WO2009153439A2 - Utilisation de souches d'algues depourvues de paroi cellulaire pour la production de lipides neutres - Google Patents

Utilisation de souches d'algues depourvues de paroi cellulaire pour la production de lipides neutres Download PDF

Info

Publication number
WO2009153439A2
WO2009153439A2 PCT/FR2009/000611 FR2009000611W WO2009153439A2 WO 2009153439 A2 WO2009153439 A2 WO 2009153439A2 FR 2009000611 W FR2009000611 W FR 2009000611W WO 2009153439 A2 WO2009153439 A2 WO 2009153439A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
strain
cell wall
strains
starch
lipids
Prior art date
Application number
PCT/FR2009/000611
Other languages
English (en)
Other versions
WO2009153439A3 (fr
Inventor
Magali Siaut
Stéphan CUINE
Patrick Carrier
Christian Triantaphylides
Gilles Peltier
Original Assignee
Commissariat A L'energie Atomique
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Commissariat A L'energie Atomique filed Critical Commissariat A L'energie Atomique
Publication of WO2009153439A2 publication Critical patent/WO2009153439A2/fr
Publication of WO2009153439A3 publication Critical patent/WO2009153439A3/fr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6463—Glycerides obtained from glyceride producing microorganisms, e.g. single cell oil

