CN104140930B - 一株高产油莲园绿球藻及其用途 - Google Patents

一株高产油莲园绿球藻及其用途 Download PDF

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本发明公开了一株高产油莲园绿球藻及其用途。本发明的莲园绿球藻(Chlorococcum lianyuanensis)于2013年12月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号：CGMCC No.8605。莲园绿球藻可以在生产生物柴油、处理生活废水、生产色素、固定二氧化碳或作为渔业养殖中的开口饵料中的应用。

Description

一株高产油莲园绿球藻及其用途
技术领域：
本发明属于微生物及生物能源技术领域，具体涉及一种高产油莲园绿球藻及其用途。
背景技术：
微藻是生产生物柴油的理想原料，但高生产成本制约了其产业化进程，利用微藻生产生物柴油首先需要获得具有优良性状的产油微藻藻株，但目前已报道的产油微藻仍然存在诸多缺点：
1)藻种的生长速度慢且生物量低，特别是在油脂快速积累期，绝大部分藻种的生物量低于4.0g L-1，无法满足下游生物柴油提炼的原料需求。
2)许多微藻仅可在逆境条件下积累较高含量的油脂，但逆境条件下微藻的生长受到严重抑制，导致生物质积累量降低，而在正常培养阶段，其油脂含量低于30％，无法满足规模化生产的需要。
3)中性脂含量未公布或相对较低，微藻脂类可分为中性脂、糖脂和磷脂，其中中性脂是生产生物柴油的最理想材料，而过高含量的糖脂和磷脂将会严重影响生物柴油的品质。
4)一些产油微藻，如小球藻，其细胞体积较少，采收困难，目前针对此类微藻的采收方法仅有高速离心，设备成本高，能耗大，导致微藻生物柴油成本增加。
5)产油微藻的耦合培养方式研发不足。微藻生物柴油的高成本是制约其产业化开发的主要瓶颈，获得可在生活废水生长的产油微藻，并以生活废水替代部分营养盐培养产油微藻，在生产生物柴油的同时净化环境，具有双重作用。目前已公开的专利中，一些专利产油微藻不能在废水中生长，如衣藻，另外，一些专利产油微藻并未提及其废水处理特性。
世界能源危机的加剧激发了科学家探寻持续、可再生、环境友好型能源形式的兴趣，产油微藻(oleaginous microalgae)相对于其他陆生高等油料作物具有细胞结构简单、光合效率高、生长速率快、单位面积油脂产量高、可合成高附加值产品、可在废水中生长、同时可吸收二氧化碳(发电厂、水泥厂等)净化环境等优势，被认为是生产生物柴油(biodiesel)的理想原料。
微藻种类多样，目前自然界中发现的微藻种类已超过40,000种，不同门类的藻类在形态、生长特性、环境适应性、营养需求、油脂积累特性和脂肪酸组成等方面存在较大差异，上述差异为产油藻株的筛选提供了广阔的空间。正常条件下，绿藻的平均总脂含量为25.5％DW，硅藻为22.7％DW，其他藻类(金藻纲,真眼点藻纲,甲藻门,黄藻纲和红藻纲)为27.1％DW，而在胁迫条件下绿藻的总脂含量提高为45.7％DW，硅藻提高为44.6％DW，其他藻类(金藻纲,真眼点藻纲,甲藻门,黄藻纲和红藻纲)提高为44.6％DW，蓝藻中未发现储藏性脂类的积累。选育性能优越的藻株是开展产油微藻生理生化研究和产业化培养的基础，可用于产业化培养的工程藻株应具备：(1)生长速度快、生物质浓度高；(2)油脂积累速度快且含量高；(3)广温适应性；(3)易培养，可抵抗环境中细菌、杂藻、真菌、原生动物、变形虫侵害；(4)具有较低的夜间呼吸作用；(5)具备遗传改造的可行性。
