WO2012029727A1 - 光合成産物の生産性を向上させた藻類およびその利用 - Google Patents

光合成産物の生産性を向上させた藻類およびその利用 Download PDF

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glutathione
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小川　健一
正信 西川
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    • C12Y603/02—Acid—amino-acid ligases (peptide synthases)(6.3.2)
    • C12Y603/02002—Glutamate-cysteine ligase (6.3.2.2)

Definitions

  • the present invention relates to algae with improved productivity of photosynthetic products and use thereof, and specifically, algae with improved productivity of photosynthetic products, a method for producing the algae, and production of biomass using the algae. Regarding the method.
  • biofuels for example, bioethanol, biodiesel, etc.
  • corn and soybean are mainly used to produce biomass. Corn and soybeans are also used as food and feed. For this reason, rising prices of food and feed caused by a significant increase in biofuel production are regarded as problems.
  • biomass production by algae has attracted attention as a biomass production means that can replace corn and soybean (see, for example, Patent Document 1 and Patent Document 2).
  • Biomass production by algae has advantages such as not competing with food and feed, and being able to grow in large quantities.
  • Patent Document 3 describes a technique for producing fats and oils using a mutant lacking a cell wall in Chlamydomonas.
  • Non-Patent Document 1 reports that Chlamydomonas having a deficiency in a starch synthesis gene in addition to cell wall mutation (cw15) releases oil droplets made of oil and fat.
  • Non-Patent Document 2 reports that in the cell wall mutant of Chlamydomonas (cw15), the productivity of fats and oils is increased by disrupting the starch synthesis gene.
  • Non-Patent Document 3 is known as a report on mutations in Chlamydomonas cell walls.
  • Japanese Patent Publication Japanese Patent Laid-Open No. 11-196985 (published on July 27, 1999)” Japanese Patent Publication “Japanese Patent Laid-Open No. 2003-310288 (published on November 05, 2003)” International Publication No. 2009/153439 Pamphlet (released on December 23, 2009) Japanese Patent Gazette “Japanese Patent Laid-Open No. 2010-88334 (Released on April 22, 2010)”
  • the biomass production technology using algae as described above has a problem in terms of productivity.
  • a nutrient restriction process such as nitrogen starvation is required to induce the production and accumulation of biomass in algae.
  • nitrogen starvation is required to induce the production and accumulation of biomass in algae.
  • the present invention has been made in view of the above-described conventional problems, and an object of the present invention is to provide an algae that can improve biomass productivity and its use without performing a nutrient restriction step.
  • the present inventors have artificially increased the glutathione concentration in algal chloroplasts, resulting in nutrient limitation such as nitrogen starvation. It has been found that the productivity of biomass in algal cells can be improved without performing the process, and the present invention has been completed.
  • the alga according to the present invention is characterized in that the glutathione concentration in the chloroplast is increased.
  • the method for producing algae according to the present invention is a method for producing the algae described above, It includes a glutathione concentration increasing step for increasing the glutathione concentration in the algal chloroplast.
  • the biomass production method according to the present invention is characterized by using the algae according to the present invention or the algae produced by the algae production method according to the present invention.
  • the method for producing biomass according to the present invention is characterized by including a step of culturing algae in the presence of a substance that increases the glutathione concentration in the algal chloroplasts.
  • the alga according to the present invention can improve the productivity of the photosynthetic product in the algal cells without increasing the concentration of glutathione in the algal chloroplasts, even if it is not nitrogen-starved. For this reason, if the algae according to the present invention are used, it is not necessary to exchange for a culture solution containing no nitrogen for inducing accumulation of photosynthetic products. That is, according to the present invention, it is possible to easily and efficiently induce the accumulation of photosynthesis products. Therefore, according to the method for producing biomass according to the present invention, biomass can be produced from algae efficiently at a lower cost than in the past.
  • FIG. 1 The result of investigating the growth ability and the starch production ability of the GSH1 overexpressing strain prepared in Example 1 is shown, (a) is a graph showing the growth ability of the GSH1 overexpressing strain, and (b) is a culture start 309. It is a figure showing the state of the culture solution after time, (c) is a figure showing the result of the iodine starch reaction in the sample 4.
  • FIG. 1 The results of examining the growth ability and starch production ability of the parent strain (wild type strain) are shown, (a) is a graph showing the growth ability of the parent strain (wild type strain), and (b) is 215 hours after the start of culture. It is a figure showing the state of this culture solution.
  • (a) is a diagram showing a histogram of cells (particles) showing fluorescence derived from chlorophyll in the parent strain (wild type strain) of sample 8.
  • (B) is a figure showing the correlation with the magnitude
  • the result of investigating the state of the GSH1 overexpressing strain of sample 4 is shown, (a) is a diagram showing a histogram of cells (particles) showing fluorescence of chlorophyll in the GSH1 overexpressing strain of sample 4.
  • (b) It is a figure showing the correlation with the magnitude
  • (A) is a graph showing the change over time of particles showing fluorescence derived from chlorophyll in Sample 9 and Sample 10, that is, density of cells and particles not showing fluorescence derived from chlorophyll, ie, density of starch granules
  • (B) is a graph showing the change over time of the starch amount per culture solution in Sample 9 and Sample 10
  • (c) is the time course of the starch amount per cell in Sample 9 and Sample 10. It is a graph showing a change.
  • TEP normal and TP N-free in the legends of (b) and (c) mean “TAP medium containing nitrogen source” and “TAP medium not containing nitrogen source”, respectively.
  • A is a graph showing the change over time of the particles exhibiting chlorophyll-derived fluorescence in Sample 11 and Sample 12, that is, the density of cells and the particle not exhibiting chlorophyll-derived fluorescence, that is, the density of starch granules
  • B is a graph showing the change over time of the starch amount per culture solution in Sample 11 and Sample 12
  • (c) is the time course of the starch amount per cell in Sample 11 and Sample 12. It is a graph showing a change.
  • TEP normal and TP N-free in the legends of (b) and (c) mean “TAP medium containing nitrogen source” and “TAP medium not containing nitrogen source”, respectively.
  • A is a graph showing the change over time in the density of particles exhibiting chlorophyll-derived fluorescence and the density of particles not exhibiting chlorophyll-derived fluorescence in the GSH1 overexpressing strain and the parent strain (wild-type strain);
  • b) is a graph showing changes over time in the amount of starch per culture solution. It is a figure showing the result of the iodine starch reaction in a GSH1 overexpression strain and a parent strain (wild type strain).
  • FIG. 9 It is a figure showing the result of having investigated the growth ability of the GSH1 overexpression strain. The results of examining the state of the GSH1 overexpressing strain at each passage time are shown.
  • A shows the size of the GSH1 overexpressing strain at the time of “passage 1” shown in FIG. It is a figure showing the correlation with complexity
  • (b) is a figure showing the correlation between the size of the cell of the GSH1 overexpression strain when performing the "passage 2" shown in FIG. 9, and the complexity inside the cell.
  • C is a figure showing the correlation with the cell size of the GSH1 overexpression strain when performing "passage 3" shown in FIG. 9, and the complexity inside a cell.
  • (a) is a diagram showing a histogram of cells showing fluorescence derived from Nile red in the parent strain (wild type strain), and (b) is a GSH1 excess. It is a figure showing the histogram of the cell which shows the fluorescence derived from Nile red in an expression strain
  • (c) is a figure showing the observation result by the confocal laser microscope of the parent strain (wild type strain) dye
  • (d () Is a figure showing the observation result by the confocal laser scanning microscope of the NSH red stained GSH1 overexpression strain.
  • (a) is a diagram showing the correlation between the cell size of the GSH1 overexpressing strain and the complexity of the cell interior
  • (b) is the diagram of the GSH1 overexpressing strain. It is a figure showing the correlation with the magnitude
  • (c) is the size of a cell and the inside of a cell regarding the cell contained in the area
  • (d) is a figure showing the correlation with the magnitude
  • GSH1 overexpressing strain STA6 - background
  • STA6 - parent strain
  • STA6 - represents the result of state was examined for
  • (a) shows the parent strain - diagram showing the correlation between the cell size and complexity of the cell interior (STA6)
  • B) is a diagram showing the correlation between the cell size of the GSH1 overexpressing strain (sta6 - background) strain and the complexity of the inside of the cell.
  • GSH1 overexpression before 3 days after and after medium exchange culture (STA6 - background) and its parent strain (STA6 -) represents the results of examining the oil producing ability of
  • (a) shows the front GSH1 overexpressing strain after culture is a diagram representing the histogram of cells showing fluorescence from Nile Red in
  • FIG. 3 is a diagram showing a histogram of cells showing Nile red-derived fluorescence in the parent strain (sta6 ⁇ strain). It is a figure showing the result of having investigated the amount of chlorophyll of the GSH1 overexpression strain produced in Example 1.
  • a transformant of cyanobacteria, E. coli. c. gshA plus strain and E. coli. c. (a) shows the result of examining the absorption spectrum of pigments extracted from the gshA minus strain. c. It is a figure showing the absorption spectrum of a gshA plus strain, (b) c. It is a figure showing the absorption spectrum of a gshA minus strain, (c) c. From the spectrum of the gshA plus strain, c. It is a figure showing the spectrum which deducted the spectrum of the gshA minus strain.
  • (A) is a graph showing the change over time of particles showing fluorescence derived from chlorophyll in Sample 9 and Sample 10, that is, density of cells and particles not showing fluorescence derived from chlorophyll, ie, density of starch granules
  • (B) is a graph showing the change over time of the starch amount per culture solution in Sample 9 and Sample 10
  • (c) is the time course of the starch amount per cell in Sample 9 and Sample 10. It is a graph showing a change.
  • “TAP normal” and “TAP N-free” in the legends of (b) and (c) mean “TAP medium containing nitrogen source” and “TAP medium not containing nitrogen source”, respectively. .
  • (A) is a graph showing the change over time of the particles exhibiting chlorophyll-derived fluorescence in Sample 11 and Sample 12, that is, the density of cells and the particle not exhibiting chlorophyll-derived fluorescence, that is, the density of starch granules
  • (B) is a graph showing the change over time of the starch amount per culture solution in Sample 11 and Sample 12
  • (c) is the time course of the starch amount per cell in Sample 11 and Sample 12. It is a graph showing a change.
  • “TAP normal” and “TAP N-free” in the legends of (b) and (c) mean “TAP medium containing nitrogen source” and “TAP medium not containing nitrogen source”, respectively. .
  • the algae according to the present invention are not limited as long as the glutathione concentration in the chloroplast is increased, and other configurations are not limited, but are preferably algae in which the productivity of the photosynthesis product is improved.
  • the glutathione concentration in the chloroplast is increased means that the glutathione concentration in the chloroplast is higher than the glutathione concentration in the chloroplast of the same species of wild type algae. Means. When the glutathione concentration in the chloroplast is 1.1 times or more compared to the glutathione concentration in the chloroplast of the same species of wild-type algae grown under the same conditions, the glutathione concentration in the chloroplast increases. It is preferable to determine that the glutathione concentration in the chloroplast is increased when there is a significant difference of 5% by t-test. Note that the glutathione concentration in the chloroplasts of wild-type algae is preferably measured simultaneously by the same method, but data accumulated as background data may be used.
  • the concentration of glutathione in the algal chloroplast can be directly measured by a method in which roGFP2 is present in the chloroplast, which is a molecular probe that changes its color tone to reflect the redox state (see, for example, Meyer AJ, et al. (2007) Plan Journal 52: 973-986.
  • Redox-sensitive GFP in Arabidopsis thaliana is a quantitative biosensor for the redox potential of the cellular glutathione redox buffer.
  • Glutathione includes reduced glutathione (hereinafter referred to as “GSH”) and oxidized glutathione (hereinafter referred to as “GSSG”).
  • GSH reduced glutathione
  • GSSG oxidized glutathione
  • the concentration of either GSH or GSSG may be increased, and the concentrations of both GSH and GSSG may be increased.
  • the productivity of the photosynthetic product is improved means that the productivity of the photosynthetic product is higher than the productivity of the photosynthetic product of wild-type algae of the same species.
  • productivity of the photosynthetic product is 1.1 times or more compared to the productivity of the photosynthetic product of the same type of wild-type algae grown under the same conditions, it is judged that the productivity of the photosynthetic product is improved.
  • productivity of the photosynthetic product is improved when there is a significant difference of 5% in the t-test.
  • productivity can be evaluated from various viewpoints such as the conditions of light to be irradiated (light quantity, intensity, time, etc.), nutrients to be administered, whether or not a step of making a starved state per unit time is essential, and culture temperature. it can.
  • photosynthate refers to a substance that algae produces by carbon fixation by photosynthesis.
  • biomass such as sugars (eg, starch), fats and oils, and the like
  • Derivatives such as metabolites.
  • the carbon fixation by photosynthesis said here refers to the metabolism of the carbon compound generally using the chemical energy derived from light energy. Therefore, the origin of carbon taken into the metabolic system is not limited to inorganic compounds such as carbon dioxide, but also includes organic compounds such as acetic acid.
  • the “algae” is not particularly limited as long as it is algae having a photosynthetic ability and capable of generating a photosynthesis product.
  • examples of such algae include microalgae classified into the green alga class of the green algal plant family, and more specifically, Chlamydomonas reinhardtii and Chlamydomonas moebushii belonging to the genus Chlamydomonas of the green alga class.
  • Chlamydomonas moewusii Chlamydomonas moewusii
  • Chlamydomonas eugametos Chlamydomonas segnis, etc .
  • Donaliella salina Donaliella teral primolecta
  • Chlorella vulgaris belonging to the genus Chlorella of the green alga class, Chlorella pyrenoidosa, etc .
  • the method for obtaining algae having an increased glutathione concentration in the chloroplast is not particularly limited. This method will be specifically described in the section of “2. Method for producing algae according to the present invention” described later.
  • the algae according to the present invention in a chloroplast are ⁇ -glutamylcysteine synthetase (hereinafter sometimes referred to as “GSH1”), glutathione synthetase (hereinafter sometimes referred to as “GSH2”), ATP.
  • GSH1 ⁇ -glutamylcysteine synthetase
  • GSH2 glutathione synthetase
  • ATP ⁇ -glutamylcysteine synthetase
  • the expression level and / or activity of at least one protein selected from the group consisting of sulfurylase, adenosine 5′-phosphosulfate reductase, sulfite reductase, cysteine synthase and serine acetyltransferase is increased.
  • These proteins are enzymes involved in the glutathione biosynthetic system in the chloroplast, and it can be understood that an increase in the expression level thereof is an increase
  • the alga according to the present invention contains at least one protein selected from the group consisting of GSH1, GSH2, ATP sulfurylase, adenosine 5′-phosphosulfate reductase, sulfite reductase, cysteine synthase, and serine acetyltransferase.
  • An encoding polynucleotide may be introduced.
  • the algae into which such exogenous polynucleotide is introduced and overexpressed can be said to be algae in which the glutathione concentration in the chloroplast is increased.
  • the present invention encodes at least one protein selected from the group consisting of GSH1, GSH2, ATP sulfurylase, adenosine 5′-phosphosulfate reductase, sulfite reductase, cysteine synthase, and serine acetyltransferase. Therefore, it can be said that the present invention provides a transformed algae having an increased glutathione concentration in chloroplasts. Such transformed algae naturally have improved productivity of photosynthetic products.
  • the polynucleotide encoding the ⁇ -glutamylcysteine synthetase may be selected from the group consisting of the following (a) to (d): (A) a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; (B) a polynucleotide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and encoding a polypeptide having ⁇ -glutamylcysteine synthetase activity ; (C) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 2; (D) Hybridizing under stringent conditions with a polynucleotide having a base sequence complementary to any one of the polynucleotides (a) to (c) above, and ⁇ -glutamylcysteine synthe synthe synthe synthe
  • the introduction of the polynucleotide into the algal cells can be confirmed by a conventionally known PCR method, Southern hybridization method, Northern hybridization method, or the like.
  • the expression of the protein encoded by the polynucleotide can also be confirmed by measuring by a conventionally known immunological technique. It can also be confirmed by measuring the enzyme activity of the protein encoded by the polynucleotide by a conventionally known biochemical technique.
  • the algae of the present invention can induce the production and / or accumulation of photosynthetic products in algal cells without increasing nitrogen starvation due to the increased glutathione concentration in the algal chloroplasts. For this reason, if the algae of the present invention are used, it is not necessary to exchange for a culture solution that does not contain nitrogen for inducing the accumulation of photosynthetic products.
  • wild-type algae when nitrogen starvation occurs under heterotrophic conditions (when there is a carbon source such as acetic acid), wild-type algae accumulate a small amount of photosynthetic products in the cells during the growth phase, and photosynthetic products during the stationary phase. Accumulate, but few photosynthetic products are detected outside the cell.
  • the algae according to the present invention produce and accumulate photosynthetic products in both the growth phase (logarithmic growth phase) and the stationary phase, and a large amount of photosynthetic products are detected outside the cells.
  • wild-type algae When heterotrophic conditions do not lead to nitrogen starvation, wild-type algae accumulate only a few photosynthetic products in the cell during the growth phase, but the accumulation further decreases during the stationary phase, and is almost detectable outside the cell. Not. On the other hand, the algae according to the present invention produce and accumulate photosynthetic products both in the growth phase and in the stationary phase, and many photosynthesis products are detected extracellularly.
  • the amount of light required to induce photosynthesis product accumulation during nitrogen starvation is generally greater in wild-type algae than in heterotrophic conditions. A lot is needed.
  • the algae according to the present invention a photosynthesis product continues to be produced without particularly increasing the light intensity.
  • the productivity of the photosynthetic product is improved in the algae according to the present invention as the irradiation light is stronger.
  • Chlamydomonas is used as an algae, it is more advantageous to irradiate more intense light for the production of photosynthetic products because of its characteristics. It can be said that the accumulation limit of the product is extremely limited.
  • the alga of the present invention is characterized in that the culture density is kept small. For this reason, the alga of the present invention has high utilization efficiency of light. Therefore, even with the same amount of light (brightness), more photosynthetic products can be produced and accumulated as compared to wild-type algae of the same species.
  • the cell density is at an appropriate level (eg, maintained lower than the wild type), it is useful in terms of light utilization efficiency. In other words, as the cell density increases, the production capacity of photosynthetic products will reach a certain point because the light that reaches the deeper of the culture tank is attenuated due to the “shade effect” caused by the cells existing on the surface of the culture tank.
  • the algae of the present invention such a problem can be avoided because the culture density is kept smaller than that of the wild type.
  • the algae of the present invention can increase the accumulation of starch granules linearly according to the culture time. Therefore, by maintaining such a culture state by supplying water or adding a medium, a photosynthesis product can be continuously produced by so-called continuous cultivation (for example, starch is continuously produced as starch granules). ).
  • the alga of the present invention has a large space for increasing the culture density compared to the wild type.
  • artificial manipulation for example, reduction of cell dispersion medium (for example, moisture) by the filtration process etc.
  • the culture density is increased to the limit where the productivity of the photosynthetic product is saturated, and the photosynthetic product is effectively removed. It can also be produced.
  • the alga of the present invention has few resting cells. For this reason, if biomass is manufactured using the algae of this invention, a yield will be good and a culture solution can be saved. In addition, since the amount of waste is small, it is possible to reduce waste disposal costs (dehydration, incineration, landfill, etc.), which is particularly advantageous when batch culture is performed. Also, less waste leads to better yield. Specifically, for example, solids in wastes in fermentation such as wine brewing are mostly cells, but the alga of the present invention ruptures and self-melts as starch granules are released. The degradation products become nutrients for other cells, improving the yield.
  • the algae of the present invention can discharge the photosynthetic products accumulated in the cells of the algae to the outside of the cells, the photosynthetic products can be easily recovered.
  • the photosynthesis product is starch
  • starch accumulated by photosynthesis can be discharged out of the cells as starch granules without disrupting the algal cells. For this reason, if biomass is produced using the algae of the present invention, starch can be purified relatively easily.
  • the starch granules produced by the algae of the present invention are characterized by being minute.
  • a general starch granule made of corn, potato, wheat, etc. has an average particle size of 10-50 ⁇ m
  • the starch granule produced by the alga of the present invention has a long average particle size. It is a fine particle having a uniform size of 1.3 ⁇ m (standard deviation 0.181) and a short diameter of 1.0 ⁇ m (standard deviation 0.204).
  • Rice, quinoa, and the like produce fine starch granules having an average particle size of about 2 to 3 ⁇ m, but they form an endosperm that is organized by adhesion, similar to starch granules produced by corn, potato, wheat, and the like. Therefore, in order to prepare minute starch granules in which corn, potato, wheat, rice, quinoa, etc. are used as raw materials, each of them is in a state of being separated, costly treatment such as fine grinding is necessary. Such fine starch granules are useful in the manufacture of pharmaceuticals.
  • each of these starch granules is in a discrete state without any treatment such as grinding.
  • the starch granules produced by the GSH1 overexpressing strain are finer than the general starch granules produced by corn, potato, wheat and the like.
  • Such fine starch granules are useful in the manufacture of pharmaceuticals.
  • a carrier for delivering a therapeutic agent for pulmonary diseases to the bronchiole a dry powder combining a therapeutic agent and starch microgranules
  • Inhaler is expected to be used.
  • a so-called “eating vaccine” by presenting a peptide antigen on the surface of starch granules (for example, Dauville ⁇ e et al. 2010, PLos One ⁇ 5 vol.12, e15424; Japanese Patent Publication No. 2003-500060 (Japanese Patent Application No. 2000-620111) discloses that a malaria antigen is presented on the surface of starch granules of Chlamydomonas.
  • Glutathione is a substance that regulates the intracellular redox state, and can function as a cell or organ differentiation regulator (see WO 01/080638), and as a plant growth regulation aid. It is known that it can function (see Japanese Laid-Open Patent Publication No. 2004-352679).
  • both the induction of the accumulation of photosynthesis products and the recovery of the photosynthesis products can be easily and efficiently performed as compared with the conventional technology. For this reason, biomass can be efficiently manufactured from algae at a lower cost than before by using the algae of the present invention in a method for manufacturing biomass described later.
  • the method for producing algae according to the present invention improves the glutathione concentration in the chloroplast and the productivity of the photosynthetic product as compared with the wild type algae described above.
  • a method for producing algae (algae of the present invention) which includes at least a glutathione concentration increasing step for increasing the glutathione concentration in the algal chloroplasts, and other conditions, steps, etc. Is not limited.
  • the glutathione concentration increasing step is a step of increasing the glutathione concentration in the algal chloroplast.
  • “to increase the glutathione concentration in the chloroplast” means to increase the glutathione concentration in the chloroplast as compared to the wild-type algae of the same species.
  • the algae after the glutathione concentration increasing step have a higher glutathione concentration than the wild-type algae of the same species. It can be determined by the method described in the section of “1. Algae according to the present invention” that the glutathione concentration in the algal chloroplast increased compared to the wild-type strain of the algae.
  • the method for increasing the glutathione concentration in the chloroplast is not particularly limited as long as the glutathione concentration in the algal chloroplast can be increased as a result.
  • a method of randomly introducing a mutation into a target alga using a known mutagenesis method a substance that increases the glutathione concentration in chloroplasts in a cell (in some cases, the alga genome) It can be obtained by the method introduced in
  • Method of randomly introducing mutations into algae is not particularly limited, and a known method can be appropriately selected and used. Specifically, for example, a method of treating algae with a chemical substance (eg, EMS, NTG, etc.), a method using radiation, a method using a transposon, a method using T-DNA, a prokaryotic eukaryotic cell junction And a method of physical introduction with a gene gun or the like.