Definitions

  • the present invention relates to the use of cell wallless algal strains for the production of neutral lipids.
  • Lipids and especially triglycerides have a significant commercial interest in the field of food and more recently in the field of biofuels.
  • Triglycerides are usually produced by higher plants (rapeseed, sunflower, soy for example) where they accumulate in specific reserve organs, seeds. Unicellular algae are also likely to accumulate lipids within their single cell.
  • microalgae In the context of a programmed reduction in fossil fuel reserves, the use of microalgae as a source of biofuels is enjoying renewed interest (Chisti, 2007 and Haag, 2007).
  • the microalgae culture has a number of advantages over land-based crops: superior surface production, limited competition with food production or water, pressure on the controllable environment (recycling of inputs).
  • the production costs of microalgae on the one hand and lipid extraction on the other hand are still too high compared to the price of the marketable product, thus limiting the applications.
  • the improvement of lipid production capacity represents a major challenge (Chisti, 2007 and Hu et al, 2008).
  • the inventors have undertaken research on the molecular mechanisms of lipid accumulation in microalgae. They chose as the study model the unicellular green algae biflagellate Chlamydomonas reinhardtii, whose entire genome has been sequenced and for which molecular tools are available (for example, possibility of genetically transforming its three genomes: nuclear, chloroplast and mitochondrial). . Surprisingly, the inventors have demonstrated a significant increase in the accumulation of neutral lipids (mainly triglycerides) in cell wall-free mutant Chlamydomonas reinhardtii strains cultured under nitrogen deficiency conditions compared to wild types with a cell wall grown under the same conditions. They also found that in the case of strains of C.
  • neutral lipids mainly triglycerides
  • the subject of the present invention is therefore the use of a mutant strain of algae without a cell wall, for the production of neutral lipids, preferably triglycerides, said mutant strain being obtained from a wild strain provided with a wall. cellular.
  • neutral lipids may also be mono- and / or di-glycerides (which may be produced as intermediates for triglyceride biosynthesis).
  • said algae is a green alga, preferably a unicellular green alga (Chlorophyceae), preferably chosen from Chlorococcales, especially the genera Scenedesmus, Chlorococcum, Clorella, and the Volvocales, in particular the genera Lobochlamys and Chlamydomonas.
  • Chlorococcales especially the genera Scenedesmus, Chlorococcum, Clorella, and the Volvocales, in particular the genera Lobochlamys and Chlamydomonas.
  • said alga is a freshwater alga or soil, but is not a halophilic alga.
  • said alga belongs to the genus Chlamydomonas.
  • said alga belongs to the species Chlamydomonas reinhardtii.
  • mutant strain of algae without a cell wall means a mutant strain of alga having no cell wall at all, or having a non-functional cell wall (due, for example, to the absence of attachment to the cell wall). the plasma membrane).
  • Mutant strains of algae lacking a cell wall are known per se, and can easily be identified in particular on the basis of their soft amoeboid morphology and / or tests such as the Triton TM X-100 test (Jaenicke et al. , 1987) described hereinafter; by way of nonlimiting examples, mention may be made of the strains of Chlamydomonas described by Davies and Plaskitt, (1971), which have been divided by these authors into three classes:
  • class A the cell wall is produced in a normal amount but is not attached to the plasma membrane;
  • class B the cell wall is produced in a normal quantity, attached to the plasma membrane, but the colony morphology of the strains belonging to this class is identical to that of class A or C mutants, ie the structural strength of the colonies is lost; class C: small amounts of cell wall are produced and are not attached to the plasma membrane.
  • a strain without a cell wall can be identified, for example, based on the following test.
  • a volume (approximately 100 ⁇ l to 1 ml) of cells (in liquid culture) is incubated with an equivalent volume of 0.5% Triton TM X-100, preferably for 10 to 40 minutes. After incubation, the cells are centrifuged for 5 minutes at 10,000 g in the presence of Triton TM X-100 and the cell pellet is observed.
  • the green color of the cell pellet indicates that the strain is provided with a cell wall (whose function is intact); the white color of the cell pellet indicates that the strain is devoid of cell wall.
  • any strain which has a mutation inactivating a gene coding for a constituent of the cell wall and / or proteins involved in the functional integrity of the cell wall for example glycoproteins rich in hyrdoxyproline
  • any gene involved in the regulation of gene expression of the cell wall biosynthetic pathway for example glycoproteins rich in hyrdoxyproline
  • genes encoding glycoproteins rich in hydroxyproline mention may be made of the following genes which have been identified in Chlamydomonas reinhardtii:
  • VSP1, VSP3, VSP4, VSP6 and VSP7 coding for the corresponding VSP proteins (hydroxyproline-rich cell wall protei ⁇ ),
  • said mutant strain lacking cell wall is further affected in the synthesis of starch.
  • the mutant strain assigned in the starch synthesis is a strain which accumulates at most 90%, preferably 50% and in ascending order preferably 40%, 30%, 20%, 10%, 5% and 1%. the amount of starch accumulated by a wild-type strain of the same species grown under the same conditions.
  • mutant strains of algae according to the present invention accumulating 10% to 1% of the amount of starch accumulated by a wild-type strain of the same species, grown under the same conditions, are more particularly preferred.
  • strains with a mutation inactivating one of the FADP-glucose pyrophosphorylase subunits include strains with a mutation inactivating one of the FADP-glucose pyrophosphorylase subunits (STAI and STA6 encoded proteins), or a mutation inactivating a gene encoding an enzyme of the biosynthetic pathway.
  • starch such as starch synthetases (SSS1 to SSS5 and STA3 genes), starch grain synthetases (GBSS genes), starch branching enzymes (SBE1 to SBE3 genes) , isoamylase (STAT gene), disconnection enzymes (ISO1 to ISO3 genes) and D-enzyme (STAIl gene).
  • FIG. 8 a diagram showing the pathway of biosynthesis of starch in Chlamydomonas reinhardtii in which the above enzymes are involved is presented in FIG. 8.
  • FIG. 8 By way of nonlimiting examples of cell wall-free mutant strains that can be used according to FIG. The present invention will include C. reinhardtii strains CC-820 (cw!
  • Mutant strains CC-820, CC-846, CC-847, CC-848, CC-849, CC-850, CC-851, CC-852, CC-853, CC-854, CC-855, CC-856 , CC-857, CC-858, CC-859, CC-860 and CC-406 are available from Chlamydomonas Center, Duke University, Durham, NC, USA
  • mutant strains CC-851, CC-854 and CC-406 are known not to be affected in the synthesis of starch;
  • mutant strain BAFJ3 is known to be both free of cell wall and affected in the synthesis of starch (Van den Koornhuyse et al,
  • This strain is mutated at the STA1 locus by insertion of an expression cassette of the enzyme argininosuccinate lyase (pARG7) into the gene coding for the large subunit (regulatory subunit) of ADP-glucose pyrophosphorylase. ;
  • strain BAFJ5 is also known to be both free of cell wall and affected in the synthesis of starch; this strain is mutated at the ST A6 locus in the gene coding for the small catalytic subunit of ADP-glucose pyrophosphorylase (Zabawinski et al, 2001);
  • - BAFJ6 strain is also known to be both free of cell wall and affected in the synthesis of starch; this strain is mutated at the STA 7 locus, by insertion of an expression cassette of the enzyme argininosuccinate lyase (pARG7) into the gene coding for isoamylase (Mouille, 1996).
  • pARG7 argininosuccinate lyase
  • C. reinhardtii strains derived from strain X
  • X being mutant strains CC-820, CC-846, CC-847, CC-848, CC-849, CC-850, CC-851, CC-852, CC-853, CC-854, CC-855, CC-856, CC-857, CC-858, CC-859, CC-860, CC-406, BAFJ3, BAFJ5 or BAFJ6, or any other strain mutant lacking a cell wall, and possibly affected in the synthesis of starch, as defined above), strains of Chlamydomonas reinhardtii obtained either by crossing with another strain or by mutagenesis or by genetic transformation of strain X, and retaining at least the accumulation properties of the neutral lipids of strain X.
  • strains resulting from a cross between strain X and a strain of wild type C. reinhardtii for example, strain 137C
  • strain CC-3491 cw15mt-
  • strain CC-406 strains in which one or more of the endogenous genes of strain X has been mutated and / or strains resulting from the genetic transformation of strain X by one or more genes (s). ) of interest, so as to modify some of its physiological properties and / or to confer on said strain additional physiological characteristics (for example, high biomass productivity, high rate of division, reduced size chlorophyllian antennas, resistance to oxidative stress, pathogen resistance).
  • strains can be obtained from strain X by conventional techniques of random mutagenesis (for example X-ray mutation or insertion) or directed mutagenesis and genetic transformation of C. reinhardtii, such as those described for example by Harris, 1989. ; Boyton et al, 1988; Fernandez et al, 1989; Debuchy et al., 1989 and Shimogawara et al., 1998.
  • the use of a mutant strain of algae devoid of cell wall as defined above for the production of neutral lipids has the further advantage of facilitating the recovering the lipid droplets produced by said strain, the cells being easily broken by osmotic or mechanical shock.
  • the lipid droplets can then be harvested by flotation, centrifugation by phase separation or filtration, for example.
  • the subject of the present invention is also a method for producing neutral lipids, in particular triglycerides, which comprises a step of culturing a mutant strain of algae devoid of cell wall, and optionally also affected in the synthesis of starch, as defined above, under photoautotrophic conditions (light as a source of energy and carbon dioxide as carbon source) and total or partial nitrogen deficiency, and under an air atmosphere enriched to about 1% to 5% of carbon dioxide (CO 2 ), preferably 2%.
  • photoautotrophic conditions light as a source of energy and carbon dioxide as carbon source
  • CO 2 carbon dioxide
  • total nitrogen deficiency conditions is defined as the culture of a mutant strain of algae as defined above in a culture medium containing no nitrogen.
  • Nonrogen partial deficiency conditions is defined as the cultivation of a mutant strain of algae as defined above in a culture medium whose concentration of nitrogen, preferably in the form of ammonium (NH 4 Cl) , is strictly less than 7.5 mM, preferably less than or equal to 5 mM, and in ascending order preferably less than or equal to 2.5 mM, 1 mM, 0.5 mM, 0.25 mM and 0.1 mM.
  • the method according to the present invention may further comprise a lipid extraction step.
  • Techniques for extracting lipids from eukaryotic microorganisms and more particularly from unicellular algae are known to those skilled in the art (see, for example, International Applications WO 01/54510 and WO 2008/013548).
  • the present invention also relates to a method of screening for mutant strains of Chlamydomonas that accumulate lipids comprising the following steps: a) incubation of strains of Chlamydomonas in the presence of Red Nil (7-diethylamino-3,4-benzophenoxazine-2- one), b) excitation of strains of Chlamydomonas at a wavelength between 450 nm and 540 nm, preferably at 488 nm, c) measurement of the fluorescence emitted by Chlamydomonas strains at a wavelength between 560 and 640 nm, preferably at 580 nm, d) comparison of the amount of fluorescence emitted by the different strains of Chlamydomonas.
  • the strains of Chlamydomonas are previously cultivated under photoautotrophic conditions and total or partial nitrogen deficiency and under an air atmosphere enriched to about 1% to 5% of carbon dioxide. (CO 2 ), preferably 2%.
  • the strains of Chlamydomonas are cultured in a minimum medium (Harris, 1989) and under an air atmosphere enriched with 2% carbon dioxide, and then put under conditions of total nitrogen deficiency (for example, for 3 days).
  • the Chlamydomonas strains are incubated, preferably in the dark, in the presence of Red Nile for at least five minutes, preferably from ten to forty minutes, and preferably again for twenty minutes.
  • FIG. 1 illustrates the content of starch and total fatty acids (expressed in ⁇ g of starch or total fatty acids / 10 6 cells) in response to a total deficiency of nitrogen in different strains of Chlamydomonas reinhardtii.
  • the cells are cultured in a mineral medium in air enriched with 2% CO 2 .
  • the cells are harvested by centrifugation and suspended in a nitrogen-free mineral medium.
  • the measurements are either carried out in the exponential growth phase (+ N) or at different times after the total nitrogen deficiency (-N, 1 to 4 days after the deficiency).
  • Intracellular content of starch (B) and total fatty acids (D) of strains of mutant C. reinhardtii mutant stal-2 (BAFJ3), sta (BAFJ5) and stal (BAFJ6) lacking cell wall and affected in the synthesis of starch and cv / 15 mutant strain (CC-406), lacking cell wall, stal -2, sta ⁇ and sta7 strains are derived.
  • the intracellular content of total fatty acids is determined by gas chromatography / mass spectrometry;
  • FIG. 2 illustrates the intracellular content of neutral lipids in response to a total nitrogen deficiency in C. reinhardtii strains 137C (A), cw15 (B), 17 (C) and BAFJ3 (D).
  • the cells are cultured under the conditions described for Figure 1 above.
  • the intracellular content of neutral lipids is monitored daily by measuring the fluorescence emitted at 580 nm after staining the cells with a lipid-specific fluorescent probe, Red Nile (added at a final concentration of 1 ⁇ g / ml) and expressed in units. arbitrary;
  • FIG. 3 is a table showing the total lipid content in response to a total nitrogen deficiency in strains of C. reinhardtii 137C (CC-124), stal-1 (17), cw15 (CC-406), sta (BAFJ5) and stal -2 (BAFJ3).
  • the cells are cultured under the conditions described for Figure 1 above.
  • the total mass of lipids is determined gravimetrically.
  • A) Intracellular total lipid content is expressed as ⁇ g total lipids / 10 6 cells.
  • B) The productivity of the strains is expressed as a percentage of total lipids with respect to the dry cell weight;
  • FIG. 4 illustrates the evolution of the different classes of lipids in response to a total nitrogen deficiency in different strains of C. reinhardtii: CC-124 (137C), CC-406 (cw15), 17 (stal-1), and BAFJ3 (stal-2) and BAFJ6 (sta7).
  • the cultures are taken either in the exponential phase of growth (+ N), or four days after the application of a total deficiency of nitrogen (-N, T + 4).
  • Their lipid content is analyzed by thin layer chromatography.
  • the migration is carried out in a solvent n-hexane / diethyl ether / acetic acid (85: 15: 1) and the revelation is carried out by iodine vapor.
  • the position of polar and neutral lipids (especially triglycerides, represented by an asterisk) is indicated;
  • FIG. 5 illustrates the subcellular localization of triglyceride storage vesicles in different strains of C. reinhardtii (CC-124 (137C), CC-406 (cw15), 17 and BAFJ3) after Nile Red cell staining and observation in epifluorescence microscopy.
  • Red Nile stains are performed on culture samples either taken in the exponential phase of growth (+ N) or at different times after the total nitrogen deficiency (-N, 1 to 4 days after the deficiency). The images are obtained in visible light (high panel) and after excitation at 488 nm of the colored samples (bottom panel).
  • the yellow fluorescence is emitted by intracellular neutral lipids stained with Nile Red (580 nm) and the red fluorescence corresponds to the autofluorescence of chlorophyll (670 nm).
  • the arrows indicate: Wales red fluorescence (autofluorescence of chlorophyll); > yellow fluorescence (neutral lipids); orange fluorescence (polar lipids, degradation of membranes);
  • FIG. 6A illustrates the fluorescence emitted by the microalgae at 580 nm in response to an excitation at 488 nm and measured using a spectrofluorometer (Perkin Elmer), after 20 min of incubation in the dark in the presence of Red Nile.
  • FIG. 6B illustrates the experimental validation of the screening method by comparing the response of the BAFJ5 accumulating lipid strain (mutant strain) and a wild-type strain (CC- 124). Two culture volumes (100 ⁇ L and 200 ⁇ L) are tested and give comparable results;
  • FIG. 7 illustrates the pathway of biosynthesis of starch in Chlamydomonas reinhardtii
  • - Figure 8A illustrates the accumulation of starch and total fatty acids in response to a total nitrogen deficiency in wild-type strain CC-408 Chlamydomonas reinhardtii. Measurements are made either in the exponential growth phase (+ N) or at different times after the total nitrogen deficiency (-N, 1 to 3 days after the deficiency). The intracellular starch content is expressed in ⁇ g of starch / 10 6 cells.
  • FIG. 8B illustrates the evolution of the different classes of lipids in response to a total nitrogen deficiency in strain CC-408.
  • the cultures are taken either in the exponential phase of growth (+ N), or 1, 2 or 3 days after the application of a total deficiency of nitrogen (-N, T + 1, T + 2, T + 3).
  • Their lipid content is analyzed by thin layer chromatography.
  • the migration is carried out in a solvent n-hexane / diethyl ether / acetic acid (85: 15: 1) and the development is carried out by iodine vapor.
  • the position of the neutral lipids (especially triglycerides, TG) is indicated by an asterisk;
  • FIG. 9A illustrates the accumulation of starch and total fatty acids in response to a total nitrogen deficiency in the mutant strain of Chlamydomonas reinhardtii CC-851 (also called cw2);
  • Figure 9B illustrates the evolution of the different classes of lipids in response to a total nitrogen deficiency in mutant strain CC-851.
  • the position of neutral lipids (especially triglycerides) is indicated by an asterisk.
  • the experimental conditions are identical to those for strain CC-408.
  • starter cultures at the end of the log phase are used to inoculate a new culture in a 300 ml column containing 200 ml of Minimum Medium (Harris, 1989) adjusted to 80 mM Trizma (pH 7.4) at a starting density of 1x10 5 cells ml -1 under constant illumination (150 ⁇ mol.m -1 sec -1 ) and under an atmosphere enriched with 2% (v / v) CO 2 ( bubbling of the culture medium).
  • the culture in logarithmic phase medium is harvested (4x10 6 cells / ml), resuspended in 200 ml of Minimum Medium without nitrogen and placed in an air atmosphere enriched with 2% (v / v) of CO 2 for 3 to 4 days.
  • Cell growth is monitored by cell counting using an automated cell counter (Multisizer TM 3 Coulter Counter - Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA). Quantification of chlorophyll and starch
  • the quantification of chlorophyll and starch is carried out using, respectively, the method of Lichtenthaler (1987) and a protocol adapted from the method cited in Klein and Betz (1978).
  • 2x10 6 cells of Chlamydomonas reinhardtii cultured in Minimum Medium, 80 mM Trizma and under an enriched air atmosphere at 2% (v / v) CO 2 are harvested, either during the exponential phase of growth or at different times after total deficiency in nitrogen, and stored at -80 ° C.
  • the cell pellets are resuspended in 2 ml of methanol for the extraction of chlorophyll, mixed vigorously for 1 min and centrifuged.
  • the supernatants are used to quantify chlorophyll by photometry according to the method of Lichtenthaler (1987).
  • Pellets are used to quantify starch.
  • the pellets are rinsed with 1 ml of sodium acetate buffer (100 mM, pH 4.5), resuspended in 500 .mu.l of sodium acetate buffer and autoclaved for 15 minutes at 120.degree. C. to solubilize the starch.
  • the total starch is then quantified by following the enzymatic conversion to glucose using a kit commercial based on an enzymatic method (Starch Assay Kit SA-20 - Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), as recommended by the supplier.
  • Nile Red stained cells are linearly correlated with the polar and neutral lipid content as determined by gravimetry (Jara et al, 2003).
  • the lipids are extracted from C. reinhardtii cells using the two-step method described in Bligh and Dyer (1959). The total mass of lipids is determined gravimetrically after removal of the solvents using a light stream of N 2 gas.
  • TLC thin layer chromatography
  • the lipids are dissolved in hexane and separated on the chromatography plates (250 ⁇ M, 20 ⁇ 20 cm, Adsorbosil-Plus, Alltech, France) with n-hexane. / diethyl ether / acetic acid (85: 15: 1, v / v).
  • the different classes of lipids are visualized using iodine vapor.
  • the total fatty acids of whole C. reinhardtii cells are quantified by gas chromatography / mass spectrometry (GC / MS).
  • the extracted lipids are first derivatized with boron trifluoride (BF3) in methanol (7%, w / v) to obtain methyl esters of fatty acids (FAMEs), according to Morrison and Smith. (1964).
  • Heptadecanoic acid (17: 0) is used as an external standard.
  • the lipid esters are then extracted with hexane and injected into a gas chromatograph (FOCUS) coupled to a quadrupole mass spectrometer (DSQ II, Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA). Hydrogen is used as a carrier gas.
  • FOCUS gas chromatograph
  • DSQ II quadrupole mass spectrometer
  • the injector and the transfer line are maintained at 225 ° C. and 250 ° C. respectively, and the ion source at 200 ° C.
  • the FAMEs are separated on a TR-WAX column (30m x 0.25mm x 0.25 ⁇ m, Thermo Fisher Scientific) in split mode (5: 1 fraction ratio) at an oven temperature of 45 ° C. After 1.5 min, the temperature of the oven is raised to 150 ° C to 15 0 CuIm "1 , then 240 ° C to 60 ° CmIn " 1 and held at 240 0 C for 3 min.
  • the fatty acid methyl esters are identified and quantified by comparison with the standards (FAME Mixture Me-100, Larodan Fine Chemicals AB, Malmo, Sweden). Chromatograms and mass spectra are analyzed using Xcalibur software (Thermo Fisher Scientific).
  • mutant strain CC-406 (cw15) devoid of cell wall, there is a strong increase in this fluorescence indicating a net increase in neutral lipid content.
  • the accumulation of neutral lipids occurs after 3 days of total deficiency, which corresponds to the moment when the accumulation of starch reaches a plateau.
  • mutants BAFJ3 and 17 accumulate only a small amount of starch (FIGS. 1A and 1B), as previously observed (Bail et al. 1991 and Van der Koornhuyse et al, 1996).
  • BAFJ3 a strong increase in the fluorescence of the Red Nile indicating an accumulation of neutral lipids ( Figure 2D).
  • Nile Red The essentially qualitative results obtained with Nile Red were confirmed by measurements of the total lipid production by gravimetric method, and of the intracellular content of total fatty acids, carried out after trans-esterification by gas chromatography coupled to a mass spectrometer. .
  • the assays were carried out in triplicate on cells in exponential growth phase (+ N), or during 4 days of total nitrogen deficiency (-N, T + 1, T + 2, T + 3, T + 4).
  • Total lipids were determined by gravimetric method.
  • the fatty acid methyl esters (total FA) obtained after trans-esterification of the total lipids are analyzed and assayed by gas chromatography coupled to a mass spectrometer.
  • the intracellular content of total fatty acids is expressed in ⁇ g total FA / 10 6 cells (the results are shown in Figure 1).
  • the productivity of total fatty acids and total lipids is expressed for each strain in percentage relative to the dry matter (P standard deviation is calculated on the three repetitions). The results are presented in Table 1 below and in Figure 3.
  • the lipid productivity data for each strain presented in Figure 3 show that the BAFJ3 cell wall-free and affected strain in the starch biosynthesis pathway accumulates lipids significantly (up to 48% of dry weight). during the nitrogen deficiency. Under the same conditions, the lipid content of the wild-type CC-124 strain (137C) with a cell wall does not exceed 18% of the dry weight.
  • total fatty acid dosages (expressed as total ⁇ g AGs per 10 6 cells) indicate that their intracellular content increases by a factor of up to 3 for the CC-406 cell-free strain (cwl 5). and up to a factor of 7 for BAFJ3 between the exponential phase of growth and after 4 days of nitrogen deficiency (Figure ID).
  • strains CC-406 and CC-124 containing respectively much more starch than BAFJ3 strains and 17 produce less fatty acids or lipids: for example, 17% total FA for CC-406 against 30% for BAFJ3 after 4 days of nitrogen deficiency.
  • strain BAFJ5 did not accumulate starch (unlike strain CC-406 (cw15) from which it is derived), and that the strain BAFJ6 accumulated very small quantities (approximately 3 ⁇ g of starch / 10 6 cells) of phytoglycogen, a soluble form of starch.
  • the total lipid content (expressed in ⁇ g.10 "6 cells or in% relative to the dry cell matter) of the strain BAFJ5 (sta ⁇ ) is represented in FIG. 3. It may be noted that the total lipid content of this strain increases significantly in response to nitrogen deficiency.
  • strains CC-851 (cw2) and CC-406 (cw15) suggests that the functional integrity of the cell wall, rather than the presence of the constituents of the cell wall, is involved in the accumulation of triglycerides, that is, that is, the accumulation of neutral lipids seems to be induced by the loss of functional integrity of the cell wall.
  • FIG. 6A A screening method using ELISA multiwell plates has been developed to screen a large number of strains.
  • the mutant BAFJ5 lipid accumulator strain was used. This strain was previously cultured in the Minimum Medium and under an air atmosphere enriched with 2% CO 2 and then placed for 3 days in total nitrogen deficiency. This micro-well screening method was then validated by comparing the fluorescence emitted at 580 nm in the presence of Nile Red by a non-lipid-producing wild strain (137C) and the lipid-producing BAFJ5 strain. The results show a clear difference in fluorescence between the wild-type strain and the mutant strain (FIG. 6B).
  • This screen is therefore usable for the high-throughput screening of algal mutant libraries in order to look for mutants that accumulate or on the contrary do not accumulate or little lipids, these mutants being of interest for the production of lipids. - or for the characterization of the molecular mechanisms involved in lipid accumulation.
  • the preculture was used to carry out a culture under photoautotrophic conditions (minimum medium and light at 150 ⁇ mol.m "2 sec -1" ) bubbled under air enriched with 2% CO 2 in the presence of a low but non-zero concentration of nitrogen (0.75 mM and 1.5 mM NH 4 Cl instead of 7.5 mM).
  • the inoculum was carried out at 0.5 ⁇ 10 6 cells / ml and samples were taken for 4 days.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