目前产油微藻藻种资源开发中存在的问题主要包括：1)专利藻种较少，目前已申请专利保护的产油微藻主要集中在小球藻和栅藻两种类型，其他藻类(如硅藻、金藻等)较少报道；2)小球藻细胞相对较小，后续采收成本高；3)产油微藻用途单一，按目前微藻生物柴油的成本进行核算，远不能满足产业化生产的需要，如能进行整合技术研发，将在一定程度上降低微藻生物柴油的生产成本，如耦合废水处理、耦合二氧化碳减排、耦合高附加值活性物质的开发等；4)目前已报道的大部分藻株与理想的工程藻株还存在一定差距(生长速率、总脂产量、抗逆性等)，不具备规模化培养价值。综上所述，目前已公开的产油微藻藻株并不能完全用于微藻生物产油的产业化应用中，有必要进行新资源产油微藻的持续探索。
目前已公开的“微藻生物柴油专利”中，涉及藻种保护的专利主要包括：
1)一株小球藻及其培养方法和应用(专利申请号：CN201110145547.7)，该发明公开了一株小球藻藻株(Chlorella sp.MRA-1，保藏编号为CGMCC No.4652)，该藻可适应多种培养基、温度、氮源浓度、CO2浓度条件，在低氮条件下的油脂含量和产率高，该藻株可应用在CO2的固定，废水的净化，油脂、蛋白质、色素、淀粉、多糖、核酸等生物质的生产。
2)栅藻藻株及其应用(专利申请号：CN201210318629.1)，该发明公开了一种栅藻藻株(Scenedesmus sp.，保藏编号为CGMCC No.6347)及其应用，该藻具有生长速度快、油脂积累快、含油量高、能够有效去除水中的含氮化合物等优点，可用于生物柴油、食品、保健品、饲料、水产品饵料、药物以及化妆品和色素的生产。
3)一种栅藻藻株及其用途(专利申请号：CN201110448718.3)，该栅藻(Desmodesmus sp.，保藏编号为CGMCC No.5150)能够在较大的温度范围内生长，生长速度快且易于收集，并且能够有效产生脂肪酸、类胡萝卜素等物质，具有在污水处理、生物柴油生产、以及饲料或食品行业等应用的潜力。
4)小球藻Yun-32及其制备方法(专利申请号：CN201010143672.X)，该发明公开了一种小球藻Yun-32(保藏编号为：CCTCC NO M2010071)。该藻株能在自养培养条件下快速生长并积累油脂，油脂含量高，其制备培养方法的工艺过程简单、培养周期短、投入低和易于保存等特点，易于工业化生产。
5)一株淡水小球藻Chlorella pyrenoidosa XJ01及其在固定CO2和生产微藻油脂中的应用(专利申请号：CN201310187830.5)，该藻(保藏编号为：CCTCC NO M2013103)能够高效固定0.03～20％的CO2，脂肪酸组成主要为C16、C18脂肪酸，适合生物柴油的生产。
6)一株栅藻藻株及其应用(专利申请号：CN201110427579.6)，该藻(保藏编号为CGMCCNO.4323)具有耐高温、易收集的特点，环境适应性强，适于高密度养殖，可用于含氮磷污水的处理、二氧化碳减排、生物柴油生产或用于水产品饵料或动物饲料等，产业化应用潜力较大。
7)一株衣藻藻株及其应用(专利申请号：CN201010002968.X)，该衣藻(保藏编号为CGMCC No.3577)油脂含量较高，可应用于制备生物柴油、饲料或食用油。
通过对已申请专利保护的产油藻株进行分析发现，一些产油微藻虽然具有较高的油脂含量，但其生物质浓度较低，产业化潜力不明显；还有一些产油微藻存在采收成本高、抗生物污染能力弱等问题。
发明内容：
本发明的第一个目的是提供一种可用于微藻油脂生产的高产油能源的微藻—莲园绿球藻(Chlorococcum lianyuanensis)，该藻株具有生长速率快、油脂含量高、细胞体积大等特点，可利用生活废水作为营养液进行生长。
本发明的莲园绿球藻(Chlorococcum lianyuanensis)于2013年12月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号：CGMCC No.8605。
