号1のアミノ酸配列において、
170番目のアミノ酸がN以外のアミノ酸であるアミノ酸配列からなるタンパク質
(F2) 前記(F1)のアミノ酸配列に対して、170番目のアミノ酸を含む同一性が80%以上のアミノ酸配列からなり、且つ、乾燥耐性を有するタンパク質
(f1) 配列番号3の塩基配列において、508番目の塩基、509番目の塩基、および510番目の塩基が、N以外のアミノ酸をコードするコドンに変異しているポリヌクレオチド
(f2) 前記(f1)のポリヌクレオチドに対して、508番目の塩基、509番目の塩基、および510番目の塩基を含む同一性が80%以上の塩基配列からなり、且つ、乾燥耐性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
本発明の新規タンパク質は、前述のように、下記(F1)または(F2)のタンパク質であることを特徴とする。
(F1) 配列番号1のアミノ酸配列において、
170番目のアミノ酸がN以外のアミノ酸であるアミノ酸配列からなるタンパク質
(F2) 前記(F1)のアミノ酸配列に対して、170番目のアミノ酸を含む同一性が80%以上のアミノ酸配列からなり、且つ、乾燥耐性を有するタンパク質
(F3) 前記(F1)の170番目のアミノ酸以外のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、乾燥耐性を有するタンパク質
励起波長:350〜650nm
励起極大波長:386〜514nm
蛍光波長:350〜650nm
蛍光極大波長:506〜524nm
本発明の新規遺伝子は、前述のように、下記(f1)および(f2)の少なくとも一方のポリヌクレオチドからなることを特徴とする。
(f1) 配列番号3の塩基配列において、508番目の塩基、509番目の塩基、および510番目の塩基が、N以外のアミノ酸をコードするコドンに変異しているポリヌクレオチド
(f2) 前記(f1)のポリヌクレオチドに対して、508番目の塩基、509番目の塩基、および510番目の塩基を含む同一性が80%以上の塩基配列からなり、且つ、乾燥耐性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(f3) 前記(f1)のポリヌクレオチドに対して、508番目の塩基、509番目の塩基、および510番目の塩基以外の塩基配列において、1もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および/または付加された塩基配列からなり、乾燥耐性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(f4) 前記(f1)のポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなり、前記相補的な配列において、前記(f1)の508番目の塩基、509番目の塩基、および510番目の塩基に対応する塩基が保存され、乾燥耐性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(f5) 配列番号1のアミノ酸配列において、170番目のアミノ酸が、N以外のアミノ酸であるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(f6) 前記(f5)の170番目のアミノ酸以外のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、乾燥耐性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(f7) 前記(f5)の170番目のアミノ酸以外のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、乾燥耐性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
本発明の発現ベクターは、前述のように、前記本発明の新規遺伝子を含むことを特徴とする。本発明の発現ベクターによれば、例えば、前記発現ベクターを前記宿主に導入することで、前記本発明の新規タンパク質を容易に製造できる。本発明の発現ベクターは、例えば、前記本発明の新規遺伝子の説明等を援用できる。
