CN101583713A

CN101583713A - 种子收量提高的植物

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Publication number: CN101583713A
Application number: CNA2008800022592A
Authority: CN
Inventors: 小川健一; 岩崎郁
Original assignee: Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2007-01-16
Filing date: 2008-01-15
Publication date: 2009-11-18
Anticipated expiration: 2028-01-15
Also published as: WO2008087932A1; US20100083404A1; AU2008205946B2; EP2123753A1; EP2123753A4; CN101583713B; ZA200904852B; MX2009007556A; AU2008205946A1; CA2675696C; BRPI0806216A2; CA2675696A1; US8173865B2; JPWO2008087932A1; EP2123753B1; JP5774809B2

Abstract

导入了γ－谷氨酰半胱氨酸合成酶基因的形质转化植物相比于野生型植物，其花数和种子数中的至少一个均增加，种子收量提高。由此，清楚了植物来源的γ－谷氨酰半胱氨酸合成酶基因产物的功能，并且提供了做出种子收量提高的植物的技术。

Description

种子收量提高的植物

技术领域

本发明涉及种子收量提高的植物，更详细的是通过导入植物来源的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因而花数、种子数和种子重量中的至少一个增加的植物，以及使植物的花数和种子数中的至少一个增加的方法。

背景技术

以往，植物不仅作为粮食还作为鉴赏用、纸和药品等工业材料和燃料，在各种场合，与人类越来越紧密相关。而且，近年来，植物还作为代替化石燃料的生物质能而备受关注。

对于在这样多样的用途中利用的植物的发芽、成长、开花等的机理大多并不清楚。这是因为，植物主要是根据经验和直觉进行栽培，其收成大都受气候等自然的影响所左右。因此，弄清楚植物的发芽、成长、开花的机理，对它们进行调整和控制，在鉴赏用草本花以及谷物和野菜等粮食的产量增加中十分重要，而且对于森林中木材的培育以及生物质能也极为重要。

迄今为止，作为调整植物的成长的手段，人们逐步进行了通过温室等人工气候环境调整开花时期，使用乙烯等化学药品促进成长等努力。然而，以往这些方法中的许多方法通过经验和直觉调整植物的成长，并没有基于可以科学判断植物的成长过程的材料。

因此，本发明人对于植物的发芽、成长、开花的机理逐步开展研究。其结果是，并已指出活性氧和谷胱甘肽等氧化还原状态调节物质在植物的发育中作为控制因子都是必需的(参照专利文献1，2)。

谷胱甘肽(GSH)是经γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶由半胱氨酸和谷氨酸合成γ-谷氨酰半胱氨酸，再经GSH合成酶添加甘氨酸而合成的多肽。谷胱甘肽是细胞内的主要抗氧化物质，而且，具有解毒细胞内的异物的功能。

据报道在导入了大肠杆菌的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因的形质转化植物中，谷胱甘肽量有效增加(参照非专利文献1-3)。但是，有报道指出这种形质转化植物存在遇光变弱的情况(参照非专利文献3)。

另一方面，据报道在使植物自身具有的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因过度表达时，具体在通过在拟南芥中导入拟南芥的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因使之过度表达的形质转化植物中，γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶mRNA及其翻译产物(蛋白质)的表达量大幅增加，但谷胱甘肽量的增加小(非专利文献4)。所以，人们意识到采用植物来源的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因作为植物中的谷胱甘肽量增加的方法不理想。

专利文献1：WO01/080638(公开日：平成15(2003)年7月22日)

专利文献2：日本公开专利公报特开2004-352679(公开日：平成16(2004)年12月16日)

非专利文献1：Noctor G，Strohm M，Jouanin L，Kunert KJ，Foyer CH，Rennenberg H.Synthesis of glutathione in leaves of transgenic poplaroverexpressing γ-谷氨酰半胱氨酸synthetase.Plant Physiol.1996Nov；112(3)：1071-1078.

非专利文献2：Noctor G，Arisi AC，Jouanin L，Foyer CH.Manipulationof glutathione and amino acid biosynthesis in the chloroplast.PlantPhysiol.1998Oct；118(2)：471-482.

非专利文献3：Creissen G，Firmin J，Fryer M，Kular B，Leyland N，Reynolds H，Pastori G，Wellburn F，Baker N，Wellburn A，Mullineaux P。Elevated glutathione biosynthetic capacity in the chloroplasts of transgenictobacco plants paradoxically causes increased oxidative stress.PlantCell.1999 Jul；11(7)：1277-1292.

非专利文献4：Xiang C，Werner BL，Christensen EM，Oliver DJ.Thebiological functions of glutathione revisited in arabidopsis transgenic plantswith altered glutathione levels.Plant Physiol.2001 Jun；126(2)：564-574.

发明内容

如上所述，尽管人们尝试进行了通过在植物中导入γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因使谷胱甘肽量增加的尝试(非专利文献1-4)，过去的报告中公开了在植物中导入γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因时(非专利文献4)，在非压力下没发现对植物的正常生长过程(形态等)有大的影响，但是没有就对收获量会有何种影响作研究。

而且，由于考虑到通过在植物中导入植物来源的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因难以使谷胱甘肽量大幅增加，因此本发明人之外基本没有其它研究组研究植物来源的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因产物与植物生长之间的关系。

然而，本发明人发现谷胱甘肽具有作为植物的生长调节剂的效果，因此认为内源的谷胱甘肽合成系统伴随植物的生长受到某种控制。科学把握植物的生长过程，科学预测开花时期并进行调整不仅在鉴赏用草本花和粮食用植物而且在森林以及生物质能用的植物资源中都极为重要。因此，为了弄清楚内源谷胱甘肽合成的未知的控制系统，了解与催化该合成系统的第一阶段的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶相关的植物来源的基因产物的功能，弄清楚其与植物的生长的关系意义十分深远。

该研究的结果是，发现了谷胱甘肽合成的控制与种子收量之间存在紧密的关系，并且了解了这种控制存在于催化合成的第一阶段的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因产物中。

本发明的目的在于基于这种发现提供一种制作种子收量提高的植物。

本发明人在研究植物生长中植物来源的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因产物的控制机制的过程中，发现导入了植物来源的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因的形质转化植物中γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因的表达量提高的植物，通过在比使每单位面积的生物量和种子收获量充分提高的栽种密度更高的栽种密度下进行栽培，花数和种子数都比亲本植物有所增加，从而完成了本发明。

也就是说，本发明涉及的植物的特征在于具有使γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性水平增加的变异，而且通过在比使每单位面积的生物量和种子收获量充分提高的栽种密度更高的栽种密度下进行栽培，单位面积的生物量和种子收获量比亲本植物进一步增加。

而且，本发明涉及的植物的特征在于具有使γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶表达水平增加的变异，而且通过在比使每单位面积的生物量和种子收获量充分提高的栽种密度更高的栽种密度下进行栽培，单位面积的生物量和种子收获量比野生型植物进一步增加。

而且，本发明涉及的形质转化植物的特征在于导入了编码植物来源的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的多核苷酸，而且通过在比使每单位面积的生物量和种子收获量充分提高的栽种密度更高的栽种密度下栽培，单位面积的生物量和种子收获量比亲本植物进一步增加。

本发明涉及的形质转化植物中，编码上述植物来源的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的多核苷酸的翻译产物具有叶绿体移行信号肽是优选的。

编码具有叶绿体移行信号肽的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的多肽优选选自于以下的(a)-(d)：

(a)编码由序列号1所示的氨基酸序列构成的多肽的多核苷酸

(b)编码序列号1所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加了一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的多肽的多核苷酸

(c)序列号2所示的碱基序列构成的多核苷酸

(d)与序列号2所示的碱基序列构成的多核苷酸在严紧条件下杂交的多核苷酸

本发明涉及的形质转化植物中，优选的是编码上述植物来源的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的多核苷酸的翻译产物不具有叶绿体移行信号肽，收获指数提高。

编码不具有叶绿体移行信号肽的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的多核苷酸优选选自于以下的(e)-(h)：

(e)编码序列号3所示的氨基酸序列构成的多肽的多核苷酸

(f)编码由序列号3所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加了一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的多肽的多核苷酸

(g)由序列号4所示的碱基序列构成的多核苷酸

(h)与由序列号4所示的碱基序列构成的多核苷酸在严紧条件下杂交的多核苷酸。

本发明涉及的形质转化植物可以还导入了编码谷胱甘肽结合型醛缩酶的多核苷酸。

本发明涉及的方法是使植物的花数和种子数中的至少任意一个增加的方法，其特征在于包括：在植物中导入编码γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的多核苷酸的工序，以及在比使单位面积的生物量和种子收获量充分提高的栽种密度更高的栽种密度下栽培导入了上述多核苷酸的植物的工序。

本发明的方法中优选上述编码γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的多核苷酸选自于以下的(a)-(h)：

(a)编码序列号1所示的氨基酸序列构成的多肽的多核苷酸

(c)序列号2所示的碱基序列构成的多核苷酸

(e)编码序列号3所示的氨基酸序列构成的多肽的多核苷酸

(g)由序列号4所示的碱基序列构成的多核苷酸

本发明的其它目的，特征和优点通过以下所述记载会十分清楚。而且，本发明的优点参照附图按照以下说明也是一目了然的。

附图说明

图1：A为表示具有叶绿体移行信号肽的GSH1基因和不具有叶绿体移行信号肽的GSH1基因的克隆中使用的引物和限制性酶位点的图，B是表示形质转化时使用的构建体的图。

图2：是导入了35S-Ch1.GSH1-pBI121的形质转化植物(2-16)和作为亲本植物的野生型植物(Col)中GSH1mRNA的RT-PCR的结果的电泳图像。而且，ACT1是被发现在该生长条件下构成性表达的对照基因。

图3：是表示野生型植物，导入了35S-Ch1.GSH1-pBI121的形质转化植物和导入了35S-cyt.GSH1-pBI121的形质转化植物中具有叶绿体移行信号肽的GSH1mRNA的定量RT-PCR的结果的图。

