JP7397438B2 - 油脂生産性が増加した緑藻変異体及びその利用 - Google Patents
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Description
(1)配列番号7又は8に示すASPの保存領域と少なくとも50%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つASP活性を有するタンパク質の活性を低下させた真核微細藻類変異体であって、親株と比較して、(i)細胞内の油脂含有率及び油脂生産性が増加すること、(ii)窒素欠乏時のクロロフィル減少速度が低下すること、(iii)バイオマス生産性が増加すること、(iv)細胞が肥大化すること、(v)培養液の発泡が減少すること、(vi)細胞の器壁への付着性が低下すること、及び、(vii)細胞壁が脆弱化することから成る群より選択される1以上の特徴を有する、前記真核微細藻類変異体。
(2)さらに、配列番号23及び24に示すB型レスポンスレギュレータータンパク質の保存領域のそれぞれと少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つB型レスポンスレギュレーター活性を有するタンパク質の活性を低下させた、及び/又は、配列番号31又は32に示す油滴タンパク質の保存領域と少なくとも50%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つ油滴の膜表面に局在するタンパク質の機能が低下した、(1)記載の真核微細藻類変異体。
(3)前記タンパク質をコードする遺伝子を破壊した、(1)又は(2)記載の真核微細藻類変異体。
(4)前記タンパク質をコードする遺伝子の発現を低下させた、(1)又は(2)記載の真核微細藻類変異体。
(5)前記タンパク質をコードする遺伝子の翻訳効率を低下させた、(1)又は(2)記載の真核微細藻類変異体。
(6)緑藻植物門(Chlorophyta)に属する、(1)~(5)のいずれか1記載の真核微細藻類変異体。
(7)トレボキシア藻網(Trebouxiophyceae)に属する、(6)記載の真核微細藻類変異体。
(8)コッコミクサ属(Coccomyxa)に属する、(7)記載の真核微細藻類変異体。
(9)(1)~(8)のいずれか1記載の真核微細藻類変異体を培養する工程を含む、油脂生産方法。
(i)細胞内の油脂含有率及び油脂生産性が増加すること、
(ii)窒素欠乏時におけるクロロフィル減少速度が低下すること、
(iii)バイオマス生産性が向上すること、
(iv)細胞が肥大化すること、
(v)培養液の発泡が減少すること、
(vi)細胞の器壁への付着性が低下すること、及び、
(vii)細胞壁が脆弱化すること、
という多面的な特徴のうちの1以上を有した真核微細藻類変異体に関する。
(1) 本発明に係る遺伝子をターゲットとして変異を導入し、当該遺伝子を破壊する;
(2) 本発明に係る遺伝子の転写を抑制し、該遺伝子の発現を低下させる;
(3) 本発明に係る遺伝子の翻訳を抑制し、該遺伝子の翻訳効率を低下させる;
方法が挙げられる。
本発明に係る遺伝子をターゲットとして変異を導入する方法としては、ZFN、TALENあるいはCRISPR/Casと呼ばれる遺伝子ノックアウト法(Gaj T, Gersbach CA, Barbas CF 3rd. (2013) ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol. 31:397-405.)を用いることにより、その遺伝子が欠損した変異体を作出できる。
本発明に係る遺伝子の転写を抑制する方法としては、対象となる真核微細藻類における該遺伝子のプロモーター領域に変異やマーカー遺伝子等を導入する方法が挙げられる。
また、該遺伝子の正の発現制御に関わる遺伝子に変異を導入し、それらの機能を低下させる方法が挙げられる。
あるいは、該遺伝子の負の発現制御に関わる遺伝子に変異を導入し、負の発現制御が常時働くようにする方法が挙げられる。
本発明に係る遺伝子の翻訳を抑制する方法としては、いわゆるRNA干渉法(Cerutti H et al., 2011, Eukaryot Cell, 10, 1164)やアンチセンス法が挙げられる。
KJ株細胞(受託番号FERM BP-22254)に対して、N-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(NTG)による突然変異誘起処理を施し、窒素欠乏時の油脂含有率が増加した変異体を以下の方法で取得した。
Obi株(受託番号FERM BP-10484)のASP1遺伝子(ゲノム配列:配列番号2、CDS配列:配列番号4、全長アミノ酸配列:配列番号6、保存領域のアミノ酸配列:配列番号8)を特異的に切断するためのgRNAを設計し、CRISPR/Cas9法を用いて、実施例1と同様にObi株のASP1遺伝子の破壊を行った。表4に示すように、ASP1遺伝子のgRNA標的部位に303塩基対の挿入配列を持つ変異体が得られ、この変異及び該変異を有する変異体をasp1-19と名付けた。asp1-19変異体はナンセンス変異によりASP1タンパク質の活性が失われていると予測された。Obi株とasp1-19変異体を試験管で連続光条件下、酸性の窒素欠乏培地で7日間培養し、油脂生産性を比較したところ、表5に示すように、ASP1破壊株ではバイオマス生産量及び油脂含有率がObi株より増加し、油脂生産性が約1.33倍に増加した。さらに、培養14日目のObi株とasp1-19変異体の顕微鏡写真を図1に示す。ASP1破壊株は、KJ株においてもObi株においても、細胞の大きさが増大し、細胞内の油滴の数も増加していた。