本発明の新規タンパク質の製造方法は、特に制限されず、例えば、遺伝子工学的手法により製造してもよいし、公知の合成方法により製造してもよい。前者の場合、本発明の製造方法は、前記本発明の新規遺伝子を発現させる発現工程を含む。これにより、本発明の新規タンパク質の製造方法は、例えば、前記本発明の新規蛍光タンパク質を容易に製造できる。
本発明の形質転換体は、前述のように、前記本発明の新規遺伝子を含むことを特徴とする。本発明の形質転換体は、前記本発明の新規遺伝子を含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の形質転換体は、前記本発明の新規遺伝子を含むため、例えば、乾燥耐性を有する。本発明の形質転換体は、例えば、前記本発明の新規タンパク質等の説明を援用できる。
本発明の形質転換体の製造方法は、前述のように、宿主に、本発明の新規遺伝子を導入する導入工程を含むことを特徴とする。本発明の形質転換体の製造方法は、宿主に、本発明の新規遺伝子を導入する導入工程を含むことを特徴とし、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の形質転換体の製造方法によれば、例えば、前記本発明の形質転換体を容易に製造できる。
本発明の新規蛍光タンパク質のスクリーニング方法(以下、「本発明のスクリーニング方法」ともいう。)は、前述のように、前記本発明の新規タンパク質に変異を導入した候補タンパク質から、配列番号1のアミノ酸配列における170番目のアミノ酸がN以外のアミノ酸であり、且つ乾燥耐性を有するタンパク質を選抜する選抜工程を含むことを特徴とし、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明のスクリーニング方法によれば、例えば、蛍光活性を有するタンパク質を容易にスクリーニングできる。本発明のスクリーニング方法は、例えば、前記本発明の新規タンパク質、新規遺伝子、発現ベクター、および製造方法等の説明を援用できる。
本発明のスクリーニング方法により、新規蛍光タンパク質をスクリーニングできることを確認した。
Error−prone PCR法を用いて、変異ポリヌクレオチドを作製し、前記変異ポリヌクレオチドをベクターに連結して、変異ポリヌクレオチド発現ベクターを構築した。具体的には、以下のようにして行った。まず、CpYGFPのポリヌクレオチド(配列番号3)を、以下のプライマーセットを用いて、PCR(Polymerase Chain Reaction)により増幅し、ランダムに変異が挿入された変異ポリヌクレオチドを得た。PCR反応液は、GeneMorph II Random Mutagenesis Kit(200550、Agilent Technologies社製)のキットを用い、説明書に従って調製した。
プライマー配列1(配列番号8)
5'-ATGCTTCCGGCTCGTATGTTG-3'
プライマー配列2(配列番号9)
5'-GTACGGCCGACTAGTAGGCC-3'
大腸菌DH5α株に、前記変異ポリヌクレオチド発現ベクターを、それぞれ単独で、ヒートショック法により形質導入した。得られた形質転換体を、抗生物質(カルベニシリン)100μg/mLを含有するLB培地を用いて培養した。
そして、培養した菌体を集菌し、光源として、LEDUV光源(NS375LIM、ナイトライド・セミコンダクター株式会社製)、フィルタとして、UL360(オーエムジー株式会社製)を用いて、前記菌体の蛍光活性を確認した。
前記(3)で蛍光活性が確認できた菌体のコロニーを収集し、プラスミドを精製し、以下の条件でダイレクトシーケンスに供した。シーケンスプライマーは、前記(1)の前記プライマーセットを用いた。その結果、蛍光活性が確認できた前記菌体は、前記本発明の新規遺伝子(配列番号4)を有していることが確認できた。これらの結果から、本発明のスクリーニング方法により、本発明の新規蛍光タンパク質をスクリーニングできることがわかった。
シーケンサー ABI 3130xl(Applied Biosystems社製)
シーケンス試薬 BigDye Terminator V1-1 cycle sequencing kit(Applied Biosystems社製)
本発明の新規タンパク質が蛍光活性を有することを確認した。