图4：是表示野生型植物，导入了35S-Ch1.GSH1-pBI121的形质转化植物和导入了35S-cyt.GSH1-pBI121的形质转化植物中所有GSH1mRNA的定量RT-PCR的结果的图。

图5：是表示野生型植物，导入了35S-Ch1.GSH1-pBI121的形质转化植物和导入了35S-cyt.GSH1-pBI121的形质转化植物中导入的35S-GSH1-pBI121来源(35S-Ch1.GSH1-pBI121或35S-cyt.GSH1-pBI121)的GSH1mRNA的定量RT-PCR的结果的图。

图6：是表示野生型植物，导入了35S-Ch1.GSH1-pBI121的形质转化植物和导入了35S-cyt.GSH1-pBI121的形质转化植物中宿主基因组来源的GSH1mRNA的定量的RT-PCR的结果的图。

图7：是以野生型植物(Col-0)的基因组来源的GSH1mRNA量为1以相对值表示导入了35S-cyt.GSH1-pBI121的形质转化植物(35S-cyt.GSH11-1，2-7，3-6)中35S-GSH1-pBI121来源的GSH1mRNA量的图。

图8：是表示野生型植物和导入了35S-cyt.GSH1-pBI121的形质转化植物中GSH1基因产物的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性的图。

图9：是表示生长的光强度变化时的导入了35S-Ch1.GSH1-pBI121的形质转化植物中内源谷胱甘肽量的变化的图。

图10：是表示导入了35S-cyt.GSH1-pBI121的形质转化植物中内源谷胱甘肽量的图。

图11：是拟南芥(Col-0，35S-cyt.GSH1)的植物体的照片。

图12：是对22℃，长日照条件下生长的拟南芥(Col-0，35S-Ch1.GSH12-16，35S-cyt.GSH11-1，2-7，3-6)的地上部分生物量(种子以外)(A)，种子重量(B)，收获指数(C)和地上部分生物量(D)进行比较的图。

图13：A是表示导入了35S-cyt.GSH1-pBI121的形质转化植物(35S-cyt.GSH1(2-7))和导入了35S-5’UTRcyt.GSH1-pBI121的形质转化植物中的来自于35S-GSH1-pBI121(35S-cyt.GSH1-pBI121或35S-5’UTRcyt.GSH1-pBI121)的GSH1mRNA的定量RT-PCR的结果的图。B是表示同植物中宿主基因组来源的GSH1mRNA的定量RT-PCR的结果的图。以35S-cyt.GSH1(2-7)的GSH1mRNA量作为1，用相对值表示。

图14：A是表示大肠杆菌来源GSH1基因的克隆用引物和限制性酶位点的图，B是表示用于转化的构建体的图。

图15：是表示mRNA的稳定性由于插入GSH1基因的5’非翻译区域而提高的植物的生长和生产性比Col有所提高的图。

图16：是表示使大肠杆菌来源的GSH1在拟南芥中表达，使之局部存在于叶绿体时的植物的样子的图。

图17：是表示使大肠杆菌来源的GSH1在拟南芥中表达，使之局部存在于细胞质时的植物的样子的图。

图18：是表示生长时的光强度设定在200μE/m²/s时的植物的生长性和种子收量的图。

图19：是表示栽种密度和每个个体的生长性和种子收量之间的关系的图(数值是相对值)。

图20：是表示通过GSH1基因导入可以抑制取决于栽种密度的生物量，种子收量和收获指数的降低的图。

图21：是表示表达GSH1的植物的单位面积的收量和种子量的差异的图。

图22：是表示野生型植物的栽种密度和种子收量的关系的图。

图23：是表示提高谷胱甘肽结合型醛缩酶的表达时的GSH1基因的导入效果的图。

图24：是表示提高谷胱甘肽结合型醛缩酶的表达时的GSH1基因的导入效果的图。

图25：表示导入了35S-cyt.GSH1-pBI121的菊花的每个钵中的总花数。

具体实施方式

本发明提供了具有使γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性水平增加的变异，而且通过在比使单位面积的生物量和种子收获量充分提高的栽种密度更高的栽种密度下栽培，单位面积的生物量或种子收获量比亲本植物进一步增加的植物。

而且，本发明提供了具有使γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的表达水平增加的变异，而且通过在比使单位面积的生物量和种子收获量充分提高的栽种密度更高的栽种密度下栽培，单位面积的生物量或种子收获量比亲本植物进一步增加的植物。

本发明涉及的植物通过在比使单位面积的生物量和种子收获量充分提高的栽种密度更高的栽种密度下栽培，花数、种子数和种子重量中的至少一个比亲本植物增加。

“栽种密度”是指单位面积中栽种的个体数。通常，培育植物时，按合适的间隔栽种幼苗和树苗，间苗。这是因为，个体的栽种密度一旦提高，则每个个体的生物量生产性降低，每单位面积的生物量生产性达到顶点。这样，存在与植物的单位面积的生物量生产性相适应的栽种密度，以超过该密度的密度栽种导致相对于种子和幼苗的购入费用而收获物量降低，因此不优选。本发明中所谓“使单位面积的生物量和种子收获量充分提高的栽种密度”是指各品种中最合适的栽种密度(即，单位面积的生物量生产性达到最大的最合适的栽种密度)。而且，尽管植物的每个品种所最适的栽种密度并不相同，但本领域技术人员可以容易地了解相应与所使用的植物的最适的栽种密度。本发明涉及的植物在以比使单位面积的生物量和种子收获量充分提高的栽种密度更高的栽种密度栽培时，单位面积的生物量或种子收获量比亲本植物/野生型植物进一步增加。但是，栽培本发明涉及的植物时的栽种密度不需要限于比上述最适栽种密度更高的情况，优选为各品种中最适的栽种密度的30％以上，更优选在60％以上，更为优选100％以上。

本发明中，所谓“γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性”是指催化使谷氨酸与半胱氨酸在γ位形成酰胺键的反应的活性。

γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性水平，可以例如，采取通过氮取代等方式进行的氧化防止措施，将破碎的植物体进行离心分离而获得的上清作为试样，在含有半胱氨酸，谷氨酸和ATP的反应液中添加试样后，作为一定时间内合成的γ-谷氨酰半胱氨酸量求得。此外，还可以通过定量伴随该反应生成的磷酸量来求得。

“γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性水平增加”是指活性水平高于同一种亲本植物的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性水平。优选与在同一条件下栽种的同一种亲本植物的同一部位的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性水平相比，活性水平在1.1倍以上时判断为活性水平增加，更优选通过t检验存在5％水平的显著差异时判断为活性水平增加。而且，亲本植物的活性水平必须用相同方法同时测定。

本发明中，所谓“γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的表达水平”是指γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶mRNA的量或γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶蛋白质的量。

作为测定γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶mRNA水平的方法，如果是可以测定特定mRNA水平的方法，则无特别限定，可以从公知方法中适当选择。具体可以例举例如RT-PCR法，实时RT-PCR法，Competitive PCR法，Northern blot法，原位杂交法，原位PCR法，DNA阵列法等。

作为测定γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶蛋白质水平的方法，如果是可以测定特定蛋白质水平的方法，则无特别限定，可以从公知方法中适当选择。具体可以例举例如使用与测定对象的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶蛋白质特异性结合的抗体。作为使用抗体测定蛋白质水平的公知方法，可以例举例如radio imuno assay(RIA)法，ELISA法(固相酶免疫测定法)，western blot法，免疫沉淀法，免疫组织化学法，抗体阵列法等。

所谓“γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的表达水平增加”是指mRNA或蛋白质水平高于同一种亲本植物的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的表达水平。优选与在同一条件下栽种的同一种亲本植物的同一部位的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶表达水平相比，表达水平在1.1倍以上时判断为表达水平增加，更优选通过t检验存在5％水平的显著差异时判断为表达水平增加。而且，优选亲本植物的表达水平用相同方法同时测定，而且可以使用积累的数据作为背景数据。

本发明中所称“花数”是指1个个体或单位面积中所种植的植物上形成的花数。

而且，所谓“种子数”是指1个个体或单位面积中所种植的植物上形成的种子数。

所谓“花数增加”是指与相同栽培条件下栽培的同一种亲本植物的花数相比增加。而且，所谓“种子数增加”是指与相同栽培条件下栽培的同一种亲本植物的种子数相比增加。

如果花数增加，例如，以观赏花作为目的的观叶植物的价值则升高。而且，由于花数增加与果实增加相关，因此利用果实的植物的价值也升高。而且，如果种子数增加，则利用种子的植物的价值升高。

γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性水平增加的植物可以通过以下方式获得，例如，在目标植物中用公知的变异导入法随机导入变异，从中筛选出γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性水平增加的个体。

同样，γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶表达水平增加的植物也可以通过以下方式获得，在从随机导入了变异的植物组中筛选出γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶表达水平增加的个体。

在植物中随机导入变异的方法没有特别限定，可以适当选择公知的方法进行使用。具体可以例举例如用化学物质(例如，EMS，NTG等)处理种子的方法，利用放射线的方法，利用转座子的方法，利用T-DNA的方法，通过基因枪物理导入的方法等。

γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性水平增加的个体的筛选中，可以使用上述γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性水平的测定方法。同样，γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶表达水平增加的个体的筛选中，可以使用上述γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶表达水平的测定方法。

此外，如果γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶表达水平增加，则通常，与之相随，γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性水平增加。因此，可以容易地理解γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶表达水平增加的植物也相当于γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性水平增加的植物。

迄今为止，以及就获得内源性的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的活性水平，或者表达水平增加的变异体的方法进行了说明，但γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的活性水平或表达水平增加的植物可以通过导入编码植物来源的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的多核苷酸来获得。也就是说，本发明提供了导入了编码植物来源的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的多核苷酸且花数和种子数中的至少一个增加的形质转化植物。以下，就本发明涉及的形质转化植物和本发明涉及的使植物的花数和种子数中的至少一个增加的方法进行说明。

此外，在本说明书中使用时，用语“多肽”可以与“肽”或“蛋白质”交换使用。而且，在本说明书中使用时，用语“多核苷酸”可以与“基因”“核酸”或“核酸分子”交换使用，是指核苷酸聚合物。