  • a chemical substance eg, EMS, NTG, etc.
  • GSH1, GSH2, ATP sulfurylase, adenosine 5′-phosphosulfate reductase, sulfite reductase, cysteine synthase, serine acetyltransferase, etc. proteins involved in the glutathione biosynthesis system in chloroplasts can be obtained.
  • a mutation may be introduced into the encoding polynucleotide to increase the expression level and / or activity of the protein, and as a result, an alga having an increased glutathione concentration in the chloroplast may be obtained.
  • the method for selecting algae introduced with a desired mutation is not particularly limited, and a known method can be used.
  • a method for obtaining mutant algae with increased glutathione concentration, or GSH1, GSH2, ATP sulfurylase, adenosine 5′-phosphosulfate reductase, sulfite examples thereof include a method for obtaining mutant algae having an increased expression level and / or activity of proteins such as reductase, cysteine synthase, and serine acetyltransferase.
  • the “substance that increases glutathione concentration in chloroplasts” for example, (A) Increasing glutathione concentration in algal chloroplasts And (B) introducing a polynucleotide having a function of reducing the expression level of a protein that lowers the glutathione concentration in algal chloroplasts, thereby increasing the glutathione concentration in chloroplasts. You can get algae.
  • the polynucleotide (A) or (B) may be used alone or in combination.
  • polypeptide is used interchangeably with “peptide” or “protein”.
  • polynucleotide is used interchangeably with “gene”, “nucleic acid” or “nucleic acid molecule” and is intended to be a polymer of nucleotides.
  • introducing a polynucleotide means that the polynucleotide to be introduced is present in the algal cell, and the polynucleotide to be introduced is inserted (introduced) into the algal genome. Cases are also included.
  • the introduction of the polynucleotide into the algal cell can be confirmed by a conventionally known PCR method, Southern hybridization method, Northern hybridization method or the like.
  • the expression level of the protein that increases the glutathione concentration in the chloroplast can be increased.
  • glutathione in the chloroplast is increased.
  • the concentration can be increased.
  • polynucleotides examples include polynucleotides encoding ⁇ -glutamylcysteine synthetase (hereinafter sometimes referred to as “GSH1 gene”), and polynucleotides encoding glutathione synthetase (hereinafter referred to as “GSH2 gene”).
  • GSH1 gene polynucleotides encoding ⁇ -glutamylcysteine synthetase
  • GSH2 gene polynucleotides encoding glutathione synthetase
  • These polynucleotides are preferably derived from plants, more preferably polynucleotides possessed by the host algae themselves, but algae-derived polynucleotides other than the host algae and other higher plant-derived polynucleotides are also preferably used. be able to.
  • ⁇ -glutamylcysteine synthetase is an enzyme that synthesizes ⁇ -glutamylcysteine by amide-bonding glutamic acid to cysteine at the ⁇ position.
  • Glutathione synthase is an enzyme that synthesizes glutathione by adding glycine to ⁇ -glutamylcysteine.
  • GSH1 gene is not particularly limited, but one example of a suitable GSH1 gene used in the present invention is the Chlamydomonas GSH1 gene (CHLREDRAFT — 181975) used in the Examples by the present inventors. Can do.
  • Chlamydomonas GSH1 consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and the gene (full-length cDNA) encoding it consists of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • positions 134 to 136 are start codons, and positions 1571 to 1573 are stop codons.
  • the Chlamydomonas GSH1 gene has positions 134 to 1573 as an open reading frame (ORF) in the base sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 is the base sequence of ORF of Chlamydomonas GSH1 gene.
  • the translation product of Chlamydomonas GSH1 gene has a chloroplast translocation signal peptide in the N-terminal region. Therefore, the translation product of Chlamydomonas GSH1 gene, ie, Chlamydomonas GSH1, is usually present in chloroplasts.
  • polynucleotides (a) to (d) can be preferably exemplified as nucleotides to be introduced into algae:
  • A a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1;
  • B a polynucleotide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and encoding a polypeptide having ⁇ -glutamylcysteine synthetase activity ;
  • C a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 2;
  • D Hybridizing under stringent conditions with a polynucleotide having a base sequence complementary to any one of the polynucleotides (a) to (c) above, and ⁇ -glutamylcysteine synthetase activity
  • a polynucleotide encoding a
  • SEQ ID NO: 2 shows an example of a base sequence encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • mutant protein is not limited to a protein having a mutation artificially introduced by a known mutant polypeptide production method, and may be a protein obtained by isolating and purifying a naturally occurring protein.
  • Preferred variants have conservative or non-conservative amino acid substitutions, deletions, or additions. Silent substitution, addition, and deletion are preferred, and conservative substitution is particularly preferred. These do not alter the polypeptide activity according to the invention.
  • conservative substitutions are substitutions of one amino acid for another in the aliphatic amino acids Ala, Val, Leu, and Ile, exchange of hydroxyl residues Ser and Thr, acidic residues Asp and Glu exchange, substitution between amide residues Asn and Gln, exchange of basic residues Lys and Arg, and substitution between aromatic residues Phe, Tyr.
  • stringent conditions means that only when at least 90% identity, preferably at least 95% identity, most preferably at least 97% identity exists between sequences. It means that hybridization occurs. Specifically, for example, hybridization solution (50% formamide, 5 ⁇ SSC (150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate), 50 mM sodium phosphate (pH 7.6), 5 ⁇ Denhart solution, 10% sulfuric acid The conditions include washing the filter in 0.1 ⁇ SSC at about 65 ° C. after overnight incubation in dextran and 20 ⁇ g / ml denatured sheared salmon sperm DNA).
  • Hybridization can be performed by a well-known method such as the method described in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory (2001). Usually, the higher the temperature and the lower the salt concentration, the higher the stringency (harder to hybridize), and a polynucleotide with higher homology can be obtained.
  • ⁇ -glutamylcysteine synthetase activity means an activity of catalyzing a reaction in which glutamic acid is amide-bonded to cysteine at the ⁇ -position.
  • ⁇ -glutamylcysteine synthetase activity refers to, for example, cysteine, glutamic acid, and ATP, using a supernatant obtained by centrifuging crushed algae as a sample while taking antioxidant measures such as substituting the solution with nitrogen. It can be determined as the amount of ⁇ -glutamylcysteine synthesized in a certain time after the sample is added to the reaction solution. In addition, the amount of phosphoric acid produced during the reaction can be determined quantitatively.
  • GSH1 genes derived from plants other than Chlamydomonas include, for example, Arabidopsis (TAIR (Accession Gene: 2127172, Name AT4G23100.1), Zinnia (Genbank accession: AB158510), Rice (Genbank accession: AJ508915), Tobacco (Genbank accession: DQ444219) GSH1 genes such as these are known, and these can also be suitably used in the present invention. Similar to Chlamydomonas, the translation products of these genes also have a chloroplast translocation signal peptide in the N-terminal region.
  • polynucleotide (B) in addition, by introducing the polynucleotide (B) into algal cells, the expression level of the protein that lowers the glutathione concentration in the chloroplast can be reduced. As a result, the glutathione concentration in the chloroplast is reduced. Can be increased.
  • polynucleotides include double stranded RNA (dsRNA), siRNA (short interfering ⁇ ⁇ RNA), and template DNA of these RNAs used in the conventionally known RNA interference (RNAi) method. It is done.
  • CLT1 protein that lowers the glutathione concentration in algal chloroplasts
  • CLT1 protein that lowers the glutathione concentration in algal chloroplasts
  • CLT1 is a transporter that transports glutathione from the chloroplast to the cytoplasm, and was first found in Arabidopsis thaliana and named CLT1 (Proc Natl Acad Sci USA (2010) vol. 107 (5) 2331- 2336). That is, as an example of (B) above, a polynucleotide intended to reduce the expression level of glutathione transporters such as CTL1 can be mentioned.
  • the “polynucleotide” used in the method for producing algae of the present invention may be derived from genomic DNA, cDNA, or chemically synthesized DNA. RNA may also be used. It can be appropriately selected according to the purpose.
  • a method for obtaining a polynucleotide used in the method for producing algae of the present invention for example, when obtaining a GSH1 gene, a method for isolating and cloning a DNA fragment encoding GSH1 by a known technique can be mentioned.
  • a probe that specifically hybridizes with a portion of the base sequence of DNA encoding Chlamydomonas GSH1 may be prepared, and a genomic DNA library or cDNA library may be screened.
  • a method for obtaining a polynucleotide used in the method for producing algae of the present invention a method using an amplification means such as PCR can be mentioned.
  • amplification means such as PCR
  • primers are prepared from the 5 ′ side and 3 ′ side sequences (or complementary sequences thereof) of cDNA encoding GSH1 of Chlamydomonas, and genomes are prepared using these primers.
  • a large amount of DNA fragment (GSH1 gene) encoding GSH1 used in the present invention can be obtained by performing PCR or the like using DNA (or cDNA) as a template and amplifying a DNA region sandwiched between both primers.
  • the GSH2 gene, ATP sulfurylase gene, adenosine 5'-phosphosulfate reductase gene, sulfite reductase gene, cysteine synthase gene, serine acetyltransferase gene, and CLT1 gene can be obtained in the same manner.
  • the polynucleotide used in the method for producing algae of the present invention can be obtained using a desired algae as a supply source.
  • the method for introducing a polynucleotide into algae is not particularly limited.
  • the polynucleotide can be introduced into algal cells by introducing an expression vector comprising the polynucleotide.
  • a method for constructing an expression vector a conventionally known method may be used, and it is not particularly limited.
  • a recombinant expression vector in which a promoter that functions in algal cells is linked upstream of the target polynucleotide and a terminator that functions in algal cells is linked downstream can be constructed and introduced into algae.
  • a PsaD promoter can be preferably used.
  • the PsaD promoter has a stronger promoter activity than the endogenous promoter of the GSH1 gene. Therefore, more ⁇ -glutamylcysteine synthetase can be expressed by using the PsaD promoter.
  • the expression vector obtained by using the PsaD promoter can be expressed depending on the intensity of light irradiated when introduced into algal cells. The amount can be adjusted.
  • transformed algae into which a target gene has been introduced are first selected using a conventionally known drug selection method using the expression of a drug resistance marker such as kanamycin resistance or hygromycin resistance as an index. Thereafter, whether or not the target gene has been introduced into the algae can be confirmed by PCR, Southern hybridization, Northern hybridization or the like.
  • DNA is prepared from transformed algae, and PCR is performed by designing specific primers for the introduced DNA. After that, the amplification product is subjected to agarose gel electrophoresis, polyacrylamide gel electrophoresis, capillary electrophoresis, etc., stained with ethidium bromide, etc., and the target amplification product is detected to confirm that it has been transformed. Can do.
  • the productivity of the photosynthetic product is improved, so the algae having an increased concentration of glutathione in the chloroplast are alga having improved productivity of the photosynthetic product, Easy to understand. Whether the productivity of the photosynthetic product is improved in the screened individual can be confirmed by the above-described method for measuring the productivity of the photosynthetic product.
  • the method for producing biomass according to the present invention is an algae in which the glutathione concentration in chloroplasts is increased as compared with wild-type algae (this book). Algae of the invention) or a method of producing biomass using the algae produced by the method of producing algae of the present invention.
  • the algae of the present invention are described in the section “1. Algae according to the present invention”, and the method for producing algae according to the present invention is described in the section “2. The method for producing algae according to the present invention”. Therefore, the description is omitted here.
  • biomass is intended to mean substances produced by algae by carbon fixation by photosynthesis, such as sugars (for example, starch), fats and oils, and is also referred to as “photosynthesis products”.
  • the method for inducing production or accumulation of photosynthetic products in algal cells is not particularly limited.
  • the biomass production method of the present invention may include a light irradiation step of irradiating the algae with light in order to induce production or accumulation of photosynthetic products in the cells of the algae.
  • the algae according to the present invention are excellent in that a photosynthesis product can be produced in and out of cells even with a small amount of light compared to conventional wild-type algae.
  • the lower limit of the amount of light to be irradiated is not particularly limited, for example, 40 ⁇ E / m 2 / sec or more can be set realistically.
  • No special light irradiation device is required as a light irradiation device for irradiating light in the above-mentioned range.
  • sunlight light in which sunlight is qualitatively and quantitatively adjusted with a mirror, an optical fiber, a filter, a mesh, or the like; artificial light such as an incandescent lamp, a fluorescent lamp, a mercury lamp, or a light emitting diode can be used.
  • the light to be irradiated light having a wavelength range suitable for photosynthesis of general algae can be used, and for example, it is preferably 400 nm to 700 nm.
  • condition other than nitrogen starvation refers to culturing in a culture solution containing an amount of inorganic nitrogen necessary for algae to grow.
  • the amount necessary for the growth of algae means that the amount of inorganic nitrogen contained in the culture solution is 0.001 to 0.1% by weight in terms of nitrogen atom, preferably 0.005 to 0.05% by weight.
  • the “inorganic nitrogen” refers to nitrogen such as ammonia nitrogen, nitrite nitrogen, nitrate nitrogen and the like.
  • the inorganic nitrogen contained in the culture solution is about 0.01% by weight in terms of nitrogen atoms.
  • a culture solution containing an amount of inorganic nitrogen necessary for the growth of algae a culture solution usually used for culturing algae may be used, and there is no particular limitation.
  • examples of such a culture solution include conventionally known TAP medium, HSM medium, ATCC 897 medium, and the like.
  • the accumulation of starch in cells can be induced by culturing the algae of the present invention in TAP medium while irradiating with 45 ⁇ E / m 2 / sec of light.
  • the algae of the present invention can be induced to accumulate intracellular starch by culturing in TAP medium while irradiating with 80 ⁇ E / m 2 / sec of light.
  • the light irradiation step may be performed under nitrogen starvation conditions.
  • the “nitrogen starvation condition” refers to culturing in a culture solution in which the content of inorganic nitrogen is less than 0.001% by weight in terms of nitrogen atoms.
  • a TAP N-free medium can be suitably used as a culture solution not containing nitrogen.
  • the algae of the present invention is cultured under nitrogen starvation conditions (in TAP N-free medium) with irradiation of 80 ⁇ E / m 2 / sec to reduce starch accumulation in the cells. Can be guided.
  • a feature of the algae according to the present invention is that no nutrient restriction step such as nitrogen starvation is required when producing a photosynthesis product. That is, in the method for producing biomass according to the present invention, a mode in which a nutrient restriction step such as a nitrogen starvation state is not substantially performed (a nutrition restriction step such as a nitrogen starvation state is not substantially included) is possible. Such features can simplify the process and improve the productivity of photosynthetic products.
  • the light irradiation step may be performed under autotrophic conditions.
  • the above “autonomous conditions” refers to conditions for culturing without supplying a carbon source other than carbon dioxide.
  • the light irradiation step can be performed under autotrophic conditions by culturing the algae of the present invention in an HSM culture solution by a method of light irradiation while supplying air.
  • the supply source of carbon dioxide is not limited to the atmosphere, but carbon dioxide contained in the flue of a thermal power plant or steelworks is used to send carbon dioxide to the culture medium at a higher concentration than the atmosphere. It is also possible to increase.
  • the medium Under autotrophic conditions, carbon dioxide or a gas containing carbon dioxide is sent (vented) from near the bottom of the culture vessel. The diffusion rate of carbon dioxide in water is extremely slow compared to that in the atmosphere. Therefore, it is necessary to stir the medium. By stirring the culture medium, it is possible to irradiate the algae with light without unevenness. Since carbon dioxide becomes an anion in water, if the buffering capacity of the medium is weak, the medium is inclined to the acidic side by aeration, so that the solubility of carbon dioxide is lowered and it is difficult to use for photosynthesis. Therefore, it is preferable that the medium has a buffering capacity that maintains the pH near neutrality or the alkaline side. As such a medium, a conventionally known HSM medium or the like is preferably exemplified.
  • the biomass production method of the present invention may further include a step of recovering a photosynthesis product in addition to the above-described “light irradiation step”.
  • starch accumulated in the cells can be discharged out of the cells as starch granules.
  • the starch granules discharged out of the cells and the algae are separated, and the separated starch granules may be recovered.
  • the method for separating the starch granules discharged from the cells and the algae is not particularly limited. For example, it can be performed by separation means based on physical properties such as particle size and / or shape of starch granules and algae cells by natural sedimentation by standing, centrifugation, sieving and the like.
  • the present invention includes a biomass production method including a step of culturing algae in the presence of a substance that increases the concentration of glutathione in the algal chloroplasts.
  • substances that increase the glutathione concentration in algal chloroplasts and can be absorbed by algae by contact with algae include, for example, glutathione, glutathione conjugates, active oxygen (eg, peroxidation) Hydrogen, etc.), active nitrogen, polyamine, titanium oxide, jasmonic acid, salicylic acid, cysteine, cystine, heavy metal cadmium and iron ion.
  • Polyamine is a raw material for hydrogen peroxide. Titanium oxide generates active oxygen by light.
  • Cysteine and cystine are the precursors of glutathione. About heavy metal cadmium and iron ion, it is preferable to administer excessively. In particular, in view of cost, hydrogen peroxide is preferable.
  • Substances that increase the glutathione concentration in the algal chloroplasts that can be absorbed by algae by contact with algae include, for example, the substance in the culture solution used when algae photosynthesis By making it contact with algae, it can be absorbed by algae.
  • biomass is produced using the algae according to the present invention or the algae produced by the method for producing algae according to the present invention.
  • accumulation of photosynthetic products in algal cells can be induced.
  • the photosynthetic product accumulated in the algal cells can be discharged out of the cell, so that the photosynthetic product can be easily recovered. That is, according to the biomass production method of the present invention, both the induction of accumulation of the photosynthetic product and the recovery of the photosynthetic product can be easily and efficiently performed as compared with the prior art. Therefore, according to the biomass production method of the present invention, it is possible to produce biomass from algae efficiently at a lower cost than in the past.
  • the algae according to the present invention is a group consisting of ⁇ -glutamylcysteine synthetase, glutathione synthetase, ATP sulfurylase, adenosine 5′-phosphosulfate reductase, sulfite reductase, cysteine synthetase and serine acetyltransferase in the chloroplast.
  • the expression level and / or activity of at least one protein selected from the above may be increased.
  • the algae according to the present invention are selected from the group consisting of the above-mentioned ⁇ -glutamylcysteine synthetase, glutathione synthetase, ATP sulfurylase, adenosine 5′-phosphosulfate reductase, sulfite reductase, cysteine synthetase and serine acetyltransferase.
  • An exogenous polynucleotide encoding at least one protein may be introduced.
  • the polynucleotide encoding the ⁇ -glutamylcysteine synthetase may be selected from the group consisting of the following (a) to (d): (A) a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; (B) a polynucleotide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and encoding a polypeptide having ⁇ -glutamylcysteine synthetase activity ; (C) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 2; (D) Hybridizing under stringent conditions with a polynucleotide having a base sequence complementary to any one of the polynucleotides (a) to (c) above, and ⁇ -glutamylcysteine synthe synthe synthe synthe
  • the glutathione concentration increasing step includes ⁇ -glutamylcysteine synthetase, glutathione synthetase, ATP sulfurylase, adenosine 5′-phosphosulfate reductase, sulfite reductase, cysteine synthetase and serine acetyl. It may be a step of introducing an exogenous polynucleotide encoding at least one protein selected from the group consisting of transferase into algae.
  • the biomass production method according to the present invention may include a light irradiation step of irradiating the algae with light.
  • the light irradiation step may be performed under conditions that are not substantially nitrogen starvation.
  • Example 1 ⁇ Preparation of GSH1 overexpression strain> A plasmid was prepared by linking the GSH1 gene (SEQ ID NO: 2) encoding Chlamydomonas-derived ⁇ -glutamylcysteine synthetase (SEQ ID NO: 1) downstream of the PsaD gene promoter (PsaD promoter).
  • GSH1 gene SEQ ID NO: 2 encoding Chlamydomonas-derived ⁇ -glutamylcysteine synthetase (SEQ ID NO: 1) downstream of the PsaD gene promoter (PsaD promoter).
  • circular DNA pSP124S (see Plant Journal (1998) Vol. 14 (4): 441-447.), A vector for Chlamydomonas, is opened by simultaneous treatment with restriction enzymes EcoRI and EcoR5. Then, the polynucleotide of SEQ ID NO: 4 (about 3.13 kilobase pairs) was ligated and simultaneously circularized. This circular DNA was amplified using Escherichia coli by a known method, and extracted and purified from Escherichia coli.
  • the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 4 was prepared by the following method.
  • Chlamydomonas reinhardi CC503 strain (Chlamydomonas Center, sold by Duke University, USA) was cultured for 4 days under the conditions of TAP medium, 24 ° C., 50 ⁇ E / m 2 / sec. Using a cell collected from this culture as a material, a cDNA mixture was prepared using a cDNA synthesis reagent kit (Solid phase cDNA synthesis kit, manufactured by Takara Bio Inc.).
  • a PCR reaction (annealing temperature: 58 ° C.) was performed by a known method using the oligonucleotides of SEQ ID NOs: 5 and 6, and Chlamydomonas GSH1 gene was ORF followed by 3′UTR region. It was recovered as a continuous approximately 2.27 kilobase pair polynucleotide. Furthermore, the terminal structure was processed using restriction enzyme EcoR1.
  • Genomic DNA was prepared using a DNA extraction reagent kit (Nippon Gene Co., Isoplant) using CC503 cells cultured and accumulated in the same manner as in (1) above.
  • a PCR reaction (annealing temperature: 56 ° C.) was performed by a known method using the oligonucleotides of SEQ ID NOs: 7 and 8, and the promoter region of Chlamydomonas PsaD gene was about 0.86 kilobase pairs. It was recovered as a polynucleotide.
  • the terminal structure was processed using the restriction enzyme Hpa1.
  • Chlamydomonas reinhardtii CC503 strain (hereinafter referred to as “Chlamydomonas”).
  • the transformant strain (hereinafter referred to as “GSH1 overexpressing strain”) in which the polynucleotide is inserted into the genomic DNA and stably inherited to the child generation as cells replicate, and the CC503 strain has acquired bleomacicin resistance. Selected as an indicator. Insertion of the plasmid DNA containing the polynucleotide into the genomic DNA was confirmed by the PCR method.
  • the PsaD gene is a gene involved in photosynthesis. Therefore, by changing the intensity of light to be irradiated, the activity of the PsaD promoter can be regulated and the expression level of the GSH1 gene can be regulated. That is, when a strong light is irradiated to a GSH1 overexpressing strain, the expression level of exogenous GSH1 in the GSH1 overexpressing strain increases. When a weak light is irradiated, the expression amount of exogenous GSH1 in the GSH1 overexpressing strain is Less.
  • Example 2 The GSH1 overexpressing strain prepared in Example 1 was semi-subordinated using Tris-acetate-phosphate (TAP) medium, pH 7 (see Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 54, 1665-1669.). Cultivation was carried out under nutrient conditions, and the growth ability and starch production ability were evaluated. As a control, a wild-type Chlamydomonas strain CC503 (hereinafter referred to as “parent strain (wild-type strain)”) was used. The culture conditions for each sample are shown in Tables 1 and 2.
  • TEP Tris-acetate-phosphate
  • L-Buthionine-sulfoximine (abbreviation BSO (model number B2515, manufactured by Sigma-Aldrich) added to the TAP medium is an inhibitor of GSH synthase.
  • FIG. 1A is a graph showing the growth ability of a GSH1 overexpressing strain
  • FIG. 1B is a view showing the state of the culture solution 309 hours after the start of culture
  • (A) of FIG. 2 is a graph showing the growth ability of the parent strain (wild type strain)
  • (b) is a diagram showing the state of the culture solution 215 hours after the start of culture.