実施例1で得られた、前記本発明の新規遺伝子(配列番号4)を有する菌体のコロニーを収集し、抗生物質(カルベニシリン)100μg/mLを含有するLB培地において、37℃で18時間培養した。そして、培養した菌体を、6000rpm、4℃の条件で、10分間遠心し、集菌した。得られたペレットを、PBS溶液を用いて、1回洗浄した。前記洗浄後のペレットを、1.6mLのPBS溶液に懸濁した。つぎに、得られた懸濁液を、超音波ホモジナイザー(QSONICA、和研薬株式会社製)を用いて、Amp30%、1分間の条件で、超音波処理した。そして、前記処理後の懸濁液を、1300rpm、4℃の条件で、10分間遠心し、得られた上清を回収した。前記上清に、0.2ml(50%スラリー)のTALON(登録商標)Metal Affinity Resin(Z5502N、TAKARA社製)を加え、室温で1時間反応させた。前記反応液を、PBS溶液を用いて洗浄した後、300mMのイミダゾールを含有する0.5mlのPBS溶液を加え、タンパク質を溶出させた。そして、アミコンウルトラ−0.5(UFC5010、Merck Millipore社製)を用いて、前記反応液のバッファー交換を行い、PBS溶液に置換した。前記形質転換体から得られた精製サンプルを、YGFP N170Dタンパク質とし、以下の実験に使用した。前記各精製サンプル中のタンパク質濃度は、前記各サンプルを、10%SDS溶液で希釈した後、Pierce BCA Protein Assay Kit(♯23225、Pierce社製)を用いて発色させ、マイクロプレートリーダー(Infinite(登録商標) M1000Pro、TECAN社製)を用いて、562nmにおける吸光度を測定することにより決定した。また、同様にして、前記本発明の新規遺伝子(配列番号7)を有する菌体から、YGFP N170Eタンパク質を含む精製サンプルを調製した。
前記YGFP N170Dタンパク質および前記YGFP N170Eタンパク質を、それぞれ、前記(1)で得られた前記タンパク質濃度に基づき、前記サンプル中のタンパク質濃度が、2μmol/Lとなるように希釈した。前記希釈後のサンプル70μLについて、前記マイクロプレートリーダーを用い、下記測定条件で蛍光強度(FI)を測定した。また、ポジティブコントロールとして、前記YGFP N170Dおよび前記YGFP N170Eに代えて、既知の蛍光タンパク質であるBK15(配列番号11)を用いた以外は同様にして、測定した。配列番号11のアミノ酸配列は、以下の通りである。以下のアミノ酸配列において、四角で囲んだアミノ酸(N)は、170番目のアミノ酸(アスパラギン)である。
励起波長:350〜650nm(バンド幅:5nm)
蛍光(検出)波長:350〜650nm(バンド幅:5nm)
レーザー強度(Gain):100
本発明の新規タンパク質が乾燥耐性を有することを確認した。
(付記1)
下記(F1)または(F2)のタンパク質であることを特徴とする、新規タンパク質。
(F1) 配列番号1のアミノ酸配列において、
170番目のアミノ酸がN以外のアミノ酸であるアミノ酸配列からなるタンパク質
(F2) 前記(F1)のアミノ酸配列に対して、170番目のアミノ酸を含む同一性が80%以上のアミノ酸配列からなり、且つ、乾燥耐性を有するタンパク質
(付記2)
前記(F1)のタンパク質が、配列番号2および6の少なくとも一方のアミノ酸配列からなるタンパク質である、付記1記載の新規タンパク質。
(付記3)
下記(f1)および(f2)の少なくとも一方のポリヌクレオチドからなることを特徴とする、新規遺伝子。
(f1) 配列番号3の塩基配列において、508番目の塩基、509番目の塩基、および510番目の塩基が、N以外のアミノ酸をコードするコドンに変異しているポリヌクレオチド
(f2) 前記(f1)のポリヌクレオチドに対して、508番目の塩基、509番目の塩基、および510番目の塩基を含む同一性が80%以上の塩基配列からなり、且つ、乾燥耐性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(付記4)
前記配列番号3の塩基配列において、
508番目の塩基、509番目の塩基、および510番目の塩基が、DおよびEの少なくとも一方をコードするコドンである、付記3記載の新規遺伝子。
(付記5)
381番目の塩基が、Aに置換された、付記3または4記載の新規遺伝子。
(付記6)
前記(f1)のポリヌクレオチドが、配列番号4および7の少なくとも一方の塩基配列からなるポリヌクレオチドである、付記3から5のいずれかに記載の新規遺伝子。