L'invention concerne l'utilisation de souches d'algues dépourvues de paroi cellulaire, et optionnellement affectées aussi dans la synthèse de l'amidon pour la production de lipides neutres.

Description

UTILISATION DE SOUCHES D'ALGUES DEPOURVUES DE PAROI CELLULAIRE POUR LA PRODUCTION DE LIPIDES NEUTRES.
La présente invention concerne l'utilisation de souches d'algues dépourvues de paroi cellulaire pour la production de lipides neutres. Les lipides et particulièrement les triglycérides ont un intérêt commercial important dans le domaine de l'alimentation et plus récemment dans celui des biocarburants. Les triglycérides sont généralement produits par les végétaux supérieurs (colza, tournesol, soja par exemple) où ils s'accumulent dans des organes de réserve spécifiques, les graines. Les algues unicellulaires sont également susceptibles d'accumuler des lipides au sein de leur cellule unique.
Chez les végétaux supérieurs, l'accumulation de triglycérides de réserve a lieu au moment du remplissage du grain, alors que chez les microalgues elle a généralement lieu en réponse à une carence nutritive (carence en azote chez les chlorophycées ou en silice chez les diatomées). Si quelques espèces d'algues ont été répertoriées comme accumulant des quantités significatives de lipides (par exemple les chlorophycées Chlorella vulgaris et Neochloris oleoabundans), d'autres comme Chlamydomonas reinhardtii ont été décrites comme n'accumulant pas de lipides (Sheehan et al, 1998 et Hu et al, 2008). Par ailleurs, chez C. reinhardtii, la carence minérale est aussi connue pour provoquer une augmentation importante du contenu en amidon (Bail et al, 1990).
Une méthode de production de produits huileux (chaînes hydrocarbonées, graisses et cires) à partir de souchee de Dunaliella (algue verte unicellulaire, halophile, mobile et naturellement dépourvues de paroi cellulaire), cultivée dans un milieu enrichi en dioxyde de carbone a été décrite dans la Demande de Brevet français n° 2 461 003. Diverses méthodes ont été proposées pour augmenter le contenu en lipides de végétaux ou d'algues. Ces méthodes reposent principalement sur des techniques de génie génétique : par exemple sur-expression d'un gène codant pour l'acétyl-coenzyme A ou une UDP-glucose pyrophosphorylase (voir les Brevets américains US 5,559,220 et US 5,928,932, et les Demandes Internationales WO 00/66749 et WO 01/81604). Dans un contexte de diminution programmée des réserves de carburant fossile, l'utilisation de microalgues comme source de biocarburants connaît un vif regain d'intérêt (Chisti, 2007 et Haag, 2007). La culture de microalgues présente un certain nombre d'avantages par rapport aux cultures terrestres : production surfacique supérieure, compétition limitée avec la production de denrées alimentaires ou avec les ressources en eau, pression sur l'environnement maîtrisable (recyclage des intrants). Toutefois, les coûts de production des microalgues d'une part et d'extraction des lipides d'autre part sont encore trop élevés par rapport au prix du produit commercialisable, limitant ainsi les applications. Dans ce contexte, l'amélioration des capacités de production de lipides représente un enjeu majeur (Chisti, 2007 et Hu et ai, 2008).
Les Inventeurs ont entrepris des travaux de recherche sur les mécanismes moléculaires d'accumulation des lipides chez les microalgues. Ils ont choisi comme modèle d'étude l'algue verte unicellulaire biflagellée Chlamydomonas reinhardtii, dont le génome entier a été séquence et pour laquelle des outils moléculaires sont disponibles (par exemple, possibilité de transformer génétiquement ses trois génomes : nucléaire, chloroplastique et mitochondrial). De manière surprenante, les Inventeurs ont mis en évidence une augmentation significative de l'accumulation de lipides neutres (principalement des triglycérides) chez des souches de Chlamydomonas reinhardtii mutantes dépourvues de paroi cellulaire, cultivées dans des conditions de carence en azote par rapport aux souches de type sauvage pourvues d'une paroi cellulaire cultivées dans les mêmes conditions. Ils ont en outre constaté que dans le cas de souches de C. reinhardtii dépourvues de paroi cellulaire et également affectées dans le métabolisme de l'amidon, le contenu en lipides et en acides gras totaux pouvait atteindre respectivement jusqu'à 50% et 41% du poids sec de la culture, après trois à quatre jours de carence totale en azote. La présente invention a donc pour objet l'utilisation d'une souche mutante d'algue dépourvue de paroi cellulaire, pour la production de lipides neutres, de préférence des triglycérides, ladite souche mutante étant obtenue à partir d'une souche sauvage pourvue de paroi cellulaire.
Ces lipides neutres peuvent également être des mono- et/ou di-glycérides (qui peuvent être produits en tant qu'intermédiaires de biosynthèse des triglycérides).
Selon un mode de mise en œuvre préféré de la présente invention ladite algue est une algue verte, de préférence une algue verte unicellulaire (Chlorophycée), choisie de préférence parmi les Chlorococcales, notamment les genres Scenedesmus, Chlorococcum, Clïorella, et les Volvocales, notamment les genres Lobochlamys et Chlamydomonas.
Selon une disposition préférée de ce mode de mise en œuvre, ladite algue est une algue d'eau douce ou de sol, mais n'est pas une algue halophile. Selon une autre disposition préférée de ce mode de mise en œuvre, ladite algue appartient au genre Chlamydomonas. Avantageusement, ladite algue appartient à l'espèce Chlamydomonas reinhardtii.
On entend par « souche mutante d'algue dépourvue de paroi cellulaire » une souche mutante d'algue ne possédant pas du tout de paroi cellulaire, ou possédant une paroi cellulaire non fonctionnelle (due, par exemple, à l'absence d'attachement à la membrane plasmique).
Des souches mutantes d'algues dépourvues de paroi cellulaire sont connues en elles-mêmes, et peuvent être aisément identifiées notamment sur la base de leur morphologie amiboïde molle et/ou de tests tels que le test au Triton™ X-IOO (Jaenicke et al, 1987) décrit ci-après ; à titre d'exemples non limitatifs on citera les souches de Chlamydomonas décrites par Davies and Plaskitt, (1971), qui ont été réparties par ces auteurs en trois classes :
- classe A : la paroi cellulaire est produite en quantité normale mais n'est pas attachée à la membrane plasmique ;
- classe B : la paroi cellulaire est produite en quantité normale, attachée à la membrane plasmique mais la morphologie des colonies des souches appartenant à cette classe est identique à celle des mutants de classe A ou C, c'est-à-dire que la force structurale des colonies est perdue ; - classe C : de faibles quantités de paroi cellulaire sont produites et ne sont pas attachées à la membrane plasmique.
Une souche dépourvue de paroi cellulaire peut être identifiée, par exemple, sur la base du test suivant. Il est incubé un volume (environ 100 μl à 1 ml) de cellules (en culture liquide) avec un volume équivalent de 0.5% Triton™ X-100 de préférence pendant 10 à 40 minutes. Après incubation, les cellules sont centrifugées pendant 5 minutes à 10 000 g en présence du Triton™ X-100 et le culot cellulaire est observé. La couleur verte du culot cellulaire indique que la souche est pourvue d'une paroi cellulaire (dont la fonction est intègre) ; la couleur blanche du culot cellulaire indique que la souche est dépourvue de paroi cellulaire. De manière générale, on peut utiliser pour la mise en œuvre de la présente invention, toute souche qui présente une mutation inactivant un gène codant pour un constituant de la paroi cellulaire et/ou des protéines impliquées dans l'intégrité fonctionnelle de la paroi cellulaire (par exemple des glycoprotéines riches en hyrdoxyproline), ainsi que tout gène impliqué dans la régulation de l'expression des gènes de la voie de biosynthèse de la paroi cellulaire.
A titre d'exemples de gènes codant pour des glycoprotéines riches en hydroxyproline, on peut citer les gènes suivants qui ont été identifiés chez Chlamydomonas reinhardtii :
- les gènes VSP (VSPl, VSP3, VSP4, VSP6 et VSP7) codant pour les protéines VSP correspondantes (hydroxyproline-rich cell wall proteiή),
- les gènes GPl et GP 2 codant pour les protéines gpl (« végétative cell wall protein ») et gp2 (« extracellular matrix protein »), et - les gènes codant pour les pherophorines (Hallman, 2006).
Selon un autre mode de mise en œuvre avantageux de la présente invention, ladite souche mutante dépourvue de paroi cellulaire est en outre affectée dans la synthèse de l'amidon.
On définit comme souche mutante affectée dans la synthèse de l'amidon, une souche qui accumule au plus 90%, de préférence 50% et par ordre croissant de préférence 40%, 30%, 20%, 10%, 5% et 1% de la quantité d'amidon accumulée par une souche de type sauvage de la même espèce, cultivée dans les mêmes conditions.
Les souches mutantes d'algues selon la présente invention accumulant 10% à 1% de la quantité d'amidon accumulée par une souche de type sauvage de la même espèce, cultivée dans les mêmes conditions, sont plus particulièrement préférées.
Il s'agit notamment de souches présentant une mutation inactivant l'une des sous-unités de FADP-glucose pyrophosphorylase (protéines codées par les gènes STAl et STA6), ou d'une mutation inactivant un gène codant une enzyme de la voie de biosynthèse de l'amidon telle que les synthétases so lubies de l'amidon (gènes SSSl à SSS5 et STA3), les synthétases liées au grain d'amidon (gènes GBSS), les enzymes de branchement de l'amidon (gènes SBEl à SBE3), l'isoamylase (gène STAT), les enzymes de débranchement (gènes ISOl à ISO3) et le D-enzyme (gène STAIl). A titre illustratif, un schéma montrant la voie de biosynthèse de l'amidon chez Chlamydomonas reinhardtii dans laquelle interviennent les enzymes ci-dessus est présenté à la Figure 8. A titre d'exemples non limitatifs de souches mutantes dépourvues de paroi cellulaire utilisables selon la présente invention, on citera les souches de C. reinhardtii CC-820 (cw!7 mt-), CC-846 (cwl mt-), CC-847 (cwl4 mt+), CC-848 (cw8 mt+), CC-849 (cw 10 mt-), CC-850 (cwl 8 mt-), CC-851 (cw2 mt+) (souche de la classe A telle que définie ci-dessus), CC-852 (cw9 mt-), CC-853 (cwl 9 mt-), CC-854 (cw20 mt+) (souche de la classe B telle que définie ci-dessus), CC-855 (cw6 mt+), CC-856 (cwl8 mt+), CC-857 (cw4 mt+), CC-858 (cwl77 mt+), CC-859 (cw51 mt+), CC-860 (cw3 mt+), CC-406 (cwlδ mt-) (souche de la classe C telle que définie ci-dessus), BAFJ3 (mt+ nitl nit2 cwl5 arg7-7 stal-2::ARG7), BAFJ5 {nitl nit2 cwl5 arg7-7 sta6-l:: ARGl) et BAFJ6 (mt+ nitl nit2 cwl5 arg7-7 sta7-l::ARG7), de préférence les souches CC-406, BAFJ3, BAFJ5 et BAFJ6, ainsi que les souches dérivées de celles-ci.
Les souches mutantes CC-820, CC-846, CC-847, CC-848, CC-849, CC- 850, CC-851, CC-852, CC-853, CC-854, CC-855, CC-856, CC-857, CC-858, CC-859, CC-860 et CC-406 sont disponibles auprès du Chlamydomonas Center, Duke University, Durham, NC, Etats-Unis
Parmi ces souches,
- les souches mutantes CC-851, CC-854 et CC-406 sont connues pour ne pas être affectées dans la synthèse de l'amidon ;
- la souche mutante BAFJ3 est connue pour être à la fois dépourvue de paroi cellulaire et affectée dans la synthèse de l'amidon (Van den Koornhuyse et al,
1996). Cette souche est mutée au locus STAl, par insertion d'une cassette d'expression de l'enzyme argininosuccinate lyase (pARG7), dans le gène codant pour la grande sous-unité (sous-unité régulatrice) de l'ADP-glucose pyrophosphorylase ;
- la souche BAFJ5 est aussi connue pour être à la fois dépourvue de paroi cellulaire et affectée dans la synthèse de l'amidon ; cette souche est mutée au locus ST A6, dans le gène codant pour la petite sous-unité catalytique de l'ADP-glucose pyrophosphorylase (Zabawinski et al, 2001) ;
- la souche BAFJ6 est également connue pour être à la fois dépourvue de paroi cellulaire et affectée dans la synthèse de l'amidon ; cette souche est mutée au locus STA 7, par insertion d'une cassette d'expression de l'enzyme argininosuccinate lyase (pARG7), dans le gène codant pour l'isoamylase (Mouille, 1996).