可以在本发明中使用的编码γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的多核苷酸(以下记为“GSH1基因”。)如果是植物来源则没有特别限定。优选为宿主植物本身具有的GSH1基因，但也可以适当使用来源于与宿主植物不同的植物的GSH1基因。

这里，可以在本发明中使用的植物来源的GSH1基因的翻译产物在具有叶绿体移行信号肽时，确认了本发明涉及的形质转化植物除了花数和种子数中的至少一个增加之外，生物量和种子收量也增加了。另一方面，可以在本发明中使用的植物来源的GSH1基因的翻译产物在不具有叶绿体移行信号肽时，发现本发明涉及的形质转化植物除了花数和种子数中的至少一个增加之外，收获指数也提高了。这些表现型的特点在下文进行说明。

植物来源的GSH1基因编码的蛋白质通常含有叶绿体移行信号肽。所以，植物来源的GSH1基因产物，即γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶通常存在于叶绿体中。另一方面，不具有叶绿体移行信号肽的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶无法向叶绿体移行。

本说明书中所谓“不具有叶绿体移行信号肽的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶”是指不存在正常行使功能的叶绿体移行信号肽的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶，例如，包括原来存在的叶绿体移行信号肽区域全部缺失，一部分缺失而丧失叶绿体移行功能，由于氨基酸的取代或添加而丧失叶绿体移行功能，原本不具有叶绿体移行信号肽等。

因此，编码不具有叶绿体移行信号肽的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的GSH1基因需要作为例如编码叶绿体移行信号肽的区域发生缺失的变异GSH1基因进行人工制备。

作为本发明中可以使用的合适的GSH1的基因的1种，可以例举本发明人使用的拟南芥的GSH1基因(TAIR登录基因：2127172，名称AT4G23100.1)。拟南芥的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶由序列号1所示的氨基酸序列构成，编码其的基因(全长cDNA)由序列号5所示的碱基序列构成。序列号5所示的碱基序列中，第172-174位为启始密码子，第1738位-1740位为终止密码子。也就是说，拟南芥GSH1基因，序列号5所示的碱基序列中，具有第172-1740位的开放性阅读框(ORF)。序列号2所示的碱基序列是拟南芥GSH1基因的ORF的碱基序列。

而且，拟南芥的GSH1基因产物(序列号1所示的氨基酸序列构成的多肽)，如果使其自N末端起的73个氨基酸缺失，本发明人发现γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶不向叶绿体移行而存在于细胞质中。因此，可以例举由序列号3所示的氨基酸序列构成的多肽作为不具有叶绿体移行信号肽的拟南芥的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶，编码其的基因由序列号4所示的碱基序列构成。但是，缺失的氨基酸不限于自N末端起的73个氨基酸，只要在叶绿体移行信号肽的功能丧失的前提下，可以进行适当选择。本领域技术人员使用公知技术可以容易地确认进行怎样的改变叶绿体移行信号肽的功能是否丧失。

作为拟南芥以外的植物来源的GSH1基因，已知有例如百日草(Genbank登录号：AB158510)，稻(Genbank登录号：AJ508915)，烟草(Genbank登录号：DQ444219)等，这些都可以在本发明中适当使用。这些基因的翻译产物与拟南芥一样，在N末端区域中具有叶绿体移行信号肽。

而且，由在序列号1或3所示的氨基酸序列中缺失，取代或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列构成，且编码具有γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性的多肽的多核苷酸也可以在本发明中适当使用。

这其中所谓的“缺失，取代或添加了1个或多个氨基酸”是指缺失，取代或添加了通过定点诱变法等公知的变异肽制备法可以缺失，取代或添加的程度的数目(优选10个以下，更优选7个以下，更优选5个以下)的氨基酸。这种变异蛋白质不限于具有通过公知的变异多肽制备法人为导入的变异的蛋白质，还可以是分离纯化的天然存在的蛋白质。

本领域周知的是，蛋白质的氨基酸序列中的几个氨基酸可以以对该蛋白质的结构或功能没有显著影响的容易地进行改变。而且，公知的是，不仅有人为进行改变的变异体，而且还存在天然蛋白质中该蛋白质的结构或功能不发生显著变化的变异体。

优选的变异体具有保守性或非保守性氨基酸取代，缺失或添加。优选的是沉默取代，添加和缺失，特别优选的是保守性取代。这些都不会使本发明涉及的多肽活性发生变化。

被认为是代表性的保守性取代的为以下取代：脂肪族氨基酸Ala，Val，Leu和Ile中的1个氨基酸向其它氨基酸的取代，羟基残基Ser和Thr的交换，酸性残基Asp和Glu的交换，氨基残基Asn和Gln之间的取代，碱性残基Lys和Arg的交换，以及芳香族残基Phe，Tyr之间的取代。

而且，本发明中，只要可以编码具有γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性的蛋白质，还可以使用在严紧条件下与由序列号2或4所示的碱基序列构成的多核苷酸杂交的多核苷酸。这种多核苷酸包括例如由序列号1中所示的氨基酸中缺失，取代或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的多肽的多核苷酸。

本发明中所谓“严紧条件”是指只是在序列之间存在至少90％的同一性，优选至少95％的同一性，最优选至少97％的同一性时才发生杂交。具体可以例举例如在杂交溶液(含50％甲酰胺，5×SSC(150mM的NaCl，15mM的柠檬酸三钠)，50mM的磷酸钠(pH7.6)，5×Denhert液，10％硫酸葡聚糖和20μg/ml的变性剪切鲑精子DNA)中于42℃温育过夜后，约65℃在0.1×SSC清洗过滤器的条件。

杂交可以按Sambrook等人在分子克隆，实验室手册第三版，冷泉港实验室(2001)中记载的方法进行。通常，温度越高，盐浓度越低的严紧度越高(更难杂交)。可以获得同源性更高的多核苷酸。

氨基酸序列和碱基序列的同一性可以用Karlin和Altschul的算法BLAST(Karlin S，Altschul SF，Proc。Natl.Acad.Sci.USA，87：2264-2268(1990)；Karlin S，Altschul SF，Proc。Natl.Acad.Sci.USA，90：5873-5877(1993))来决定。现已开发了基于BLAST的算法的称为BLASTN和BLASTX的程序(Altschul SF等人，J.Mol.Biol.，215：403(1990))。

可以在本发明中使用的GSH1基因，可以是来源于基因组DNA，也可以来源于cDNA，也可以是化学合成DNA。而且也可以是RNA。

作为获得可以在本发明中使用的GSH1基因，可以例举通过公知的技术分离并克隆编码γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的DNA片段的方法。例如，可以制备与编码拟南芥的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的DNA的碱基序列的一部分特异性杂交的探针，筛选基因组DNA文库和cDNA文库。

或者，作为或者可以在本发明中使用的GSH1基因，可以例举使用PCR等扩增手段的方法。例如，通过从编码拟南芥的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的cDNA中5’侧和3’侧的序列(或者其互补序列)中分别制备引物，使用这些引物，以基因组DNA(或者cDNA)作为模板进行PCR等，扩增两条引物间所夹的DNA区域，可以大量获得可以在本发明中使用的编码γ-谷氨酰半胱氨酸的DNA片段(GSH1基因)。

可以在本发明中使用的GSH1基因可以以合适的植物的组织或细胞作为供给源来获得。由于所有的植物具有GSH1基因，因此可以以所希望的植物作为供给源来获得GSH1基因。

本发明中，作为在植物中导入GSH1基因的方法，可以适当使用构建在编码γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的DNA的上游连结在植物细胞中行使功能的启动子，在下游连结在植物细胞中行使功能的终止子的重组表达载体，再导入于植物中的方法。

后述的实施例中，作为在植物细胞中行使功能的启动子，使用构成型表达的花椰菜花叶病毒35S启动子，但不限于此。作为花椰菜花叶病毒35S启动子以外的构成型启动子，可以例举稻的肌动蛋白启动子，玉米的泛素等，这些启动子也可以在本发明中适当使用。

作为构成型启动子以外的启动子，可以例举rbsS启动子，Cab启动子等的绿叶组织特异的启动子和HSP70启动子等诱导性启动子，但不限于此。而且，在叶绿体的基因组中直接插入时的启动子，可以例举rbcL启动子等，但如果是在叶绿体中行使功能的启动子，就不限于此。

作为在植物细胞中行使功能的终止子，可以例举胭脂碱合成酶(NOS)基因来源的终止子，花椰菜花叶病毒来源的终止子等。

可以在植物的转化时使用的重组表达载体，如果是可以使插入基因在植物细胞内表达的表达载体，则没有特别限定。尤其是，在载体导入于植物体中的方法为采用农杆菌的方法时，优选使用pBI系统等二元载体。作为二元载体，可以例举例如pBIG，pBIN19，pBI101，pB121，pBI221等。

本发明中的转化的对象植物，也指植物体整体，植物器官(例如，叶，花瓣，茎，根，种子等)，植物组织(例如表皮，韧皮部，薄壁组织，木质部，维管束，栅栏组织，海绵状组织等)或植物培养细胞，或各种形态的植物细胞(例如，悬浮培养细胞)，原生质体，叶的切片，愈伤组织等中的任意一种。作为可以在转化时使用的植物，没有特别限定，可以适当选择可使用的GSH1基因能够表达的植物。

这其中，使用拟南芥的GSH1基因时，转化的对象植物为与拟南芥近缘的油菜科的植物是合适的，但不限于此。例如，据报道烟草，杨树，柠檬等可以用拟南芥的基因制作形质转化植物。我们认为，如果按照(Franke R，McMichael CM，Meyer K，Shirley AM，Cusumano JC，ChappleC.(2000)Modified lignin in tobacco and poplar plants over-expressing theArabidopsis gene encoding ferulate 5-hydroxylase.Plant J.22：223-234；PenaL，Martin-Trillo M，Juarez J，Pina JA，Navarro L，Martinez-ZapaterJM.(2001)Constitutive expression of Arabidopsis LEAFY or APETALA1gene in citrus reduces their generation time.Nat Biotechnol.19：263-267)，在上述植物中导入拟南芥的GSH1基因，则可以制作出花数和种子数中的任意一个增加的各种形质转化植物。