(付記7)
前記(f2)のポリヌクレオチドが、配列番号5の塩基配列からなるポリヌクレオチドである、付記3から6のいずれかに記載の新規遺伝子。
(付記8)
付記3から7のいずれかに記載の新規遺伝子を含むことを特徴とする、発現ベクター。
(付記9)
付記3から7のいずれかに記載の新規遺伝子を含むことを特徴とする、形質転換体。
(付記10)
前記形質転換体が、植物である、付記9記載の形質転換体。
(付記11)
宿主に、付記3から7のいずれかに記載の新規遺伝子を導入する導入工程を含むことを特徴とする、形質転換体の製造方法。
(付記12)
さらに、前記宿主に、前記新規遺伝子を発現させる発現工程を含む、付記11記載の形質転換体の製造方法。
(付記13)
前記宿主が、植物である、付記11または12記載の形質転換体の製造方法。
(付記14)
配列番号1のアミノ酸配列からなるタンパク質または付記1もしくは2記載の新規タンパク質に変異を導入した候補タンパク質から、配列番号1のアミノ酸配列における170番目のアミノ酸に対応するアミノ酸がN以外のアミノ酸であり、且つ乾燥耐性を有するタンパク質を選抜する選抜工程を含むことを特徴とする、新規蛍光タンパク質のスクリーニング方法。
(付記15)
前記選抜工程において、
前記配列番号1のアミノ酸配列における170番目のアミノ酸に対応するアミノ酸が、DまたはEであり、
且つ乾燥耐性を有するタンパク質を選抜する、付記14記載のスクリーニング方法。
(付記16)
配列番号3の塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは付記3から6のいずれかに記載の新規遺伝子に変異を導入した変異ポリヌクレオチドがコードする候補タンパク質から、配列番号1のアミノ酸配列における170番目のアミノ酸がN以外のアミノ酸であり、且つ乾燥耐性を有するタンパク質を選抜する、付記14または15記載のスクリーニング方法。
Claims (8)
- 下記(F1)または(F2)のタンパク質であることを特徴とする、新規タンパク質。
(F1) 配列番号2および6の少なくとも一方のアミノ酸配列からなるタンパク質
(F2) 前記(F1)のアミノ酸配列に対して、同一性が90%以上のアミノ酸配列からなり、且つ、170番目のアミノ酸が保存され、且つ、乾燥耐性を有するタンパク質 - 下記(f1)および(f2)の少なくとも一方のポリヌクレオチドからなることを特徴とする、新規ポリヌクレオチド。
(f1) 配列番号3の塩基配列において、508番目の塩基、509番目の塩基、および510番目の塩基が、DおよびEの少なくとも一方をコードするコドンに変異しているポリヌクレオチド
(f2) 前記(f1)のポリヌクレオチドに対して、同一性が90%以上の塩基配列からなり、且つ、508番目の塩基、509番目の塩基、および510番目の塩基が保存され、且つ、乾燥耐性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド - 381番目の塩基が、Aに置換された、請求項2記載の新規ポリヌクレオチド。
- 前記(f1)のポリヌクレオチドが、配列番号4および7の少なくとも一方の塩基配列からなるポリヌクレオチドである、請求項2または3記載の新規ポリヌクレオチド。
- 前記(f2)のポリヌクレオチドが、配列番号5の塩基配列からなるポリヌクレオチドである、請求項2から4のいずれか一項に記載の新規ポリヌクレオチド。
- 請求項2から5のいずれか一項に記載の新規ポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、ヒトを除く形質転換体。
- ヒトを除く宿主に、請求項2から5のいずれか一項に記載の新規ポリヌクレオチドを導入する導入工程を含むことを特徴とする、ヒトを除く形質転換体の製造方法。
- 配列番号1のアミノ酸配列からなるタンパク質または請求項1記載の新規タンパク質に変異を導入した候補タンパク質から、配列番号1のアミノ酸配列における170番目のアミノ酸に対応するアミノ酸がDおよびEの少なくとも一方であり、且つ乾燥耐性を有するタンパク質を選抜する選抜工程を含むことを特徴とする、新規蛍光タンパク質のスクリーニング方法。
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