  • the vertical axis of the graphs of FIG. 1 (a) and FIG. 2 (a) represents the optical density (OD), and the horizontal axis represents the culture time.
  • the optical density shown on the vertical axis was measured by an apparatus (ODTechr-S / ODBox-A, manufactured by Taitec Co., Ltd.) that measures the OD value based on the amount of transmitted light of infrared rays (950 nm).
  • the arrow written in the graph represents the timing at which flow cytometry (FCM) was performed.
  • the cells of Samples 1 to 4 all had proliferative ability under semi-heterotrophic conditions. Since there was no great difference in the growth ability of each sample, it was confirmed that the expression of exogenous GSH1 gene does not affect the growth of Chlamydomonas.
  • the sample 1 and sample 4 showed white turbidity in the culture solution.
  • “semi-heterotrophic” is cultured using acetic acid in the medium as the main carbon source, but because it is irradiated with light and the culture flask is not sealed, compared to acetic acid, Although the contribution to growth is small, it means that carbon dioxide in the atmosphere is also used as a carbon source.
  • each cell was irradiated with 488 nm excitation light, and the fluorescence intensity near 600 nm was measured.
  • fluorescence near 600 nm corresponds to fluorescence of chlorophyll.
  • fluorescent particles (trade name: Flow count) manufactured by Beckman Coulter coexist to measure fluorescence of 525 nm to 700 nm emitted by 488 nm excitation light did.
  • the size of the cell (particle) and the complexity inside the cell (particle) were measured by measuring the forward scattered light and the side scattered light.
  • FIG. 3 and FIG. (A) of FIG. 3 is a diagram showing a histogram of cells (particles) showing chlorophyll fluorescence in the parent strain (wild-type strain) of sample 8
  • (b) is a diagram of the parent strain (wild-type strain) of sample 8. It is a figure showing the correlation with the magnitude
  • 4A is a diagram showing a histogram of cells (particles) showing chlorophyll fluorescence in the GSH1 overexpressing strain of sample 4
  • FIG. 4B is a culture of the GSH1 overexpressing strain of sample 4.
  • the chlorophyll fluorescence was hardly detected in the GSH1 overexpression strain of Sample 4.
  • the GSH1 overexpression strain of Sample 4 did not have many living cells.
  • the particles existing outside the square frame were considered to be starch granules discharged out of the cells. That is, in the GSH1 overexpressing strain, it was considered that the starch produced in the cells was discharged out of the cells as starch granules with the death of the cells.
  • “Density of particles emitting fluorescence derived from chlorophyll by irradiation with excitation light (488 nm)” in FIG. 3A and FIG. 4A is shown in Table 3, “Excitation light (488 nm)”.
  • Table 4 shows the “density of particles that did not emit fluorescence derived from chlorophyll by irradiation”.
  • the number of cells (particles) shown in Table 3 and Table 4 was calculated based on the value of the internal standard, and was expressed by a numerical value obtained by dividing the number of particles contained in 1 mL of the culture solution by 10 to the third power.
  • Example 3 The GSH1 overexpressing strain prepared in Example 1 was cultured under nitrogen starvation conditions, and the growth ability and starch grain production ability were evaluated. Specifically, the GSH1 overexpressing strain was cultured using the same TAP medium as in Example 2 on a swivel platform for 8 days at 24 ° C. with continuous light of 17 ⁇ E / m 2 / sec. Thereafter, in order to exchange the culture solution, the cells are collected as a precipitate by centrifugation (2000 g, 5 minutes), the collected cells are divided into two equal parts, and one of the cells is added to a TAP N-free medium containing no nitrogen source. (Gorman and Levine (see Proc. Natl. Acad. Sci.
  • the cell density when resuspended was adjusted to be about 1.1 times the cell density at the end of preculture using TAP medium. That is, the cells contained in 90 mL of the preculture were resuspended in 100 mL of a new medium.
  • the culture was carried out on a swivel with a light intensity of 80 ⁇ E / m 2 / sec, and a part of the culture was taken every day to evaluate the growth ability and starch production ability.
  • a parent strain wild type strain, CC503 strain
  • the culture conditions for each sample are shown in Tables 5 and 6.
  • FIG. 5 is a graph showing changes over time of “density of cells (particles) exhibiting chlorophyll fluorescence” and “density of cells (particles) not exhibiting chlorophyll fluorescence” in Sample 9 and Sample 10.
  • FIG. 6 is a graph showing changes over time of “density of cells (particles) exhibiting chlorophyll fluorescence” and “density of cells (particles) not exhibiting chlorophyll fluorescence” in Sample 11 and Sample 12.
  • the vertical axis indicates the density of cells (particles)
  • the horizontal axis indicates the culture time. The culture time is expressed as 0 hours when the culture medium is changed.
  • FIG. 5 is a graph showing changes over time of “density of cells (particles) exhibiting chlorophyll fluorescence” and “density of cells (particles) not exhibiting chlorophyll fluorescence” in Sample 9 and Sample 10.
  • the vertical axis indicates the density of cells (particles)
  • the density of cells (particles) that do not exhibit chlorophyll fluorescence corresponds to “the density of starch granules”.
  • the density of cells having chloroplasts increased once after the start of culture in a culture solution containing a nitrogen source. And then tended to decrease.
  • a culture solution not containing a nitrogen source cells having chloroplasts hardly proliferated.
  • the density of the starch granules increased with time regardless of the presence or absence of the nitrogen source in the culture solution.
  • the density of cells (cells having chloroplasts) in the culture solution decreased, the density of starch granules tended to increase.
  • Starch contained in a sample obtained by extracting a part from the culture solution of Samples 9, 10, 11 and 12 was quantified at intervals of 1 to 2 days.
  • Glucose test Wako manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. was used for quantification. The results are shown in FIGS. 5B and 5C and FIGS. 6B and 6C.
  • FIG. 5 (c) and FIG. 6 (c) show the results of expressing the amount of starch in the culture solution as a numerical value per cell having 1 million chloroplasts.
  • the productivity per cell of the GSH1 overexpressing strain is remarkably improved as compared with the parent strain (wild type strain) regardless of the presence or absence of nitrogen starvation conditions.
  • the GSH1 overexpressing strain is superior to the parent strain (wild type strain) in terms of yield relative to the medium components that are part of the raw material.
  • the amount of waste consisting of cell constituents is lower in the GSH1 overexpressing strain compared to the parent strain (wild type strain). This also means that it is easier than the parent strain (wild-type strain).
  • the improvement in productivity per cell is very advantageous.
  • FIG. 19 shows changes over time of “density of cells (particles) exhibiting chlorophyll fluorescence” and “density of cells (particles) not exhibiting chlorophyll fluorescence” in Sample 9 and Sample 10, as in FIG. It is a graph showing.
  • FIG. 20 shows changes over time of “density of cells (particles) exhibiting chlorophyll fluorescence” and “density of cells (particles) not exhibiting chlorophyll fluorescence” in Sample 11 and Sample 12, as in FIG. It is a graph showing.
  • FIG. 19 and FIG. 20 when the same experiment as the experiment shown in FIG. 5 and FIG. 6 was repeatedly performed, the obtained results showed the same tendency as the results shown in FIG. 5 and FIG. Therefore, it was confirmed that the reproducibility of the data was high.
  • Example 4 The GSH1 overexpression strain prepared in Example 1 was cultured under autotrophic conditions, and the growth ability and starch grain production ability were evaluated. Specifically, the GSH1 overexpressing strain is pre-cultured in a TAP medium, and then transferred to an HSM medium (see Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1960) 46, 83-91.) Light was irradiated while aseptic air was sent through a glass tube inserted in the vicinity. A magnetic stirrer was used for stirring the culture solution. Detailed culture conditions are shown in Table 7. As a control, the parent strain (wild-type strain) was cultured under the same conditions, and the growth ability and starch grain production ability were evaluated.
  • Sterilized water was replenished in a timely manner in order to maintain the amount of medium reduced by transpiration accompanying aeration at approximately 300 mL.
  • Results are shown in FIG. (A) of FIG. 7 shows “density of cells (particles) exhibiting chloroplast fluorescence” and “cells (particles) not exhibiting chloroplast fluorescence in the GSH1 overexpression strain and the parent strain (wild-type strain). It is a graph showing a time-dependent change of "density of", (b) is a graph showing a time-dependent change of the starch amount per culture solution.
  • the vertical axis represents the cell (particle) density
  • the horizontal axis represents the culture time. The culture time is represented as 0 hour when the culture is started under autotrophic conditions.
  • the above-mentioned “density of cells (particles) that do not exhibit chloroplast fluorescence” corresponds to “density of starch granules”.
  • iodine starch reaction was performed on the GSH1 overexpressing strain and the parent strain (wild-type strain) on the 10th day after culturing under autotrophic conditions. Specifically, cells (particles) were collected by centrifugation from 1 mL of a culture solution of a GSH1 overexpressing strain. Similarly for the parent strain (wild type strain), cells (particles) were recovered from the culture solution. The collected cells (particles) were treated with acetone to remove chlorophyll from the cells, and then an iodine starch reaction was performed. The reason for removing chlorophyll from the cells is to make the result of the iodine starch reaction easier to see.
  • FIG. 8 is a diagram showing the results of iodine starch reaction in a GSH1 overexpressing strain and a parent strain (wild type strain).
  • white particles are colored deep blue-purple by the iodine starch reaction, and thus it was confirmed that starch granules were discharged out of the cells.
  • the parent strain wild type strain
  • the coloring was weak, a slight iodine starch reaction was observed. From these results, it was suggested that a certain amount of starch was produced in the parent strain (wild type strain) even in the autotrophic condition, not in the nitrogen starvation condition.
  • starch was quantified using 1 mL of culture solution sample collected over time every day.
  • Glucose test Wako manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. was used for quantification.
  • the start of starch production is earlier than the parent strain (wild type strain).
  • the amount of starch produced is larger than the parent strain (wild-type strain) that has undergone the same culture.
  • the starch concentration in the culture solution on the 10th day of culture was 416.8 mg for the GSH1 overexpressing strain and 196.4 mg for the parent strain (wild type strain) per liter of the culture solution. Therefore, the productivity per culture broth was more than twice as high in the GSH1 overexpressing strain as the parent strain (wild type strain).
  • the GSH1 overexpressing strain is superior to the parent strain (wild type strain) in terms of yield relative to the medium components that are part of the raw material. It also means that the amount of waste consisting of cell constituents is lower in the GSH1 overexpressing strain compared to the parent strain (wild type strain). In addition, regarding the purification of starch, the GSH1 overexpressing strain This also means that it is easier than the parent strain (wild-type strain). Furthermore, since the results of the examples shown in FIGS.
  • the GSH1 over-expressing strain is It is suggested that it is a strain in which the medium components can be used more effectively compared to the strain), and is more preferable as a cell strain when continuously producing starch by photosynthesis.
  • Example 5 100 ml of TAP medium was inoculated with the GSH1 overexpression strain prepared in Example 1, and cultured under continuous light of 80 ⁇ E / m 2 / sec. The OD value is continuously monitored based on the amount of transmitted light of infrared rays (950 nm), and 5 mL of the culture solution is extracted in the logarithmic growth phase or stationary phase, and the extracted culture solution is transferred (passaged) to a new 100 mL TAP medium. The culture was continued in the same manner.
  • FIG. 9 is a diagram showing the results of examining the growth ability of GSH1 overexpressing strains.
  • the arrows shown in FIG. 9 indicate the time when the start point is withdrawn from the culture solution.
  • “primary” means primary culture
  • “passage 1” means the first subculture
  • “passage 2” means the second subculture
  • “passage” means the third subculture
  • “Passage 4” means the fourth subculture.
  • the GSH1 overexpressing strain can be newly grown as a seed culture not only in the logarithmic growth phase but also in a culture that has passed about 150 hours after entering the stationary phase. It was confirmed that.
  • FIG. 10 shows the result of further detailed analysis of the characteristics of the GSH1 overexpressing strain in each growth phase.
  • FIG. 10 shows the results of examining the state of the GSH1 overexpressing strain at each passage, and (a) shows the cell size of the GSH1 overexpressing strain when “passage 1” shown in FIG. 9 is performed.
  • (B) shows the correlation between the cell size of the GSH1 overexpressing strain and the complexity inside the cell when “passage 2” shown in FIG. 9 is performed.
  • C is a figure showing the correlation between the cell size of the GSH1 overexpressing strain and the complexity of the inside of the cell when “passage 3” shown in FIG. 9 is performed.
  • Example 6 In the GSH1 overexpressing strain prepared in Example 1, the shape of starch granules released to the outside of the cell was observed. Specifically, the starch granules released extracellularly are suspended in 1 mL of 0.01% Tween 20 (registered trademark, manufactured by Sigma, model number P1379), and further 9 mL of Percoll (registered trademark, manufactured by Sigma, model number) P1644), dispersed, purified by centrifugation (9,100 ⁇ g, 30 minutes), and the resulting starch granules were observed using a scanning electron microscope.
  • Tween 20 registered trademark, manufactured by Sigma, model number P1319
  • Percoll registered trademark, manufactured by Sigma, model number
  • FIG. 11 is a diagram showing the results of observing the shape of starch granules released from the GSH1 overexpressing strain to the outside of the cells.
  • (A) of FIG. 11 is a figure showing the result of having observed the starch grain using the scanning electron microscope.
  • the starch granules produced by the GSH1 overexpressing strain have an average particle size of 1.3 ⁇ m (standard deviation 0.181) in the major axis and 1.0 ⁇ m in the minor axis (standard). It was confirmed that the particles were small and had a uniform size with a deviation of 0.204).
  • a general starch granule made of corn, potato, wheat or the like has an average particle size of 10 to 50 ⁇ m, so it can be seen how small the starch granule produced by the GSH1 overexpressing strain is.
  • the starch granules produced by the GSH1 overexpressing strain are finer than the general starch granules produced by corn, potato, wheat and the like. Such fine starch granules are useful in the manufacture of pharmaceuticals.
  • the release of starch granules in the GSH1 overexpressing strain is the release accompanying cell rupture. Before and after cell rupture, autolysis occurs, but the starch granules themselves are not subject to degradation by the enzymes responsible for autolysis. For this reason, a starch grain with few impurities is obtained in the GSH1 overexpression strain.
  • the low molecular weight substance produced by self-melting can be used for the growth of algae, and the recycling of such a substance can be expected to save a medium necessary for the growth of algae.
  • Cell autolysis does not occur in wild type strains, but only in GSH1 overexpressing strains.
  • FIG. 11 (b) is a diagram showing the results of the iodine starch reaction in the starch granules released from the GSH1 overexpressing strain. As shown in FIG. 11 (b), the GSH1 overexpressing strain is shown. It was confirmed that the starch granules released from the above were colored violet by the iodine starch reaction, similar to the corn starch used as a control.
  • FIG. 11 (c) is a graph showing the starch production ability of the GSH1 overexpressing strain when BSO, which is an inhibitor of GSH synthase, is added.
  • BSO which is an inhibitor of GSH synthase
  • Example 7 The oil and fat production ability in the GSH1 overexpression strain was examined. Specifically, the GSH1 overexpression strain prepared in Example 1 was precultured in 200 mL of TAP medium (containing a nitrogen source) for 4 days under continuous light of 17 ⁇ E / m 2 / sec. Next, the cells contained in the 90 mL culture were collected by centrifugation (2,000 g, 5 minutes), and the collected cells were collected from TAP medium (100 mL) containing a new nitrogen source or TAP medium containing no new nitrogen source. The medium was changed by resuspension in (100 mL). Thereafter, the cells were cultured for 6 days under continuous light at 80 ⁇ E / m 2 / sec. Cells were stained with Nile Red at the end of preculture and 6 days after medium change, and the stained cells were subjected to flow cytometry.
  • TAP medium containing a nitrogen source
  • Chlamydomonas reinhardi CC503 strain wild type strain
  • the same experiment was performed using Chlamydomonas reinhardi CC503 strain (wild type strain) which is the parent strain of the GSH1 overexpressing strain.
  • FIG. 12 shows the result of examining the oil-and-fat production ability of a GSH1 overexpressing strain
  • (a) is a diagram showing a histogram of cells showing fluorescence derived from Nile red in a parent strain (wild type strain)
  • FIG. 6 is a view showing a histogram of cells showing Nile red-derived fluorescence in a GSH1 overexpressing strain
  • (c) is a confocal laser microscope observation of a Nile red-stained parent strain (wild-type strain) contained in the preculture. It is a figure showing a result
  • (d) is a figure showing the observation result by the confocal laser microscope of the GSH1 overexpression strain dyed Nile red contained in preculture.
  • light gray peaks correspond to cells cultured in a TAP medium containing a nitrogen source
  • white peaks are cultured in a TAP medium not containing a nitrogen source.
  • the rightmost peak corresponds to the artificial fluorescent beads (internal standard) added to determine the particle density.
  • the lower histograms in FIGS. 12A and 12B correspond to Nile red-stained cells included in the preculture.
  • the fluorescence intensity per cell was changed to a preculture (with nitrogen source) culture sample cultured for 4 days, a culture sample after 6 days after replacing with a nitrogen source medium.
  • the culture sample increased compared to the parent strain.
  • the fluorescence intensity of Nile red-derived fluorescence in the GSH1 overexpressing strain was about 10 times 0.5 times (approximately 3, 2 times) stronger than that of the parent strain (wild type strain).
  • FIG. 13 shows the results of examining the state of the GSH1 overexpressing strain
  • (a) is a diagram showing the correlation between the cell size of the GSH1 overexpressing strain and the complexity inside the cell
  • (b) is the GSH1 It is a figure showing the correlation with the magnitude
  • (c) is a cell size regarding the cell contained in the area
  • D) is a diagram showing the correlation between the cell size of the parent strain (wild-type strain) and the complexity inside the cell.
  • a gate is applied to a group of particles that emit fluorescence strongly in FIG. 13B (particles in a region surrounded by a square in FIG. 13B). I found that the cells were shining strongly. On the other hand, it was found that the microparticles released from the cells (that is, the population of microparticles to which the starch granules belong) did not shine. From the above, it was confirmed that fine particles composed of fats and oils were not included in the group of fine particles that showed forward scattering equivalent to starch granules and side scattering equivalent to starch granules.
  • the fluorescence derived from Nile Red is emitted strongly when the cell remains in its form.
  • the flow cytometer FCM It cannot be detected (it is difficult to detect). For this reason, when the cell collapse in the GSH1 overexpressing strain progressed, it was considered that the difference in the amount of oil and fat between the GSH1 overexpressing strain and the parent strain (wild type strain) could be estimated to be smaller than actual.
  • fatty acids were extracted from each cell, and quantitative quantitative analysis was performed. Specifically, the same cells (GSH1 overproducing strains as those subjected to the flow cytometry described above under a continuous light of 80 ⁇ E / m 2 / sec in a TAP medium containing a nitrogen source or a TAP medium not containing a nitrogen source. And the fatty acids produced by GSH1 overexpressing strains by the method developed by Bligh and Dyer (see Can. J. Biochem. Physiol.
  • the samples provided for GC / MS are the following four types: (i) Parent strain (wild-type strain) cultured in the presence of nitrogen (ii) Parent strain (wild-type strain) cultured under nitrogen starvation conditions (iii) GSH1 overexpressing strain cultured in the presence of nitrogen (iv) GSH1 overexpressing strain cultured under nitrogen starvation conditions.
  • Pentadecanoic acid manufactured by GL Sciences, model number 1021-43150
  • palmitic acid manufactured by Sigma, model number P0500
  • palmitoleic acid manufactured by Sigma, model number P9417
  • stearic acid manufactured by Sigma, model number S4751
  • oleic acid Sigma, Model No. O1008
  • Linoleic acid Sigma, Model L1376)
  • Linolenic acid Sigma, Model L2376
  • FIG. 14 is a diagram showing the results of gas chromatograph mass spectrometry. As shown in FIG. 14, a peak corresponding to palmitic acid (C 16: 0 ) contained in the standard product was observed in all samples. As a result, it was confirmed that palmitic acid was produced as a fatty acid in the parent strain (wild type strain) and the GSH1 overexpression strain.
  • Table 8 shows the results of quantifying the amount of fat and oil contained in the parent strain (wild type strain) and the GSH1 overexpressing strain.
  • Example 8 It has been reported that the Chlamydomonas reinhardi sta6 deficient mutant (also referred to as “sta6 mutant”) has a higher fat content than the wild type (Chlamydomonas reinhardi STA6) strain. When the oil body, which is a reservoir of intracellular fats and oils, is stained with Nile Red, the sta6 mutant has been reported to be larger and contain more oil bodies than the wild type (Wang et al. ( 2009) Eukaryotic Cell Vol. 8 (12): 1856-1868.
  • a GSH1 overexpression strain was prepared using a sta6 deletion mutant as a parent strain. Specifically, in place of Chlamydomonas reinhardi CC503 strain, the same method as Example 1 was used except that CC4333 strain (Chlamydomonas Center, US, Duke University) was used instead of sta6 mutant.
  • a GSH1 overexpressing strain (referred to as “GSH1 overexpressing strain (sta6 - background)”) was prepared.
  • Figure 15 is GSH1 overexpressing strain represents the results of examining the state of, (a) shows the parent strain (STA6 - - background) and its parent strain (sta6) (sta6 -) cell size and cell interior of the complexity It is a figure showing a correlation, (b) is a figure showing the correlation with the cell size of a GSH1 overexpression strain (sta6 - background), and the complexity inside a cell.
  • GSH1 overexpressing strain STA6 - background
  • parent strain STA6 -
  • GSH1 overexpressing strain means that the difference between the structure of the size and the cells of the cell is not recognized between the - - and (STA6 background) parent strain (STA6) Yes.
  • TAP medium 100 ml of TAP medium was inoculated with a GSH1 overexpressing strain (sta6 - background) and pre-cultured under continuous light at 17 ⁇ E / m 2 / sec for 5 days. Thereafter, the cells contained in the 90 mL culture were collected by centrifugation (2,000 g, 5 minutes). The medium was changed by resuspending the collected cells in TAP medium with 90 mL of fresh nitrogen source or TAP medium without 90 mL of fresh nitrogen source, and 80 ⁇ E / m 2 / sec continuously for 3 days. Cultured under light. Cells were stained with Nile Red at the end of preculture and 3 days after medium change, and the stained cells were subjected to flow cytometry. As a control, GSH1 overexpressing strain - a parent strains (STA6 background) STA6 mutant (CC4333 strain, STA6 -) The same experiment was performed using.
  • STA6 background parent strains
  • STA6 mutant CC4333 strain, STA6
  • FIG. 16 is a front GSH1 overexpressing strain of 3 days after and after medium exchange culture (STA6 - background) and its parent strain (STA6 -) represents the results of examining the oil producing ability of, (a) shows the front after cultivation
  • FIG. 2 is a graph showing cell histograms showing Nile red-derived fluorescence in a GSH1 overexpressing strain (sta6 — background) and its parent strain (sta6 ⁇ ), and
  • (b) is a GSH1 overexpressing strain on day 3 after medium replacement is a diagram representing the histogram of cells showing fluorescence from Nile Red in (STA6 - - background) and its parent strain (STA6).
  • the parent strain (STA6 -) of the results are expressed in dark gray histograms
  • GSH1 overexpressing strain (STA6 - background) results are expressed in light gray histograms.
  • GSH1 overexpressing strain of 3 days after medium exchange (STA6 - Background)
  • Example 9 The GSH1 overexpression strain prepared in Example 1 was inoculated into Tris-acetate-phosphate (TAP) medium, pH 7 (see Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 54, 1665-1669.), And 24 ° C.