在植物细胞中导入重组表达载体时，可以使用本领域公知的转化方法(例如，农杆菌法，粒子枪法，聚乙二醇法，电穿孔法等)。例如，在使用农杆菌法时，在适当的农杆菌(根农杆菌(Agrobacterium tumefaciens))中导入所购建的植物用表达载体，按照叶盘法(内宫博文著，植物基因操作手册，1990，27-31pp，讲谈社Scientific，东京)等使之感染无菌培养叶片，可以获得形质转化植物。

而且，在使用粒子枪法时，可以直接使用植物体，植物器官，植物组织本身，也可以制备成切片后再使用，也可以是制成原生质体再使用。可以用基因导入装置(例如，PDS-1000(BIO-RAD公司)等)处理这样制备的试样。处理条件根据植物或试样而不同，但通常在450-2000psi左右的压力，4-12cm左右的距离进行。

导入了目的基因的细胞或植物组织，首先用卡那霉素抗性或潮霉素抗性等药物抗性标记进行选择，然后用常规方法再生成植物体。转化细胞向植物体的再生可以按照植物细胞的种类，用本领域技术人员公知的方法进行。

目的基因是否导入于植物的确认，可以通过PCR法，southern杂交法，Northern杂交法等方式进行。例如，从形质转化植物制备DNA，设计特异于导入的DNA的引物，进行PCR。然后，通过对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳或毛细管电泳等，用溴化乙锭等染色，检测目的扩增产物，可以确认被转化。

如果一旦获得在基因组中导入了GSH1基因的形质转化植物，则可以通过有性生殖或无性生殖从该植物体获得其后代。而且，还可以从该植物体及其后代或克隆中获得繁殖材料(例如，种子，原生质体等)，基于这些繁殖材料量产目标植物体。

通过以比使每单位面积的生物量和种子收获量充分提高的栽种密度更高的栽种密度下栽种如上述方式获得形质转化植物(即本发明涉及的形质转化植物)，花数和种子数中的至少一个比亲本植物(转化时使用的植物)相比有所增加。

本发明涉及的植物中，确认了具有叶绿体移行信号肽的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的表达水平增加，γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性增加的植物的花数和种子数中的至少一者比亲本植物有所增加，而且生物量和种子收量也增加了。作为这种植物，相当于具有叶绿体移行信号肽的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的表达量由于人工变异诱导，或者天然变异而增加的植物，以及导入了编码具有叶绿体移行信号肽的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的多核苷酸的形质转化植物。

本发明中所谓“生物量”是指植物个体的干燥重量。而且，所谓“种子收量是指”1个植物个体的所有重子的重量或单位面积的种子收量。

由于通过增加生物量，可以固定二氧化碳作为碳水化合物，因此可以获得有效减少大气中的CO₂量的效果，蔬菜的可使用部分增大的粮食增产的效果，在为树木等时纸等原料可以增产的效果等各种好处。而且，由于种子收量增加，可以实现作为粮食和能源作物的种子收量大幅增产，可以获得促进生产成本大幅减少这样的优点。

本发明中涉及的植物中，确认了表达不具有叶绿体移行信号肽的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的植物，花数和种子数中的至少一者比亲本植物有所增加，而且收获指数也提高了。作为这种植物，相当于通过人工变异诱导或者天然变异而表达原本的具有叶绿体移行信号肽的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶以及不具有叶绿体移行信号肽的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的植物，以及导入了编码不具有叶绿体移行信号肽的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的多核苷酸的形质转化植物。

本发明中所谓“收获指数”是指用(1个植物个体的总种子的重量)/(含有种子含量的该植物个体的干燥重量)计算得到的值。

通过增加收获指数，单位面积的种子收量增加，可以获得在营养素限制的土地等上特别有效地提高收获量这样的优点。

本发明涉及的形质转化植物，可以再导入编码谷胱甘肽结合型醛缩酶的多核苷酸(谷胱甘肽结合型醛缩酶基因)。本发明人已经发现导入了编码谷胱甘肽结合性醛缩酶的DNA的形质转化植物的成长性和病虫害抵抗性提高(WO2007/091634)。导入了谷胱甘肽结合型醛缩酶基因的形质转化植物的成长性提高，但其收获指数未必提高，其依赖于光条件。提高将GSH1基因与谷胱苷肽结合型醛缩酶基因一起导入，植物的收获指数和种子收量的提高效果进一步增强。阅读本说明书的本领域技术人员可以容易地理解导入谷胱甘肽结合型醛缩酶基因的方法可以按照上述GSH1基因的导入手段进行。

而且，在用于实施发明的最佳方式中所进行的具体的实施方式和以下的实施例始终是用于弄清楚本发明的技术内容，不应当只限定于这种具体例子而狭义地进行解释，本领域技术人员可以在本发明的精神和附加的权利要求的范围内进行变化来实施。

而且，本说明书中记载的学术文献和专利文献的所有内容都作为参考引入本说明书中。

实施例

以下，用实施例对本发明进行更详细的说明，本发明不限于这些实施例。

(1)使用植物

作为用于制备转化体的亲本植物，使用野生型拟南芥的Columbia(Col-0)。植物播种于在正方形的塑料罐(6.5×6.5×5cm)中从底部开始按2∶1∶1的比例按三层装入了蛭石(旭工业，冈山)，KUREHA培养土(クレハ(KUREHA)园艺培土，吴羽化学，东京)，蛭石的土壤中，在生长温度22℃，长日条件(16小时明期/8小时暗期)下生长。

(2)GSH1基因的克隆，GSH1基因的改变和GSH1转化体的制作

从3周大的拟南芥的野生型Columbia(Col-0)中分离总RNA，用Prostar first strand RT-PCR试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA，USA)合成cDNA。

如图1的A的上部分(Ch1.GSH1)所示，使用基于GSH1的cDNA序列设计的以下特异的引物，全长cDNA作为2个片段通过PCR进行扩增，将各个片段亚克隆到pGEM-T Easy载体(Promega，Madison，WI，USA)中。在引物GSH1_5’-3和GSH1_3’-2上分别插入向植物转化用二元载体pBI121中导入时所需的XbaI和SacI切断部位(以下所示的序列中下划线表示取代的碱基)。

[化1]

GSH1_5’-3：5’-GCTTTCTTCTAGATTTCGACGG-3’(序列号6)

GSH1_3’-3：5’-CCTGATCATATCAGCTTCTGAGC-3’(序列号7)

GSH1_5’-2：5’-ATGCCAAAGGGGAGATACGA-3’(序列号8)

GSH1_3’-2：5’-GGAGACTCGAGCTCTTCAGATAG-3’(序列号9)

在KpnI切断部位融合2个片段，构建出含有全长cDNA的载体(Ch1.GSH1-pGEM)。用限制性酶XbaI和SacI处理Ch1.GSH1-pGEM后，用该片段取代二元载体pBI121的花椰菜花叶病毒的35S启动子的下游的编码β-葡糖苷酸酶(GUS)的区域，制备出用于制作形质转化植物的构建体(35S-Ch1.GSH1-pBI121)(参照图1的B)。

在拟南芥基因组上只存在1拷贝的GSH1，含有向叶绿体的移行信号。因此，为了使GSH1基因产物(γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶)在细胞质中累积，因此制作用于使去掉推定为叶绿体移行信号的N末端73个氨基酸，将N末端起的第74位的丙氨酸残基取代为蛋氨酸残基的蛋白质表达的构建体(35S-cyt.GSH1-pBI121)。首先，以下所示的N末端起的第74位的丙氨酸残基取代为蛋氨酸残基，其上游插入了XbaI切断部位的(碱基取代部位用下划线表示)的引物GSH1(cyt.)_5’和上述GSH1_3’-3进行PCR(参照图1的A中部)，用限制性酶XbaI和KpnI处理片段后，亚克隆到pBluescript载体(Stratagene，La Jolla，CA，USA)中(cyt.GSH1-pBS)。

[化2]

GSH1(cyt.)_5’：5’-AGGGCATCTAGAGACCATGGCAAGTCC-3’(序列号10)

用限制性酶XbaI和KpnI处理cyt.GSH1-pBS后，将片段取代35S-Ch1.GSH1-pBI121的GSH1的XbaI-KpnI片段，制成35S-cyt.GSH1-pBI121(参照图1的B)。

此外，为了提高GSH1基因的mRNA的稳定性，制备具有GSH1基因的64bp的5’非翻译区的35S-5’UTRcyt.GSH1-pBI121。首先，将Ch1.GSH1-pGEM上的XbaI-NcoI片段取代cyt.GSH1-pBS上的XbaI-NcoI片段(5’UTRcyt.GSH1-pBS)。用限制性酶XbaI和KpnI处理后，将片段取代35S-Ch1.GSH1-pBI121上的XbaI-KpnI片段，制成35S-5’UTRcyt.GSH1-pBI121(参照图1的B)。

而且，为了制备在植物内过剩积累大肠杆菌来源的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的形质转化植物，从大肠杆菌(DH5α)克隆GSH1基因，制备转化用构建体(35S-EcGSH1-pBI121)。预测这种构建体在细胞质中累积。因此，为了在叶绿体中累积大肠杆菌来源的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶，还制作了在大肠杆菌的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的N末端上融合了含有推定为拟南芥的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的叶绿体移行信号肽的区域的N末端89个氨基酸的构建体(35S-Ch1.EcGSH1-pBI121)。首先，以大肠杆菌(DH5α)作为模板，如图14的A的上部分(EcGSH1)所示，分别使用基于大肠杆菌GSH1的碱基序列(GenBank登录号：X03954)设计的以下特异的引物EcGSH1_F1和EcGSH1_R1以及EcGSH1_F2和EcGSH1_R2，全长GSH1基因作为2个片段通过PCR扩增，用限制性酶XbaI或SacI处理片段后，亚克隆到pBluescript载体(Stratagene，LA Jolla，CA，USA)中(EcGSH1_FR1-pBS和EcGSH1_FR2-pBS)。在引物EcGSH1_FR1中插入向植物转化用二元载体pBI121导入时必需的XbaI和叶绿体移行信号插入所必需的Hinc II切断部位。而且，为了将起始密码子由亮氨酸取代为蛋氨酸残基而导入碱基取代。在引物EcGSH1_R2中插入向植物转化用二元载体pBI121导入时必需的SacI切断部位(以下所示的序列中下划线表示取代的碱基)。