On entend par « souches de C. reinhardtii, dérivées de la souche X » (X étant les souches mutantes CC-820, CC-846, CC-847, CC-848, CC-849, CC-850, CC-851, CC-852, CC-853, CC-854, CC-855, CC-856, CC-857, CC-858, CC-859, CC-860, CC-406, BAFJ3, BAFJ5 ou BAFJ6, ou toute autre souche mutante dépourvue de paroi cellulaire, et éventuellement affectée dans la synthèse de l'amidon, telle que définie ci-dessus), des souches de Chlamydomonas reinhardtii obtenues soit par croisement avec une autre souche soit par mutagénèse ou par transformation génétique de la souche X, et conservant au moins les propriétés d'accumulation des lipides neutres de la souche X. Il peut s'agir de souches résultant d'un croisement entre la souche X et une souche de C. reinhardtii de type sauvage (par exemple, la souche 137C), telles que par exemple la souche CC-3491 (cwl5 mt-) (disponible auprès du Chlamydomonas Center) qui résulte d'un tel croisement à partir de la souche CC-406. Il peut s'agir également de souches dans lesquelles un ou plusieurs des gènes endogènes de la souche X a (ont) été muté(s) et/ou de souches résultant de la transformation génétique de la souche X par un ou plusieurs gène(s) d'intérêt, de manière à modifier certaines de ses propriétés physiologiques et/ou conférer à ladite souche des caractéristiques physiologiques supplémentaires (par exemple, forte productivité de biomasse, fort taux de division, antennes chlorophylliennes de taille réduite, résistance au stress oxydatif, résistance aux pathogènes). Ces souches peuvent être obtenues à partir de la souche X par les techniques classiques de mutagénèse aléatoire (par exemple mutation aux rayons X ou par insertion) ou dirigée et de transformation génétique de C. reinhardtii, telles que celles décrites par exemple par Harris, 1989 ; Boyton et al, 1988 ; Fernandez et al, 1989 ; Debuchy et al, 1989 et Shimogawara et al, 1998.. L'utilisation d'une souche mutante d'algue dépourvue de paroi cellulaire telle que définie ci-dessus pour la production de lipides neutres, présente en outre l'avantage de faciliter la récupération des gouttelettes lipidiques produites par ladite souche, les cellules pouvant être aisément cassées par choc osmotique ou mécanique. Les gouttelettes lipidiques peuvent ensuite être récoltées par flottaison, centrifugation par séparation de phase ou fïltration par exemple.
La présente invention a aussi pour objet un procédé de production de lipides neutres, notamment de triglycérides, qui comprend une étape de culture d'une souche mutante d'algue dépourvue de paroi cellulaire, et optionnellement aussi affectée dans la synthèse de l'amidon, telle que définie ci-dessus, en conditions photoautotrophes (lumière comme source d'énergie et dioxyde de carbone comme source de carbone) et de carence totale ou partielle en azote, et sous atmosphère d'air enrichi à environ 1% à 5% de dioxyde de carbone (CO2), de préférence 2%.
On définit comme « conditions de carence totale en azote » la culture d'une souche mutante d'algue telle que définie ci-dessus dans un milieu de culture ne contenant pas d'azote.
On définit comme « conditions de carence partielle en azote » la culture d'une souche mutante d'algue telle que définie ci-dessus dans un milieu de culture dont la concentration en azote, de préférence sous forme d'ammonium (NH4Cl), est strictement inférieure à 7,5 mM, de préférence inférieure ou égale à 5 mM, et par ordre croissant de préférence, inférieure ou égale à 2,5 mM, 1 mM, 0,5 mM, 0,25 mM et 0,1 mM.
Le procédé selon la présente invention peut comprendre en outre une étape d'extraction des lipides. Les techniques d'extraction des lipides à partir de microorganismes eucaryotes et plus particulièrement d'algues unicellulaires sont connues de l'homme du métier (voir par exemple les Demandes Internationales WO 01/54510 et WO 2008/013548).
La présente invention a également pour objet une méthode de criblage de souches mutantes de Chlamydomonas qui accumulent des lipides comprenant les étapes suivantes : a) incubation des souches de Chlamydomonas en présence de Rouge Nil (7-diethylamino-3,4-benzophenoxazine-2-one), b) excitation des souches de Chlamydomonas à une longueur d'onde comprise entre 450 nm et 540 nm, de préférence à 488 nm, c) mesure de la fluorescence émise par les souches de Chlamydomonas à une longueur d'onde comprise entre 560 et 640 nm, de préférence à 580 nm, d) comparaison de la quantité de fluorescence émise par les différentes souches de Chlamydomonas. Selon un mode de mise en œuvre avantageux de ladite méthode de criblage, les souches de Chlamydomonas sont préalablement cultivées en conditions photoautotrophes et de carence totale ou partielle en azote et sous atmosphère d'air enrichi à environ 1% à 5% de dioxyde de carbone (CO2), de préférence 2%.
Selon une disposition particulière de ce mode de mise en œuvre, les souches de Chlamydomonas sont cultivées en milieu minimum (Harris, 1989) et sous atmosphère d'air enrichi à 2% de dioxyde de carbone, puis mises en conditions de carence azotée totale (par exemple, pendant 3 jours).
Selon un autre mode de mise en œuvre avantageux de ladite méthode de criblage, les souches de Chlamydomonas sont incubées, de préférence à l'obscurité, en présence de Rouge Nil pendant au moins cinq minutes, de préférence de dix à quarante minutes, et de préférence encore pendant vingt minutes.
Les dispositifs permettant de mesurer la fluorescence émise par un microorganisme sont bien connus de l'Homme du métier. Il peut par exemple utiliser un spectrofluoromètre. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples illustrant les propriétés d'accumulation de lipides neutres des souches mutantes de Chlamydomonas reinhardtii dépourvues de paroi cellulaire, ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels :
- la Figure 1 illustre le contenu en amidon et en acides gras totaux (exprimé en μg d'amidon ou d'acides gras totaux /106 cellules) en réponse à une carence totale en azote chez différentes souches de Chlamydomonas reinhardtii. Les cellules sont cultivées en milieu minéral sous air enrichi avec 2% CO2. Au cours de la phase exponentielle de croissance, les cellules sont récoltées par centrifugation et mises en suspension dans un milieu minéral dépourvu d'azote. Les mesures sont soit effectuées en phase exponentielle de croissance (+N), soit à différents temps après la carence totale en azote (-N, 1 à 4 jours après la carence). Contenu intracellulaire en amidon (A) et en acides gras totaux (C) de la souche de C. reinhardtii mutante stal-1 (17) affectée dans la voie de biosynthèse de l'amidon et de la souche de type sauvage 137C (CC-124) dont la souche stal-1 est issue. Contenu intracellulaire en amidon (B) et en acides gras totaux (D) des souches de C. reinhardtii mutantes stal-2 (BAFJ3), staό (BAFJ5) et stal (BAFJ6) dépourvues de paroi cellulaire et affectées dans la synthèse de l'amidon et de la souche de mutante cv/15 (CC-406), dépourvue de paroi cellulaire, dont les souches stal -2, staό et sta7 sont issues. Le contenu intracellulaire en acides gras totaux est dosé par chromatographie en phase gazeuse / spectrométrie de masse ;
- la Figure 2 illustre le contenu intracellulaire en lipides neutres en réponse à une carence totale en azote chez les souches de C. reinhardtii 137C (A), cwl5 (B), 17 (C) et BAFJ3 (D). Les cellules sont cultivées dans les conditions décrites pour la Figure 1 ci-dessus. Le contenu intracellulaire en lipides neutres est suivi quotidiennement par la mesure de la fluorescence émise à 580 nm après coloration des cellules par une sonde fluorescente spécifique des lipides, le Rouge Nil (ajouté à une concentration finale de 1 μg/ml) et exprimé en unité arbitraire ;
- la Figure 3 est un tableau représentant le contenu en lipides totaux en réponse à une carence totale en azote chez les souches de C. reinhardtii 137C (CC-124), stal-1 (17), cwl5 (CC-406), staό (BAFJ5) et stal -2 (BAFJ3). Les cellules sont cultivées dans les conditions décrites pour la Figure 1 ci-dessus. La masse totale de lipides est déterminée par gravimétrie. A) Le contenu intracellulaire en lipides totaux est exprimé en μg de lipides totaux /106 cellules. B) La productivité des souches est exprimée en pourcentage de lipides totaux par rapport au poids sec cellulaire ;
- la Figure 4 illustre l'évolution des différentes classes de lipides en réponse à une carence azotée totale chez différentes souches de C. reinhardtii : CC- 124 (137C), CC-406 (cwl5), 17 (stal-1), et BAFJ3 (stal-2) et BAFJ6 (sta7). Les cultures sont prélevées soit en phase exponentielle de croissance (+N), soit quatre jours après l'application d'une carence totale en azote (-N, T+4). Leur contenu lipidique est analysé en chromatographie sur couche mince. La migration est effectuée dans un solvant n- hexane/diéthyl éther/acide acétique (85:15:1) et la révélation est réalisée par vapeur d'iode. La position des lipides polaires et neutres (notamment les triglycérides, représentés par un astérisque) est indiquée ;
- la Figure 5 illustre la localisation subcellulaire des vésicules de stockage de triglycérides chez différentes souches de C. reinhardtii (CC- 124 (137C), CC- 406 (cwl5), 17 et BAFJ3) après coloration des cellules au Rouge Nil et observation en microscopie à épifluorescence. Les colorations au Rouge Nil sont effectuées sur des échantillons de culture soit prélevés en phase exponentielle de croissance (+N), soit à différents temps après la carence azotée totale (-N, 1 à 4 jours après la carence). Les images sont obtenues en lumière visible (panneau haut) et après excitation à 488 nm des échantillons colorés (panneau bas). La fluorescence jaune est émise par les lipides neutres intracellulaires colorés au Rouge Nil (580 nm) et la fluorescence rouge correspond à P autofluorescence de la chlorophylle (670 nm). Les flèches indiquent : ». fluorescence rouge (autofluorescence de la chlorophylle) ; > fluorescence jaune (lipides neutres) ; fluorescence orangée (lipides polaires, dégradation des membranes) ; - la Figure 6A illustre la fluorescence émise par les microalgues à 580 nm en réponse à une excitation à 488 nm et mesurée grâce à un spectrofluorimètre (Perkin Elmer), après 20 min d'incubation à l'obscurité en présence de Rouge Nil. Des gammes de concentrations cellulaires allant de 3.103 à 107 cellules/mL et de concentrations en Rouge Nil allant de 10"4 à 10"2 mg/mL sont testées. Ces essais ont permis de déterminer une gamme de concentrations cellulaires dans laquelle le signal de réponse au Rouge Nil est proportionnel à la quantité de cellules (et donc de lipides neutres). La Figure 6B illustre la validation expérimentale de la méthode de criblage en comparant la réponse de la souche BAFJ5 accumulatrice de lipides (souche mutante) et d'une souche de type sauvage (CC- 124). Deux volumes de culture (lOOμL et 200μL) sont testés et donnent des résultats comparables ;
- la Figure 7 illustre la voie de biosynthèse de l'amidon chez Chlamydomonas reinhardtii ; - la Figure 8A illustre l'accumulation d'amidon et d'acides gras totaux en réponse à une carence totale en azote chez la souche de Chlamydomonas reinhardtii de type sauvage CC-408. Les mesures sont soit effectuées en phase exponentielle de croissance (+N), soit à différents temps après la carence totale en azote (-N, 1 à 3 jours après la carence). Le contenu intracellulaire en amidon est exprimé en μg d'amidon/106 cellules. Le contenu intracellulaire en acides gras totaux est dosé quotidiennement par chromatographie en phase gazeuse / spectrométrie de masse ; la Figure 8B illustre l'évolution des différentes classes de lipides en réponse à une carence azotée totale chez la souche CC-408. Les cultures sont prélevées soit en phase exponentielle de croissance (+N), soit 1, 2 ou 3 jours après l'application d'une carence totale en azote (-N, T+l, T+2, T+3). Leur contenu lipidique est analysé en chromatographie sur couche mince. La migration est effectuée dans un solvant n-hexane/diéthyl éther/acide acétique (85:15:1) et la révélation est réalisée par vapeur d'iode. La position des lipides neutres (notamment les triglycérides, TG) est indiquée par un astérisque ;