  • TEP Tris-acetate-phosphate
  • the culture was carried out under semi-heterotrophic conditions in which the sample was placed in the culture chamber, shaken, and irradiated with continuous light of 100 ⁇ E / m 2 / sec. Every two days, cells contained in 1 mL cultures were collected and chlorophyll a and chlorophyll b were extracted using a solvent whose composition was 80% acetone / 20% water.
  • FIG. 17 is a diagram showing the results of examining the amount of chlorophyll in the GSH1 overexpressing strain prepared in Example 1.
  • the total amount of chlorophyll increases with cell growth from the 4th day to the 10th day of culture. Reduced by decomposition.
  • the total amount of chlorophyll reached the maximum value on the 10th day of culture and was 3.8 ⁇ g / mL per culture. This is smaller than the total amount of chlorophyll of the parent strain (wild type strain) of 7.6 ⁇ g / mL. That is, the total amount of chlorophyll per culture broth is less in the GSH1 overexpressing strain than in the parent strain (wild type strain) throughout the entire culture period.
  • Example 10 For the purpose of expressing gshA, a ⁇ -glutamylcysteine synthetase gene derived from E. coli, in a cyanobacterium (Cyanobacteria) Synechococcus, a recombinant DNA molecule was prepared by the following procedure.
  • the obtained DNA fragment of about 3.4 kb was ligated with the plasmid vector pZero2 (registered trademark, Invitrogen) with the restriction enzyme EcoRV and ligated with T4 DNA ligase and amplified using Escherichia coli.
  • the size of the degradation product by various restriction enzymes was examined, and it was confirmed that a plasmid having a gene region allowing DNA replication autonomously in the target cyanobacteria was completed. This plasmid was named “pZero2-pAQ1-ori”.
  • a gene cassette for expressing E. coli gshA by CAT read-through was placed on a plasmid that autonomously replicates in cyanobacteria.
  • amplification was performed by the PCR method using two types of PCR primers (SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17) using pACYC184R-SmaI-E.c.gshA prepared in the procedure (3) as a template.
  • the obtained about 2.7 kb PCR fragment and the about 6.2 kb DNA fragment generated by digesting pZero2-pAQ1-ori prepared in step (4) with restriction enzyme StuI were ligated with T4 DNA ligase, Amplification was performed using E. coli.
  • the size of the degradation product by various restriction enzymes was examined, and it was confirmed that a plasmid having a gene region allowing autonomous DNA replication in the target cyanobacteria and a gene cassette of CAT-gshA was completed.
  • This plasmid was named “pSyn5”.
  • a plasmid for use in a control experiment for introducing pSyn5 into cyanobacteria was constructed. This is a plasmid that has only CAT and no gshA.
  • amplification was performed by the PCR method using two types of PCR primers (SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 18) using pACYC184 as a template.
  • the obtained about 1.1 kb PCR fragment and pZero2-pAQ1-ori prepared in step (4) were digested with the restriction enzyme StuI, and the about 6.2 kb DNA fragment was ligated with T4 DNA ligase.
  • Amplification was performed using E. coli.
  • the size of the degradation product by various restriction enzymes was examined, and it was confirmed that a plasmid having a gene region and a CAT gene that allowed DNA replication autonomously in the target cyanobacteria was completed.
  • This plasmid was named “pSyn3”.
  • Plasmids pSyn5 and pSyn3 were separately introduced into the cyanobacterium Synechococcus strain PC7002 by a known method (see Fringaard et al. (2004) Methods Molecular Biology, Vol.274, 325-340).
  • the transformants into which the respective plasmids were introduced were named “E.c.gshA plus strain” and “E.c.gshA minus strain”.
  • E. c. In the gshA plus strain ⁇ -glutamylcysteine synthetase derived from E. coli functions.
  • E.I. c. In the gshA minus strain there is no ⁇ -glutamylcysteine synthetase derived from E. coli.
  • these 2 kinds of cyanobacteria are separately added to 80 mL of Daigo medium (1 L of purified water, 500 mg of Daigo IMK medium (Nippon Pharmaceutical Co., Ltd., model number 398-01333), and 36 g of artificial seawater SP (Nippon Pharmaceutical Co., Ltd., model number 395-01343) , 1 g of trishydroxymethylaminomethane (manufactured by Nacalai, model number 35434-21), 1 g of sodium bicarbonate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, model number 198-01315), 10 mg of chloramphenicol (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, model number 034-10572) was dissolved while being sterilized by filtration, stirred while ventilating the atmosphere, kept at 30 ° C., irradiated with continuous light of 70 ⁇ E / ⁇ E / m 2 / sec, and cultured for 3 days.
  • Daigo medium 1 L of purified water, 500 mg
  • FIG. 18 shows E. coli, which is a transformant of cyanobacteria. c. gshA plus strain and E. coli. c. It is a figure showing the result of having investigated the absorption spectrum of the pigments extracted from the gshA minus strain.
  • A in FIG. c. It is a figure showing the absorption spectrum of a gshA plus strain, (b) c. It is a figure showing the absorption spectrum of a gshA minus strain, (c) c. From the spectrum of the gshA plus strain, c. It is a figure showing the spectrum which deducted the spectrum of the gshA minus strain. Similar to the results obtained in Example 9, E.
  • biomass can be produced from algae efficiently at a lower cost than in the past.
  • Biomass is expected to be used as a raw material for biofuels. Therefore, the present invention can be used in a wide range of industries such as the energy industry.

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Abstract

　光合成産物の生産性が向上した藻類およびその利用を提供する。本発明に係る藻類は、葉緑体内のグルタチオン濃度が増加している。また、本発明に係るバイオマスの製造方法は、本発明に係る藻類または本発明に係る藻類の製造方法によって製造された藻類を用いてバイオマスを製造する。

Description

光合成産物の生産性を向上させた藻類およびその利用
　本発明は、光合成産物の生産性を向上させた藻類およびその利用に関し、具体的には、光合成産物の生産性を向上させた藻類、当該藻類の製造方法、および当該藻類を用いたバイオマスの製造方法に関する。
　化石燃料に代わる燃料として、バイオマス由来の燃料、いわゆるバイオ燃料（例えば、バイオエタノール、バイオディーゼル等）が期待されている。
　バイオ燃料の原料となる糖類（例えば、デンプン）や油脂等のバイオマスは、植物が光合成を行うことによって産生される。このため、光合成を活発に行い、糖類または油脂を細胞内に蓄積する能力を有する植物は、バイオマスの生産手段として利用可能である。現在、バイオマスを生産するために、主に、トウモロコシやダイズが利用されている。トウモロコシやダイズは、食料や飼料としても利用されている。このため、バイオ燃料の大幅な増産によって引き起こされる、食料および飼料の価格の高騰が問題視されている。
　そこで、トウモロコシやダイズに代わるバイオマス生産手段として、藻類によるバイオマス生産が注目されている（例えば、特許文献１および特許文献２を参照）。藻類によるバイオマス生産は、食料や飼料と競合しない、大量に増殖させることができる、等の利点がある。
　例えば、藻類の一種であるクラミドモナスについて、細胞壁が欠損した変異体あるいは細胞壁が薄くなる変異体が知られている（ｃｗ１５，ｃｗ９２等）。これらの変異体は、ＤＮＡを外部から細胞内へ導入する際に都合のよい性質であるため、遺伝子導入実験では広く使われている。また細胞が壊れやすいため、細胞内容物の回収が容易という意味でバイオマスの生産性を高めることから、これらの変異体を利用したバイオマス生産について報告されている。例えば、特許文献３には、クラミドモナスにおける細胞壁が欠損した変異体を用いて油脂を生産させる技術が記載されている。また、非特許文献１には、細胞壁変異（ｃｗ１５）に加え、でんぷん合成遺伝子の欠損を有しているクラミドモナスは、油脂からなる油滴が細胞外へ放出されることが報告されている。非特許文献２には、クラミドモナスの細胞壁変異体（ｃｗ１５）において、デンプン合成の遺伝子を破壊することで油脂の生産性が高まることが報告されている。また、クラミドモナス細胞壁の変異に関するレポートとして、非特許文献３が知られている。
　また、藻類の一種であるクロレラを材料として、生産したデンプンを細胞外へ放出させ、続いてエタノール発酵を行う技術も報告されている（特許文献４）。
日本国公開特許公報「特開平１１－１９６８８５号公報（１９９９年０７月２７日公開）」 日本国公開特許公報「特開２００３－３１０２８８号公報（２００３年１１月０５日公開）」 国際公開第２００９／１５３４３９号パンフレット（２００９年１２月２３日公開） 日本国公開特許公報「特開２０１０－８８３３４号公報（２０１０年　４月２２日公開）」
Zi Teng Wang, Nico Ullrich, Sunjoo Joo, Sabine Waffenschmidt, and Ursula Goodenough (2009) Eukaryotic Cell Vol. 8 (12): 1856-1868. Algal Lipid Bodies: Stress Induction, Purification, and Biochemical Characterization in Wild-Type and Starchless Chlamydomonas reinhardtii. Yantao Li, Danxiang Han, Guongrong Hu, David Dauvillee, Milton　Sommerfeld, Steven Ball and Qiang Hu (2010) Metabolic Engineering Vol. 12 (4): 387-391. Chlamydomonas starchless mutant defective in ADP-glucose pyrophosphorylase hyper-accumulates triacylglycerol. Hyams, J., Davies, D.R. (1972) Mutation Research 14 (4): 381-389. The induction and characterisation of cell wall mutants of Chlamydomonas reinhardi.
　しかし、上述のような藻類を用いたバイオマスの生産技術では、生産性の面で問題がある。例えば、酢酸などの炭素源を用いて従属栄養条件にて藻類を培養しバイオマスを生産する場合、藻類におけるバイオマスの生産・蓄積を誘導するためには、窒素飢餓状態にする等の栄養制限工程が必要となる。一般的に、窒素を含有している培養液を用いて藻類を増殖培養させるため、窒素飢餓状態にするためには、窒素を含有しない培養液に交換する必要がある。このため、工程が複雑化し生産性が低下したりコストが高くなったりするという問題点がある。
　本発明は、上記従来の問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、栄養制限工程を行うことなく、バイオマスの生産性を向上させ得る藻類およびその利用を提供することにある。
　本発明者らは、上記課題を解決することを主な目的として、種々の検討を重ねた結果、藻類の葉緑体内のグルタチオン濃度を人為的に増加させた結果、窒素飢餓状態等の栄養制限工程を行わずとも、藻類の細胞内におけるバイオマスの生産性を向上させ得ることを見出し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明に係る藻類は、葉緑体内のグルタチオン濃度が増加していることを特徴としている。
　本発明に係る藻類の製造方法は、上述した藻類を製造する方法であって、
　藻類の葉緑体内のグルタチオン濃度を増加させる、グルタチオン濃度増加工程を含むことを特徴としている。
　本発明に係るバイオマスの製造方法は、本発明に係る藻類または本発明に係る藻類の製造方法によって製造された藻類を用いることを特徴としている。
　本発明に係るバイオマスの製造方法は、藻類の葉緑体内のグルタチオン濃度を増加させる物質の存在下にて、藻類を培養する工程を含むことを特徴としている。
　本発明に係る藻類は、藻類の葉緑体内のグルタチオン濃度が増加していることにより、窒素飢餓状態にせずとも、藻類の細胞内における光合成産物の生産性を向上させ得る。このため、本発明に係る藻類を用いれば、光合成産物の蓄積を誘導するための窒素を含有していない培養液への交換が不要となる。つまり、本発明によれば、光合成産物の蓄積の誘導を、容易かつ効率よく行うことができる。それゆえ、本発明に係るバイオマスの製造方法によれば、従来よりも安価に、効率よく藻類からバイオマスを製造することできる。
　本発明の他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分分かるであろう。また、本発明の利点は、添付図面を参照した次の説明で明白になるであろう。
実施例１で作製したＧＳＨ１過剰発現株の増殖能およびデンプン産生能を調べた結果を表し、（ａ）は、ＧＳＨ１過剰発現株の増殖能を表すグラフであり、（ｂ）は、培養開始３０９時間後の培養液の状態を表す図であり、（ｃ）は、試料４におけるヨウ素デンプン反応の結果を表す図である。 親株（野生型株）の増殖能およびデンプン産生能を調べた結果を表し、（ａ）は、親株（野生型株）の増殖能を表すグラフであり、（ｂ）は、培養開始２１５時間後の培養液の状態を表す図である。 試料８の親株（野生型株）の状態を調べた結果を表し、（ａ）は、試料８の親株（野生型株）におけるクロロフィル由来の蛍光を示す細胞（粒子）のヒストグラムを表す図であり、（ｂ）は、試料８の親株（野生型株）の培養物中に浮遊する粒子の大きさと粒子内部の複雑さとの相関を表す図である。 試料４のＧＳＨ１過剰発現株の状態を調べた結果を表し、（ａ）は、試料４のＧＳＨ１過剰発現株におけるクロロフィルの蛍光を示す細胞（粒子）のヒストグラムを表す図であり、（ｂ）は、試料４のＧＳＨ１過剰発現株の培養物中に浮遊する粒子の大きさと粒子内部の複雑さとの相関を表す図である。 （ａ）は、試料９および試料１０における、クロロフィル由来の蛍光を示す粒子、すなわち細胞の密度およびクロロフィル由来の蛍光を示さない粒子、すなわちデンプン粒の密度の経時的な変化を表すグラフであり、（ｂ）は、試料９および試料１０における、培養液あたりのデンプン量の経時的な変化を表すグラフであり、（ｃ）は、試料９および試料１０における、細胞あたりのデンプン量の経時的な変化を表すグラフである。なお、（ｂ）および（ｃ）の凡例中にある「TAP normal」、「TAP N-free」は、それぞれ「窒素源を含むＴＡＰ培地」、「窒素源を含まないＴＡＰ培地」の意味である。 （ａ）は、試料１１および試料１２における、クロロフィル由来の蛍光を示す粒子、すなわち細胞の密度およびクロロフィル由来の蛍光を示さない粒子、すなわちデンプン粒の密度の経時的な変化を表すグラフであり、（ｂ）は、試料１１および試料１２における、培養液あたりのデンプン量の経時的な変化を表すグラフであり、（ｃ）は、試料１１および試料１２における、細胞あたりのデンプン量の経時的な変化を表すグラフである。なお、（ｂ）および（ｃ）の凡例中にある「TAP normal」、「TAP N-free」は、それぞれ「窒素源を含むＴＡＰ培地」、「窒素源を含まないＴＡＰ培地」の意味である。 （ａ）は、ＧＳＨ１過剰発現株および親株（野生型株）における、クロロフィル由来の蛍光を示す粒子の密度およびクロロフィル由来の蛍光を示さない粒子の密度の経時的な変化を表すグラフであり、（ｂ）は、培養液あたりのデンプン量の経時的な変化を表すグラフである。 ＧＳＨ１過剰発現株および親株（野生型株）におけるヨウ素デンプン反応の結果を表す図である。 ＧＳＨ１過剰発現株の増殖能を調べた結果を表す図である。 各継代時点でのＧＳＨ１過剰発現株の状態を調べた結果を表し、（ａ）は、図９に示す「継代１」を行ったときのＧＳＨ１過剰発現株の細胞の大きさと細胞内部の複雑さとの相関を表す図であり、（ｂ）は、図９に示す「継代２」を行ったときのＧＳＨ１過剰発現株の細胞の大きさと細胞内部の複雑さとの相関を表す図であり、（ｃ）は、図９に示す「継代３」を行ったときのＧＳＨ１過剰発現株の細胞の大きさと細胞内部の複雑さとの相関を表す図である。 ＧＳＨ１過剰発現株から細胞外へ放出されたデンプン粒の形状を観察した結果を示す図であり、（ａ）は、デンプン粒を、走査型電子顕微鏡を用いて観察した結果を表す図であり、（ｂ）は、ＧＳＨ１過剰発現株から放出されたデンプン粒のおけるヨウ素デンプン反応の結果を表す図であり、（ｃ）は、ＧＳＨ合成酵素の阻害剤であるＢＳＯを終濃度が８ｍＭとなるように培地へ添加した場合の、ＧＳＨ１過剰発現株のデンプン産生能を表す図である。 ＧＳＨ１過剰発現株の油脂産生能を調べた結果を表し、（ａ）は、親株（野生型株）におけるナイルレッド由来の蛍光を示す細胞のヒストグラムを表す図であり、（ｂ）は、ＧＳＨ１過剰発現株におけるナイルレッド由来の蛍光を示す細胞のヒストグラムを表す図であり、（ｃ）は、ナイルレッド染色した親株（野生型株）の共焦点レーザー顕微鏡による観察結果を表す図であり、（ｄ）は、ナイルレッド染色したＧＳＨ１過剰発現株の共焦点レーザー顕微鏡による観察結果を表す図である。 ＧＳＨ１過剰発現株の状態を調べた結果を表し、（ａ）は、ＧＳＨ１過剰発現株の細胞の大きさと細胞内部の複雑さとの相関を表す図であり、（ｂ）は、ＧＳＨ１過剰発現株の細胞の大きさとナイルレッド由来の蛍光強度との相関を表す図であり、（ｃ）は、（ｂ）の図において四角で囲った領域に含まれている細胞に関して、細胞の大きさと細胞内部の複雑さとの相関を表す図であり、（ｄ）は、親株（野生型株）の細胞の大きさと細胞内部の複雑さとの相関を表す図である。 ガスクロマトグラフ質量分析の結果を表す図である。 ＧＳＨ１過剰発現株（ｓｔａ６－背景）およびその親株（ｓｔａ６－）の状態を調べた結果を表し、（ａ）は、親株（ｓｔａ６－）の細胞の大きさと細胞内部の複雑さとの相関を表す図であり、（ｂ）は、ＧＳＨ１過剰発現株（ｓｔａ６－背景）株の細胞の大きさと細胞内部の複雑さとの相関を表す図である。 前培養後および培地交換後３日目のＧＳＨ１過剰発現（ｓｔａ６－背景）およびその親株（ｓｔａ６－）の油脂産生能を調べた結果を表し、（ａ）は、前培養後のＧＳＨ１過剰発現株（ｓｔａ６－背景）およびその親株（ｓｔａ６－）におけるナイルレッド由来の蛍光を示す細胞のヒストグラムを表す図であり、（ｂ）は、培地交換後３日目のＧＳＨ１過剰発現株（ｓｔａ６－背景）およびその親株（ｓｔａ６－株）におけるナイルレッド由来の蛍光を示す細胞のヒストグラムを表す図である。 実施例１で作製したＧＳＨ１過剰発現株のクロロフィル量を調べた結果を表す図である。 ラン藻の形質転換体である、Ｅ．ｃ．ｇｓｈＡプラス株およびＥ．ｃ．ｇｓｈＡマイナス株より抽出した色素類の吸光スペクトルを調べた結果を表し、（ａ）は、Ｅ．ｃ．ｇｓｈＡプラス株の吸光スペクトルを表す図であり、（ｂ）は、Ｅ．ｃ．ｇｓｈＡマイナス株の吸光スペクトルを表す図であり、（ｃ）は、Ｅ．ｃ．ｇｓｈＡプラス株のスペクトルからＥ．ｃ．ｇｓｈＡマイナス株のスペクトル差し引いたスペクトルを表す図である。 （ａ）は、試料９および試料１０における、クロロフィル由来の蛍光を示す粒子、すなわち細胞の密度およびクロロフィル由来の蛍光を示さない粒子、すなわちデンプン粒の密度の経時的な変化を表すグラフであり、（ｂ）は、試料９および試料１０における、培養液あたりのデンプン量の経時的な変化を表すグラフであり、（ｃ）は、試料９および試料１０における、細胞あたりのデンプン量の経時的な変化を表すグラフである。なお、（ｂ）および（ｃ）の凡例中にある「TAP normal」、「TAP N-free」は、それぞれ「窒素源を含むＴＡＰ培地」、「窒素源を含まないＴＡＰ培地」の意味である。 （ａ）は、試料１１および試料１２における、クロロフィル由来の蛍光を示す粒子、すなわち細胞の密度およびクロロフィル由来の蛍光を示さない粒子、すなわちデンプン粒の密度の経時的な変化を表すグラフであり、（ｂ）は、試料１１および試料１２における、培養液あたりのデンプン量の経時的な変化を表すグラフであり、（ｃ）は、試料１１および試料１２における、細胞あたりのデンプン量の経時的な変化を表すグラフである。なお、（ｂ）および（ｃ）の凡例中にある「TAP normal」、「TAP N-free」は、それぞれ「窒素源を含むＴＡＰ培地」、「窒素源を含まないＴＡＰ培地」の意味である。