本发明的第二个目的是上述莲园绿球藻在生产生物柴油、处理生活废水、生产色素、固定二氧化碳或作为渔业养殖中的开口饵料中的应用。
本发明的莲园绿球藻(Chlorococcum lianyuanensis)相比于现有技术中的微藻，具有以下优点：
1)莲园绿球藻在正常培养条件下的生物量可达8.89g L-1，其总脂含量可占细胞干重的55.54％(大多为三酰甘油TAG)，总脂产量4.94g L-1，脂肪酸组成分析发现，莲园绿球藻的脂肪酸以C16:0和C18:1为主，适宜用来生产生物柴油。
2)莲园绿球藻可利用生活废水作为营养液进行生长，大幅度降低生活废水中的氮、磷和重金属元素的浓度，起到净化环境的目的；另一方面可以减少营养盐的需求，降低微藻的培养成本。
3)莲园绿球藻的细胞体积较大、结构简单，易采收，大细胞也是基础研究的理想材料。
4)莲园绿球藻还含有一些有益的色素，可以应用到色素生产领域。
5)莲园绿球藻可以作为渔业养殖中的开口饵料，也可以作为动物饲料的添加剂。
因此，本发明的莲园绿球藻可应用在产油微藻的基础研究、油脂生产、生活废水处理、色素生产、二氧化碳固定、饵料和饲料开发等，具有非常重要的开发利用潜力。
本发明的莲园绿球藻(Chlorococcum lianyuanensis)于2013年12月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号：CGMCC No.8605。
附图说明：
图1为莲园绿球藻细胞的形态，其中A为放大40倍，B为放大40倍，C为放大17500倍；
图2为莲园绿球藻的生长曲线；
图3为莲园绿球藻色素组成
图4为莲园绿球藻脂肪酸组成；
图5为莲园绿球藻在生活废水中生长状况；
图6为莲园绿球对沼液的水质净化的能力；
图7为莲园绿球对沼液中部分重金属离子的去除效果。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
本发明的莲园绿球藻(Chlorococcum lianyuanensis)分离自水深较浅的人造湖水体，该莲园绿球藻为单细胞，椭圆形，细胞壁较薄或常见不规则增厚，色素体在新生细胞中呈周生、杯状，具1个蛋白核，细胞逐渐成熟后分散并充满整个细胞；细胞核1个，淀粉颗粒多个；无性繁殖形成多数动孢子，偶尔亦会形成不动孢子(图1)。莲园绿球藻细胞大小在8-12μm，细胞较大。
1.环境条件：
莲园绿球藻(Chlorococcum lianyuanensis)适宜生长温度为15-30℃，光照强度为10-1000μmol photons m-2s-1，pH为6-10，可在CO2浓度为0-10％的通气条件下生长。
2.营养条件：
a).NaNO3100-1500mg/L；b).K2HPO4·3H2O10-100mg/L；c).MgSO4·7H2O10-80mg/L；d).CaCl2·2H2O10-50mg/L；e).NaCO310-30mg/L；f).FeCl3·6H2O2-6mg/L；g).Citric acid4-8mg/L；h).EDTANa22-5mg/L；i).H3BO32-4mg/L；j).MnCl2·4H2O1-2mg/L；k).ZnSO4·7H2O0.1-0.3mg/L；l).Na2MoO4·2H2O0.2-0.4mg/L；m).Co(NO3)2·6H2O0.02-0.05mg/L；n).CuSO4·5H2O0.06-0.09mg/L。
3、莲园绿球藻的总脂百分含量的分析和脂肪酸成份分析
莲园绿球藻在正常培养条件(BG-11培养基，其他为常规条件)下的生物量可达8.89g L-1(图2)，其总脂含量可占细胞干重的55.54％(大多为三酰甘油TAG)，总脂产量4.94g L-1，脂肪酸组成分析发现，莲园绿球藻的脂肪酸以C16:0和C18:1为主，适宜用来生产生物柴油(图4)，其细胞体积较大，易于采收。该藻色素中含有β-胡萝卜素和叶黄素，可以用于色素的生产(图3)，以及作为饲料添加剂，可以提高饲料的营养价值。莲园绿球藻细胞大小在8-12μm，可用于渔业养殖的开口饵料。