- la Figure 9A illustre l'accumulation d'amidon et d'acides gras totaux en réponse à une carence totale en azote chez la souche de Chlamydomonas reinhardtii mutante CC-851 (dénommée aussi cw2) ; la Figure 9B illustre l'évolution des différentes classes de lipides en réponse à une carence azotée totale chez la souche mutante CC-851. La position des lipides neutres (notamment les triglycérides) est indiquée par un astérisque. Les conditions expérimentales sont identiques à celles pour la souche CC-408. EXEMPLES
I- MATERIELS ET METHODES
Souches et conditions de culture
Les souches de Chlamydomonas reinhardtii de type sauvage CC- 124 (dénommée aussi 137C) (mt- nitl nitl) et CC-408 (mt+), et les souches mutantes de C. reinhardtii dépourvues de paroi cellulaire CC-406 (mt- cw!5) (dénommée aussi cwl5 ; souche totalement dépourvue de paroi cellulaire) et CC-851 (mt+ cw2) (dénommée aussi cw2 ; souche mutante de classe A) utilisées dans cette étude ont été obtenues auprès du Chlamydomonas Center (Duke University, Durham, NC, USA). Les souches de C. reinhardtii mutées dans le métabolisme de l'amidon stal-2 (souche BAFJ3, mt+ nitl nit2 cwl5 argl-7 stal-2::ARG7, Van den Koornhuyse et al, 1996), stal-1 (souche 17, mt- nitl nit2 stal-1, Bail et al, 1991), staό (souche BAFJ5, nitl nit2 cw!5 argl-7 sta6-l::ARG7, Zabawinski et al, 2001), et sta7 (souche BAFJ6, mt+ nitl nit2 cwl5 arg7-7 sta7-l::ARG7, Mouille et al, 1996) ont été obtenues auprès de l'Université des Sciences et Technologies de Lille, France.
Les souches de C. reinhardtii sont maintenues à 25 °C en milieu liquide TAP (Harris, 1989) sous éclairage constant (150 μmol.m"2.sec"') et agitées continuellement afin d'obtenir des cultures « starters » {inocula). Pour les cultures sous concentration élevée en CO2, les cultures starters en fin de phase logarithmique sont utilisées pour inoculer une nouvelle culture dans une colonne de 300 ml contenant 200 ml de Milieu Minimum (Harris, 1989) ajusté à 80 mM de Trizma (pH 7,4) à une densité de départ de 1x105 cellules.ml"1 sous éclairage constant (150 μmol.m^.sec"1) et sous atmosphère d'air enrichi à 2% (v/v) de CO2 (bullage du milieu de culture). Après 72 heures, la culture en milieu de phase logarithmique est récoltée (4x106 cellules / ml), remise en suspension dans 200 ml de Milieu Minimum sans azote et mise sous atmosphère d'air enrichi à 2% (v/v) de CO2 pendant 3 à 4 jours. La croissance des cellules est suivie par comptage cellulaire à l'aide d'un compteur de cellules automatisé (Multisizer™ 3 Coulter Counter - Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA). Quantification de Ia chlorophylle et de l'amidon
La quantification de la chlorophylle et de l'amidon est réalisée en utilisant, respectivement, la méthode de Lichtenthaler (1987) et un protocole adapté de la méthode citée dans Klein et Betz (1978). 2x106 cellules de Chlamydomonas reinhardtii cultivées dans du Milieu Minimum, 80 mM Trizma et sous atmosphère d'air enrichi à 2% (v/v) CO2 sont récoltées, soit pendant la phase exponentielle de croissance ou à différents temps après la carence totale en azote, et stockées à -80 0C. Les culots de cellules sont remis en suspension dans 2 ml de méthanol pour l'extraction de la chlorophylle, mélangés vigoureusement pendant 1 min et centrifugés. Les surnageants sont utilisés pour quantifier la chlorophylle par photométrie selon la méthode de Lichtenthaler (1987). Les culots sont utilisés pour quantifier l'amidon. Les culots sont rincés avec 1 ml de tampon acétate de sodium (100 mM, pH 4,5), remis en suspension dans 500 μl de tampon acétate de sodium et passés à l'autoclave pendant 15 min à 120 °C pour solubiliser l'amidon. L'amidon total est ensuite quantifié en suivant la conversion enzymatique en glucose à l'aide d'un kit commercial basé sur une méthode enzymatique (Starch Assay Kit SA-20 - Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), selon les recommandations du fournisseur.
Analyse de Ia teneur en lipides neutres en utilisant Ia coloration au Rouge NiI Le Rouge Nil (9-diéthylamino-5H-benzophénoxazine-5-un) est un colorant qui est excité à 488 nm et émet une fluorescence jaune-or (λmax = 580) en présence de lipides neutres et orange-rouge (A^13x = 615) en présence de lipides polaires. Il est largement utilisé pour la coloration des lipides, car il peut interagir et fluorescer en présence de phospholipides, cholestérols, esters cholestéryl et triglycérides (Greenspan and Fowler, 1985). La teneur en lipides cellulaires est ainsi déterminée en utilisant le Rouge Nil (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA, N3013), tel que décrit dans de la Jara et al. (2003). L'intensité de fluorescence des cellules colorées au Rouge Nil est linéairement corrélée à la teneur en lipides polaires et neutres telle que déterminée par gravimétrie (de la Jara et al, 2003). Les solutions de Rouge Nil sont préparées dans du méthanol (0,1 mg.ml" '). Brièvement, 2x106 cellules de C. reinhardtii sont incubées dans l'obscurité pendant 20 min avec la solution de coloration (0,1 μg.ml"1 de Rouge Nil dans du TBS IX). Les mesures de fluorescence sont effectuées en utilisant un spectrofluoromètre (Perkin-Elmer LS50B) (λexcitation = 488 nm, λémission = 580 nm). Les cellules non colorées sont utilisées comme contrôles d'autofluorescence. Extraction des lipides et chromatographie sur couche mince
Les lipides sont extraits des cellules de C. reinhardtii en utilisant la méthode en deux étapes décrite dans Bligh et Dyer (1959). La masse totale de lipides est déterminée par gravimétrie après élimination des solvants à l'aide d'un léger courant de N2 gazeux. Pour l'analyse par chromatographie sur couche mince (CCM), les lipides sont dissouts dans l'hexane et séparés sur les plaques de chromatographie (250 μM, 20 x 20 cm ; Adsorbosil-Plusl, Alltech, France) avec du n-hexane / diéthyl éther / acide acétique (85:15:1, v/v). Les différentes classes de lipides sont visualisées à l'aide de la vapeur d'iode.
Analyse des esters méthyliques d'acides gras (FAMEs) par chromatographie en phase gazeuse / spectrométrie de masse
Les acides gras totaux des cellules entières de C. reinhardtii sont quantifiés par chromatographie en phase gazeuse / spectrométrie de masse (GC/MS). Les lipides extraits sont d'abord dérivés au trifiuorure de bore (BF3) dans du méthanol (7%, p/v) pour obtenir des esters méthyliques d'acides gras (FAMEs), selon Morrison et Smith (1964). L'acide heptadécanoïque (17:0) est utilisé comme standard externe. Les esters lipidiques sont ensuite extraits par l'hexane et injectés dans un chromatographe en phase gazeuse (FOCUS) couplé à un spectromètre de masse quadripolaire (DSQ II, Thermo Fisher Scientific, San José, CA, USA). L'hydrogène est utilisé comme gaz porteur. L'injecteur et la ligne de transfert sont maintenus à 225 0C et 250 °C respectivement, et la source d'ions à 200 °C. Les FAMEs sont séparés sur une colonne TR-WAX (30 m x 0,25 mm x 0,25 μm ; Thermo Fisher Scientific) en mode split (ratio de fractionnement 5:1) à une température de four de 45 °C. Après 1,5 min, la température du four est portée à 150 °C à 15 0CuIm"1, puis à 240 °C à 6 0CmIn"1 et tenue à 240 0C pendant 3 min. Les esters méthyliques d'acides gras sont identifiés et quantifiés par comparaison aux standards (FAME Mixture Me-100, Larodan Fine Chemicals AB, Malmô, Suède). Les chromatogrammes et spectres de masse sont analysés en utilisant le logiciel Xcalibur (Thermo Fisher Scientific).
Observation par microscopie à épifluorescence du Rouge Nil et de Ia chlorophylle
La fluorescence du Rouge Nil et de la chlorophylle des cellules de C. reinhardtii est observée à l'aide d'un microscope à épifluorescence Leica DMRXA en utilisant un objectif à immersion à huile 63 X/1.6 (Leica Microsystems, Germany ; filtre d'excitation ByPass 475/40 et filtre barrière Long Pass 510). Les images sont saisies avec le logiciel Spot Insight 4 (Diagnostic Instruments, Inc, Sterling Heights, MI).
II- COMPARAISON DU CONTENU INTRACELLULAIRE EN AMIDON ET EN LIPIDES NEUTRES DE LA SOUCHE DE C. REINHARDTII DE TYPE SAUVAGE 137C (CC-124) AVEC LA SOUCHE CC-406 DEPOURVUE DE PAROI CELLULAIRE Les contenus intracellulaires en amidon et en lipides neutres de la souche de C. reinhardtii de type sauvage CC- 124 (137C) et de la souche mutante CC-406 (cwl5) dépourvue de paroi cellulaire ont été comparés dans des conditions photoautotrophes dans un milieu minéral sous air enrichi en CO2 (2 %) et de carence totale en azote.
Les résultats sont présentés aux Figures 1 et 2. Au cours de la phase exponentielle de croissance, le contenu cellulaire en amidon est de l'ordre de 10 à 15 μg.10"6 cellules quelque soit la souche considérée. Ce contenu s'accroît dès le premier jour de carence azotée totale pour atteindre environ 50 μg.10"6 cellules et se stabiliser ensuite chez la souche sauvage ou continuer à augmenter pour atteindre 130-140 μg.10" cellules chez la souche mutante CC-406 (Figures IA et IB). Quant au contenu intracellulaire en lipides neutres suivi par la fluorescence du Rouge Nil (Figure 2A et 2B), il évolue assez peu chez la souche sauvage. A l'inverse, chez la souche mutante CC-406 (cwl5) dépourvue de paroi cellulaire, on observe une forte augmentation de cette fluorescence indiquant un accroissement net du contenu en lipides neutres. L'accumulation de lipides neutres intervient après 3 jours de carence totale, ce qui correspond au moment où l'accumulation d'amidon atteint un plateau.
III- COMPARAISON DU CONTENU INTRACELLULAIRE EN AMIDON ET EN LIPIDES NEUTRES DE DEUX SOUCHES DE C. REINHΛRDTII AFFECTEES DANS LA SYNTHESE DE L'AMIDON ET DEPOURVUES (BAFJ3) OU NON (17) DE PAROI CELLULAIRE
Les contenus intracellulaires en amidon et en lipides neutres ont été comparés chez deux mutants affectés dans la biosynthèse de l'amidon : BAFJ3 et 17. La souche 17, issue de la souche sauvage CC-124 (137C), possède une paroi cellulaire normale (Bail et al, 1991). La souche BAFJ3, issue de la souche CC-406 (cwl5), est dépourvue de paroi cellulaire (Van der Koornhuyse et al, 1996). Les deux souches sont mutées au même locus, STAl, dans le gène codant pour la sous-unité régulatrice de PADP-glucose pyrophosphorylase (Bail et al 1991 ; Van der Koornhuyse et al, 1996).
Les résultats sont représentés aux Figures 1 et 2. En réponse à une carence totale en azote, les mutants BAFJ3 et 17 n'accumulent que peu d'amidon (Figures IA et IB), comme cela avait été précédemment observé (Bail et al, 1991 et Van der Koornhuyse et al, 1996). En revanche, on observe dès le premier jour de carence totale en azote chez la souche affectée dans la synthèse de l'amidon et dépourvue de paroi cellulaire, BAFJ3, une forte augmentation de la fluorescence du Rouge Nil indiquant une accumulation de lipides neutres (Figure 2D). Quant à la souche 17, qui est affectée dans la synthèse de l'amidon mais qui présente une paroi cellulaire normale, une faible augmentation de la fluorescence du Rouge Nil des lipides neutres est observée (Figure 2C), suggérant que cette souche accumule peu de lipides neutres au cours de la carence totale en azote. On remarque que la cinétique d'accumulation de lipides neutres diffère entre les deux souches dépourvues de paroi cellulaire. En effet, l'accumulation semble survenir plus tôt (à J+2) chez la souche BAFJ3 que chez la souche CC-406 (à J+3). IV- MESURES QUANTITATIVES DU CONTENU INTRACELLULAIRE EN LIPIDES TOTAUX ET EN ACIDES GRAS TOTAUX CHEZ LES SOUCHES CC- 124 (137C), CC-406 (cw!5), 17 (stal-1) ET BAFJ3 (stal-2)