　以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。ただし、本発明はこれに限定されるものではなく、記述した範囲内で種々の変形を加えた態様で実施できるものである。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。なお、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ～Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」を意味する。
　〔１．本発明に係る藻類〕
　本発明に係る藻類は、葉緑体内のグルタチオン濃度が増加したものであればよく、その他の構成は限定されないが、光合成産物の生産性が向上している藻類であることが好ましい。
　ここで、本発明において、「葉緑体内のグルタチオン濃度が増加している」とは、同一種の野生型藻類の葉緑体内のグルタチオン濃度と比較して、葉緑体内のグルタチオン濃度が高いことを意味する。同一条件で栽培した同一種の野生型藻類の葉緑体内のグルタチオン濃度と比較して、葉緑体内のグルタチオン濃度が１．１倍以上である場合に、葉緑体内のグルタチオン濃度が増加していると判断することが好ましく、さらにｔ検定で５％レベルの有意差がある場合に、葉緑体内のグルタチオン濃度が増加していると判断することがより好ましい。なお、野生型藻類の葉緑体内のグルタチオン濃度は同一の方法で同時に測定したものであることが好ましいが、背景データとして蓄積されているデータを用いてもよい。
　藻類の葉緑体内のグルタチオン濃度は、レドックス状態を反映して色調が変化する分子プローブである、ｒｏＧＦＰ２を葉緑体内に存在させる方法によって直接測定することができる（例えば、Meyer AJ, et al. (2007) Plant Journal 52: 973-986.Redox-sensitive GFP in Arabidopsis thaliana is a quantitative biosensor for the redox potential of the cellular glutathione redox buffer. およびGutscher M, et al. (2008) Nat Methods 5: 553-559. Real-time imaging of the intracellular glutathione redox potential.を参照）。またこれ以外にも、グルタチオン生合成系に関与するタンパク質の発現量、または該タンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現量を指標として、これらが増加している場合にグルタチオン濃度が増加していると間接的に測定することもできる。タンパク質やポリヌクレオチドの発現量の測定方法については従来公知の手法を好適に利用できる。
　上記「グルタチオン」としては、還元型グルタチオン（以下、「ＧＳＨ」という。）および酸化型グルタチオン（以下、「ＧＳＳＧ」）がある。本発明に係る方法においては、ＧＳＨまたはＧＳＳＧのどちらか一方のグルタチオンの濃度を増加させればよく、ＧＳＨおよびＧＳＳＧの両方の濃度を増加させてもよい。
　また、「光合成産物の生産性が向上する」とは、同一種の野生型藻類の光合成産物の生産性と比較して、光合成産物の生産性が多いことを意味する。同一条件で栽培した同一種の野生型藻類の光合成産物の生産性と比較して、光合成産物の生産性が１．１倍以上である場合に、光合成産物の生産性が向上していると判断することが好ましく、さらにｔ検定で５％レベルの有意差がある場合に、光合成産物の生産性が向上していると判断することがより好ましい。例えば、照射する光の条件（光量、強度、時間等）、投与する栄養素、単位時間あたり、飢餓状態とさせる工程が必須か否か、培養温度等の種々の観点で生産性を評価することができる。
　なお、本明細書において、上記「光合成産物（photosynthate）」とは、藻類が光合成による炭素固定によって産生する物質を指し、具体的には、例えば、糖類（例えば、デンプン）、油脂等のバイオマスおよびその派生物（代謝産物等）を指す。なお、ここで言う光合成による炭素固定とは、光エネルギーに由来する化学エネルギーを利用した炭素化合物の代謝全般を指す。従って、代謝系に取り込まれる炭素の由来は、二酸化炭素等の無機化合物に限らず、酢酸等の有機化合物も含まれる。
　本明細書において、上記「藻類」としては、光合成能力を有し、光合成産物を生成可能な藻類であれば、特に制限されない。このような藻類としては、例えば、緑藻植物門の緑藻綱に分類される微細藻類が挙げられ、さらに具体的には、緑藻綱のクラミドモナス属に属するクラミドモナス・ラインハルディ（Chlamydomonas reinhardtii）、クラミドモナス・モエブシイ（Chlamydomonas moewusii）、クラミドモナス・ユーガメタス（Chlamydomonas eugametos）、クラミドモナス・セグニス（Chlamydomonas segnis）等；緑藻綱のドナリエラ属に属するドナリエラ・サリナ（Dunaliella salina）、ドナリエラ・テルチオレクタ（Dunaliella tertiolecta）、ドナリエラ・プリモレクタ（Dunaliella primolecta）等；緑藻綱のクロレラ属に属するクロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）、クロレラ・ピレノイドーサ（Chlorella pyrenoidosa）等；緑藻綱のヘマトコッカス属に属するヘマトコッカス・プルビアリス（Haematococcus pluvialis）等；緑藻綱のクロロコックム属に属するクロロコックム・リトラエ（Chlorococcum littorale）等；緑藻綱または黄緑色藻綱のボトリオコッカス属に属するボトリオコッカス・ブラウニー（Botryococcus braunii）等；緑藻綱のコリシスチス属に属するコリシスチス・マイナー（Choricystis minor）等；緑藻綱のシュードコリシスチス属に属するシュードコリシスチス・ エリプソイディア（Pseudochoricystis ellipsoidea）等；珪藻綱のアンフォーラ属に属するアンフォーラ（Amphora sp.）等；珪藻綱のニッチア属に属するニッチア・アルバ（Nitzschia alba）、ニッチア・クロステリウム（Nitzschia closterium）、ニッチア・ラエビス（Nitzschia laevis）等；渦鞭毛藻綱のクリプセコディニウム属に属するクリプセコディニウム・コーニー（Crypthecodinium cohnii）等；ミドリムシ綱のミドリムシ属に属するユーグレナ・グラチリス（Euglena gracilis）、ユーグレナ・プロキシマ（Euglena proxima）等；繊毛虫門のゾウリムシ属に属するミドリゾウリムシ（Paramecium bursaria）等；藍藻門のシネココッカス属に属するシネココッカス・アクアティリス（Synechococcus aquatilis）、シネココッカス・エロンガタス（Synechococcus elongatus）等；藍藻門スピルリナ属に属するスピルリナ・プラテンシス（Spirulina platensis）、スピルリナ・スブサルサ（Spirulina subsalsa）等；藍藻門のプロクロロコッカス属に属するプロクロロコッカス・マリウス（Prochlorococcus marinus）等；藍藻門のオーシスチス属に属するオーシスチス・ポリモルファ（Oocystis polymorpha）等；等が例示される。
　葉緑体内のグルタチオン濃度が増加している藻類を取得する方法は特に制限されない。かかる方法については、後述する「２．本発明に係る藻類の製造方法」の項で具体的に説明する。
　本発明に係る藻類は、葉緑体において、γ－グルタミルシステイン合成酵素（以下、「ＧＳＨ１」と称する場合もある。）、グルタチオン合成酵素（以下、「ＧＳＨ２」と称する場合もある。）、ＡＴＰスルフリラーゼ、アデノシン５’－ホスホ硫酸還元酵素、亜硫酸還元酵素、システイン合成酵素およびセリンアセチル転移酵素からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質の発現量および／または活性が増加していることが好ましい。これらのタンパク質は、葉緑体内のグルタチオン生合成系に関与する酵素であり、これらの発現量の増加が、すなわち葉緑体内のグルタチオン濃度の増加と把握することができる。
　また、本発明に係る藻類は、ＧＳＨ１、ＧＳＨ２、ＡＴＰスルフリラーゼ、アデノシン５’－ホスホ硫酸還元酵素、亜硫酸還元酵素、システイン合成酵素およびセリンアセチル転移酵素からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが導入されていてもよい。かかる外因性ポリヌクレオチドが導入され、且つ（過剰）発現されている藻類とは、すなわち葉緑体内のグルタチオン濃度が増加した藻類であるといえる。
　換言すれば、本発明は、ＧＳＨ１、ＧＳＨ２、ＡＴＰスルフリラーゼ、アデノシン５’－ホスホ硫酸還元酵素、亜硫酸還元酵素、システイン合成酵素およびセリンアセチル転移酵素からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが導入されており、葉緑体内のグルタチオン濃度が増加した形質転換藻類を提供するものであるといえる。かかる形質転換藻類は、当然のことながら、光合成産物の生産性が向上しているものである。
　また、本発明に係る藻類では、上記γ－グルタミルシステイン合成酵素をコードするポリヌクレオチドが、以下の（ａ）～（ｄ）からなる群より選択されてもよい：
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つγ－グルタミルシステイン合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｄ）上記（ａ）～（ｃ）のポリヌクレオチドのうちいずれかのポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つγ－グルタミルシステイン合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。上記（ａ）～（ｄ）のポリヌクレオチドの詳細については後述する。
　なお、本発明の藻類において、上記ポリヌクレオチドが藻類の細胞内に導入されていることは、従来公知のＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等によって確認することができる。また、ポリヌクレオチドがコードするタンパク質の発現を、従来公知の免疫学的手法により測定することでも確認可能である。また、ポリヌクレオチドがコードするタンパク質が示す酵素活性を、従来公知の生化学的手法により測定することでも確認可能である。
　本発明の藻類は、藻類の葉緑体内のグルタチオン濃度が増加していることにより、窒素飢餓状態にせずとも、藻類の細胞内における光合成産物の生産および／または蓄積を誘導し得る。このため、本発明の藻類を用いれば、光合成産物の蓄積を誘導するための窒素を含有していない培養液への交換が不要となる。
　本発明の作用効果を野生型と対比して説明すると以下の通りである。まず、従属栄養条件（酢酸などの炭素源がある場合）において窒素飢餓状態とした場合、野生型の藻類は、増殖期にわずかに細胞内に光合成産物を蓄積し、また定常期に光合成産物を蓄積するが、細胞外ではほとんど光合成産物が検出されない。これに対して、本発明に係る藻類では、増殖期（対数増殖期）および定常期のいずれにおいても光合成産物を生産・蓄積し、さらに細胞外にて多量の光合成産物が検出される。また、従属栄養条件において窒素飢餓状態としない場合、野生型の藻類は、増殖期にほんのわずか細胞内に光合成産物を蓄積するが、定常期にはさらにその蓄積は低下し、細胞外ではほとんど検出されない。一方、本発明に係る藻類では、増殖期および定常期のいずれにおいても光合成産物を生産・蓄積し、細胞外においても多くの光合成産物が検出される。
　次に、独立栄養条件（光合成による二酸化炭素固定に依存して増殖する条件）では、一般的に野生型の藻類では、窒素飢餓時の光合成産物蓄積誘導に要する光量は、従属栄養条件の場合より多く必要となる。これに対して、本発明に係る藻類では、特に光強度を強くせずとも光合成産物は産生され続ける。もちろん、照射する光が強いほど本発明に係る藻類においても光合成産物の生産性は向上する。例えば、藻類としてクラミドモナスを利用する場合、その特性から、光合成産物の生産にはより強い光を照射する方が有利であるが、野生型の藻類に比べて、本発明に係る藻類は光量による光合成産物の蓄積制限は極めて限定的である点が特徴といえる。
　また、本発明の藻類は、培養密度が小さく維持されるという特徴がある。このため、本発明の藻類は、光の利用効率が高い。よって、同じ光量（明るさ）でも、同一種の野生型藻類と比べて、より多くの光合成産物を生産・蓄積させることができる。一般に、細胞密度が適当なレベルにある（例えば、野生型より低く維持される）場合、光の利用効率の点で有用性がある。つまり、光合成産物の生産能力は、細胞密度が上昇するにつれ、培養槽表層に存在する細胞による“日陰効果”で、培養槽深層に到達する光が減衰されるので、ある点で頭打ちになるという問題があるが、本発明の藻類では、培養密度が野生型に比べて小さく維持されるため、このような問題を回避できる。
　さらに、本発明の藻類は、培養時間に応じて、直線的にデンプン粒の蓄積を増加できる。このため、このような培養状態を、水の補給または培地の添加によって維持することにより、いわゆる連続培養によって、光合成産物を連続的に生産できる（例えば、デンプンをデンプン粒として連続的に生産する等）。
　あるいは、本発明の藻類は、培養密度を上げるための空間的余地が野生型に比べて大きい。人為的操作（例えば、ろ過工程等による細胞分散媒（例えば、水分）の減量など）により、光合成産物の生産性が飽和する限度にまで、その培養密度を上昇させて、光合成産物を効果的に生産することもできる。
　また、本発明の藻類は、休止細胞が少ない。このため、本発明の藻類を用いてバイオマスを製造すれば、歩留まりがよく、培養液を節約することができる。また、廃棄物が少ないため、廃棄物の処分費用（脱水、焼却、埋め立てなど）を少なくでき、特にバッチ培養を行う場合に有利である。また、廃棄物が少ないことは、歩留まりがよいことにつながる。具体的には、例えば、ワイン醸造など、発酵における廃棄物中の固形物はほとんどが細胞であるが、本発明の藻類はデンプン粒の放出にともない細胞が破裂、自己融解するので、死細胞の分解物が別の細胞の栄養になり、歩留まりがよくなる。
　さらに、本発明の藻類は、藻類の細胞内に蓄積された光合成産物を細胞外に排出させることができるため、光合成産物の回収が容易である。例えば、光合成産物がデンプンである場合に、光合成によって蓄積したデンプンを、藻類の細胞を破砕しなくとも、デンプン粒として細胞外に排出させることができる。このため、本発明の藻類を用いてバイオマスを製造すれば、デンプンの精製を比較的容易に行うことができる。
　本発明の藻類によって生成されたデンプン粒は微小であることが特徴である。例えば、トウモロコシ、ジャガイモ、コムギ等によって作られる一般的なデンプン粒は平均粒径が１０～５０μｍであるのに対して、本発明の藻類によって生成されたデンプン粒は、その平均粒径が長径で１．３μｍ（標準偏差０．１８１）、短径で１．０μｍ（標準偏差０．２０４）である微小な、かつ大きさが揃った粒子である。イネやキヌア等は平均粒径が２～３μｍ程度の微小なデンプン粒を造るが、それらは、トウモロコシ、ジャガイモ、コムギ等が作るデンプン粒と同様に、密着により組織化した胚乳を形成する。従って、トウモロコシ、ジャガイモ、コムギ、イネ、キヌア等を原材料にして、一つひとつがばらばらの状態になった微小なデンプン粒を調製するには、磨細など、コストにかかる処理が必要である。かかる微小なデンプン粒は、医薬品の製造において有用である。つまり、本発明の藻類を用いれば、微小で大きさの揃ったデンプン粒を大量に生産することができると共に、デンプン粒は藻類の細胞外に排出されるので精製を比較的容易に行うことができる。しかも、これらのデンプン粒は、磨砕等の処理をすることなく、一つひとつがばらばらの状態になっている。
　このように、ＧＳＨ１過剰発現株によって生成されるデンプン粒は、トウモロコシ、ジャガイモ、コムギ等によって作られる一般的なデンプン粒に比べて微小である。かかる微小なデンプン粒は、医薬品の製造において有用である。具体的には、かかる微小なデンプン粒は肺の細気管支の径よりも小さいので、肺疾患の治療薬を細気管支にまで送達させるための担体（治療薬とデンプン微小粒とを組み合わせたドライパウダーインヘラー）としての利用が期待される。
　また、デンプン粒の表面にペプチド性の抗原を提示させることによって、いわゆる「食べるワクチン」として活用することが期待される（例えば、Dauville´e et al. 2010, PLos One 5巻12号、e15424；特表２００３－５０００６０号公報（特願２０００－６２０１１１号公報）には、マラリア抗原をクラミドモナスのデンプン粒表面に提示させることが開示されている。）。
　なお、グルタチオンは、細胞内の酸化還元状態を調節する物質であり、細胞または器官の分化調節剤として機能し得ること（国際公開第０１／０８０６３８号パンフレットを参照）、および植物生長調整補助剤として機能し得ること（日本国公開特許公報「特開２００４－３５２６７９号公報」を参照）が知られている。
　しかし、藻類の葉緑体内のグルタチオン濃度を増加させることによって、窒素飢餓状態にせずとも、藻類の細胞内における光合成産物の蓄積を誘導し得、さらに藻類の細胞内に蓄積された光合成産物を細胞外に排出させることができるなどということは、上記従来知られているグルタチオンの機能からは全く予測できないものである。
　本発明の藻類を用いれば、光合成産物の蓄積の誘導および光合成産物の回収の両方を、従来技術と比較して、容易に、効率よく行うことができる。このため、本発明の藻類を、後述するバイオマスの製造方法において用いることにより、従来よりも安価に、効率よく藻類からバイオマスを製造することができる。
　〔２．本発明に係る藻類の製造方法〕
　本発明に係る藻類の製造方法（以下、「本発明の藻類の製造方法」と称する。）は、上述した、野生型藻類と比較して葉緑体内のグルタチオン濃度および光合成産物の生産性が向上している藻類（本発明の藻類）を製造する方法であって、藻類の葉緑体内のグルタチオン濃度を増加させる、グルタチオン濃度増加工程を少なくとも含んでいればよく、その他の条件、工程等の構成は限定されない。
　本発明の藻類の製造方法について、以下に具体的に説明する。
　（１．グルタチオン濃度増加工程）
　グルタチオン濃度増加工程は、藻類の葉緑体内のグルタチオン濃度を増加させる工程である。
　ここで、上記「葉緑体内のグルタチオン濃度を増加させる」とは、同一種の野生型藻類に比べて葉緑体内のグルタチオン濃度を増加させることを意味する。換言すれば、グルタチオン濃度増加工程後の藻類は、同一種の野生型藻類に比べて高いグルタチオン濃度を有している。藻類の葉緑体内のグルタチオン濃度が当該藻類の野生型株に比べて増加したことは、「１．本発明に係る藻類」の項で説明した方法によって判定することができる。
　グルタチオン濃度増加工程において、葉緑体内のグルタチオン濃度を増加させる方法は、結果として、藻類の葉緑体内のグルタチオン濃度を増加させることができる限り、特に制限されない。例えば、（ｉ）目的の藻類に、公知の変異導入法を用いてランダムに変異を導入する方法；（ｉｉ）葉緑体内のグルタチオン濃度を増加させる物質を細胞内（場合によっては、藻類のゲノム中）に導入する方法；等により取得することができる。
　以下に、上記（ｉ）および（ｉｉ）の方法について具体的に説明する。
　（ｉ）藻類にランダムに変異を導入する方法
　藻類にランダムに変異を導入する方法は特に限定されず、公知の方法を適宜選択して使用することができる。具体的には、例えば、藻類を化学物質（例えば、ＥＭＳ、ＮＴＧなど）で処理する方法、放射線を利用する方法、トランスポゾンを利用する方法、Ｔ－ＤＮＡを利用する方法、原核真核細胞間接合を利用する方法、ジーンガンなどで物理的に導入する方法などを挙げることができる。かかる手法により、例えば、ＧＳＨ１、ＧＳＨ２、ＡＴＰスルフリラーゼ、アデノシン５’－ホスホ硫酸還元酵素、亜硫酸還元酵素、システイン合成酵素、セリンアセチル転移酵素等の葉緑体におけるグルタチオンの生合成系に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチドに変異を導入し、タンパク質の発現量および／または活性を高め、その結果として葉緑体内のグルタチオン濃度が増加した藻類を取得すればよい。
　所望の変異が導入された藻類を選別する方法も公知の手法を利用でき、特に制限されない。例えば、上述した葉緑体内のグルタチオン濃度を直接測定する方法を利用して、グルタチオン濃度が増加した変異藻類を取得する方法、あるいはＧＳＨ１、ＧＳＨ２、ＡＴＰスルフリラーゼ、アデノシン５’－ホスホ硫酸還元酵素、亜硫酸還元酵素、システイン合成酵素、セリンアセチル転移酵素等のタンパク質の発現量および／または活性が増加した変異藻類を取得する方法等を挙げることができる。
　（ｉｉ）葉緑体内のグルタチオン濃度を増加させる物質を細胞内に導入する方法
　上記「葉緑体内のグルタチオン濃度を増加させる物質」として、例えば、（Ａ）藻類の葉緑体内のグルタチオン濃度を増加させるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、（Ｂ）藻類の葉緑体内のグルタチオン濃度を低下させるタンパク質の発現量を低下させる機能を有するポリヌクレオチドを導入することにより、葉緑体内のグルタチオン濃度が増加している藻類を取得することができる。上記（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチドは、単独で用いてもよく、併用してもよい。
　なお、本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用される。また、本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。
　なお、上記「ポリヌクレオチドを導入する」とは、導入対象のポリヌクレオチドが藻類の細胞内に存在していればよく、導入対象のポリヌクレオチドが、藻類のゲノム中に挿入（導入）されている場合も含まれる。ポリヌクレオチドが藻類の細胞内に導入されたことは、従来公知のＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等によって確認することができる。
　上記（Ａ）のポリヌクレオチドを少なくとも１種、藻類の細胞内に導入することによって、葉緑体内のグルタチオン濃度を増加させるタンパク質の発現量を増加させることができ、その結果として葉緑体内のグルタチオン濃度を増加させることができる。