其中总脂百分含量分析方法为：
准确称取100-150mg冻干藻粉于螺口玻璃瓶中，加入2mL10％DMSO溶于甲醇(体积比)溶剂，加热到45摄氏度，搅拌45分钟，3000rpm，离心10min，收集上清；再重复以上步骤两次；之后取4mL乙醚：己烷＝1：1(体积比)溶剂加入样品中，加热到45摄氏度搅拌60min,离心10min，收集上清液，再重复步骤两次，合并所得上清液；添加6mL去离子水使溶液分层，上层包含总脂成分，在氮气保护下加热蒸发溶剂后转移含有少量溶剂的总脂到预称重的EP管中，在氮保护下蒸发溶剂至恒重，称重求得总脂含量。
其中脂肪酸成分的分析方法为：
称取20mg冻干藻粉，置于10mL带盖玻璃管中，加入2.5mL含有2％硫酸的甲醇溶液，震荡均匀，密闭容器在80摄氏度水浴中搅拌加热2.5小时(每半小时观察搅拌情况)；冷却却到室温后，加入1mL饱和食盐水和1mL正己烷(高效气相色谱液)，震荡均匀后静置分层；上层正己烷有机相通过无水硫酸钠过滤(在5mL大枪头中加入小块脱脂棉，再添加无水硫酸钠)，再用3-4mL正己烷冲洗，氮吹蒸发多余溶剂至1mL容量瓶中；最后加入C17作为内标，再加入色谱级正己烷定容至1mL，进行色谱分析。
该莲园绿球藻(Chlorococcum lianyuanensis)于2013年12月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号：CGMCC No.8605。
实施例2：莲园绿球藻处理生活废水
1.废水来源
实验中的废水取自广东省广州市某果蔬农贸市场的果蔬垃圾经发酵后的废弃沼液与BG-11培养基混合，配制出不同实验组的具有体积浓度梯度的废水培养基。
2.实验设计
实验以BG-11培养基为对照组，分别用BG-11将沼液稀释为25％、50％、75％和100％(体积比)，然后接入莲园绿球藻，利用管式光生物反应器通气培养8天，通过测定单位体积叶绿素含量(mg/L)反映莲园绿球藻生长及对果蔬垃圾发酵废液的适应性，并运用普通光学显微镜及透射电镜观察细胞形态及超微结构的变化，收获藻粉用于总脂和碳水化合物含量的测定，通过测定对果蔬垃圾发酵废液的COD、TN、TP、色度及Pb、As、Cu等十四种金属元素含量变化，评价莲园绿球藻对果蔬垃圾发酵废液的净化效果。
3.处理效果
莲园绿球藻对沼液的适应性较好，可作为废水培养的优良藻种，生物量在一定浓度的沼液培养基里优于BG-11培养基的，最高含量是BG-11的2倍(图5)；显微镜观察发现，沼液培养中，细胞均较大，细胞密度大，电镜显示，细胞中积累了大量的碳水化合物，但是形态和数量有较大区别，其中低体积浓度沼液培养基中常规的淀粉颗粒较多；莲园绿球藻对果蔬垃圾发酵后的废弃液的净化效果也十分显著，能有效的降低其COD、TN、TP，其中最突出的是总氮的去除率可达到63.39％(图6)；培养后，废沼液的色度降低，原液中多种对人体有害的重金属元素去除率超过60％(图7，原液为原始的沼液)。
莲园绿球藻可利用生活废水作为营养液进行生长，大幅度降低生活废水中的氮、磷和重金属元素的浓度。微藻在培养过程中通过光合作用可高效固定二氧化碳，用在二氧化碳固定减排领域。

Claims (2)

1.莲园绿球藻(Chlorococcum lianyuanensis)，其保藏号为：CGMCC No.8605。
2.权利要求1所述的莲园绿球藻在生产生物柴油、处理生活废水、生产色素、固定二氧化碳或作为渔业养殖中的开口饵料中的应用。
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