TWI591178B - 使光合成產物之生產性提升的藻類及其利用 - Google Patents

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Description

使光合成產物之生產性提升的藻類及其利用
本發明係關於使光合成產物之生產性提升的藻類及其利用，具體而言，係關於使光合成產物之生產性提升的藻類、該藻類之製造方法、及使用該藻類製造生質能(biomass)之方法。
就替代化石燃料的燃料而言，正期待來自生質能之燃料，即所謂的生質燃料(例如，生質乙醇(bioethanol)、生質柴油(biodiesel)等)。
成為生質燃料原料的糖類(例如，澱粉)或油脂等生質能係藉由植物進行光合成所產生。因此，活潑地進行光合成，且具有於細胞內蓄積糖類或油脂能力的植物可利用作為生質能之生產手段。現在，為了生產生質能，主要是利用玉米或大豆。玉米或大豆亦被利用作為食物或飼料。因此，由於生質燃料的大幅增產所引起之食物及飼料之價格高漲正被視為問題。
因此，作為替代玉米或大豆之生質能生產手段，藉由藻類的生質能生產正受到注目(例如，參照專利文獻1及專利文獻2)。藉由藻類的生質能生產具有不會與食物或飼料競合，且可大量增殖等之優點。
例如，關於為一種藻類的單胞藻屬(chlamydomonas)，已知細胞壁為缺損的變異體或細胞壁變薄的變異體(cw15，cw92等)。此等變異體因有適合自外部導入DNA至細胞內的性質，而被廣泛使用於基因導入實驗。又因細胞容易損壞，於所謂細胞內容物的回收為容易的意義下，因提高生質能之生產性，故關於利用此等之變異體的生質能生產被報告。例如，專利文獻3已記載使用單胞藻屬中細胞壁缺損的變異體而使油脂生產的技術。又，非專利文獻1已報告除了具有細胞壁變異(cw15)之外，還具有澱粉合成基因缺損的單胞藻屬會使油脂所構成的油滴被釋放至細胞外。非專利文獻2已報告關於單胞藻屬之細胞壁變異體(cw15)，藉由破壞澱粉合成的基因而提高油脂之生產性。又，就關於單胞藻屬細胞壁之變異的報告而言，已知有非專利文獻3。
又，亦已報告將為藻類的一種的綠球藻(Chlorella)作為材料，使產生的澱粉被釋放至細胞外，接著進行乙醇發酵的技術(專利文獻4)。
[先行技術文獻]
[專利文獻]
[專利文獻1]　日本國公開專利公報「特開平11-196885號公報(1999年07月27日公開)」
[專利文獻2]　日本國公開專利公報「特開2003-310288號公報(2003年11月05日公開)」
[專利文獻3]　國際公開第2009/153439號小冊(2009年12月23日公開)
[專利文獻4]　日本國公開專利公報「特開2010-88334號公報(2010年4月22日公開)」
[非專利文獻]
[非專利文獻1]　Zi Teng Wang,Nico Ullrich,Sunjoo Joo,Sabine Waffenschmidt,and Ursula Goodenough(2009) Eukaryotic Cell Vol. 8(12): 1856-1868. Algal Lipid Bodies: Stress Induction,Purification,and Biochemical Characterization in Wild-Type and Starchless Chlamydomonas reinhardtii.
[非專利文獻2]　Yantao Li,Danxiang Han,Guongrong Hu,David Dauvillee,Milton Sommerfeld,Steven Ball and Qiang Hu(2010) Metabolic Engineering Vol. 12(4): 387-391. Chlamydomonas starchless mutant defective in ADP-glucose pyrophosphorylase hyper-accumulates triacylglycerol.
[非專利文獻3]　Hyams,J.,Davies,D.R.(1972) Mutation Research 14(4): 381-389. The induction and characterisation of cell wall mutants of Chlamydomonas reinhardi.
