JP5774809B2 - 種子収量が向上した植物 - Google Patents
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Description
(a)配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
(b)配列番号1に示されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
(c)配列番号2に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
(d)配列番号2に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
(e)配列番号3に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
(f)配列番号3に示されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
(g)配列番号4に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
(h)配列番号4に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
(a)配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
(b)配列番号1に示されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
(c)配列番号2に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
(d)配列番号2に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
(e)配列番号3に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
(f)配列番号3に示されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
(g)配列番号4に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
(h)配列番号4に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
本発明の他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分分かるであろう。また、本発明の利点は、添付図面を参照した次の説明によって明白になるであろう。
形質転換体を作製するための親植物として、野生型シロイヌナズナのColumbia (Col-0)を用いた。植物は、正方形のプラスチックポット(6.5×6.5×5 cm)の中に底からバーミキュライト(旭工業、岡山)、クレハ培養土(クレハ園芸培土、呉羽化学、東京)、バーミキュライトを2:1:1の割合で3層に入れた土壌に播種し、生育温度22℃、長日条件(16時間明期/8時間暗期)で生育させた。
3週齢のシロイヌナズナの野生型Columbia(Col-0)から全RNAを単離し、Prostar first strand RT-PCRキット(Stratagene, La Jolla, CA, USA)を用いてcDNAを合成した。
35S-Chl.GSH1-pBI121を導入した形質転換体においては、以下のようにRT-PCRを行い、GSH1遺伝子の発現量を調べた。
cyt.GSH1_7SとAtGSH1_R1: 全GSH1 mRNA(葉緑体移行シグナルを含むGSH1 mRNAと含まないGSH1 mRNAを合わせたもの)
AtGSH1_F2とAtGSH1_R3: 宿主ゲノム由来のGSH1 mRNA
AtGSH1_F1とNos term_R2: 導入した発現ベクター由来のGSH1 mRNA。
http://www.affrc.go.jp/ja/db/seika/data_flower/h13/flower01004.htmlに記載の手順に従った。
3齢週のシロイヌナズナ(Col-0, 35S-Chl.GSH1 2-16)の植物体を0.2mM EDTA、10% glycerol、10mM MgCl2を含む50mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)中で破砕し、遠心分離して得られた上清からMicrocon YM-10 (Amicon, Inc., Beverly, MA, USA)を用いて低分子を除いたものを酵素液とした。酵素液を反応液[120mM HEPES (pH 8.0)、60mM MgCl2、6mM ATP、6mM PEP、6 units pyruvate kinase、5mM DTE、48mM L-glutamate、40mM L-cysteine]に加え30℃で反応させた。反応はL-cysteine 添加で開始しトリクロロ酢酸添加で停止させた。反応液はMicrocon YM-3 (Amicon, Inc., Beverly, MA, USA)を用いて高分子を除いた後、逆相C18カラムを用いたHPLC (Shiseido, Tokyo, Japan)で分離し、γ-ECをmodel 5200A Coulochem II electrochemical detector (ESA, Inc., Chelmsford, MA, USA)で検出した。移動相の組成は、50mM sodium phosphate monobasic monohydrate (pH 2.7)、1.0mM octanesulfonic acid、2.7% methanolとした。
5-1 方法1
25、50、100、200、500μE/m2/sの光条件下で生育させた3齢週のシロイヌナズナ(Col-0, 35S-Chl.GSH1 2-16)の地上部を5%トリクロロ酢酸中で破砕し、遠心分離して得られた上清に等量のジエチルエーテルを加えて懸濁し、エーテル層を取り除きトリクロロ酢酸を除去した。これを3回繰返した後、遠心エバポレーターで完全にエーテルを除去し測定に用いた。測定はEllmanの方法(Ellman, G.L. (1959) Tissue sulfhydryl goups. Arch. Biochem. Biophys. 82: 70-77)に従いグルタチオンレダクターゼ-DTNB (5,5’-Dithiobis 2-nitrobenzonic acid)リサイクル法により行った。抽出液を反応液[5mM EDTA、0.25mM NADPH、0.75units glutathione reductaseを含む10mM sodium phosphate緩衝液(pH7.5)]に加え、5mM DTNBを添加し反応を開始した。2-nitro-5-thiobenzonic acidの生成を412nmの吸光度増加の初速から求めた。全GSH量は標準物質を用いて作製した検量線により算出した。