　このようなポリヌクレオチドとしては、例えば、γ－グルタミルシステイン合成酵素をコードするポリヌクレオチド（以下、「ＧＳＨ１遺伝子」と称する場合もある。）、グルタチオン合成酵素をコードするポリヌクレオチド（以下、「ＧＳＨ２遺伝子」と称する場合もある。）、ＡＴＰスルフリラーゼをコードするポリヌクレオチド、アデノシン５’－ホスホ硫酸還元酵素をコードするポリヌクレオチド、亜硫酸還元酵素をコードするポリヌクレオチド、システイン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、セリンアセチル転移酵素をコードするポリヌクレオチド等を好ましく例示できる。これらのポリヌクレオチドは、植物由来であることが好ましく、より好ましくは、宿主藻類自身が有するポリヌクレオチドであるが、宿主藻類と異なる藻類由来のポリヌクレオチドやその他高等植物由来のポリヌクレオチドも好適に用いることができる。
　上記「γ－グルタミルシステイン合成酵素（ＧＳＨ１）」は、グルタミン酸をγ位でシステインとアミド結合させることによってγ－グルタミルシステインを合成する酵素である。また、上記「グルタチオン合成酵素（ＧＳＨ２）」は、γ－グルタミルシステインにグリシンが付加することによってグルタチオンを合成する酵素である。
　上記「ＧＳＨ１遺伝子」の具体例としては特に限定されないが、本発明に用いられる好適なＧＳＨ１遺伝子の１種として、本発明者らが実施例で用いているクラミドモナスのＧＳＨ１遺伝子（CHLREDRAFT_181975）を挙げることができる。クラミドモナスのＧＳＨ１は配列番号１に示されるアミノ酸配列からなり、それをコードする遺伝子（全長ｃＤＮＡ）は配列番号３に示される塩基配列からなる。配列番号３に示される塩基配列のうち、第１３４位～第１３６位が開始コドンであり、第１５７１位～第１５７３位が終止コドンである。すなわち、クラミドモナスＧＳＨ１遺伝子は、配列番号３に示される塩基配列のうち、第１３４位～第１５７３位をオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）として有している。配列番号２に示される塩基配列は、クラミドモナスＧＳＨ１遺伝子のＯＲＦの塩基配列である。クラミドモナスＧＳＨ１遺伝子の翻訳産物は、Ｎ末端領域に葉緑体移行シグナルペプチドを有している。それゆえ、クラミドモナスのＧＳＨ１遺伝子の翻訳産物、すなわちクラミドモナスのＧＳＨ１は、通常、葉緑体に存在している。
　すなわち、本発明においては、藻類に導入するヌクレオチドとして、下記（ａ）～（ｄ）のポリヌクレオチドを好ましく例示できる：
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つγ－グルタミルシステイン合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｄ）上記（ａ）～（ｃ）のポリヌクレオチドのうちいずれかのポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つγ－グルタミルシステイン合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
　なお、配列番号２は、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列の一例を示している。
　ここで、上記「１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ペプチド作製法により欠失、置換もしくは付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下）のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されることを意味する。このような変異タンパク質は、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に導入された変異を有するタンパク質に限定されるものではなく、天然に存在するタンパク質を単離精製したものであってもよい。
　タンパク質のアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このタンパク質の構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけでなく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。
　好ましい変異体は、保存性もしくは非保存性アミノ酸置換、欠失、または添加を有する。好ましくは、サイレント置換、添加、および欠失であり、特に好ましくは、保存性置換である。これらは、本発明に係るポリペプチド活性を変化させない。
　代表的に保存性置換と見られるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの中での１つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換、ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置換である。
　本明細書において、上記「ストリンジェントな条件」とは、少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、最も好ましくは少なくとも９７％の同一性が配列間に存在するときにのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。具体的には、例えば、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄する条件を挙げることができる。
　ハイブリダイゼーションは、Sambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory（2001）に記載されている方法のような周知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり（ハイブリダイズし難くなる）、より相同性の高いポリヌクレオチドを取得することができる。
　アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Karlin S, Altschul SF, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 2264-2268 (1990); Karlin S, Altschul SF, Proc. Natl. Acad Sci. USA, 90: 5873-5877 (1993) ）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al., J. Mol. Biol., 215: 403 (1990) ）。
　本発明において、上記「γ－グルタミルシステイン合成酵素活性」とは、グルタミン酸をγ位でシステインとアミド結合させる反応を触媒する活性を意味する。「γ－グルタミルシステイン合成酵素活性」は、例えば、溶液を窒素置換するなどして酸化防止措置を講じつつ、破砕した藻類を遠心分離して得られる上清を試料として、システインおよびグルタミン酸、ＡＴＰを含む反応液に試料を添加した後、一定時間に合成されるγ－グルタミルシステイン量として求めることができる。その他、その反応に伴い、生成されるリン酸量を定量して求めることもできる。
　クラミドモナス以外の植物由来のＧＳＨ１遺伝子としては、例えば、シロイヌナズナ（TAIR Accession Gene:2127172、Name AT4G23100.1）、ヒャクニチソウ（Genbank accession: AB158510）、イネ（Genbank accession: AJ508915）、タバコ（Genbank accession: DQ444219）等のＧＳＨ１遺伝子が知られており、これらも本発明に好適に用いることができる。これらの遺伝子の翻訳産物も、クラミドモナスと同様にＮ末端領域に葉緑体移行シグナルペプチドを有している。
　また、上記（Ｂ）のポリヌクレオチドを藻類の細胞内に導入することによって、葉緑体内のグルタチオン濃度を低下させるタンパク質の発現量を減少させることができ、その結果として葉緑体内のグルタチオン濃度を増加させることができる。このようなポリヌクレオチドとしては、例えば、従来公知のＲＮＡ干渉（RNA interference；RNAi）法において用いられる、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（short interfering RNA）、これらのＲＮＡの鋳型ＤＮＡ等が挙げられる。
　上記「藻類の葉緑体内のグルタチオン濃度を低下させるタンパク質」としては、例えば、ＣＬＴ１等を好ましく例示できる。上記「ＣＬＴ１」は、グルタチオンを葉緑体から細胞質へ輸送するトランスポーターであり、最初にシロイヌナズナで見つけられ、ＣＬＴ１と命名された（Proc Natl Acad Sci USA (2010) vol. 107 (5) 2331-2336を参照）。つまり、上記（Ｂ）の例示として、ＣＴＬ１等のグルタチオントランスポーターの発現量を減少させることを意図したポリヌクレオチドを挙げることができる。
　本発明の藻類の製造方法において用いられる「ポリヌクレオチド」は、ゲノムＤＮＡに由来しても、ｃＤＮＡに由来してもよく、化学合成されたＤＮＡであってもよい。また、ＲＮＡでもよい。目的に応じて適宜選択され得る。
　本発明の藻類の製造方法において用いられるポリヌクレオチドを取得する方法として、例えば、ＧＳＨ１遺伝子を取得する場合は、公知の技術により、ＧＳＨ１をコードするＤＮＡ断片を単離し、クローニングする方法が挙げられる。クラミドモナスのＧＳＨ１をコードするＤＮＡの塩基配列の一部と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすればよい。
　あるいは、本発明の藻類の製造方法において用いられるポリヌクレオチドを取得する方法として、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法を挙げることができる。例えば、ＧＳＨ１遺伝子を取得する場合は、クラミドモナスのＧＳＨ１をコードするｃＤＮＡのうち、５’側および３’側の配列（またはその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明に用いられるＧＳＨ１をコードするＤＮＡ断片（ＧＳＨ１遺伝子）を大量に取得できる。ＧＳＨ２遺伝子やＡＴＰスルフリラーゼ遺伝子、アデノシン５’－ホスホ硫酸還元酵素遺伝子、亜硫酸還元酵素遺伝子、システイン合成酵素遺伝子、セリンアセチル転移酵素遺伝子およびＣＬＴ１遺伝子についても同様の手法で取得できる。
　本発明の藻類の製造方法において用いられるポリヌクレオチドは、所望の藻類を供給源として取得することができる。
　本発明の藻類の製造方法において、ポリヌクレオチドを藻類に導入する方法としては、特に限定されるものではない。例えば、当該ポリヌクレオチドを備える発現ベクターを導入することによって、当該ポリヌクレオチドを藻類の細胞内に導入することができる。また、発現ベクターの構築方法としては、従来公知の方法を使用すればよく、特に限定されるものではない。例えば、日本国公開特許公報「特開２００７－４３９２６号公報」および日本国公開特許公報「特開平１０－０５７０８６８号公報」に開示された、発現ベクターの構築方法および藻類の形質転換方法に従って、導入対象ポリヌクレオチドの上流に藻類細胞で機能するプロモーターを、下流に藻類細胞で機能するターミネーターを連結した組換え発現ベクターを構築し、藻類に導入することができる。
　上記「プロモーター」としては、例えば、ＰｓａＤプロモーターを好適に用いることができる。ＰｓａＤプロモーターは、ＧＳＨ１遺伝子の内因性のプロモーターよりもプロモーター活性が強い。このため、ＰｓａＤプロモーターを用いることにより、γ－グルタミルシステイン合成酵素をより多く発現させることができる。また、ＰｓａＤ遺伝子は、光合成に関与する遺伝子であるので、ＰｓａＤプロモーターを用いれば、得られる発現ベクターでは、藻類の細胞内に導入されたときに、照射する光の強さによって導入対象遺伝子の発現量を調節することができる。
　（２．その他の工程）
　本発明の藻類の製造方法では、上述した「グルタチオン濃度増加工程」に加えて、葉緑体内のグルタチオン濃度が増加している藻類をスクリーニングする、スクリーニング工程をさらに含んでいてもよい。
　例えば、目的の遺伝子が導入された形質転換藻類は、まず、カナマイシン耐性やハイグロマイシン耐性などの薬剤耐性マーカーの発現を指標として、従来公知の薬剤選択法を用いて選択する。その後、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法などによって、目的の遺伝子が藻類に導入されたか否かを確認することができる。例えば、形質転換藻類からＤＮＡを調製し、導入されたＤＮＡに特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。その後、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動などを行い、臭化エチジウムなどによって染色し、目的の増幅産物を検出することによって、形質転換されたことを確認することができる。
　葉緑体内のグルタチオン濃度が増加している個体のスクリーニングには、上述した葉緑体内のグルタチオン濃度の測定方法等を用いればよい。
　なお、葉緑体内のグルタチオン濃度が増加した結果として、光合成産物の生産性が向上するので、葉緑体内のグルタチオン濃度が増加した藻類は、光合成産物の生産性が向上した藻類であることは、容易に理解できる。スクリーニングした個体において光合成産物の生産性が向上しているか否かは、上述した光合成産物の生産性の測定方法によって確認することができる。
　〔３．本発明に係るバイオマスの製造方法〕
　本発明に係るバイオマスの製造方法は（以下、「本発明のバイオマスの製造方法」と称する。）、上述した、野生型藻類と比較して葉緑体内のグルタチオン濃度が増加している藻類（本発明の藻類）または本発明の藻類の製造方法によって製造された藻類を用いてバイオマスを製造する方法である。
　本発明の藻類については、「１．本発明に係る藻類」の項で説明しており、また、本発明の藻類の製造方法については、「２．本発明に係る藻類の製造方法」の項で説明したとおりであるので、ここでは省略する。
　なお、本明細書において、上記「バイオマス」とは、藻類が光合成による炭素固定によって産生する物質、例えば、糖類（例えば、デンプン）、油脂等を意図し、「光合成産物」とも言い換えられる。
　本発明のバイオマスの製造方法では、藻類の細胞内において光合成産物の生産または蓄積を誘導する方法は、特に制限されない。例えば、本発明のバイオマスの製造方法では、藻類の細胞内における光合成産物の生産または蓄積を誘導するために、上記藻類に対して光を照射する、光照射工程を含んでいてもよい。
　従来の方法では、藻類の細胞内への光合成産物の蓄積を誘導するためには、窒素飢餓条件下にする必要があり、かつ、光合成産物の著しい蓄積を促すためには２００μＥ／ｍ２／秒以上の光量の光を照射する必要があった。しかし、本発明のバイオマスの製造方法では、特に光量を調節せずとも光合成産物の蓄積を誘導することが可能であるが、好ましくは藻類に対して、１０００μＥ／ｍ２／秒以下、より好ましくは５００μＥ／ｍ２／秒以下、さらに好ましくは４００μＥ／ｍ２／秒以下、３００μＥ／ｍ２／秒以下、２００μＥ／ｍ２／秒以下、１５０μＥ／ｍ２／秒以下、１００μＥ／ｍ２／秒以下、８０μＥ／ｍ２／秒以下の光量の光を照射することが好ましい。照射する光量が小さいほど、エネルギー効率が高まり、生産性が向上する。本発明に係る藻類は、従来の野生型の藻類に比べて少ない光量でも、細胞内および細胞外へ光合成産物を産生させることができる点で優れる。なお、照射する光量の下限は特に制限されないが、例えば、４０μＥ／ｍ２／秒以上が現実的に設定できる。
　上述した範囲の光を照射するための光照射装置として、特別な光照射装置を必要としない。例えば、太陽光；太陽光を鏡、光ファイバー、フィルター、メッシュ等で質的および量的に調節を加えた光；白熱灯、蛍光灯、水銀ランプ、発光ダイオード等の人工光を用いることができる。また、照射する光は、一般的な藻類の光合成に好適な波長域の光を用いることができ、例えば、４００ｎｍ～７００ｎｍであることが好ましい。
　また、本発明のバイオマスの製造方法では、藻類の細胞内での光合成産物の生産または蓄積を誘導するために、窒素飢餓条件下で藻類を培養する必要がない。このため、上記光照射工程は、窒素飢餓ではない条件において行ってもよい。ここで、上記「窒素飢餓ではない条件」とは、藻類が生育するために必要な量の無機態窒素を含有している培養液中で培養することをいう。ここで、藻類が生育するために必要な量とは、培養液中に含有されている無機態窒素が、窒素原子換算で０．００１～０．１重量％であり、好ましくは０．００５～０．０５重量％である。なお、上記「無機態窒素」とは、例えば、アンモニア態窒素、亜硝酸態窒素、硝酸態窒素等の窒素をいう。なお、後述する実施例で用いたＴＡＰ培地では、培養液中に含有されている無機態窒素が、窒素原子換算で約０．０１重量％である。
　藻類が生育するために必要な量の無機態窒素を含有している培養液としては、藻類を培養するために通常用いられる培養液を用いればよく、特に制限されない。このような培養液としては、例えば、従来公知のＴＡＰ培地、ＨＳＭ培地、ＡＴＣＣ８９７培地等を挙げることができる。
　一実施形態において、本発明の藻類を、ＴＡＰ培地において、４５μＥ／ｍ２／秒の光を照射しながら培養することによって、細胞内へのデンプンの蓄積を誘導することができる。別の実施形態において、本発明の藻類を、ＴＡＰ培地において、８０μＥ／ｍ２／秒の光を照射しながら培養することによって、細胞内へのデンプンの蓄積を誘導することができる。
　上記光照射工程は、窒素飢餓条件下において行ってもよい。上記「窒素飢餓条件」とは、無機態窒素の含有量が窒素原子換算で０．００１重量％より少ない培養液中で培養することをいう。特に制限されないが、光照射工程を窒素飢餓条件下において行う場合は、窒素を含有していない培養液として、例えば、ＴＡＰ　Ｎ－ｆｒｅｅ培地を好適に用いることができる。一実施形態において、本発明の藻類を、窒素飢餓条件下（ＴＡＰ　Ｎ－ｆｒｅｅ培地中）において、８０μＥ／ｍ２／秒の光を照射しながら培養することによって、細胞内へのデンプンの蓄積を誘導することができる。
　上述したように、本発明に係る藻類の特徴点として、光合成産物を産生させる際に、窒素飢餓状態等の栄養制限工程を必要としない点を挙げることができる。つまり、本発明のバイオマスの製造方法では、実質的に窒素飢餓状態等の栄養制限工程を実施しない（実質的に窒素飢餓状態等の栄養制限工程を含まない）態様が可能である。かかる特徴により、工程を簡略化でき、光合成産物の生産性が向上する。
　また、光照射工程は、独立栄養条件下において行ってもよい。ここで、上記「独立栄養条件」とは、二酸化炭素以外に炭素源を供給しないで培養する条件をいう。具体的には、例えば、本発明の藻類を、ＨＳＭ培養液中で、大気を送気しつつ光照射する方法によって培養することによって、光照射工程を独立栄養条件下において行うことができる。なお、二酸化炭素の供給源としては、大気に限定されず、火力発電所や製鉄所等の煙道中に含まれる二酸化炭素を活用して、大気より高い濃度で二酸化炭素を培地へ送り込み、生産性を高めることも可能である。
　独立栄養条件下では、培養容器の底部付近から、二酸化炭素または二酸化炭素を含む気体を送る（通気する）。二酸化炭素の水中での拡散速度は、大気中と比べて極度に遅い。それゆえ、培地を攪拌する必要がある。培地を攪拌することによって、藻類に対して光をムラ無く照射することも可能となる。二酸化炭素は水中で陰イオンとなるため、培地の緩衝能が弱いと、通気により培地が酸性側に傾き、二酸化炭素の溶解度が低下し、光合成に利用されにくくなる。それゆえ、培地にはｐＨが中性付近またはアルカリ性側に保たれる緩衝能があることが好ましい。かかる培地としては、従来公知のＨＳＭ培地等が好ましく例示される。
　（２．その他の工程）
　本発明のバイオマスの製造方法では、上述した「光照射工程」に加えて、光合成産物を回収する工程をさらに含んでいてもよい。
　例えば、光合成産物がデンプンである場合、本発明のバイオマスの製造方法によれば、細胞内に蓄積されたデンプンを、デンプン粒として細胞外に排出させることができるので、光合成産物を回収する工程では、細胞外に排出されたデンプン粒と藻類とを分離し、分離したデンプン粒を回収すればよい。細胞外に排出されたデンプン粒と藻類とを分離する方法は、特に制限されない。例えば、静置による自然沈降、遠心分離、篩等により、デンプン粒および藻類の細胞の粒子径および／または形等の物理的性質に基づく分離手段によりなされ得る。
　なお、本発明のバイオマスの製造方法は、藻類に接触させることで藻類に吸収させることができる物質を用いて、葉緑体内のグルタチオン濃度を増加させた藻類を用いて行ってもよい。すなわち、藻類の葉緑体内のグルタチオン濃度を増加させる物質の存在下にて、藻類を培養する工程を含むバイオマスの製造方法も本発明に含まれる。
　藻類の葉緑体内のグルタチオン濃度を増加させる物質であって、藻類に接触させることで藻類に吸収させることができる物質の具体例としては、例えば、グルタチオン、グルタチオン抱合体、活性酸素（例えば過酸化水素等）、活性窒素、ポリアミン、酸化チタン、ジャスモン酸、サリチル酸、システイン、シスチン、重金属カドミウム、鉄イオンが例示できる。なお、ポリアミンは過酸化水素の原料となる。酸化チタンは光によって活性酸素を生成する。システイン、シスチンはグルタチオンの前駆体である。重金属カドミウム、鉄イオンについては、過剰投与することが好ましい。特に、コストを考慮すると、過酸化水素が好ましい。
　藻類の葉緑体内のグルタチオン濃度を増加させる物質であって、藻類に接触させることで藻類に吸収させることができる物質は、例えば、藻類に光合成させるときに用いる培養液中に、当該物質を含有させることによって藻類に接触させることで藻類に吸収させることができる。
　本発明のバイオマスの製造方法は、本発明の藻類または本発明の藻類の製造方法によって製造された藻類を用いてバイオマスの製造を行うので、後述する実施例に示すように、強い光を照射したり、窒素飢餓状態にしたりして藻類を培養せずとも、藻類の細胞内における光合成産物の蓄積を誘導し得る。また、葉緑体内のグルタチオン濃度を増加させることによって、藻類の細胞内に蓄積された光合成産物を細胞外に排出させることができるため、光合成産物の回収が容易である。つまり、本発明のバイオマスの製造方法によれば、光合成産物の蓄積の誘導および光合成産物の回収の両方を、従来技術と比較して、容易に、効率よく行うことができる。それゆえ、本発明のバイオマスの製造方法によれば、従来よりも安価に、効率よく藻類からバイオマスを製造することできる。
　本発明に係る藻類は、葉緑体において、γ－グルタミルシステイン合成酵素、グルタチオン合成酵素、ＡＴＰスルフリラーゼ、アデノシン５’－ホスホ硫酸還元酵素、亜硫酸還元酵素、システイン合成酵素およびセリンアセチル転移酵素からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質の発現量および／または活性が増加していてもよい。
　本発明に係る藻類では、上記γ－グルタミルシステイン合成酵素、グルタチオン合成酵素、ＡＴＰスルフリラーゼ、アデノシン５’－ホスホ硫酸還元酵素、亜硫酸還元酵素、システイン合成酵素およびセリンアセチル転移酵素からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチドが導入されていてもよい。
　本発明に係る藻類では、上記γ－グルタミルシステイン合成酵素をコードするポリヌクレオチドが、以下の（ａ）～（ｄ）からなる群より選択されてもよい：
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つγ－グルタミルシステイン合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｄ）上記（ａ）～（ｃ）のポリヌクレオチドのうちいずれかのポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つγ－グルタミルシステイン合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
　本発明に係る藻類の製造方法では、上記グルタチオン濃度増加工程は、γ－グルタミルシステイン合成酵素、グルタチオン合成酵素、ＡＴＰスルフリラーゼ、アデノシン５’－ホスホ硫酸還元酵素、亜硫酸還元酵素、システイン合成酵素およびセリンアセチル転移酵素からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチドを藻類に導入する工程であってもよい。
　本発明に係るバイオマスの製造方法では、上記藻類に対して光を照射する、光照射工程を含んでいてもよい。
　本発明に係るバイオマスの製造方法では、上記光照射工程は、実質的に窒素飢餓ではない条件において行ってもよい。
　本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
　以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
　〔実施例１〕
　＜ＧＳＨ１過剰発現株の作製＞
　クラミドモナス由来のγ－グルタミルシステイン合成酵素（配列番号１）をコードするＧＳＨ１遺伝子（配列番号２）を、ＰｓａＤ遺伝子のプロモーター（ＰｓａＤプロモーター）の下流に連結したプラスミドを作製した。