Les résultats essentiellement qualitatifs obtenus avec le Rouge Nil ont été confirmés par des mesures de la production en lipides totaux par méthode gravimétrique, et du contenu intracellulaire en acides gras totaux, effectuées après trans-estérification par chromatographie en phase gazeuse couplée à un spectromètre de masse.
Les dosages ont été effectués en triplicat sur des cellules en phase exponentielle de croissance (+N), ou pendant 4 jours de carence totale en azote (-N, T+l, T+2, T+3, T+4). Les lipides totaux ont été dosés par méthode gravimétrique. Les esters méthyliques d'acides gras (AG totaux) obtenus après trans-estérification des lipides totaux sont analysés et dosés par chromatographie en phase gazeuse couplée à un spectromètre de masse. Le contenu intracellulaire en acides gras totaux est exprimé en μg d'AG totaux /106 cellules (les résultats sont présentés à la Figure 1). La productivité en acides gras totaux et lipides totaux est exprimée pour chaque souche en pourcentage par rapport à la matière sèche (P écart-type est calculé sur les trois répétitions). Les résultats sont présentés au Tableau 1 ci-dessous et à la Figure 3.
Figure imgf000016_0001
Les données de productivité en lipides de chaque souche présentées à la Figure 3 montrent que la souche BAFJ3 dépourvue de paroi cellulaire et affectée dans la voie de biosynthèse de l'amidon accumule des lipides de façon significative (jusqu'à 48% du poids sec) au cours de la carence azotée. Dans les mêmes conditions, le contenu en lipides de la souche sauvage CC- 124 (137C) pourvue d'une paroi cellulaire ne dépasse pas 18% du poids sec. En parallèle, les dosages d'acides gras totaux (exprimés en μg AG totaux par 106 cellules) indiquent que leur contenu intracellulaire augmente d'un facteur allant jusqu'à 3 pour la souche dépourvue de paroi cellulaire CC-406 (cwl 5) et d'un facteur allant jusqu'à 7 pour BAFJ3 entre la phase exponentielle de croissance et après 4 jours de carence azotée (Figure ID). A l'inverse, ces concentrations restent stables pour la souche CC- 124 et n'augmentent pas même d'un facteur 2 pour la souche 17 (Figure IC). Enfin, en terme de productivité en acides gras et/ou lipides totaux (quantité exprimée en pourcentage par rapport à la matière sèche formée), les souches CC-406 et CC- 124 contenant respectivement beaucoup plus d'amidon que les souches BAFJ3 et 17, produisent moins d'acides gras ou de lipides : par exemple, 17 % d'AG totaux pour CC-406 contre 30% pour BAFJ3 après 4 jours de carence azotée.
V- ANALYSE DU CONTENU INTRACELLULAIRE EN AMIDON ET EN LIPIDES DE DEUX SOUCHES DE C. REINHARDTII AFFECTEES DANS LA SYNTHESE DE L'AMIDON ET DEPOURVUES DE PAROI CELLULAIRE (BAFJ5 ET BAF J6)
Les contenus intracellulaires en amidon et en lipides des souches mutantes de C. reinhardtii BAFJ5 (dénommée aussi staό) et BAFJ6 (dénommée aussi sta7) ont été comparés dans des conditions photoautotrophes dans un milieu minéral sous air enrichi en CO2 (2 %) et de carence totale en azote. Les protocoles expérimentaux sont décrits à l'Exemple I ci-dessus.
L'analyse du contenu intracellulaire en amidon de ces deux souches a montré (voir Figure IB) qu'au cours de la carence en azote, la souche BAFJ5 n'accumulait pas d'amidon (contrairement à la souche CC-406 (cwl5) dont elle est issue), et que la souche BAFJ6 accumulait de très faibles quantités (environ 3 μg d'amidon /106 cellules) de phytoglycogène, une forme soluble d'amidon.
Le contenu en lipides totaux (exprimé en μg.10"6 cellules ou en % par rapport à la matière sèche cellulaire) de la souche BAFJ5 (staό) est représenté à la Figure 3. On peut remarquer que le contenu en lipides totaux de cette souche augmente de manière significative en réponse à une carence en azote.
Le contenu en acides gras totaux des souches BAFJ5 (staό) et BAFJ6
(staT) a fortement augmenté en réponse à la carence en azote pour atteindre respectivement
18 μg.10"6 cellules et 28 μg.10"6 cellules après 4 jours de carence en azote (voir Figure ID).
Les résultats de productivité en acides gras totaux (quantité exprimée en pourcentage par rapport à la matière sèche formée) des souches BAFJ5 et BAFJ6 sont représentés au Tableau 2 ci-dessous.
Figure imgf000018_0001
VI- ANALYSE DES LIPIDES PRODUITS PAR LES SOUCHES DEPOURVUES DE PAROI CELLULAIRE (CC-406, BAFJ3 ET BAFJ6) La séparation par chromatographie sur couche mince des différentes classes de lipides accumulés au cours de la carence totale en azote confirme que les lipides représentés chez les mutants dépourvus de paroi cellulaire (CC-406, BAFJ3 et BAFJ6) sont essentiellement des lipides neutres de type triglycérides (Figure 4). De plus, l'observation par microscopie à épifluorescence des cellules colorées au Rouge Nil révèle la présence de vésicules lipidiques de couleur jaune chez les souches CC-406 (cwl5), BAFJ3 (staJ-2) et BAFJ6 (staT). Ces mêmes vésicules sont respectivement absentes et peu nombreuses chez les souches CC-124 (137C) et 17. Les triglycérides accumulés au cours de la carence totale en azote chez les souches mutantes dépourvues de paroi cellulaire seraient donc stockés dans ces vésicules pour remplir la quasi-totalité du volume cellulaire en fin d'expérience (Figure 5).
VII- ANALYSE DU CONTENU INTRACELLULAIRE EN AMIDON, EN LIPIDES ET EN ACIDES GRAS TOTAUX DES SOUCHES CC-408 ET CC-851
Afin de montrer le rôle de l'intégrité fonctionnelle de la paroi cellulaire sur l'accumulation des lipides, le contenu intracellulaire en amidon, lipides et acides gras a été comparé chez deux souches de C. reinhardtii : la souche de type sauvage CC-408 (pourvue d'une paroi cellulaire fonctionnelle) et la souche mutante CC-851, qui produit une paroi cellulaire en quantité normale mais qui n'est pas attachée à la membrane plasmique.
Le dosage de l'amidon et des lipides a été effectué en triplicat sur des cellules en phase exponentielle de croissance (+N), ou pendant 3 jours après une carence totale en azote (-N, T+l, T+2, T+3). Les protocoles expérimentaux sont décrits à l'Exemple I ci-dessus.
Les résultats du dosage et de l'analyse des lipides totaux de la souche CC-408 sont présentés au Tableau 3 ci-dessous et à la Figure 8.
Figure imgf000019_0001
Les résultats du dosage et de l'analyse des lipides totaux de la souche CC-851 sont présentés au Tableau 4 ci-après et à la Figure 9.
Figure imgf000019_0002
II ressort de ces résultats que :
- le contenu intracellulaire en acides gras totaux de la souche de type sauvage CC-408 est resté inchangé au cours de la carence azotée (comme pour la souche CC- 124). En revanche, on observe chez la souche mutante CC-851 (cw2) une forte accumulation d'amidon (jusqu'à 80 μg.10"6 cellules) et d'acides gras (jusqu'à 22 μg.10"6 cellules). L'analyse des lipides accumulés par la souche CC-851 (cw2) a montré que ceux- ci étaient principalement des lipides neutres (triglycérides) ; - le dosage des lipides totaux (quantité exprimée en μg.10"6 cellules) indique que leur contenu dans la souche CC-851 double en réponse à la carence en azote (comme pour la souche CC-406). Cette réponse similaire entre les souches CC-851 (cw2) et CC-406 (cwl5) suggère que l'intégrité fonctionnelle de la paroi cellulaire, plutôt que la présence des constituants de la paroi cellulaire, est impliquée dans l'accumulation des triglycérides, c'est-à-dire que l'accumulation des lipides neutres semble être induite par la perte de l'intégrité fonctionnelle de la paroi cellulaire.
VIII- MISE AU POINT ET VALIDATION D'UNE METHODE DE CRIBLAGE SUR PLAQUE MULTI-PUITS POUR LA SELECTION DE SOUCHES MUTANTES DE C. REINHARDTII QUI ACCUMULENT DES LIPIDES. Dans le but de cribler des mutants de l'algue Chlamydomonas reinhardtii sur-producteurs de lipides de réserve, un crible de sélection, basé sur la coloration des lipides par une sonde fluorescente spécifique, le Rouge Nil, a été mis au point et validé. Après excitation à 488 nm du Rouge Nil, l'émission maximale de fluorescence se situe autour de 580 nm (dans le jaune) pour les lipides neutres et de 620 nm (dans le rouge) pour les lipides polaires.
Une méthode de criblage faisant appel à des plaques multi-puits de type Elisa a été mise au point pour cribler un grand nombre de souches (Figure 6A). Pour cela, la souche mutante BAFJ5 accumulatrice de lipides a été utilisée. Cette souche a été préalablement cultivée en Milieu Minimum et sous atmosphère d'air enrichi à 2% de CO2 puis placée pendant 3 jours en carence azotée totale. Il a été ensuite procédé à la validation de cette méthode de criblage sur micro-puits par comparaison de la fluorescence émise à 580 nm en présence de Rouge Nil par une souche sauvage (137C) non productrice de lipides et la souche BAFJ5 productrice de lipides. Les résultats montrent une nette différence de fluorescence entre la souche sauvage et la souche mutante (Figure 6B).
Ce crible est donc utilisable pour le criblage haut-débit de banques de mutants d'algues dans le but de rechercher des mutants qui accumulent ou au contraire n'accumulent pas ou peu de lipides, ces mutants présentant un intérêt pour la production de lipides elle-même ou pour la caractérisation des mécanismes moléculaires impliqués dans l'accumulation de lipides.
IX- PROCEDE DE PRODUCTION DE LIPIDES NEUTRES EN CONDITIONS DE CARENCE PARTIELLE EN AZOTE A PARTIR DE LA SOUCHE MUTANTE DE C. REINHARDTII BAFJ3 La souche de Chlamydomonas reinhardtii mutante BAFJ3 a été cultivée dans un premier temps en conditions mixotrophes (milieu TAP et lumière à 250 μmol.m" 2.sec"') sous agitation constante. Une fois la phase exponentielle de croissance atteinte (4 à 8.106 cellules/ml), la préculture a été utilisée pour réaliser une culture en conditions photoautotrophes (milieu minimum et lumière à 150 μmol.m"2. sec"1) bullée sous air enrichi à 2% de CO2 en présence d'une concentration faible mais non nulle en azote (0,75 mM et 1,5 mM NH4Cl au lieu de 7,5 mM). L'inoculum a été effectué à 0,5.106 cellules/ml et des échantillons ont été prélevés durant 4 jours.
Les acides gras totaux ont été dosés et analysés selon les protocoles expérimentaux décrits à l'Exemple I ci-dessus. Le résultat du dosage des acides gras totaux est présenté au Tableau 5 ci-après (prélèvements à T+l et T+4).
Figure imgf000021_0001
L'analyse, par chromatographie sur couche mince, des lipides accumulés par la souche BAFJ3, a montré que ceux-ci étaient principalement des lipides neutres (triglycérides).
Il ressort de ces résultats qu'une concentration nulle (cf. Exemples IV et VI) ou faible en azote dans le milieu de culture permet d'induire une accumulation significative de lipides intracellulaires, notamment des lipides neutres chez la souche mutante BAFJ3 de C. reinhardtii.
BIBLIOGRAPHIE
- Bail S (1990) Plant Science 66, 1-9
- Bail S et al. (1991) Planta 185, 17-26 - Bligh EG and Dyer WJ (1959) Canadian Journal of Biochemistry and Physiology 37, 91 1-917
- Boyton JE et al (1988) Science 240, 1534-1538
- Chisti Y (2007) Biotechnology Advances 25, 294-306
- Davies RD and Plaskitt A (1971) Genêt. Res. 17, 33-43 - de la Jara A et al. (2003) J. Appl. Phycol. 15, 433-438
- Debuchy R et al. (1989) EMBO J. 8, 2803-2809
- Femandez E et al. (1989) PNAS 86, 6449-6453
- Greenspan P and Fowler SD, (1985) Journal of Lipid Research 26, 781-788
- Haag AL (2007) Nature 447, 520-521 - Hallman A (2006) Plant J. 45, 292-307
- Harris EH (1989) The Chlamydomonas SourceBook : A comprehensive guide to biology and laboratory use (Académie Press, San Diego)
- Jaenicke L et al. (1987) Eur. J. Biochem. 170:485-91
- Klein U and Betz A (1978) Plant Physiol. 61, 953-956 - Lichtenthaler HK (1987) Methods in Enzymology 148, 380-382
- Morrison WR and Smith LM (1964) Journal of Lipid Research 5, 600-608
- Mouille G et al. (1996) Plant CeIl 8, 1353-1366
- Sheehan J et al. (1998) Final report. Program Biodiesel from Algae. U.S. Department of Energy. Office of Fuels Development - Shimogawara K et al. (1998) Genetics 148, 1821-1828
- Van der Koornhuyse N et al. (1996) J. Biol. Chem. 271, 16281-16287
- Vidi PA et al. (2007) BMC Biotechnology. 7, 4
- Zabawinski, C. et al. (2001) J. Bact. 183, 1069-1077