2齢週のシロイヌナズナ(Col-0, 35S-cyt.GSH1 1-1, 2-7, 3-6)の地上部を液体窒素中で粉末状に破砕した後、10倍量の抽出バッファー(0.1 M HCl: (0.1 M NaClO4, 0.1% H3PO4) = 1:1)を添加し、氷中で融解、混合し、遠心分離した。得られた上清はMicrocon YM-3 (Amicon, Inc., Beverly, MA, USA)を用いて高分子を除いた後、逆相C18カラム(Shiseido, Tokyo, Japan)を用いたHPLC で分離し、還元型グルタチオン(GSH)および酸化型(GSSG)をLaChrom UV-VIS Detector L-7420 (Hitachi, Japan)で検出した。移動相の組成は、0.1 M NaClO4、0.1% H3PO4、1% acetonitrileとした。グルタチオン量は標準物質を用いて作製した検量線により算出した。
シロイヌナズナ(Col-0, 35S-Chl.GSH1 2-16, 35S-cyt.GSH1 1-1, 2-7, 3-6)をポットに播種し、22℃、長日条件下で生育させた。図11に、播種後33日目のCol-0、並びに35S-cyt.GSH1 2-7および 3-6の植物体の写真を示した。図11から明らかなように、35S-cyt.GSH1 2-7および 3-6は既に開花しているが、Col-0は未だ開花に至っていない。すなわち、35S-cyt.GSH1 形質転換植物は親植物(Col-0)に比べて成長速度が速いことが分かる。
Claims (19)
- 植物由来のγ−グルタミルシステインシンセターゼをコードするポリヌクレオチドが導入されている形質転換植物であって、該ポリヌクレオチドの翻訳産物は葉緑体移行シグナルペプチドを有しておらず、かつ、親植物における単位面積あたりのバイオマス量および種子収穫量を十分に向上させる植栽密度よりも高い植栽密度にて栽培されることで、親植物と比較して単位面積あたりのバイオマス量または種子収穫量がさらに増加することを特徴とする形質転換植物。
- 上記γ−グルタミルシステインシンセターゼをコードするポリヌクレオチドが以下の(e)〜(h)からなる群より選択されることを特徴とする請求項1に記載の形質転換植物。
(e)配列番号3に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
(f)配列番号3に示されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなりかつ葉緑体移行シグナルペプチドを有していないポリペプチド、をコードするポリヌクレオチド
(g)配列番号4に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
(h)配列番号4に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ葉緑体移行シグナルペプチドを有していない翻訳産物をコードするポリヌクレオチド - グルタチオン結合型アルドラーゼをコードするポリヌクレオチドがさらに導入されていることを特徴とする請求項1または2に記載の形質転換植物。
- 植物の花の数および種子の数の少なくともいずれかを増加させる方法であって、
植物由来のγ−グルタミルシステインシンセターゼをコードするポリヌクレオチドを植物に導入する工程、および
上記ポリヌクレオチドが導入されている植物を、親植物における単位面積あたりのバイオマス量および種子収穫量を十分に向上させる植栽密度よりも高い植栽密度にて栽培する工程
を包含することを特徴とする方法。 - 上記γ−グルタミルシステインシンセターゼをコードするポリヌクレオチドが以下の(a)〜(h)からなる群より選択されることを特徴とする請求項4に記載の方法。
(a)配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
(b)配列番号1に示されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(c)配列番号2に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
(d)配列番号2に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
(e)配列番号3に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
(f)配列番号3に示されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(g)配列番号4に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
(h)配列番号4に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド - 植物の単位面積あたりのバイオマス量または種子収穫量を増加させる方法であって、
植物由来のγ−グルタミルシステインシンセターゼをコードするポリヌクレオチドを植物に導入する工程、および
上記ポリヌクレオチドが導入されている植物を、親植物における単位面積あたりのバイオマス量および種子収穫量を十分に向上させる植栽密度よりも高い植栽密度にて栽培する工程
を包含することを特徴とする方法。 - 上記植物由来のγ−グルタミルシステインシンセターゼをコードするポリヌクレオチドの翻訳産物は葉緑体移行シグナルペプチドを有していることを特徴とする請求項6に記載の方法。
- 上記γ−グルタミルシステインシンセターゼをコードするポリヌクレオチドが以下の(a)〜(d)からなる群より選択されることを特徴とする請求項7に記載の方法。
(a)配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
(b)配列番号1に示されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(c)配列番号2に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