然而，使用如上述的藻類的生質能之生產技術於生產性的面向上具有問題。例如，使用乙酸等碳源於從屬營養條件培養藻類而生產的生質能情形，為了誘導藻類中生質能的生產‧蓄積，作成缺氮狀態等之營養限制步驟成為必要。一般而言，因使用含有氮的培養液而使藻類增殖培養，故為了作成缺氮狀態，有必要交換為不含有氮的培養液。因此，有步驟複雜化、生產性降低而成本變高的問題點。
本發明係鑑於上述習知的問題點，其目的係提供不進行營養限制步驟，且可使生質能之生產性提升的藻類及其利用。
本發明者們，就解決上述課題為主要目的，不斷進行各種檢討的結果，發現使藻類之葉綠體內的麩胱甘肽(glutathione)濃度人工地增加的結果，即使不進行缺氮狀態等之營養限制步驟，可使藻類細胞內的生質能的生產性提升，遂而完成本發明。
即，本發明有關的藻類係以葉綠體內之麩胱甘肽濃度增加為特徴。
本發明有關的藻類之製造方法係製造上述藻類的方法，其特徵為包含：麩胱甘肽濃度增加步驟，其係使藻類之葉綠體內的麩胱甘肽濃度增加。
本發明有關的生質能之製造方法，其特徵係使用本發明有關的藻類或藉由本發明有關的藻類之製造方法所製造的藻類。
本發明有關的生質能之製造方法係包含於使藻類之葉綠體內的麩胱甘肽濃度增加的物質存在下，培養藻類的步驟。
本發明有關的藻類係藉由增加藻類葉綠體內的麩胱甘肽濃度，即使未成為缺氮狀態，仍可使藻類細胞內的光合成產物之生產性提升。因此，若使用本發明有關的藻類，不需要進行為了誘導光合成產物的蓄積而與不含氮的培養液交換。即，依據本發明，光合成產物之蓄積之誘導可容易且有效率地進行。因此，依據本發明有關的生質能之製造方法，與先前技術相較可更便宜、有效率地自藻類製造生質能。
本發明之其他目的、特徴、及優異點如以下所示的記載可充分了解。又，本發明之有利點參照所附圖式的下列說明而明白。
[用以實施發明之形態]
以下，詳細說明關於本發明之實施形態。惟，本發明並未限定於此等例，可於記述範圍內增加各種變形的態樣下實施。又，本說明書中記載的學術文獻及專利文獻全部於本說明書中作為參考而被引用。又，本說明書中只要未特別說明，表示數值範圍的「A~B」係意指「A以上、B以下」。
[1.本發明有關的藻類]
本發明有關的藻類只要增加葉綠體內之麩胱甘肽濃度者即可，其他之構成並未限定，但以光合成產物生產性提升的藻類為較佳。
其中，於本發明，「葉綠體內之麩胱甘肽濃度增加」係指與同一種之野生型藻類的葉綠體內之麩胱甘肽濃度作比較，葉綠體內之麩胱甘肽濃度變高。與於同一條件下栽培的同一種野生型藻類之葉綠體內麩胱甘肽濃度作比較，葉綠體內之麩胱甘肽濃度為1.1倍以上的情形，判斷為葉綠體內之麩胱甘肽濃度增加者為較佳，再者在t檢定下有5%顯著水準時，判斷為葉綠體內之麩胱甘肽濃度增加者為更佳。又，野生型藻類之葉綠體內之麩胱甘肽濃度以同一方法同時測定者為較佳，亦可使用累積資料作為背景資料。
藻類之葉綠體內之麩胱甘肽濃度可藉由直接測量存在於葉綠體內反映出氧化還原(redox)狀態而色調會變化的分子探針roGFP2的方法(例如，參照Meyer AJ,et al.(2007) Plant Journal 52: 973-986.Redox-sensitive GFP in Arabidopsis thaliana is a quantitative biosensor for the redox potential of the cellular glutathione redox buffer.及Gutscher M,et al.(2008) Nat Methods 5: 553-559. Real-time imaging of the intracellular glutathione redox potential.)。又除此之外，以與麩胱甘肽生合成系統有關之蛋白質之表現量、或編碼該蛋白質的多核苷酸之表現量作為指標，此等會增加的情形，麩胱甘肽濃度會增加，亦可間接地測量。關於蛋白質或多核苷酸之表現量之測定方法，可較佳地利用向來習知的手法。
就上述「麩胱甘肽」而言，有還原型麩胱甘肽(以下，稱為「GSH」)及氧化型麩胱甘肽(以下，「GSSG」)。於本發明有關的方法，只要針對GSH或GSSG任一者之麩胱甘肽濃度即可，亦可使GSH及GSSG兩者之濃度增加。
又，「光合成產物之生產性提升」係意指與同一種野生型藻類之光合成產物之生產性作比較，光合成產物之生產性為多者。與於同一條件下栽培的同一種野生型藻類之光合成產物之生產性作比較，光合成產物之生產性為1.1倍以上時，判斷光合成產物之生產性會提升而為較佳，再者於t檢定下有5%顯著水準時，判斷光合成產物之生產性提升者為更佳。例如，可以照射的光條件(光量、強度、時間等)、投與的營養素、每單位時間、使飢餓狀態的步驟是否為必須、培養溫度等之各種觀點評價生產性。
又，於本說明書中，上述「光合成產物(photosynthate)」係指藻類藉由來自光合成的碳固定而產生的物質，具體而言，例如，指糖類(例如，澱粉)、油脂等之生質能及其衍生物(代謝產物等)。又，本文所述來自光合成的碳固定係指利用來自光能量的化學能量的碳化合物之代謝全體。因此，進入代謝系統的碳之來源不限於二氧化碳等之無機化合物，亦包含乙酸等之有機化合物。