　具体的には、クラミドモナス用ベクターである環状ＤＮＡ、pSP124S（Plant Journal (1998) Vol. 14(4): 441-447. を参照）を、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＲ５を同時処理することによりで開環し、配列番号４のポリヌクレオチド（約３．１３キロ塩基対）を連結すると同時に再度環状化させた。この環状ＤＮＡを公知の方法で、大腸菌を用いて増幅させ、大腸菌より抽出・精製した。
　配列番号４で示されるポリヌクレオチドは、以下の方法によって作製した。
　（１）クラミドモナス・ラインハルディＣＣ５０３株（クラミドモナスセンター、米国、デューク大学より分譲を受けた）をＴＡＰ培地、２４℃、５０μＥ／ｍ２／秒の条件で４日間培養した。この培養物より集めた細胞を材料に、ｃＤＮＡ合成試薬キット（タカラバイオ社製、Solid　phase cDNA synthesis kit）を用いｃＤＮＡの混合物を調製した。このｃＤＮＡ混合物を鋳型として、配列番号５および６のオリゴヌクレオチドを用いて、公知の方法によりＰＣＲ反応（アニーリング温度は５８℃）を実施し、クラミドモナスＧＳＨ１遺伝子をＯＲＦとこれに続く３‘ＵＴＲ領域を連続した約２．２７キロ塩基対のポリヌクレオチドとして回収した。さらに、制限酵素ＥｃｏＲ１を用いて末端構造を加工した。
　（２）上記（１）と同様に培養、集積したＣＣ５０３の細胞を材料に、ＤＮＡ抽出試薬キット（日本ジーン社製、Isoplant）を用いてゲノムＤＮＡを調製した。このゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号７および８のオリゴヌクレオチドを用いて、公知の方法によりＰＣＲ反応（アニーリング温度は５６℃）を実施し、クラミドモナスＰｓａＤ遺伝子のプロモーター領域を約０．８６キロ塩基対のポリヌクレオチドとして回収した。さらに、制限酵素Ｈｐａ１を用いて末端構造を加工した。
　（３）上記（１）および上記（２）で調製した２種類のポリヌクレオチド断片をＤＮＡリガーゼ（東洋紡社製、Ligation High）を用いて、公知の方法により連結させた。以上の実験操作により、一端が平滑末端（blunt end）であり、他の一端がＥｃｏＲ１による粘着性末端（sticky end）である、ＰｓａＤプロモーター－ＧＳＨ１遺伝子のポリヌクレオチド断片が調整できた。配列番号４に示される塩基配列のうち、第８５３位～第８５５位が開始コドンであり、第２２９４位～第２２９６位が終止コドンである。すなわち、クラミドモナスＧＳＨ１遺伝子は、配列番号３に示される塩基配列のうち、第８５３位～第２２９６位をオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）として有している。
・5’GCTCTCGCCTCAGGCGTT 3’（配列番号５）
・5’GGGGAATTCCTGAGCGAGGGCCTTACAAG 3’（配列番号６）
・5’ATCAGCACACACAGCAGGCTCAC 3’（配列番号７）
・5’TGTTAACCATTTTGGCTTGTTGTGAGTAGC 3'（配列番号８）
　上述のごとく作製した、ＰｓａＤプロモーター－ＧＳＨ１のポリヌクレオチドを含むプラスミドを、制限酵素ＥｃｏＲ１により線状化し、エレクトロポレーション法（Funct. Plant Biol. (2002)vol. 29: 231-241を参照）により、クラミドモナス・ラインハルディ（Chlamydomonas reinhardtii）ＣＣ５０３株（以下、「クラミドモナス」と称する。）へ導入した。当該ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡへ挿入され、細胞の複製に伴い子世代へ安定に受け継がれる形質転換株（以下、「ＧＳＨ１過剰発現株」と称する。）を、ＣＣ５０３株がブレオマシシン耐性を獲得したことを指標に選抜した。当該ポリヌクレオチドを含むプラスミドＤＮＡのゲノムＤＮＡへの挿入はＰＣＲ法により確認した。
　なお、ＰｓａＤ遺伝子は、光合成に関与する遺伝子である。このため、照射する光の強さを変えることによって、ＰｓａＤプロモーターの活性を調節し、ＧＳＨ１遺伝子の発現量を調節することができる。つまり、ＧＳＨ１過剰発現株に対して強い光を照射すると、ＧＳＨ１過剰発現株における外因性のＧＳＨ１の発現量は多くなり、弱い光を照射すると、ＧＳＨ１過剰発現株における外因性のＧＳＨ１の発現量は少なくなる。
　〔実施例２〕
　実施例１で作製したＧＳＨ１過剰発現株を、トリス－酢酸－リン酸（ＴＡＰ）培地、ｐＨ７（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 54, 1665-1669.を参照）を用いて、半従属栄養条件下で培養し、増殖能およびデンプン産生能を評価した。コントロールとして、野生型クラミドモナス株であるＣＣ５０３株（以下、「親株（野生型株）」と称する）を用いた。それぞれの試料の培養条件を表１および表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　試料２および試料６において、ＴＡＰ培地中に加えたL-Buthionine-sulfoximine（略称ＢＳＯ（型番Ｂ２５１５、シグマ・アルドリッチ社製）は、ＧＳＨ合成酵素の阻害剤である。
　結果を図１および図２に示す。図１の（ａ）は、ＧＳＨ１過剰発現株の増殖能を表すグラフであり、（ｂ）は、培養開始３０９時間後の培養液の状態を表す図である。図２の（ａ）は、親株（野生型株）の増殖能を表すグラフであり、（ｂ）は、培養開始２１５時間後の培養液の状態を表す図である。図１の（ａ）および図２の（ａ）のグラフの縦軸は、光学密度（ＯＤ）を表し、横軸は、培養時間を表している。縦軸に示した光学密度は、赤外線（９５０ｎｍ）の透過光量に基づいてＯＤ値を測定する装置（タイテック社製、ＯＤＳｅｎｓｏｒ-Ｓ／ＯＤＢｏｘ-Ａ）により測定した。また、グラフ中に記入した矢印は、フローサイトメトリー（ＦＣＭ）を行ったタイミングを表している。
　図１の（ａ）に示したように、試料１～４の細胞は、すべて、半従属栄養条件下において、増殖能を有していた。それぞれの試料の増殖能に大きな違いがなかったことから、外因性のＧＳＨ１遺伝子の発現は、クラミドモナスの増殖に影響を与えないことが確認された。また、図１の（ｂ）に示したように、試料１や試料４では、培養液の白濁が認められた。
　なお、本実施例でいう「半従属栄養」とは、培地中の酢酸を主な炭素源として培養しているが、光を照射しかつ培養フラスコを密封していないため、酢酸と比べて、成長へ寄与度は少ないが、大気中の二酸化炭素も炭素源として利用している状態のことをいう。
　培養液の白濁が認められた試料４の培養液をマイクロチューブに回収し、遠心分離によって得られた白色の沈殿物について、ヨウ素デンプン反応を行った。その結果を、図１の（ｃ）に示す。図１の（ｃ）に示すように、試料４から回収した白色粒子は、ヨウ素デンプン反応によって青紫色に着色することから、デンプンが凝集したものであることが明らかになった。従って、培養液の白濁が認められた試料１や試料４では、デンプンが産生されたことが明らかになった。なお、ＧＳＨ１過剰発現細胞内で産生されたデンプンは、デンプン粒として、細胞外に排出されると考えられた。
　一方、試料２や試料３では、培養液が白濁する現象が認めらなかった。ＧＳＨ合成酵素の阻害剤であるＢＳＯを加えた試料２では、ＢＳＯによって試料２のＧＳＨ１過剰発現株におけるＧＳＨの合成が阻害されたため、デンプンが細胞外に排出されなかったと考えられた。また、試料１や試料４よりも弱い光を照射した試料３では、試料１や試料４よりもＧＳＨ１過剰発現株における外因性のＧＳＨ１の発現量が少ないため、培養液の白濁が認められる程度にデンプンが細胞外に排出されなかったと考えられた。
　これに対して、図２の（ａ）に示すように、試料５～８の細胞は、すべて、半従属栄養条件下において、増殖能を有していたが、図２の（ｂ）に示したように、試料５～８では、培養液の白濁は認められなかった。つまり、親株（野生型株）では、ＴＡＰ培地において、８０μＥ／ｍ２／秒以下の光量の光を照射する培養条件では、デンプン粒が細胞外に排出されなかった。
　さらに、試料４のＧＳＨ１過剰発現株および試料８の親株（野生型株）の状態をさらに詳細に解析するために、フローサイトメトリーを行った。具体的には、それぞれの細胞に４８８ｎｍの励起光を照射し、６００ｎｍ付近の蛍光強度を測定した。かかる６００ｎｍ付近の蛍光は、クロロフィルの蛍光に相当する。クロロフィルの蛍光と同時に、細胞の密度を測定するための内部標準として、ベックマン・コールター製の蛍光性微粒子（商品名：Flow count）を共存させ、４８８ｎｍの励起光により発する５２５ｎｍ～７００ｎｍの蛍光を測定した。また、前方散乱光および側方散乱光を測定することによって、細胞（粒子）の大きさおよび細胞（粒子）内部の複雑さを測定した。
　結果を図３および図４に示す。図３の（ａ）は、試料８の親株（野生型株）におけるクロロフィルの蛍光を示す細胞（粒子）のヒストグラムを表す図であり、（ｂ）は、試料８の親株（野生型株）の培養物中に浮遊する粒子の大きさと粒子内部の複雑さとの相関を表す図である。また、図４の（ａ）は、試料４のＧＳＨ１過剰発現株におけるクロロフィルの蛍光を示す細胞（粒子）のヒストグラムを表す図であり、（ｂ）は、試料４のＧＳＨ１過剰発現株の培養物中に浮遊する粒子の大きさと粒子内部の複雑さとの相関を表す図である。なお、図３の（ａ）および図４の（ａ）の図中に記載した矢印は、内部標準のピークを表している。また、図３の（ｂ）および図４の（ｂ）の図中に記載した四角の枠は、生細胞が存在している画分を表している。
　図３の（ａ）および（ｂ）に示したように、試料８の親株（野生型株）では、ほとんどの細胞が葉緑体（クロロフィル）を有する、生細胞であることが確認された。
　これに対して、図４の（ａ）に示すように、試料４のＧＳＨ１過剰発現株では、クロロフィルの蛍光がほとんど検出されなかった。そして、図４の（ｂ）に示すように、試料４のＧＳＨ１過剰発現株では、生細胞があまり存在していなかった。図４の（ｂ）において、四角の枠外に存在している粒子は、細胞外に排出されたデンプン粒であると考えられた。つまり、ＧＳＨ１過剰発現株では、細胞内で産生されたデンプンは、細胞の死を伴って、デンプン粒として細胞外に排出されていると考えられた。
　図３の（ａ）の図および図４の（ａ）の図における、「励起光（４８８ｎｍ）照射によりクロロフィル由来の蛍光を発した粒子の密度」を表３に示し、「励起光（４８８ｎｍ）照射によりクロロフィル由来の蛍光を発しなかった粒子の密度」を表４に示す。なお、表３および表４に示した細胞（粒子）の個数は、内部標準の値を基準に算出し、培養液１ｍＬに含まれる粒子数を１０の３乗で除した数値で表した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　〔実施例３〕
　実施例１で作製したＧＳＨ１過剰発現株を、窒素飢餓条件下で培養し、増殖能およびデンプン粒の産生能を評価した。具体的には、ＧＳＨ１過剰発現株を、実施例２と同じＴＡＰ培地を用いて、光量１７μＥ／ｍ２／秒の連続光、２４℃にて８日間、旋回台上で振とう培養した。その後、培養液を交換するために遠心分離（２０００ｇ、５分間）により細胞を沈降物として回収し、回収した細胞を２等分し、一方の細胞を、窒素源を含まないＴＡＰ　Ｎ－ｆｒｅｅ培地（GormanおよびLevine（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 54, 1665-1669.を参照）考案のＴＡＰ培地の組成のうち、塩化アンモニウムを同量の塩化カリウムで置換した培地）を用いて再懸濁し、他方の細胞を、アンモニウムを含む通常のＴＡＰ培地を用いて再懸濁した。再懸濁したときの細胞密度は、ＴＡＰ培地を用いた前培養終了時の細胞密度の約１．１倍となるように調整した。すなわち、前培養９０ｍＬに含まれる細胞を、１００ｍＬの新しい培地で再懸濁した。光量８０μＥ／ｍ２／秒にて、旋回台上で振とう培養し、一日毎に培養物の一部を分取し、増殖能およびデンプン産生能を評価した。コントロールとして、親株（野生型株、ＣＣ５０３株）を用いた。それぞれの試料の培養条件を表５および６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　結果を図５および図６に示す。図５は、試料９および試料１０における、「クロロフィルの蛍光を示す細胞（粒子）の密度」および「クロロフィルの蛍光を示さない細胞（粒子）の密度」の経時的な変化を表すグラフである。図６は、試料１１および試料１２における、「クロロフィルの蛍光を示す細胞（粒子）の密度」および「クロロフィルの蛍光を示さない細胞（粒子）の密度」の経時的な変化を表すグラフである。図５および図６のグラフにおいて、縦軸は、細胞（粒子）の密度を示し、横軸は、培養時間を示す。培養時間は、培養液を交換したときを０時間として表している。また、図５および図６において、上記「クロロフィルの蛍光を示さない細胞（粒子）の密度」は、「デンプン粒の密度」に相当する。また、図５および図６において、（ｂ）および（ｃ）の凡例中にある「TAP normal」、「TAP N-free」は、それぞれ「窒素源を含むＴＡＰ培地」、「窒素源を含まないＴＡＰ培地」の意味である。
　図５の（ａ）に示したように、ＧＳＨ１過剰発現株においては、窒素源を含有している培養液中では、葉緑体を有している細胞の密度は、培養後開始後に一旦増加し、その後減少する傾向があった。一方、窒素源を含有していない培養液中では、葉緑体を有している細胞はほとんど増殖しなかった。また、培養液中の窒素源の有無に関係なく、デンプン粒の密度は、経時的に増加した。さらに、培養液中の細胞（葉緑体を有している細胞）の密度が減少してくると、デンプン粒の密度が増加する傾向があった。
　これに対して、図６の（ａ）に示したように、親株（野生型株）においては、窒素源を含有している培養液中では、細胞は増殖するが、窒素源を含有していない培養液中では、細胞は緩やかに増殖した。また、親株（野生型株）においては、培養液中の窒素源の有無に関係なく、デンプン粒の密度は増加しなかった。親株（野生型株）では、窒素飢餓条件下においてデンプンの蓄積が起こることが報告されている。しかし、通常、クラミドモナスを培養する条件の光の強さ（８０μＥ／ｍ２／秒）では、窒素飢餓条件下であっても、デンプン粒が細胞外に排出されることはない。結果は示さないが、２５０μＥ／ｍ２／秒の光を照射した場合も同様に、親株（野生型株）ではデンプン粒が細胞外に排出されることはなかった。
　試料９，１０，１１および１２の培養液から、１日ないし２日の間隔で、一部を抜き取ったサンプルに含まれるデンプンを定量した。定量にはグルコース・テスト・ワコー（和光純薬工業社製）を使用した。その結果を図５の（ｂ），（ｃ）および図６の（ｂ），（ｃ）に示す。
　図５の（ｂ）および図６の（ｂ）に示すように、窒素飢餓条件の場合（ＴＡＰ　Ｎ－ｆｒｅｅ培地）では、ＧＳＨ１過剰発現株および親株（野生型株）のいずれも培養液中のデンプン濃度は高まっている。一方、窒素飢餓条件でない場合（ＴＡＰ　培地（Ｎ含有））、親株（野生型株）ではほとんど培地中のデンプン濃度は上昇しないが、ＧＳＨ１過剰発現株では、窒素飢餓条件の場合と同様にデンプン濃度は上昇している。
　また、図５の（ｃ）および図６の（ｃ）に、培養液中のデンプン量を１００万個の葉緑体を有する細胞あたりの数値で表現した結果を示す。同図に示すように、ＧＳＨ１過剰発現株の細胞あたりの生産性は、親株（野生型株）に比べて、窒素飢餓条件の有無に関わらず、著しく向上していることがわかる。これは、デンプンの蓄積に関して、原料の一部である培地成分に対する歩留まりが、ＧＳＨ１過剰発現株の方が親株（野生型株）より優れていることを意味する。また、細胞構成成分からなる廃棄物の発生量が、ＧＳＨ１過剰発現株の方が、親株（野生型株）と比べて、低いことも意味し、さらにはデンプンの精製に関し、ＧＳＨ１過剰発現株の方が、親株（野生型株）と比べて、容易であることも意味する。また、細胞を増殖段階から生産段階へと移行させる場合、実際には細胞密度を高めることも簡便なことから、細胞あたりの生産性が向上していることは、非常に優位性がある。
　なお、図５および図６で示した実験と同じ実験を独立して繰り返し行った結果を図１９および図２０に示す。図１９は、図５と同様に、試料９および試料１０における、「クロロフィルの蛍光を示す細胞（粒子）の密度」および「クロロフィルの蛍光を示さない細胞（粒子）の密度」の経時的な変化を表すグラフである。図２０は、図６と同様に、試料１１および試料１２における、「クロロフィルの蛍光を示す細胞（粒子）の密度」および「クロロフィルの蛍光を示さない細胞（粒子）の密度」の経時的な変化を表すグラフである。図１９および図２０に示したように、図５および図６で示した実験と同じ実験を繰り返し行った場合に、得られた結果は図５および図６に示した結果と同じ傾向を示したことから、データの再現性が高いことが確認された。
　〔実施例４〕
　実施例１で作製したＧＳＨ１過剰発現株を独立栄養条件下で培養し、増殖能およびデンプン粒の産生能を評価した。具体的には、ＧＳＨ１過剰発現株を、ＴＡＰ培地で前培養した後、ＨＳＭ培地（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1960) 46, 83-91.を参照）へ植え継ぎ、培養容器底付近へ挿入したガラス管を介して無菌の空気を送気しながら、光照射した。培養液の攪拌には、マグネチック・スターラーを使用した。詳しい培養条件は表７のとおりである。コントロールとして、同条件にて、親株（野生型株）を培養し、増殖能およびデンプン粒の産生能を評価した。
　エアレーションに伴う蒸散により減少する培地量をおおむね３００ｍＬに維持するため、適時、滅菌水を補充した。
　結果を図７に示す。図７の（ａ）は、ＧＳＨ１過剰発現株および親株（野生型株）における、「葉緑体の蛍光を示す細胞（粒子）の密度」および「葉緑体の蛍光を示さない細胞（粒子）の密度」の経時的な変化を表すグラフであり、（ｂ）は、培養液あたりのデンプン量の経時的な変化を表すグラフである。図７の（ａ）のグラフにおいて、縦軸は、細胞（粒子）の密度を示し、横軸は、培養時間を示す。培養時間は、独立栄養条件下で培養を開始したときを０時間として表している。また、図７の（ａ）のグラフにおいて、上記「葉緑体の蛍光を示さない細胞（粒子）の密度」は、「デンプン粒の密度」に相当する。
　図７の（ａ）に示したように、ＧＳＨ１過剰発現株においては、親株（野生型株）と比較すると増加速度が遅いものの、細胞の密度が、経時的に増加した。また、細胞の密度の増加に伴って、デンプン粒の密度が、経時的に、直線的に増加する傾向があった。これに対して、野生型株においては、細胞の密度は増加するが、デンプン粒はほとんど細胞外に排出されなかった。
　さらに、独立栄養条件下で培養後１０日目の、ＧＳＨ１過剰発現株および親株（野生型株）について、ヨウ素デンプン反応を行った。具体的には、ＧＳＨ１過剰発現株の培養液１ｍＬから、細胞（粒子）を遠心分離によって回収した。親株（野生型株）についても同様にして培養液から細胞（粒子）を回収した。回収した細胞（粒子）を、アセトンを用いて処理し、細胞からクロロフィルを除き、その後、ヨウ素デンプン反応を行った。細胞からクロロフィルを除くのは、ヨウ素デンプン反応の結果を見やすくするためである。
　結果を図８に示す。図８は、ＧＳＨ１過剰発現株および親株（野生型株）におけるヨウ素デンプン反応の結果を表す図である。図８に示したように、ＧＳＨ１過剰発現株においては、ヨウ素デンプン反応によって白色の粒子が濃い青紫色に着色することから、デンプン粒が細胞外に排出されていることが確認された。また、親株（野生型株）においても、着色は弱いが、若干のヨウ素デンプン反応が認められた。この結果から、独立栄養条件下では、窒素飢餓条件下でなくとも、親株（野生型株）においても、ある程度のデンプンが産生されていることが示唆された。
　図７の（ａ）に示される独立栄養条件下での培養について、一日毎に経時的に採取した培養液サンプル１ｍＬを用いて、デンプンの定量を行った。定量にはグルコース・テスト・ワコー（和光純薬工業社製）を使用した。
　結果を図７の（ｂ）に示す。ＧＳＨ１過剰発現株においては、親株（野生型株）と比較するとデンプンの生産開始が早い。また、ＧＳＨ１過剰発現株においては、同じ培養時を経た親株（野生型株）と比較するとデンプンの生産量が多い。例えば、培養１０日目の培養液中のデンプン濃度は、培養液１Ｌあたり、ＧＳＨ１過剰発現株では４１６．８ｍｇ、親株（野生型株）では１９６．４ｍｇであった。従って、培養液あたりの生産性は、ＧＳＨ１過剰発現株の方が、親株（野生型株）の２倍以上高かった。これは、デンプンの蓄積に関して、原料の一部である培地成分に対する歩留まりが、ＧＳＨ１過剰発現株の方が親株（野生型株）より優れていることを意味する。また、細胞構成成分からなる廃棄物の発生量が、ＧＳＨ１過剰発現株の方が、親株（野生型株）と比べて、低いことも意味し、加えてデンプンの精製に関し、ＧＳＨ１過剰発現株の方が、親株（野生型株）と比べて、容易であることも意味する。さらには、図７の（ａ）および（ｂ）に示された実施例の結果は、デンプン生産量に対して細胞増殖量が抑えられていることから、ＧＳＨ１過剰発現株は、親株（野生型株）と比較して、培地成分をより有効利用できる株であり、光合成によるデンプン生産を連続的に行う際の細胞株として、より好ましいことを示唆している。
　〔実施例５〕
　１００ｍｌのＴＡＰ培地に実施例１で作製したＧＳＨ１過剰発現株を接種し、８０μＥ／ｍ２／秒の連続光下で培養した。赤外線（９５０ｎｍ）の透過光量に基づいてＯＤ値を連続的にモニターし、対数増殖期または定常期に、培養液を５ｍＬ抜き取り、抜き取った培養液を新しい１００ｍＬのＴＡＰ培地へ移植（継代）し、同様に培養を継続した。
　図９は、ＧＳＨ１過剰発現株の増殖能を調べた結果を表す図である。図９中に示した矢印は、その始点が、培養液を抜き取った時点を表している。また、図９中、「初代」は初代培養を意味し、「継代１」は１回目の継代培養を意味し、「継代２」は２回目の継代培養を意味し、「継代３」は３回目の継代培養を意味し、「継代４」は４回目の継代培養を意味する。
　図９に示したように、ＧＳＨ１過剰発現株は、対数増殖期のみならず、定常期に入ってから約１５０時間経過した培養であっても、種培養（Seed culture）として新たに増殖が可能であることが確認できた。なお、初代培養（初代）の指数関数的成長区間の近似線は、ｙ＝０．００６７ｘ－０．４２８７で表され、Ｒ２＝０．９９５９であった。また、継代１回目（継代１）の指数関数的成長区間の近似線は、ｙ＝０．００８５ｘ－１．７７４で表され、Ｒ２＝０．９９５２であった。
　但し、定常期に入ってから約１５０時間経過した培養を種（Seed）とする場合は、定常期に入ってすぐの培養を種とする場合と比べて、増殖の立ち上がりが１８時間程度遅かった。この結果から、ＧＳＨ１過剰発現株では、対数増殖期が終了した時点において、全ての細胞が細胞死を運命付けられているのではなく、対数増殖期が終了した集団の中には増殖能力を有している細胞が含まれていることが明らかになった。すなわち、ＧＳＨ１過剰発現株では、対数増殖期および定常期の細胞を種として反復バッチ培養が可能であることが明らかになった。
　各増殖期におけるＧＳＨ１過剰発現株の特徴をさらに詳細に解析した結果を図１０に示す。図１０は、各継代時点でのＧＳＨ１過剰発現株の状態を調べた結果を表し、（ａ）は、図９に示す「継代１」を行ったときのＧＳＨ１過剰発現株の細胞の大きさと細胞内部の複雑さとの相関を表す図であり、（ｂ）は、図９に示す「継代２」を行ったときのＧＳＨ１過剰発現株の細胞の大きさと細胞内部の複雑さとの相関を表す図であり、（ｃ）は、図９に示す「継代３」を行ったときのＧＳＨ１過剰発現株の細胞の大きさと細胞内部の複雑さとの相関を表す図である。
　図１０に示すように、ＧＳＨ１過剰発現株では、いかなる培養時期（対数増殖期および定常期）であってもデンプン粒の放出が認められることが確認された。なお、図１０の（ａ）～（ｃ）の前方散乱と側方散乱との相関図において、左下角に認められる粒子の集団がデンプン粒に相当する。図１０の（ａ）～（ｃ）から、デンプン粒が豊富に含まれていることが確認された。以上の結果から、対数増殖期の培養物においても、ＧＳＨ１過剰発現株からデンプン粒が放出されていることが明らかになった。
　〔実施例６〕
　実施例１で作製したＧＳＨ１過剰発現株において、細胞外へ放出されたデンプン粒の形状を観察した。具体的には、細胞外へ放出されたデンプン粒を１ｍＬの０．０１％のＴｗｅｅｎ２０（登録商標、シグマ社製、型番Ｐ１３７９）に懸濁し、さらに９ｍＬのPercoll（登録商標、シグマ社製、型番Ｐ１６４４）加えて分散させ、遠心分離（９，１００×ｇ、３０分間）して精製し、得られたデンプン粒を、走査型電子顕微鏡を用いて観察した。
　図１１は、ＧＳＨ１過剰発現株から細胞外へ放出されたデンプン粒の形状を観察した結果を示す図である。図１１の（ａ）は、デンプン粒を走査型電子顕微鏡を用いて観察した結果を表す図である。図１１の（ａ）に示したように、ＧＳＨ１過剰発現株によって生成されるデンプン粒は、その平均粒径が長径で１．３μｍ（標準偏差０．１８１）、短径で１．０μｍ（標準偏差０．２０４）の微小であり、かつ大きさの揃った粒子であることが確認された。トウモロコシ、ジャガイモ、コムギ等によって作られる一般的なデンプン粒は平均粒径が１０～５０μｍであることから、ＧＳＨ１過剰発現株によって生成されるデンプン粒がいかに微小であるかがわかる。