[化3]

EcGSH1_F1：5’-TTTGACAGTCTAGAGTTGACTATGATCCCG-3’(序列号25)

EcGSH1_R1：5’-TTCCGATGGCGTTTTGATTGCC-3’(序列号26)

EcGSH1_F2：5’-TCGTTTGAGCGATCTCGGCTATACC-3’(序列号27)

EcGSH1_R2：5’-AATTTTGGGAGCTCACGAGTGGCC-3’(序列号28)

在SnaB I切断部位融合两个片段，构建出含有全长GSH1的载体(EcGSH1-pBS)。用限制性酶XbaI和SacI处理EcGSH1-pBS后，用片段取代二元载体pBI121的花椰菜花叶病毒的35S启动子下游的编码β-葡糖苷酸酶(GUS)的区域，制备出用于制作形质转化植物的构建体(35S-EcGSH1-pBI121)(图14的B)。

融合了叶绿体移行信号肽的构建体(35S-Ch1.EcGSH1-pBI121)是将含有用限制性酶HincII处理EcGSH1_FR1-pBS而获得的大肠杆菌GSH1基因的上游部分的片段与用限制性酶HincII处理含有前述的拟南芥GSH1基因的全长cDNA的Ch1.GSH1-pGEM的片段相融合(Ch1.EcGSH1_FR1-pGEM)。用限制性酶AvaI和SacI对其进行处理，插入EcGSH1-pBS的AvaI和SacI片段(Ch1.EcGSH1-pGEM)。用限制性酶XbaI和SacI处理Ch1.EcGSH1-pGEM后，将片段取代二元载体pBI121的花椰菜花叶病毒的35S启动子下游的编码β-葡糖苷酸酶(GUS)的区域，制备出形质转化植物用的构建体(35S-Ch1.EcGSH1-pBI121)(图14的B)。

用农杆菌法(Clough，S.J.and SH1-pB Bent，A.F.(1998)Floral dip：Asimplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsisthaliana.Plant J.16：735-743.)在Col-0中导入通过上述方式制备的35S-Ch1.GSH1-pBI121，35S-cyt.GSH1-pBI121，35S-5’UTRcyt.GSH1-pBI121，35S-EcGSH1-pBI121和35S-Ch1.EcGSH1-pBI121这五种表达载体，制备出形质转化植物。

具体而言，在含有选择标记卡那霉素的琼脂糖培养基(1/2倍的浓度的ムラシゲ一スク一グ培养基)上，反复进行筛选直至所有的种子显示出卡那霉素抗性的世代(不分离的世代)。而且，在筛选过程中，按3比1分离卡那霉素抗性的性状，确认表达载体至少导入于单一的染色体上。

(3)通过RT-PCR进行的对GSH1基因的表达量的分析

在导入了35S-Ch1.GSH1-pBI121的转化体中，如下述方式进行RT-PCR，研究GSH1基因的表达量。

首先，用RNeasy Plant Mini试剂盒(Qiagen Inc.，Valencia，CA，USA)从3周大的转化拟南芥的地上部分提取总RNA。用DNase I(Invitrogen)处理1μg的总RNA后，用Prostar first Strand RT-PCR试剂盒(Stratagene，La，jolla，CA，USA)进行cDNA。以1μgcDNA作为模板，在94℃2分钟，1个循环，94℃30秒，50℃30秒，72℃60秒，32个循环，72℃5分钟的条件下进行PCR。使用以下的GSH1_F7和GSH1_R2作为引物。使用被发现结构性表达的ACT1基因作为对照。ACT1的PCR，使用ACT1F和ACT1R的引物对，反应液与前述一样，在94℃2分钟，1个循环，94℃30秒，55℃30秒，72℃60秒，30个循环，72℃5分钟的条件下进行。用1.2％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物。

[化4]

GSH1_F7：5’-CTTGATATGATGCTCCGAAC-3’(序列号11)

GSH1_R2：5’-ATCATATAATAAACCCACCCAGAA-3’(序列号12)

ACT1F：5’-GATGATGCACCTAGAGCTGT-3’(序列号13)

ACT1R：5’-CTCCATGTCATCCCAATTGT-3’(序列号14)

结果示于图2。如图2清楚所示，确认了35S-Ch1.GSH12-16的GSH1的相对mRNA量比野生型(Col-0)的有所增加。

分别对导入了35S-cyt.GSH1-pBI121的形质转化植物的GSH1基因表达量，包括具有叶绿体移行信号的GSH1基因和缺失叶绿体移行信号肽的GSH1基因的所有GSH1基因，或者作为宿主的野生型基因组来源的GSH1基因和使用pBI121载体导入的GSH1基因的表达量定量调查，使用实时RT-PCR法。具体步骤如下。

用RNeasy Plant Mini试剂盒(Qiagen，Valencia，CA，USA)从2周的转化拟南芥的地上部分中提取总RNA。用QuantiTect ReverseTranscription(Qiagen，Valencia，CA，USA)由1μg的总RNA进行cDNA，用SYBR GREEN PCR Master Mix(Applied Biosystems，Warrington，WA14SR，UK)，通过ABI7700进行实时PCR。在1μl cDNA模板，1μl 20μM正向引物，1μl 20μM反向引物，9μl H₂O，12μl Master Mix的反应液中，在50℃2分钟，95℃10分钟，95℃15秒，60℃60秒，40个循环的条件下进行。使用被发现构成型表达的18S核糖体RNA作为内部对照。定量采用从以野生型Col-0分离的基因组DNA或转化时使用的质粒35S-Ch1.GSH1-pBI121作为模板的PCR产物获得的校正曲线进行计算。

所采用的引物序列和组合以及可以检测的mRNA的种类如下所示。

[化5]

cyt.GSH1_7S：5’-AATTGATTGCCGCGGCAAGTCC-3’(序列号15)

ch1.GSH1_7S：5’-CTATATATACCGCGGCGCTCTTGTC-3’(序列号16)

AtGSH1_R1：5’-CCAGAGGCAAGATAGGCAATG-3’(序列号17)

AtGSH1_R2：5’-CCTCACGCCACCCGAAACAA-3’(序列号18)

AtGSH1_F1：5’-TGCGGAGAAGCTCTTGGAGATG-3’(序列号19)

AtGSH1_F2：5’-CCGTGTTCGAAGAGCTGCTGTA-3’(序列号20)

AtGSH1_R3：5’-TTCCGGAGACTCGAATTCTTCAG-3’(序列号21)

Nos term_R2：5’-CCAAATGTTTGAACGATCGGGG-3’(序列号22)

18S_F：5’-TCCTAGTAAGCGCGAGTCATC-3’(序列号23)

18S_R：5’-CGAACACTTCACCGGATCAT-3’(序列号24)

ch1.GSH1_7S和AtGSH1_R2：含有叶绿体移行信号的GSH1mRNA

cyt.GSH1_7S和AtGSH1_R1：总GSH1mRNA(包括不含叶绿体移行信号的GSH1mRNA)

AtGSH1_F2和AtGSH1_R3：宿主基因组来源的GSH1mRNA

AtGSH1_F1和Nos term_R2：导入的表达载体来源的GSH1mRNA。

含叶绿体移行信号肽的GSH1mRNA的表达水平示于图3，总GSH1mRNA的表达水平示于图4，导入的表达载体来源的GSH1mRNA的表达水平示于图5，宿主基因组来源的GSH1mRNA的表达水平示于图6。而且，这些图中，数值均用按18S核糖体RNA量标准化的相对值表示。

如图4和图5清楚所示，35S-Ch1.GSH1(2-16)的GSH1的相对mRNA量比野生型(Col-0)增加了。与之相对，35S-cyt.GSH1(1-1，2-7和3-6)中，总GSH1的相对mRNA量基本没有变化(图4)，如图3和图6清楚所示，宿主基因组来源的GSH1的mRNA也基本没有变化。但是，如图5所示，确认了导入的35S-cyt.GSH1来源的GSH1mRNA只累积了少许，清楚了收获指数和种子收量提高(参照图12的B和C)。

图7表示以野生型(Col-0)中GSH1mRNA量(基因组GSH1mRNA)作为1，以相对值表示35S-cyt.GSH1(1-1，2-7和3-6)中的35S-cyt.GSH1来源的GSH1mRNA量。这表示通过按基因组来源的GSH1表达量的千分之一至数十分之一的次序使细胞质型GSH1表达可以提高收获指数(图12的C)。

在导入了35S-5’UTRcyt.GSH1-pBI121的形质转化植物的T2世代中，为了分别对野生型基因组来源的GSH1基因的表达量和使用pBI121载体导入的GSH1基因的表达量定量调查，使用实时RT-PCR法。将T2世代的种子播种于含有选择标记卡那霉素的琼脂培养基(1/2倍的浓度的ムラシゲ一スク一グ培养基)上，将呈现卡那霉素抗性的植物体移植到土壤中，生长1周后采集叶，提取总RNA。由1μg的总RNA合成cDNA，用SYBRGREEN PCR Master Mix(Applied Biosystems，Warrington，WA14SR，UK)，通过ABI7500进行实时PCR。具体的步骤与上述35S-cyt.GSH1-pBI121一样。

导入的表达载体来源的GSH1mRNA的表达水平和宿主基因组来源的GSH1mRNA的表达水平示于图13。数值用18S核糖体RNA量标准化，用以35S-cyt.GSH1(2-7)中的GSH1mRNA量作为1的相对值来表示。如图13所示，发现宿主基因组来源的GSH1的mRNA量几乎没有变化(图13的B)，而导入的35S-5’UTRcyt.GSH1来源的GSH1比35S-cyt.GSH1(2-7)的GSH1mRNA的累积量显著增加(图13的A)。这样就清楚了，通过插入GSH1基因的5’非翻译区域，植物体内的mRNA的稳定性提高了。而且，这些植物的生长和生产性比Col高(图15)。另一方面，可以使大肠杆菌来源的EcGSH1在叶绿体中表达(图16)，也可以使之在细胞质中表达(图17)，荚比野生型的短，或者变得不稔，发现了明显的种子收量的降低。