特願2018-209358号に記載されたKJ株由来のARR1遺伝子破壊株(arr1-432、ARR1遺伝子(ゲノム配列:配列番号17、CDS配列:配列番号19、全長アミノ酸配列:配列番号21、保存領域のアミノ酸配列:レシーバー領域(配列番号23)及びBモチーフ(配列番号24)))を親株にして、実施例1と同様にCRISPR/Cas9法を用いてASP1遺伝子の破壊を試みた。
・尿素 191 mg
・リン酸二水素アンモニウム 15.2 mg
・硫酸マグネシウム七水和物 34 mg
・硫酸カリウム 25.1 mg
・塩化カルシウム二水和物 2.9 mg
・塩化ナトリウム 2.2 mg
・Fe(III)-EDTA 3.4 mg
・ミネラル溶液(ホウ酸 70 mg/L、塩化マンガン四水和物 100 mg/L、硫酸亜鉛七水和物 300 mg/L、硫酸銅五水和物 300 mg/L、塩化コバルト六水和物 70 mg/L、モリブデン酸ナトリウム 3 mg/L) 1 mL
KJ株、kjasp1-241株、kjasp1-141株、DKO-1株、TKO-1株、kjldp1-1株、arr1-432株を、50%濃度のA9培地(pH3.5)で連続光条件下、試験管でOD750=0.2の細胞密度から11日間培養した。透過電子顕微鏡(TEM)で細胞の形態を観察した結果を図7及び図8に示す。TEM解析は株式会社東海電子顕微鏡解析に依頼し、急速凍結・凍結置換法を用いて試料を作製した。
ASP1遺伝子破壊株及びASP1変異株における油脂抽出率と親株であるKJ株の油脂抽出率を比べた結果を図9に示す。表3に示したKJ株、ASP1変異株(kjasp1-1)及びKJ株由来のASP1遺伝子破壊株(kjasp1-242, kjasp1-241, kjasp1-232, kjasp1-141)の7日目の培養液15 mLを遠心して細胞を回収し、凍結乾燥処理を行った。その凍結乾燥試料の油脂含有率を測定後、ねじ口試験管にヘキサン5 mLを加え、超音波洗浄機を用いて28 kHz、45 kHzで各10分間、計20分間処理したときのヘキサン中に抽出された油脂重量を測定し、油脂抽出率を計算した。同じ15 mLの培養液に含まれる細胞からヘキサン5 mLを用いて油脂を抽出した際、KJ株と比べてASP1遺伝子破壊株は抽出された油脂量が約3倍に増加した(図9A)。KJ株の油脂抽出率は約27%と低かったが、ASP1変異株及びASP1遺伝子破壊株は油脂抽出率が約53-63%まで増加した(図9B)。ASP1遺伝子の破壊によって、KJ株の細胞壁が脆弱になり、簡単な処理で破壊されやすくなったと考えられる。
KJ株及びASP1変異株(kjasp1-1株、kjasp1-2株)を屋外レースウェイ培養した際の写真を図10に示す。KJ株は培養液の表面に泡の巨大な塊が発生した(図10A)が、この泡の塊によって、培養液表面に届く光の量が減少する可能性が考えられた。一方、同時に培養したASP1変異株(kjasp1-1株、kjasp1-2株)からは泡がほとんど発生しなかった(図10B, C)。
FERM BP-22254
Claims (9)
- 配列番号5又は6に示すアスパラギン酸プロテアーゼと少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つアスパラギン酸プロテアーゼ活性を有するタンパク質の活性を低下させた真核微細藻類変異体であって、親株と比較して、
(i)細胞内の油脂含有率及び油脂生産性が増加すること、
(ii)窒素欠乏時のクロロフィル減少速度が低下すること、
(iii)バイオマス生産性が増加すること、
(iv)細胞が肥大化すること、
(v)培養液の発泡が減少すること、
(vi)細胞の器壁への付着性が低下すること、及び、
(vii)細胞壁が脆弱化すること、
から成る群より選択される1以上の特徴を有する、前記真核微細藻類変異体。 - さらに、配列番号21又は22に示すB型レスポンスレギュレータータンパク質と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つB型レスポンスレギュレーター活性を有するタンパク質の活性を低下させた、及び/又は、
配列番号29又は30に示す油滴タンパク質と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つ油滴の膜表面に局在するタンパク質の機能が低下した、
請求項1記載の真核微細藻類変異体。 - 前記タンパク質をコードする遺伝子を破壊した、請求項1又は2記載の真核微細藻類変異体。
- 前記タンパク質をコードする遺伝子の発現を低下させた、請求項1又は2記載の真核微細藻類変異体。
- 前記タンパク質をコードする遺伝子の翻訳効率を低下させた、請求項1又は2記載の真核微細藻類変異体。
- 緑藻植物門(Chlorophyta)に属する、請求項1~5のいずれか1項記載の真核微細藻類変異体。
- トレボキシア藻網(Trebouxiophyceae)に属する、請求項6記載の真核微細藻類変異体。
- コッコミクサ属(Coccomyxa)に属する、請求項7記載の真核微細藻類変異体。
- 請求項1~8のいずれか1項記載の真核微細藻類変異体を培養する工程を含む、油脂生産方法。
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