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'une souche mutante d'algue dépourvue de paroi cellulaire pour la production de lipides neutres, ladite souche mutante étant obtenue à partir d'une souche sauvage pourvue de paroi cellulaire.
2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite souche dépourvue de paroi cellulaire est en outre affectée dans la synthèse de l'amidon.
3. Utilisation selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce que ladite souche est une souche d'algue verte, de préférence de Chlamydomonas.
4. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite souche d'algue est choisie parmi la souche CC-406, la souche CC-851 et une souche dérivée de l'une desdites souches CC-406 et CC-851.
5. Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que ladite souche de Chlamydomonas est choisie parmi la souche BAFJ3, la souche BAFJ5, la souche BAFJ6 et une souche dérivée de l'une desdites souches BAFJ3, BAFJ5 et BAFJ6.
6. Procédé de production de lipides neutres, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de culture d'une souche mutante d'algue dépourvue de paroi cellulaire, et optionnellement affectée aussi dans la synthèse de l'amidon, en conditions photoautotrophes et de carence totale ou partielle en azote, et sous atmosphère d'air enrichi à environ 1% à 5% de dioxyde de carbone.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisée en ce que ladite souche est une souche d'algue verte, de préférence de Chlamydomonas.
8. Procédé selon la revendication 6 ou la revendication 7, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape d'extraction des lipides neutres.
PCT/FR2009/000611 2008-05-27 2009-05-27 Utilisation de souches d'algues depourvues de paroi cellulaire pour la production de lipides neutres WO2009153439A2 (fr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR08/02874 2008-05-27
FR0802874A FR2931841A1 (fr) 2008-05-27 2008-05-27 Utilisation de souches d'algues depourvues de paroi cellulaire pour la production de lipides neutres.