图18表示每罐中栽种3个个体，测量以22℃，长日(16小时明期/8小时暗期)，200μE/m²/s的光强度生长时的每个个体的地上部分生物量和种子收量，再计算出收获指数的结果。如图清楚所示，表明为了提高收获指数，重要的是适当选择GSH1的表达量根据生长时的光强度而变化的转化体，GSH1的表达量高的在生长时的光强度下种子收量高。

图19表示植物在22℃，长日(16小时明期/8小时暗期)，100μE/m²/s的光强度下生长时的栽种密度与每个个体的生长性和种子收量的关系。A表示每个植物个体的种子收量。B表示使单位区划(47.25cm²)的播种种子粒数发生变化而产生的地上部分生物量的状态差异。C表示使播种种子粒数发生变化时的地上部分生物量和种子收量的变化。C的左图表示每个植物个体的地上部分生物量和种子收量的变化，右图表示单位区划的地上部分生物量和种子收量的变化。如图所示，通常的植物其个体的栽种密度如果提高，每个个体的生物量降低，每单位面积的生物量生产性达到顶点。这种条件下导入了植物来源的GSH1的植物与野生型植物的生物量和种子收量的比较结果示于图20。A和B表示栽种密度分别在低时(每个单位区划(47.25cm²)0.5个个体)和高时(每个单位区划(47.25cm²)5个个体)的结果，每个单位区划的地上部分生物量(左图上部分)，种子收量(右图上部分)，收获指数(左图下部分)的相对于野生型Col的增加率。其表示由于导入植物来源的GSH1而导致的生物量和种子收量的增加，栽种密度越高越有效增加。即使是栽种密度提高使得每单位面积的收获量达到最大的作物，通过这样导入植物来源的GSH1基因可以有效增加其收获量。

图21中表示导入了植物来源的GSH1基因的植物中每单位面积的种子收量(A)，每单位面积的总生物量(B)的相对于野生型Col的增加率，C表示收获指数(种子收量/总生物量)。还清楚了在使GSH1在细胞质中表达时，种子数增加(图21)。而且，各个个体中获得的平均种子数与野生型1482个相对，35S-ch1.GSH12-16为1486个，35S-ch1.GSH12-7-1为2317个，35S-ch1.GSH13-6-1为1815个，相对于野生型的增加率分别为0.3％，56.3％，22.5％。

图22表示在长日(16小时明期/8小时暗期)，100μE/m²/s或200μE/m²/s下生长时的野生型植物的栽种密度与种子收量的关系。还清楚了在野生型植物中，每单位面积(47.25cm²)的栽种数为2-3时种子收量达到最大，以各个密度获得的种子收量用以最大值作为1的相对值来表示。图23和24所示的结果是以图22所示的栽种密度获得的结果，清楚了通过导入植物来源的GSH1基因，种子收获量的最大值上升。而且，该效果表示在导入了谷胱甘肽结合型醛缩酶(gFBA)的植物中效果进一步提高。图23和24的植物分别在100μE/m²/s和200μE/m²/s的光强度下生长。A表示每单位面积的种子收量，B表示每单位面积的总生物量，C表示收获指数。而且，gFBA的过剩表达体的制备按照WO2007/091634中记载的步骤。

图25中表示导入了35S-cyt.GSH1-pBI121的菊的每个钵中的总花数。100mL的KUREHA园艺培养土中的转化体移植到装满了2L的培养土(1L下层蛭石，0.5L中层园艺培养土，0.5上层蛭石)的钵中，每隔3-4周追肥3g的S604号。在温室中加温，设定在最低27℃，在自然日长下开花。按盆栽移植时期和苗的批次设计四个实验区。A和B在6月末移植，C和D表示在7月末移植时每个钵的总花数。自然日长下开花的菊，其开花数对应于移植时期，开花数有所不同，如图25所示，清楚了35S-cyt.GSH1植物的花数增加，本发明的效果不依赖于移植的时期。而且，对于35S-cyt.GSH1-pBI121的菊的转化体的制备，按照http://www.affrc.go.jp/ja/db/seika/data_flower/h13/flower01004.html中记载的步骤。

(4)γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-ECS)活性的测定

在含有0.2mM EDTA，10％丙三醇，10mM MgCl₂的50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中破碎3周大的拟南芥(Col-0，35S-Ch1.GSH12-16)的植物体，用Microcon YM-10(Amicon，Inc.，Beverly，MA，USA)从通过离心分离获得的上清中除去低分子，从而制成酶液。在反应液[120mMHEPES(pH8.0)，60mM MgCl2，6mM ATP，6mM PEP，6单位的丙酮酸激酶，5mM DTE，48mM L-谷氨酸盐，40mM L-半胱氨酸]中添加酶液，使之于30℃反应。反应通过添加L-半胱氨酸开始，通过添加三氯乙酸而停止。使用Microcon YM-3(Amicon，Inc.，Beverly，MA，USA)除去反应液的高分子后，用采用逆相C18柱的HPLC(Shiseido，Tokyo，Japan)分离，用model5200A Coulochem II electrochemical detector(ESA，Inc.，Chelmsford，MA，USA)测定γ-EC。移动相的组成为50mM磷酸钠monobasicmonohydrate(pH2.7)，1.0mM octanesulfonic acid，2.7％甲醇。

结果示于图8。清楚了，35S-Ch1.GSH1(2-16)中，GSH1基因产物γ-ECS活性大概为野生型的2倍。

(5)谷胱甘肽(GSH)定量

5-1方法1

在5％的三氯乙酸中破碎在25，50，100，200，500μE/m²/s的光条件下生长的3周大的拟南芥(Col-0，35S-Ch1.GSH12-16)的地上部分，在通过离心分离获得的上清中添加等量的二乙醚，进行悬浮，再去除乙醚层除去三氯乙酸。重复3次这样的操作后，通过离心蒸发器完全除去乙醚，再用于测定中。测定通过Ellman的方法(Ellman，G.L.(1959)Tissuesulfhydryl groups.Arch.Biochem.Biophys.82：70-77)通过谷胱甘肽还原酶-DTNB(5，5’-Dithiobis 2-nitrobenzonic acid)再循环法进行。在反应液[含有5mM EDTA，0.25mM NADPH，0.75单位谷胱甘肽还原酶的10mM磷酸钠缓冲液(pH7.5)]中添加提取液，添加5mM DTNB开始反应。根据412nm的吸光度增加的初速求出2-硝基-5-硫代苯甲酸的生成。总GSH量用标准物质根据制作的校正曲线进行计算。

结果示于图9。清楚了35S-Ch1.GSH1形质转化植物无论在哪一种光强度下，内源谷胱甘肽量都高于野生型。

5-2方法2

在液氮中将2周大的拟南芥(Col-0，35S-cyt.GSH11-1，2-7，3-6)的地上部分粉碎成粉末状后，添加10倍量的提取缓冲液(0.1M HCl∶(0.1MNaClO₄，0.1％H₃PO₄)＝1∶1)，在冰中融解，混合，离心分离。用MicroconYM-3(Amicon，Inc.，Beverly，MA，USA)除去反应液的高分子后，用采用逆相C18柱的HPLC(Shiseido，Tokyo，Japan)分离，用LaChrom UV-VISDetector L-7420(Hitachi，Japan)检测还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)。移动相的组成为0.1M NaClO₄，0.1％H₃PO₄，1％乙腈。谷胱甘肽量使用标准物质根据制作的校正曲线进行计算。

结果示于图10。35S-cyt.GSH1形质转化植物内的内源谷胱甘肽量与野生型相比几乎没有变化。

(6)种子收量，生物量的测定以及花数和种子数

拟南芥(Col-0，35S-Ch1.GSH12-16，35S-cyt.GSH11-1，2-7，3-6)播种于罐中，于22℃长日条件下使之生长。图11中表示播种后第33天的Col-0以及35S-cyt.GSH12-7和3-6的植物体的照片。根据图11清楚所示，35S-cyt.GSH12-7和3-6已经开花，而Col-0未开花。也就是说，清楚了35S-cyt.GSH1形质转化植物比亲本植物(Col-0)的成长速度快。

植物体抽薹，开花，在形成有限花序的前端部分形成种子，而在地上部分挂上果囊，回收种子和地上部分。干燥后，测定每个个体的种子和地上部分的重量(地上部分生物量)。

结果示于图12的A-D。图中的星号表示与Col野生型(亲本植物)相比，在统计学上存在显著差异。具体表示实施t-检测的结果为p＜0.05，显著。

图12的A是比较种子之外的地上部分生物量的图。发现35S-Ch1.GSH12-16与Col野生型(亲本植物)相比有增加倾向，但没有显著差异。但是，如图12的D所示，包括35S-Ch1.GSH12-16的种子的地上部分的生物量与Col野生型(亲本植物)相比显著增加。另一方面，35S-cyt.GSH1形质转化植物的生物量均与Col野生型(亲本植物)程度相同。图12的B是比较种子重量的图。35S-Ch1.GSH12-16和35S-cyt.GSH11-1与Col野生型(亲本植物)相比显著增加。图12的C是比较收获指数的图。收获指数用种子质量/地上部分生物量(种子之外)进行计算。收获指数与Col野生型(亲本植物)相比，35S-Ch1.GSH12-16，35S-cyt.GSH11-1，2-7显著增加，35S-cyt.GSH13-6也呈现增加倾向。

种子大小的平均值，与Col野生型(亲本植物)相比，按35S-Ch1.GSH12-16，35S-cyt.GSH13-6，2-7，1-1的顺序依次变小。因此，根据与收获指数的关系，各形质转化植物的每个个体的种子数与Col野生型(亲本植物)相比都出现大幅增加。