(d)配列番号2に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド - 上記植物由来のγ−グルタミルシステインシンセターゼをコードするポリヌクレオチドの翻訳産物は葉緑体移行シグナルペプチドを有しておらず、収穫指数が向上していることを特徴とする請求項6に記載の方法。
- 上記γ−グルタミルシステインシンセターゼをコードするポリヌクレオチドが以下の(e)〜(h)からなる群より選択されることを特徴とする請求項9に記載の方法。
(e)配列番号3に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
(f)配列番号3に示されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(g)配列番号4に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
(h)配列番号4に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド - グルタチオン結合型アルドラーゼをコードするポリヌクレオチドを導入する工程をさらに包含することを特徴とする請求項9または10に記載の方法。
- 親植物における単位面積あたりのバイオマス量および種子収穫量を十分に向上させる植栽密度よりも高い植栽密度にて栽培することによって、親植物と比較して単位面積あたりのバイオマス量または種子収穫量が増加する植物の生産方法であって、
植物由来のγ−グルタミルシステインシンセターゼをコードするポリヌクレオチドを所望の植物に導入する工程、ならびに
親植物における単位面積あたりのバイオマス量および種子収穫量を十分に向上させる植栽密度よりも高い植栽密度にて栽培した場合に親植物と比較して花の数および種子の数の少なくともいずれかが増加している植物を選択する工程
を包含することを特徴とする生産方法。 - グルタチオン結合型アルドラーゼをコードするポリヌクレオチドを導入する工程をさらに包含することを特徴とする請求項12に記載の生産方法。
- 上記γ−グルタミルシステインシンセターゼをコードするポリヌクレオチドが以下の(a)〜(h)からなる群より選択されることを特徴とする請求項12または13に記載の生産方法。
(a)配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
(b)配列番号1に示されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(c)配列番号2に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
(d)配列番号2に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
(e)配列番号3に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
(f)配列番号3に示されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(g)配列番号4に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
(h)配列番号4に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド - 植物由来のγ−グルタミルシステインシンセターゼをコードするポリヌクレオチドの、植物の花の数および種子の数の少なくともいずれかを増加させるための、使用。
- 上記γ−グルタミルシステインシンセターゼをコードするポリヌクレオチドが以下の(a)〜(h)からなる群より選択されることを特徴とする請求項15に記載の使用。
(a)配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
(b)配列番号1に示されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(c)配列番号2に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
(d)配列番号2に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
(e)配列番号3に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
(f)配列番号3に示されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(g)配列番号4に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
(h)配列番号4に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド - 植物由来のγ−グルタミルシステインシンセターゼをコードするポリヌクレオチドの、単位面積あたりのバイオマス量または種子収穫量を増加させるための、使用。
- 上記γ−グルタミルシステインシンセターゼをコードするポリヌクレオチドが以下の(a)〜(h)からなる群より選択されることを特徴とする請求項17に記載の使用。
(a)配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
(b)配列番号1に示されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(c)配列番号2に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
(d)配列番号2に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
(e)配列番号3に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
(f)配列番号3に示されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(g)配列番号4に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
(h)配列番号4に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド - グルタチオン結合型アルドラーゼをコードするポリヌクレオチドとともに用いられることを特徴とする請求項17または18に記載の使用。
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