　このように、ＧＳＨ１過剰発現株によって生成されるデンプン粒は、トウモロコシ、ジャガイモ、コムギ等によって作られる一般的なデンプン粒に比べて微小である。かかる微小なデンプン粒は、医薬品の製造において有用である。
　また、ＧＳＨ１過剰発現株におけるデンプン粒の放出は、細胞の破裂に伴う放出である。細胞の破裂に前後して、自己融解（autolysis）が起きるが、デンプン粒自体は自己融解を担う酵素による分解を受けない。このため、ＧＳＨ１過剰発現株では、不純物の少ないデンプン粒が得られる。
　具体的には、細胞が自己融解しない場合は、細胞内に蓄積するデンプン粒を取り出すために、磨砕など化学的、物理的手段よって細胞を壊す工程が必要であり、また壊れた細胞の破片が残渣となってデンプン粒に混入する。一方、細胞が自己融解する場合は、酵素反応により、高分子のタンパク質、炭水化物、膜系等は、より低分子の物質に分解されるため、細胞の破片の発生は少なくなる。さらに、細胞が残らないということは、原料（培地成分）あたりのデンプン粒の生産効率が高いということであり、歩留まりが良いと言える。また、自己融解によって生じる低分子物質は、藻類の増殖に利用可能であると考えられ、このような物質のリサイクルにより、藻類の増殖に必要な培地の節約が期待できると考えられる。細胞の自己融解は、野生型株では起きず、ＧＳＨ１過剰発現株でのみ起きる。
　なお、図１１の（ｂ）は、ＧＳＨ１過剰発現株から放出されたデンプン粒のおけるヨウ素デンプン反応の結果を表す図であるが、図１１の（ｂ）に示したように、ＧＳＨ１過剰発現株から放出されたデンプン粒は、対照として用いたコーンスターチと同様に、ヨウ素デンプン反応によって青紫色に着色することが確認された。
　また、図１１の（ｃ）は、ＧＳＨ合成酵素の阻害剤であるＢＳＯを添加した場合の、ＧＳＨ１過剰発現株のデンプン産生能を表す図であるが、ＢＳＯを加えなかったＧＳＨ１過剰発現株では、ＧＳＨの合成が阻害されないためデンプンが細胞外に排出されるのに対して、ＢＳＯを加えたＧＳＨ１過剰発現株では、ＢＳＯによってＧＳＨの合成が阻害されたため、デンプンが細胞外に排出されないことが確認された。
　〔実施例７〕
　ＧＳＨ１過剰発現株における油脂産生能について検討した。具体的には、実施例１で作製したＧＳＨ１過剰発現株を、２００ｍＬのＴＡＰ培地（窒素源を含む）中で、１７μＥ／ｍ２／秒の連続光下で４日間にわたり前培養した。次に、９０ｍＬの培養物に含まれる細胞を遠心分離（２，０００ｇ、５分）により回収し、集めた細胞を、新しい窒素源を含むＴＡＰ培地（１００ｍＬ）または新しい窒素源を含まないＴＡＰ培地（１００ｍＬ）に再懸濁することで培地交換を行った。その後、８０μＥ／ｍ２／秒の連続光下で６日間にわたり培養した。前培養終了時および培地交換後６日目の細胞をナイルレッドで染色し、染色した細胞をフローサイトメトリーへ供した。
　コントロールとして、ＧＳＨ１過剰発現株の親株であるクラミドモナス・ラインハルディＣＣ５０３株（野生型株）を用いて同じ実験を行った。
　図１２は、ＧＳＨ１過剰発現株の油脂産生能を調べた結果を表し、（ａ）は、親株（野生型株）におけるナイルレッド由来の蛍光を示す細胞のヒストグラムを表す図であり、（ｂ）は、ＧＳＨ１過剰発現株におけるナイルレッド由来の蛍光を示す細胞のヒストグラムを表す図であり、（ｃ）は、前培養に含まれるナイルレッド染色した親株（野生型株）の共焦点レーザー顕微鏡による観察結果を表す図であり、（ｄ）は、前培養に含まれるナイルレッド染色したＧＳＨ１過剰発現株の共焦点レーザー顕微鏡による観察結果を表す図である。なお、図１２の（ａ）および（ｂ）の上段のヒストグラムにおいて、薄い灰色ピークは窒素源を含むＴＡＰ培地で培養した細胞に相当し、白抜きのピークは窒素源を含まないＴＡＰ培地で培養した細胞に相当し、一番右（一番蛍光強度が強い）のピークは粒子密度を決めるために加えた人工蛍光ビーズ（内部標準）に相当する。図１２の（ａ）および（ｂ）の下段のヒストグラムは、前培養に含まれるナイルレッド染色された細胞に相当する。
　図１２に示したように、ＧＳＨ１過剰発現株では、細胞あたりの蛍光強度が、４日間培養した前培養（窒素源あり）の培養試料、窒素源ありの培地に交換して６日後の培養試料、および窒素源なしの培地に交換して６日後の培養試料のこれら３点いずれの培養試料においても、親株と比較して増加していた。この結果は、個々の細胞に含まれる油脂の量に関し、ＧＳＨ１過剰発現株は親株（野生型株）と比べて多いことを示している。具体的には、ＧＳＨ１過剰発現株におけるナイルレッド由来の蛍光の蛍光強度は、親株（野生型株）と比べて約１０の０．５乗倍（およそ３，２倍）強かった。
　図１３は、ＧＳＨ１過剰発現株の状態を調べた結果を表し、（ａ）は、ＧＳＨ１過剰発現株の細胞の大きさと細胞内部の複雑さとの相関を表す図であり、（ｂ）は、ＧＳＨ１過剰発現株の細胞の大きさとナイルレッド由来の蛍光強度との相関を表す図であり、（ｃ）は、（ｂ）の図において四角で囲った領域に含まれている細胞に関して、細胞の大きさと細胞内部の複雑さとの相関を表す図であり、（ｄ）は、親株（野生型株）の細胞の大きさと細胞内部の複雑さとの相関を表す図である。
　図１３の（ｃ）に示したように、図１３の（ｂ）において強く蛍光を発する粒子の集団（図１３の（ｂ）中の四角で囲った領域内の粒子）に対してゲートをかけると、細胞が強く光っていることがわかった。一方、細胞から遊離した微小粒子（すなわち、デンプン粒が属する微小粒子の集団）は光っていないことがわかった。以上のことから、デンプン粒と同程度の前方散乱を示し、かつデンプン粒と同程度の側方散乱を示す、微粒子の集団に油脂から成る微粒子は含まれないことを確認することができた。
　なお、ナイルレッド由来の蛍光が強く発せられるのは、細胞がその形態を残している場合であり、細胞が壊れ、そこに含まれる油脂が細胞から遊離した場合は、フローサイトメーター（ＦＣＭ）では検出できない（検出されにくい）。このため、ＧＳＨ１過剰発現株における細胞の崩壊が進むと、ＧＳＨ１過剰発現株と親株（野生型株）との間の油脂量の差は実際よりも小さく見積もられる可能性が考えられた。
　そこで、ＧＳＨ１過剰発現株と親株（野生型株）との間の油脂量の差をより明確にするために、それぞれの細胞から脂肪酸を抽出して、定量定量分析を行った。具体的には、上記フローサイトメトリーに供した細胞と同じ細胞（ＧＳＨ１過剰生産株を、窒素源を含むＴＡＰ培地または窒素源を含まないＴＡＰ培地中で、８０μＥ／ｍ２／秒の連続光下で６日間培養した細胞）を用い、ＧＳＨ１過剰発現株によって産生された脂肪酸をBlighとDyerにより開発された方法（Can. J. Biochem. Physiol. 37(8): 911-917.を参照）によって回収し、回収した脂肪酸をメチルエステル化した後に、ガスクロマトグラフ質量分析（ＧＣ／ＭＳ）へ供した。ＧＣ／ＭＳでは、内部標準としてペンタデカン酸を添加した。ペンタデカン酸は、全ての試料に対して同じ量添加した。コントロールとして、ＧＳＨ１過剰発現株の親株であるクラミドモナス・ラインハルディＣＣ５０３株（野生型株）を用いて同じ実験を行った。
　すなわち、ＧＣ／ＭＳへ供した試料は、以下の４種類である：
　(i)窒素存在下で培養した親株（野生型株）
　(ii)窒素飢餓条件下で培養した親株（野生型株）
　(iii)窒素存在下で培養したＧＳＨ１過剰発現株
　(iv)窒素飢餓条件下で培養したＧＳＨ１過剰発現株。
　なお、脂肪酸の標準品として次の市販品を用いた。ペンタデカン酸（ジーエルサイエンス社製、型番１０２１－４３１５０）、パルミチン酸（シグマ社製、型番Ｐ０５００）、パルミトレイン酸（シグマ社製、型番Ｐ９４１７）、ステアリン酸（シグマ社製、型番Ｓ４７５１）、オレイン酸（シグマ社製、型番Ｏ１００８）、リノール酸（シグマ社製、型番Ｌ１３７６）、リノレン酸（シグマ社製、型番Ｌ２３７６）。
　図１４は、ガスクロマトグラフ質量分析の結果を表す図である。図１４に示すように、全ての試料において、標準品に含まれているパルミチン酸（Ｃ１６：０）に相当するピークが認められた。この結果、親株（野生型株）およびＧＳＨ１過剰発現株において、脂肪酸としてパルミチン酸が産生されていることが確認された。
　親株（野生型株）およびＧＳＨ１過剰発現株に含まれている油脂量を定量した結果を表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　表８に示したように、細胞１００万個当たりに含まれている油脂量を比較したところ、ＧＳＨ１過剰発現株に含まれている油脂量は、親株（野生型株）と比べて５倍以上多いことが確認された。以上のことから、藻類において葉緑体内のグルタチオン濃度を増加させることによって細胞に含まれる油脂量が増加することが確認された。
　〔実施例８〕
　クラミドモナス・ラインハルディｓｔａ６欠損変異株（「ｓｔａ６変異株」ともいう。）は、野生型（クラミドモナス・ラインハルディＳＴＡ６）株に比べて油脂の含量が多いことが報告されている。細胞内油脂の貯蔵体であるオイルボディをナイルレッドで染色すると、ｓｔａ６変異株は、野生型と比べて、より大きく、より多くのオイルボディを含むことが報告されている（Wang et al. (2009) Eukaryotic Cell Vol. 8 (12): 1856-1868.（非特許文献１）を参照）。
　そこで、ｓｔａ６欠損変異株を親株として用いてＧＳＨ１過剰発現株を作製した。具体的には、クラミドモナス・ラインハルディＣＣ５０３株の代わりに、ｓｔａ６変異株であるＣＣ４３３３株（クラミドモナスセンター、米国、デューク大学より分譲を受けた。）を用いた以外は、実施例１と同じ方法でＧＳＨ１過剰発現株（「ＧＳＨ１過剰発現株（ｓｔａ６－背景）」と称する。）を作製した。
　図１５は、ＧＳＨ１過剰発現株（ｓｔａ６－背景）およびその親株（ｓｔａ６－）の状態を調べた結果を表し、（ａ）は、親株（ｓｔａ６－）の細胞の大きさと細胞内部の複雑さとの相関を表す図であり、（ｂ）は、ＧＳＨ１過剰発現株（ｓｔａ６－背景）の細胞の大きさと細胞内部の複雑さとの相関を表す図である。
　図１５に示したように、前方散乱と側方散乱との相関図に関しては、ＧＳＨ１過剰発現株（ｓｔａ６－背景）と親株（ｓｔａ６－）との間に差は認められなかった。これは、フローサイトメトリーで観測する限りでは、ＧＳＨ１過剰発現株（ｓｔａ６－背景）と親株（ｓｔａ６－）との間で細胞の大きさや細胞内の構造について差が認められないことを意味している。
　次いで、１００ｍｌのＴＡＰ培地にＧＳＨ１過剰発現株（ｓｔａ６－背景）を接種し、１７μＥ／ｍ２／秒の連続光下で５日間、前培養した。その後、９０ｍＬの培養物に含まれる細胞を遠心分離（２，０００ｇ、５分）により集めた。集めた細胞を、９０ｍＬの新しい窒素源を含むＴＡＰ培地、または９０ｍＬの新しい窒素源を含まないＴＡＰ培地に再懸濁することにより培地交換を行い、さらに３日間、８０μＥ／ｍ２／秒の連続光下で培養した。前培養終了時および培地交換後３日目の細胞をナイルレッドで染色し、染色した細胞をフローサイトメトリーへ供した。コントロールとして、ＧＳＨ１過剰発現株（ｓｔａ６－背景）の親株であるｓｔａ６変異株（ＣＣ４３３３株、ｓｔａ６－）を用いて同じ実験を行った。
　図１６は、前培養後および培地交換後３日目のＧＳＨ１過剰発現株（ｓｔａ６－背景）およびその親株（ｓｔａ６－）の油脂産生能を調べた結果を表し、（ａ）は、前培養後のＧＳＨ１過剰発現株（ｓｔａ６－背景）およびその親株（ｓｔａ６－）におけるナイルレッド由来の蛍光を示す細胞のヒストグラムを表す図であり、（ｂ）は、培地交換後３日目のＧＳＨ１過剰発現株（ｓｔａ６－背景）およびその親株（ｓｔａ６－）におけるナイルレッド由来の蛍光を示す細胞のヒストグラムを表す図である。なお、図１６の（ａ）および（ｂ）において、親株（ｓｔａ６－）の結果は濃い灰色のヒストグラムで表し、ＧＳＨ１過剰発現株（ｓｔａ６－背景）の結果は薄い灰色のヒストグラムで表している。
　図１６の（ｂ）に示したように、培地交換後３日目のＧＳＨ１過剰発現株（ｓｔａ６－背景）株では、親株（ｓｔａ６－）と比べて、蛍光強度の分布域が強い方（右側）へとシフトしていた。これは、ＧＳＨ１過剰発現株（ｓｔａ６－背景）株は、親株（ｓｔａ６－）と比べて、細胞内の油脂含量が多いことを示している。
　以上の結果から、藻類において葉緑体内のグルタチオン濃度を増加させることによって細胞に含まれる油脂量が増加することが確認された。
　〔実施例９〕
　実施例１で作製したＧＳＨ１過剰発現株を、トリス－酢酸－リン酸（ＴＡＰ）培地、ｐＨ７（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 54, 1665-1669.を参照）に接種し、２４℃の培養チャンバー内に置き、振とうを与え、１００μＥ／ｍ２／秒の連続光を照射するという半従属栄養条件下において、培養した。２日毎に、１ｍＬの培養物に含まれる細胞を集め、組成が８０％アセトン／２０％水から成る溶媒を用いて、クロロフィルａおよびクロロフィルｂを抽出した。分光光度計を使い、波長６４５ｎｍ、６６３ｎｍにける吸光度を測定し、これらの値からＰｏｒｒａらが提唱する計算式（Biochim. Biophys. Acta (1989)、975巻、384-394を参照）によって、クロロフィルａおよびクロロフィルｂの量を算出した。
　図１７は、実施例１で作製したＧＳＨ１過剰発現株のクロロフィル量を調べた結果を表す図である。図１７に示すように、クロロフィル総量（クロロフィルａ量とクロロフィルｂ量の和）は、培養４日目から培養１０日目までは、細胞の増殖に伴い増加するが、その後は主にクロロフィルａの分解により減少する。クロロフィル総量は、培養１０日目に最大値に達し培養液あたり３．８μｇ／ｍＬであった。これは、親株（野生型株）のクロロフィル総量である７．６μｇ／ｍＬより小さい。つまり、培養液あたりのクロロフィル総量は、全培養期間をとおして、ＧＳＨ１過剰発現株の方が親株（野生型株）より少ない。
　培養液あたりのクロロフィル総量が小さい方が、藻体による過剰な光吸収による光エネルギーの損失が小さいと言える。換言すれば、同じ光量の下に液体培養を実施する場合、培養液あたりのクロロフィル総量が小さい方が、培養のより深部にまで光エネルギーを送達することできると言える。クロロフィルｂの量を減少させ、光化学系２のクロロフィルアンテナサイズを小さくする研究が報告されている（田中ら(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95巻、12719-12723、Polleら(2000) Planta 211巻、335-344を参照）。クロロフィルｂ量を減少させる操作も、培養のより深部にまで光エネルギーを送達させる効果がある。
　光合成に係る色素の総量、構成比を変化させることは、光合成産物の生産性向上に寄与すると示唆される。
　図１７に示すごとく、ＧＳＨ１の過剰発現により、色素の総量、色素の構成比を変化せしめることが可能であり、従って、ＧＳＨ１の過剰発現は光合成産物の生産性向上に寄与すると示唆される。
　〔実施例１０〕
　藍藻（ラン藻）Synechococcusにおいて大腸菌由来のγグルタミルシステイン合成酵素遺伝子であるｇｓｈＡを発現させることを目的に、以下の手順によって組換えＤＮＡ分子を作成した。
　（１）大腸菌ベクターｐＡＣＹＣ１８７（日本ジーン製、型番３１３－０２２０１、配列番号９）の３７００番目の塩基をアデニンからシトシンに置換し、制限酵素ＳｍａＩの認識サイトを作製した。続いて、このベクターを２種類の制限酵素ＳｍａＩおよびＳａｌＩで処理し、クロラムフェニコール耐性遺伝子および複製オリジン（ｐ１５Ａ　ｏｒｉ）を含む約２．７ｋｂのＤＮＡ断片を調製した。
　（２）ｇｓｈＡ遺伝子を含む約１．６ｋｂのＤＮＡ断片（配列番号１０）を、大腸菌ＪＭ１０９株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、２種類のプライマーＤＮＡ（配列番号１２および配列番号１３）を使ったＰＣＲ法により調製した。得られたＰＣＲ断片を、制限酵素ＸｈｏＩで処理した。
　（３）手順（１）および（２）で調製したＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結し、大腸菌を用いて増幅させた。各種制限酵素による分解物の大きさを調べ、目的とするクロラムフェニコール耐性遺伝子（以下、ＣＡＴと略す。）の下流にｇｓｈＡがつながった構造（以下、「ＣＡＴ－ｇｓｈＡの遺伝子カセット」と呼ぶ。）を有するプラスミドが完成したことを確認した。このプラスミドを「pACYC184R-SmaI-E.c.gshA」と命名した。
　（４）次に、ラン藻内において自律的なＤＮＡ複製をドライブする複製領域と呼ばれる遺伝子領域をクローニングした。具体的には、文献（Akiyamaら(1999)DNA RESEARCH 5巻, 327-334）を参考に、ラン藻Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ　ＰＣＣ７００２株（アメリカンタイプカルチャーコレクションＡＴＣＣ２７２６４）の菌体内に存在するプラスミドｐＡＱ１に含まれる複製領域（配列番号１１）をＰＣＲ法によって増幅させた。使用した２種類のＰＣＲプライマーの配列は配列番号１４および配列番号１５に示す。得られた約３．４ｋｂのＰＣＲ断片とプラスミドベクターｐＺｅｒｏ２（登録商標、インビトロジェン社）を制限酵素ＥｃｏＲＶで開環したＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結し、大腸菌を用いて増幅させた。各種制限酵素による分解物の大きさを調べ、目的とするラン藻内で自律的にＤＮＡ複製を可能にする遺伝子領域を有するプラスミドが完成したことを確認した。このプラスミドを「pZero2-pAQ1-ori」と命名した。
　（５）最終的に、大腸菌ｇｓｈＡをＣＡＴのリードスルーにより発現させる遺伝子カセットをラン藻内で自律的に複製するプラスミド上に載せた。具体的には、手順（３）で作製したpACYC184R-SmaI-E.c.gshAを鋳型として、２種類のＰＣＲプライマー（配列番号１６および配列番号１７）を使い、ＰＣＲ法によって増幅させた。得られた約２．７ｋｂのＰＣＲ断片と、手順（４）で作製したpZero2-pAQ1-oriを制限酵素ＳｔｕＩで分解することにより生じた約６．２ｋｂのＤＮＡ断片を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連結し、大腸菌を用いて増幅させた。各種制限酵素による分解物の大きさを調べ、目的とするラン藻内で自律的にＤＮＡ複製を可能にする遺伝子領域およびＣＡＴ－ｇｓｈＡの遺伝子カセットを有するプラスミドが完成したことを確認した。このプラスミドを「ｐＳｙｎ５」と命名した。
　（６）ｐＳｙｎ５をラン藻に導入する実験の対照実験に用いるプラスミドを構築した。これは、ＣＡＴのみを有し、ｇｓｈＡは有さないプラスミドである。具体的には、ｐＡＣＹＣ１８４を鋳型として、２種類のＰＣＲプライマー（配列番号１６および配列番号１８）を用い、ＰＣＲ法で増幅させた。得られた約１．１ｋｂのＰＣＲ断片と、手順（４）で作製したpZero2-pAQ1-oriとを制限酵素ＳｔｕＩで分解することにより生じた約６．２ｋｂのＤＮＡ断片を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連結し、大腸菌を用いて増幅させた。各種制限酵素による分解物の大きさを調べ、目的とするラン藻内で自律的にＤＮＡ複製を可能にする遺伝子領域およびＣＡＴ遺伝子を有するプラスミドが完成したことを確認した。このプラスミドを「ｐＳｙｎ３」と命名した。
　プラスミドｐＳｙｎ５およびｐＳｙｎ３を、別々に、ラン藻Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ　ＰＣ７００２株へ、公知の方法（Fringaardら(2004)Methods in Molecular Biology、 274巻、 325-340を参照）により導入した。それぞれのプラスミドを導入された形質転換体を「Ｅ．ｃ．ｇｓｈＡプラス株」、「Ｅ．ｃ．ｇｓｈＡマイナス株」と命名した。Ｅ．ｃ．ｇｓｈＡプラス株では大腸菌由来のγグルタミルシステイン合成酵素が機能する。一方、Ｅ．ｃ．ｇｓｈＡマイナス株では、大腸菌由来のγグルタミルシステイン合成酵素は存在しない。
　これら２種類のラン藻を、別々に、８０ｍＬのダイゴ培地（精製水１Ｌに、ダイゴＩＭＫ培地（日本製薬製、型番３９８－０１３３３）５００ｍｇ、人工海水ＳＰ（日本製薬製、型番３９５－０１３４３）３６ｇ、トリスヒドキシメチルアミノメタン（ナカライ製、型番３５４３４－２１）１ｇ、炭酸水素ナトリウム（和光純薬製、型番１９８－０１３１５）１ｇ、クロラムフェニコール（和光純薬製、型番０３４－１０５７２）１０ｍｇを溶解し、ろ過滅菌したもの）に接種し、大気を通気しながら攪拌し、３０℃に保温し、７０μＥ／μＥ／ｍ２／秒の連続光を照射して、３日間培養した。
　培養物１ｍＬに含まれる細胞を遠心分離により集め、水０．２ｍＬに懸濁した。次に、アセトン０．８ｍＬを加え、激しく攪拌することで色素を抽出した。遠心分離で細胞残渣を除き、澄んだ色素の溶液の吸光スペクトルを、分光光度計を用いて測定した。
　図１８は、ラン藻の形質転換体である、Ｅ．ｃ．ｇｓｈＡプラス株およびＥ．ｃ．ｇｓｈＡマイナス株より抽出した色素類の吸光スペクトルを調べた結果を表す図である。図１８の（ａ）は、Ｅ．ｃ．ｇｓｈＡプラス株の吸光スペクトルを表す図であり、（ｂ）は、Ｅ．ｃ．ｇｓｈＡマイナス株の吸光スペクトルを表す図であり、（ｃ）は、Ｅ．ｃ．ｇｓｈＡプラス株のスペクトルからＥ．ｃ．ｇｓｈＡマイナス株のスペクトル差し引いたスペクトルを表す図である。実施例９で得た結果と同様に、ラン藻の場合もＥ．ｃ．ｇｓｈＡプラス株は、Ｅ．ｃ．ｇｓｈＡマイナス株に比べて、色素組成が変化していることが示された（図１８）。このことにより、γグルタミルシステインシンセターゼをラン藻で過剰発現させた場合も、実施例１で作製したＧＳＨ１過剰発現株と同様な光合成に対する効果が得られることが示された。
　本発明によれば、従来よりも安価に、効率よく藻類からバイオマスを製造することができる。バイオマスは、バイオ燃料の原料として利用が期待されている。このため、本発明は、エネルギー産業等の広範な産業において利用可能性がある。

Claims (10)

  1. 　葉緑体内のグルタチオン濃度が増加していることを特徴とする、藻類。
  2. 　葉緑体において、γ－グルタミルシステイン合成酵素、グルタチオン合成酵素、ＡＴＰスルフリラーゼ、アデノシン５’－ホスホ硫酸還元酵素、亜硫酸還元酵素、システイン合成酵素およびセリンアセチル転移酵素からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質の発現量および／または活性が増加していることを特徴とする、請求項１に記載の藻類。
  3. 　上記γ－グルタミルシステイン合成酵素、グルタチオン合成酵素、ＡＴＰスルフリラーゼ、アデノシン５’－ホスホ硫酸還元酵素、亜硫酸還元酵素、システイン合成酵素およびセリンアセチル転移酵素からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチドが導入されていることを特徴とする、請求項１または２に記載の藻類。
  4. 　上記γ－グルタミルシステイン合成酵素をコードするポリヌクレオチドが、以下の（ａ）～（ｄ）からなる群より選択されることを特徴とする、請求項３に記載の藻類：
    （ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
    （ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つγ－グルタミルシステイン合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
    （ｃ）配列番号２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
    （ｄ）上記（ａ）～（ｃ）のポリヌクレオチドのうちいずれかのポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つγ－グルタミルシステイン合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
  5. 　請求項１～４のいずれか１項に記載の藻類を製造する方法であって、
    　藻類の葉緑体内のグルタチオン濃度を増加させる、グルタチオン濃度増加工程を含むことを特徴とする、藻類の製造方法。
  6. 　上記グルタチオン濃度増加工程は、γ－グルタミルシステイン合成酵素、グルタチオン合成酵素、ＡＴＰスルフリラーゼ、アデノシン５’－ホスホ硫酸還元酵素、亜硫酸還元酵素、システイン合成酵素およびセリンアセチル転移酵素からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチドを藻類に導入する工程であることを特徴とする、請求項５に記載の藻類の製造方法。
  7. 　請求項１～４のいずれか１項に記載の藻類、または請求項５または６に記載の藻類の製造方法によって製造された藻類を用いることを特徴とする、バイオマスの製造方法。
  8. 　上記藻類に対して光を照射する、光照射工程を含むことを特徴とする、請求項７に記載のバイオマスの製造方法。
  9. 　上記光照射工程は、実質的に窒素飢餓ではない条件において行うことを特徴とする、請求項８に記載のバイオマスの製造方法。
  10. 　藻類の葉緑体内のグルタチオン濃度を増加させる物質の存在下にて、藻類を培養する工程を含むことを特徴とするバイオマスの製造方法。
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