而且，由于拟南芥是无限花序，只要生长延续，就在茎顶分生组织中继续形成花芽。如上所述，35S-cyt.GSH1形质转化植物比亲本植物(Col-0)的生长速度快，由此表明同一时期获得的花数比亲本植物多。而且，还确认了35S-Ch1.GSH1形质转化植物与35S-cyt.GSH1一样，比亲本植物(Col-0)的生长速度快。

根据以上结果，表明35S-Ch1.GSH1形质转化植物的花数，种子数，生物量和种子质量均增加，其结果是收获指数增加。另一方面，还清楚了35S-cyt.GSH1形质转化植物的生物量没有大幅增加，花数，种子数和种子重量增加，其结果是收获指数增加。

根据本发明，可以使花数和种子数增加。其结果是起到了可以提供种子收量和收获指数提高的生产性高的植物这样的效果。

发明的详细的说明中所做的具体的实施方式或实施例，始终都是为了弄清楚本发明的技术内容，不应当狭义地解释为只限于这种具体例子，在本发明的精神和如下记载的权利要求的范围内，可以进行各种改变后来实施。

工业上利用的可能性

如果根据本发明，可以使植物的花数和种子数增加。因此，可以使鉴赏用草本花和粮食作物，以及森林和生物质能用植物资源中的花数和收量增加。因此，不仅在农林业，还可以在食品产业，能源产业等广泛的产业中利用。