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2009153439A2 true WO2009153439A2 (fr) 2009-12-23
WO2009153439A3 WO2009153439A3 (fr) 2010-04-08

Family

ID=40351341

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR2009/000611 WO2009153439A2 (fr) 2008-05-27 2009-05-27 Utilisation de souches d'algues depourvues de paroi cellulaire pour la production de lipides neutres

Country Status (2)

Country Link
FR (1) FR2931841A1 (fr)
WO (1) WO2009153439A2 (fr)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012029727A1 (fr) 2010-08-31 2012-03-08 独立行政法人科学技術振興機構 Algue dans laquelle la production de produits photosynthétiques est améliorée, et utilisation pour ladite algue
US10358666B2 (en) 2014-05-29 2019-07-23 Japan Science And Technology Agency Algae and method for producing same, and method for producing biomass using said algae
JP2020074772A (ja) * 2018-11-07 2020-05-21 学校法人 中央大学 油脂生産性が増加した緑藻変異体及びその利用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2461003A1 (fr) * 1979-07-03 1981-01-30 Yissum Res Dev Co Procede pour produire des huiles a partir d'algues

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2461003A1 (fr) * 1979-07-03 1981-01-30 Yissum Res Dev Co Procede pour produire des huiles a partir d'algues

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MOUILLE G ET AL: "Preamylopectin processing: A mandatory step for starch biosynthesis in plants" PLANT CELL, AMERICAN SOCIETY OF PLANT PHYSIOLOGISTS, ROCKVILLE, MD, US, vol. 8, no. 8, 1 août 1996 (1996-08-01), pages 1353-1366, XP002108226 ISSN: 1040-4651 cité dans la demande *
WANG ZI TENG ET AL: "Algal Lipid Bodies: Stress Induction, Purification, and Biochemical Characterization in Wild-Type and Starchless Chlamydomonas reinhardtii" EUKARYOTIC CELL, vol. 8, no. 12, décembre 2009 (2009-12), pages 1856-1868, XP002567795 ISSN: 1535-9778 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012029727A1 (fr) 2010-08-31 2012-03-08 独立行政法人科学技術振興機構 Algue dans laquelle la production de produits photosynthétiques est améliorée, et utilisation pour ladite algue
US9051575B2 (en) 2010-08-31 2015-06-09 Japan Science And Technology Agency Alga in which production of photosynthetic products is improved, and use for said alga
US10358666B2 (en) 2014-05-29 2019-07-23 Japan Science And Technology Agency Algae and method for producing same, and method for producing biomass using said algae
JP2020074772A (ja) * 2018-11-07 2020-05-21 学校法人 中央大学 油脂生産性が増加した緑藻変異体及びその利用
JP7397438B2 (ja) 2018-11-07 2023-12-13 学校法人 中央大学 油脂生産性が増加した緑藻変異体及びその利用

Also Published As

Publication number Publication date
WO2009153439A3 (fr) 2010-04-08
FR2931841A1 (fr) 2009-12-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Deng et al. The effects of nutritional restriction on neutral lipid accumulation in Chlamydomonas and Chlorella
Sheng et al. Evaluation of methods to extract and quantify lipids from Synechocystis PCC 6803
EP2616536B1 (fr) Procédé de culture d'algues unicellulaires mixotrophes en présence d'un apport lumineux discontinu sous forme de flashs
Lee Chang et al. Biodiscovery of new Australian thraustochytrids for production of biodiesel and long-chain omega-3 oils
Přibyl et al. Production of lipids and formation and mobilization of lipid bodies in Chlorella vulgaris
EP3067414B1 (fr) Procédé d'enrichissement en protéines de la biomasse de microalgues
EP2310517B1 (fr) Nouvelles souches de levure mutantes capables d'accumuler une grande quantité de lipides
US9340768B2 (en) Transformation of glycerol and cellulosic materials into high energy fuels
Fuentes-Grünewald et al. Use of the dinoflagellate Karlodinium veneficum as a sustainable source of biodiesel production
Manzoor et al. Mixotrophic cultivation of Scenedesmus dimorphus in sugarcane bagasse hydrolysate
WO2013115288A1 (fr) Procédé de production d'euglena ayant une forte teneur en ester de cire
Gosalawit et al. The potential of the oleaginous yeast Rhodotorula paludigena CM33 to produce biolipids
WO2009153439A2 (fr) Utilisation de souches d'algues depourvues de paroi cellulaire pour la production de lipides neutres
Sharma et al. Rapid lipid induction in Chlorella sp. by UV-C radiation
Ye et al. 3-Oxoacyl acyl carrier protein reductase overexpression reveals its unprecedented roles in biofuel production and high-temperature tolerance in diatom
Peng et al. Characterization of a newly isolated green microalga Scenedesmus sp. as a potential source of biodiesel
Toyoshima et al. High-level accumulation of triacylglycerol and starch in photoautotrophically grown Chlamydomonas debaryana NIES-2212
Zhang et al. Trophic transition enhanced biomass and lipid production of the unicellular green alga Scenedesmus acuminatus
KR101152761B1 (ko) 신규한 베타-카로틴 생산 균주 및 이를 이용한 베타-카로틴 제조방법
Chtourou et al. Dunaliella sp. a wild algal strain isolated from the Sfax-Tunisia solar evaporating salt-ponds, a high potential for biofuel production purposes
Ben-Sheleg et al. Characterization of nannochloropsis oceanica rose bengal mutants sheds light on acclimation mechanisms to high light when grown in low temperature
Liu et al. Effect of Fe3+ on the growth and lipid content of Isochrysis galbana
WO2012056187A2 (fr) Nouvelles souches de microalgues du genre botryococcus et procede de culture en mode mixotrophe desdites microalgues
CA3007749C (fr) Procede d'enrichissement de protistes en lipides riches en acides gras polyinsatures, en particulier de classe omega 3, et sa mise en oeuvre pour la production de ces protistes enrichis ou de ces lipides
Kugler et al. Resilience to freezing in the vegetative cells of the microalga Lobosphaera incisa (Trebouxiophyceae, Chlorophyta)

Legal Events

Date Code Title Description
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 09766001

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2