序列表

<110>独立行政法人科学技术振兴机构

<120>种子收量提高的植物

<130>A181-20

<150>JP 2007-007464

<151>2007-01-16

<160>28

<170>PatentIn第3.1版

<210>1

<211>522

<212>PRT

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>1

Met Ala Leu Leu Ser Gln Ala Gly Gly Ser Tyr Thr Val Val Pro Ser

1 5 10 15

Gly Val Cys Ser Lys Ala Gly Thr Lys Ala Val Val Ser Gly Gly Val

20 25 30

Arg Asn Leu Asp Val Leu Arg Met Lys Glu Ala Phe Gly Ser Ser Tyr

35 40 45

Ser Arg Ser Leu Ser Thr Lys Ser Met Leu Leu His Ser Val Lys Arg

50 55 60

Ser Lys Arg Gly His Gln Leu Ile Val Ala Ala Ser Pro Pro Thr Glu

65 70 75 80

Glu Ala Val Val Ala Thr Glu Pro Leu Thr Arg Glu Asp Leu Ile Ala

85 90 95

Tyr Leu Ala Ser Gly Cys Lys Thr Lys Asp Lys Tyr Arg Ile Gly Thr

100 105 110

Glu His Glu Lys Phe Gly Phe Glu Val Asn Thr Leu Arg Pro Met Lys

115 120 125

Tyr Asp Gln Ile Ala Glu Leu Leu Asn Gly Ile Ala Glu Arg Phe Glu

130 135 140

Trp Glu Lys Val Met Glu Gly Asp Lys Ile Ile Gly Leu Lys Gln Gly

145 150 155 160

Lys Gln Ser Ile Ser Leu Glu Pro Gly Gly Gln Phe Glu Leu Ser Gly

165 170 175

Ala Pro Leu Glu Thr Leu His Gln Thr Cys Ala Glu Val Asn Ser His

180 185 190

Leu Tyr Gln Val Lys Ala Val Ala Glu Glu Met Gly Ile Gly Phe Leu

195 200 205

Gly Ile Gly Phe Gln Pro Lys Trp Arg Arg Glu Asp Ile Pro Ile Met

210 215 220

Pro Lys Gly Arg Tyr Asp Ile Met Arg Asn Tyr Met Pro Lys Val Gly

225 230 235 240

Thr Leu Gly Leu Asp Met Met Leu Arg Thr Cys Thr Val Gln Val Asn

245 250 255

Leu Asp Phe Ser Ser Glu Ala Asp Met Ile Arg Lys Phe Arg Ala Gly

260 265 270

Leu Ala Leu Gln Pro Ile Ala Thr Ala Leu Phe Ala Asn Ser Pro Phe

275 280 285

Thr Glu Gly Lys Pro Asn Gly Phe Leu Ser Met Arg Ser His Ile Trp

290 295 300

Thr Asp Thr Asp Lys Asp Arg Thr Gly Met Leu Pro Phe Val Phe Asp

305 310 315 320

Asp Ser Phe Gly Phe Glu Gln Tyr Val Asp Tyr Ala Leu Asp Val Pro

325 330 335

Met Tyr Phe Ala Tyr Arg Lys Asn Lys Tyr Ile Asp Cys Thr Gly Met

340 345 350

Thr Phe Arg Gln Phe Leu Ala Gly Lys Leu Pro Cys Leu Pro Gly Glu

355 360 365

Leu Pro Ser Tyr Asn Asp Trp Glu Asn His Leu Thr Thr Ile Phe Pro

370 375 380

Glu Val Arg Leu Lys Arg Tyr Leu Glu Met Arg Gly Ala Asp Gly Gly

385 390 395 400

Pro Trp Arg Arg Leu Cys Ala Leu Pro Ala Phe Trp Val Gly Leu Leu

405 410 415

Tyr Asp Asp Asp Ser Leu Gln Ala Ile Leu Asp Leu Thr Ala Asp Trp

420 425 430

Thr Pro Ala Glu Arg Glu Met Leu Arg Asn Lys Val Pro Val Thr Gly

435 440 445

Leu Lys Thr Pro Phe Arg Asp Gly Leu Leu Lys His Val Ala Glu Asp

450 455 460

Val Leu Lys Leu Ala Lys Asp Gly Leu Glu Arg Arg Gly Tyr Lys Glu

465 470 475 480

Ala Gly Phe Leu Asn Ala Val Asp Glu Val Val Arg Thr Gly Val Thr

485 490 495

Pro Ala Glu Lys Leu Leu Glu Met Tyr Asn Gly Glu Trp Gly Gln Ser

500 505 510

Val Asp Pro Val Phe Glu Glu Leu Leu Tyr

515 520

<210>2

<211>1569

<212>DNA

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>2

atggcgctct tgtctcaagc aggaggatca tacactgttg ttccttctgg agtttgttca 60

aaggctggaa ctaaagctgt tgtttcgggt ggcgtgagga atttggatgt tttgaggatg 120

aaagaagctt ttggtagctc ctactctagg agtctatcta ccaaatcaat gcttctccat 180

tctgttaaga ggagtaagag agggcatcaa ttgattgttg cggcaagtcc tccaacggaa 240

gaggctgtag ttgcaactga gccgttgacg agagaggatc tcattgccta tcttgcctct 300

ggatgcaaaa caaaggacaa atatagaata ggtacagaac atgagaaatt tggttttgag 360

gtcaatactt tgcgccctat gaagtatgat caaatagccg agcttcttaa tggtatcgct 420

gaaagatttg aatgggaaaa agtaatggaa ggtgacaaga tcattggtct gaagcaggga 480

aagcaaagca tttcacttga acctgggggt cagttcgagc ttagtggtgc acctcttgag 540

actttgcatc aaacttgtgc tgaagtcaat tcacatcttt atcaggtaaa agcagttgct 600

gaggaaatgg gaattggttt cttaggaatt ggcttccagc ccaaatggcg tcgggaggat 660

atacccatca tgccaaaggg gagatacgac attatgagaa actacatgcc gaaagttggt 720

acccttggtc ttgatatgat gctccgaacg tgtactgttc aggttaatct ggattttagc 780

tcagaagctg atatgatcag gaagtttcgt gctggtcttg ctttacaacc tatagcaacg 840

gctctatttg cgaattcccc ttttacagaa ggaaagccaa acggatttct cagcatgaga 900

agccacatat ggacagacac tgacaaggac cgcacaggaa tgctaccatt tgttttcgat 960

gactcttttg ggtttgagca gtatgttgac tacgcactcg atgtccctat gtactttgcc 1020

tacagaaaga acaaatacat cgactgtact ggaatgacat ttcggcaatt cttggctgga 1080

aaacttccct gtctccctgg tgaactgcct tcatataatg attgggaaaa ccatctgaca 1140

acaatattcc cagaggttcg gttgaagaga tacttggaga tgagaggtgc tgatggaggt 1200

ccctggagga ggctgtgtgc cctgccagct ttctgggtgg gtttattata tgatgatgat 1260

agtctccaag ctatcctgga tctgacagct gactggactc cagcagagag agagatgcta 1320

aggaacaaag tcccagttac tggcttaaag actcctttta gggatggttt gttaaagcat 1380

gtcgctgaag atgtcctgaa actcgcaaag gatggtttag agcgcagagg ctacaaggaa 1440

gceggtttct tgaacgcagt cgatgaagtg gtcagaacag gagttacgcc tgcggagaag 1500

ctcttggaga tgtacaatgg agaatgggga caaagcgtag atcccgtgtt cgaagagctg 1560

ctgtactaa 1569

<210>3

<211>449

<212>PRT

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>3

Met Ala Ser Pro Pro Thr Glu Glu Ala Val Val Ala Thr Glu Pro Leu

1 5 10 15

Thr Arg Glu Asp Leu Ile Ala Tyr Leu Ala Ser Gly Cys Lys Thr Lys

20 25 30

Asp Lys Tyr Arg Ile Gly Thr Glu His Glu Lys Phe Gly Phe Glu Val

35 40 45

Asn Thr Leu Arg Pro Met Lys Tyr Asp Gln Ile Ala Glu Leu Leu Asn

50 55 60

Gly Ile Ala Glu Arg Phe Glu Trp Glu Lys Val Met Glu Gly Asp Lys

65 70 75 80

Ile Ile Gly Leu Lys Gln Gly Lys Gln Ser Ile Ser Leu Glu Pro Gly

85 90 95

Gly Gln Phe Glu Leu Ser Gly Ala Pro Leu Glu Thr Leu His Gln Thr

100 105 110

Cys Ala Glu Val Asn Ser His Leu Tyr Gln Val Lys Ala Val Ala Glu

115 120 125

Glu Met Gly Ile Gly Phe Leu Gly Ile Gly Phe Gln Pro Lys Trp Arg

130 135 140

Arg Glu Asp Ile Pro Ile Met Pro Lys Gly Arg Tyr Asp Ile Met Arg

145 150 155 160

Asn Tyr Met Pro Lys Val Gly Thr Leu Gly Leu Asp Met Met Leu Arg

165 170 175

Thr Cys Thr Val Gln Val Asn Leu Asp Phe Ser Ser Glu Ala Asp Met

180 185 190

Ile Arg Lys Phe Arg Ala Gly Leu Ala Leu Gln Pro Ile Ala Thr Ala

195 200 205

Leu Phe Ala Asn Ser Pro Phe Thr Glu Gly Lys Pro Asn Gly Phe Leu

210 215 220

Ser Met Arg Ser His Ile Trp Thr Asp Thr Asp Lys Asp Arg Thr Gly

225 230 235 240

Met Leu Pro Phe Val Phe Asp Asp Ser Phe Gly Phe Glu Gln Tyr Val

245 250 255

Asp Tyr Ala Leu Asp Val Pro Met Tyr Phe Ala Tyr Arg Lys Asn Lys

260 265 270

Tyr Ile Asp Cys Thr Gly Met Thr Phe Arg Gln Phe Leu Ala Gly Lys

275 280 285

Leu Pro Cys Leu Pro Gly Glu Leu Pro Ser Tyr Asn Asp Trp Glu Asn

290 295 300

His Leu Thr Thr Ile Phe Pro Glu Val Arg Leu Lys Arg Tyr Leu Glu

305 310 315 320

Met Arg Gly Ala Asp Gly Gly Pro Trp Arg Arg Leu Cys Ala Leu Pro

325 330 335

Ala Phe Trp Val Gly Leu Leu Tyr Asp Asp Asp Ser Leu Gln Ala Ile

340 345 350

Leu Asp Leu Thr Ala Asp Trp Thr Pro Ala Glu Arg Glu Met Leu Arg

355 360 365

Asn Lys Val Pro Val Thr Gly Leu Lys Thr Pro Phe Arg Asp Gly Leu

370 375 380

Leu Lys His Val Ala Glu Asp Val Leu Lys Leu Ala Lys Asp Gly Leu

385 390 395 400

Glu Arg Arg Gly Tyr Lys Glu Ala Gly Phe Leu Asn Ala Val Asp Glu

405 410 415

Val Val Arg Thr Gly Val Thr Pro Ala Glu Lys Leu Leu Glu Met Tyr

420 425 430

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435 440 445

Tyr

<210>4

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<212>DNA

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

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atcattggtc tgaagcaggg aaagcaaagc atttcacttg aacctggggg tcagttcgag 300

cttagtggtg cacctcttga gactttgcat caaacttgtg ctgaagtcaa ttcacatctt 360

tatcaggtaa aagcagttgc tgaggaaatg ggaattggtt tcttaggaat tggcttccag 420

cccaaatggc gtcgggagga tatacccatc atgccaaagg ggagatacga cattatgaga 480

aactacatgc cgaaagttgg tacccttggt cttgatatga tgctccgaac gtgtactgtt 540

caggttaatc tggattttag ctcagaagct gatatgatca ggaagtttcg tgctggtctt 600

gctttacaac ctatagcaac ggctctattt gcgaattccc cttttacaga aggaaagcca 660

aacggatttc tcagcatgag aagccacata tggacagaca ctgacaagga ccgcacagga 720

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gatgtcccta tgtactttgc ctacagaaag aacaaataca tcgactgtac tggaatgaca 840

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gattgggaaa accatctgac aacaatattc ccagaggttc ggttgaagag atacttggag 960

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gagcgcagag gctacaagga agccggtttc ttgaacgcag tcgatgaagt ggtcagaaca 1260

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<210>5

<211>2036

<212>DNA

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>5

atgctccact gatcaacttt ctttcatttt tttatcagtt tctcatttct ctctcagtcg 60

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gtgtctctca atctccgtca agcttgacga atttcaggag ctatatatac catggcgctc 180

ttgtctcaag caggaggatc atacactgtt gttccttctg gagtttgttc aaaggctgga 240

actaaagctg ttgtttcggg tggcgtgagg aatttggatg ttttgaggat gaaagaagct 300

tttggtagct cctactctag gagtctatct accaaatcaa tgcttctcca ttctgttaag 360

aggagtaaga gagggcatca attgattgtt gcggcaagtc ctccaacgga agaggctgta 420

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caaacttgtg ctgaagtcaa ttcacatctt tatcaggtaa aagcagttgc tgaggaaatg 780

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gatatgatca ggaagtttcg tgctggtctt gctttacaac ctatagcaac ggctctattt 1020

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tggacagaca ctgacaagga ccgcacagga atgctaccat ttgttttcga tgactctttt 1140

gggtttgagc agtatgttga ctacgcactc gatgtcccta tgtactttgc ctacagaaag 1200

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aggctgtgtg ccctgccagc tttctgggtg ggtttattat atgatgatga tagtctccaa 1440

gctatcctgg atctgacagc tgactggact ccagcagaga gagagatgct aaggaacaaa 1500

gtcccagtta ctggcttaaa gactcctttt agggatggtt tgttaaagca tgtcgctgaa 1560

gatgtcctga aactcgcaaa ggatggttta gagcgcagag gctacaagga agccggtttc 1620

ttgaacgcag tcgatgaagt ggtcagaaca ggagttacgc ctgcggagaa gctcttggag 1680

atgtacaatg gagaatgggg acaaagcgta gatcccgtgt tcgaagagct gctgtactaa 1740

gaaaatggga cgtgaacaaa aggtgtctat aaacctttgg gtgtgagttt atgctatctg 1800

aagaattcga gtctccggaa taaggatttt tttttttgtt gtaatcggat tttaaaaact 1860

gattttgttt tagaaattcg aagcattgaa aagcagaaga aaaattgtat gtactaaacg 1920

atttcggtgt gggaaatcgt ttgggagggt gtgtttggat cttgaataaa ttacccattt 1980

ttcttgtcac aaatttgtct acatttaacg aaataactca aaactgattt caaggc 2036

<210>6

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>6

gctttcttct agatttcgac gg 22

<210>7

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>7

cctgatcata tcagcttctg agc 23

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>8

atgccaaagg ggagatacga 20

<210>9

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>9

ggagactcga gctcttcaga tag 23

<210>10

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>10

agggcatcta gagaccatgg caagtcc 27

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>11

cttgatatga tgctccgaac 20

<210>12

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>12

atcatataat aaacccaccc agaa 24

<210>13

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>13

gatgatgcac ctagagctgt 20

<210>14

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>14

ctccatgtca tcccaattgt 20

<210>15

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>15

aattgattgc cgcggcaagt cc 22

<210>16

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>16

ctatatatac cgcggcgctc ttgtc 25

<210>17

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>17

ccagaggcaa gataggcaat g 21

<210>18

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>18

cctcacgcca cccgaaacaa 20

<210>19

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>19

tgcggagaag ctcttggaga tg 22

<210>20

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>20

ccgtgttcga agagctgctg ta 22

<210>21

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>21

ttccggagac tcgaattctt cag 23

<210>22

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>22

ccaaatgttt gaacgatcgg gg 22

<210>23

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>23

tcctagtaag cgcgagtcat c 21

<210>24

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>24

cgaacacttc accggatcat 20

<210>25

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>25

tttgacagtc tagagttgac tatgatcccg 30

<210>26

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>26

ttccgatggc gttttgattg cc 22

<210>27

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>27

tcgtttgagc gatctcggct atacc 25

<210>28

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>28

aattttggga gctcacgagt ggcc 24

Claims

1、一种植物，其特征在于具有使γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性水平增加的变异，而且通过在比使每单位面积的生物量和种子收获量充分提高的栽种密度更高的栽种密度下进行栽培，每单位面积的生物量或种子收获量相比于亲本植物进一步增加。

2、一种植物，其特征在于具有使γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶表达水平增加的变异，而且通过在比使每单位面积的生物量和种子收获量充分提高的栽种密度更高的栽种密度下进行栽培，每单位面积的生物量或种子收获量相比于野生型植物进一步增加。

3、一种形质转化植物，其特征在于导入了编码植物来源的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的多核苷酸，而且通过在比使每单位面积的生物量和种子收获量充分提高的栽种密度更高的栽种密度下进行栽培，每单位面积的生物量或种子收获量相比于亲本植物进一步增加。

4、根据权利要求3所述的形质转化植物，其特征在于所述编码植物来源的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的多核苷酸的翻译产物具有叶绿体移行信号肽。

5、根据权利要求4所述的形质转化植物，其特征在于所述编码植物来源的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的多核苷酸选自于以下(a)-(d)：

(a)编码由序列号1所示的氨基酸序列构成的多肽的多核苷酸

(c)序列号2所示的碱基序列构成的多核苷酸

(d)与序列号2所示的碱基序列构成的多核苷酸在严紧条件下杂交的多核苷酸。

6、根据权利要求3所述的形质转化植物，其特征在于所述编码植物来源的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的多核苷酸的翻译产物不具有叶绿体移行信号肽，收获指数提高。

7、根据权利要求6所述的形质转化植物，其特征在于所述编码植物来源的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的多核苷酸选自于以下(e)-(h)：

(e)编码序列号3所示的氨基酸序列构成的多肽的多核苷酸

(g)由序列号4所示的碱基序列构成的多核苷酸

8、权利要求3所述的形质转化植物，其特征在于其还导入了编码谷胱甘肽结合型醛缩酶的多核苷酸。

9、一种使植物的花数和种子数中的至少一者增加的方法，其特征在于包括：在植物中导入编码γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的多核苷酸的工序，和在比使每单位面积的生物量和种子收获量充分提高的栽种密度更高的栽种密度下栽培导入了所述多核苷酸的植物的工序。

10、根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述编码γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的多核苷酸选自于以下的(a)-(h)：

(a)编码序列号1所示的氨基酸序列构成的多肽的多核苷酸

(c)序列号2所示的碱基序列构成的多核苷酸

(e)编码序列号3所示的氨基酸序列构成的多肽的多核苷酸

(g)由序列号4所示的碱基序列构成的多核苷酸