於本說明書，就上述「藻類」而言，只要具有光合成能力，而可生成光合成產物的藻類即可，並未特別限制。就如此的藻類而言，例如，可舉例被分類為綠藻植物門之綠藻綱的微細藻類，更具體而言，可舉例屬於綠藻綱之單胞藻屬的萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、莫氏衣藻(Chlamydomonas moewusii)、卵配衣藻(Chlamydomonas eugametos)、惰性衣藻(Chlamydomonas segnis)等；屬於綠藻綱之杜氏鹽藻屬的杜氏鹽藻(Dunaliella salina)、杜氏鹽藻(Dunaliella tertiolecta)、普林莫杜氏藻(Dunaliella primolecta)等；屬於綠藻綱之綠球藻屬的小球藻(Chlorella vulgaris)、蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)等；屬於綠藻綱之紅球藻屬的雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)等；屬於綠藻綱之綠球藻屬的海洋綠球藻(Chlorococcum littorale)等；屬於綠藻綱或黃綠色藻綱之葡萄藻屬的布朗葡萄藻(Botryococcus braunii)等；屬於綠藻綱之Choricystis屬的Choricystis minor(Choricystis minor)等；屬於綠藻綱之微細綠藻屬的微細綠藻(Pseudochoricystis ellipsoidea)等；屬於矽藻綱之雙眉藻屬的雙眉藻(Amphora sp.)等；屬於矽藻綱之菱形藻屬的海洋矽藻(Nitzschia alba)、新月藻(Nitzschia closterium)、左彎菱形藻(Nitzschia laevis)等；屬於渦鞭毛藻綱之隱甲藻屬的寇氏隱甲藻(Crypthecodinium cohnii)等；屬於裸藻綱之裸藻屬的纖細裸藻(Euglena gracilis)、近軸裸藻(Euglena proxima)等；屬於纖毛蟲門之草履蟲屬的袋狀草履蟲(Paramecium bursaria)等；屬於藍綠藻門之聚球藻屬的水生聚球藻(Synechococcus aquatilis)、細長聚球藻(Synechococcus elongatus)等；屬於藍綠藻門螺旋藻屬的鈍頂螺旋藻(Spirulina platensis)、鹽澤螺旋藻(Spirulina subsalsa)等；屬於藍綠藻門之原綠球藻屬的海洋原綠球藻(Prochlorococcus marinus)等；屬於藍綠藻門之卵囊藻屬的多形卵囊藻(Oocystis polymorpha)等等。
取得葉綠體內麩胱甘肽濃度增加的藻類之方法並未特別限制。關於該方法，以後述的「2.本發明有關的藻類之製造方法」項目中具體地說明。
本發明有關的藻類係以於葉綠體中選自γ-麩胺醯基半胱胺酸合成酵素(以下，有時亦稱為「GSH1」)、麩胱甘肽合成酵素(以下，有時亦稱為「GSH2」)、ATP硫酸化酶(sulfurylase)、腺苷5’-磷硫酸還原酵素、亞硫酸還原酵素、半胱胺酸合成酵素及絲胺酸乙醯基轉移酵素所組成之群中至少1種之蛋白質之表現量及/或活性增加者為較佳。此等蛋白質係參與葉綠體內之麩胱甘肽生合成系統的酵素，即此等表現量之增加可把握葉綠體內之麩胱甘肽濃度之增加。
又，本發明有關的藻類亦可為導入編碼下列所組成之群中至少一種蛋白質的多核苷酸：GSH1、GSH2、ATP硫酸化酶、腺苷5’-磷硫酸還原酵素、亞硫酸還原酵素、半胱胺酸合成酵素及絲胺酸乙醯基轉移酵素。該外因性多核苷酸被導入，且(過度)表現的藻類即意指葉綠體內之麩胱甘肽濃度會增加的藻類。
換言之，本發明可謂為提供一種葉綠體內之麩胱甘肽濃度會增加的轉形藻類，其中導入編碼選自以下所組成之群中至少1種蛋白質的多核苷酸：GSH1、GSH2、ATP硫酸化酶、腺苷5’-磷硫酸還原酵素、亞硫酸還原酵素、半胱胺酸合成酵素及絲胺酸乙醯基轉移酵素。該轉形藻類當然為同時提升光合成產物之生產性者。
又，本發明有關的藻類中，編碼上述γ-麩胺醯基半胱胺酸合成酵素的多核苷酸亦可選自以下(a)~(d)所組成之群：
(a)編碼序列識別號1所示之胺基酸序列所構成的多胜肽的多核苷酸；
(b)編碼於序列識別號1所示之胺基酸序列中1或數個胺基酸經刪除、取代或添加的胺基酸序列所構成，且具有γ-麩胺醯基半胱胺酸合成酵素活性的多胜肽的多核苷酸；
(c)序列識別號2所示之鹼基序列所構成的多核苷酸；
(d)與上述(a)~(c)之多核苷酸中任一者之多核苷酸互補的鹼基序列所構成的多核苷酸於嚴格條件下雜交、且編碼具有γ-麩胺醯基半胱胺酸合成酵素活性的多胜肽的多核苷酸。下文詳細描述上述(a)~(d)之多核苷酸。
又，於本發明之藻類，上述多核苷酸被導入藻類之細胞內者，可藉由向來習知的PCR法、南方氏雜合反應法(Southern hybridization)、北方氏雜合反應法(Northern hybridization)等來確認。又，多核苷酸所編碼的蛋白質之表現亦可藉由向來習知的免疫學手法來確認。又，多核苷酸所編碼的蛋白質所顯示的酵素活性液可藉由向來習知的生化學手法來測定。
本發明之藻類係藉由增加藻類之葉綠體內麩胱甘肽濃度，同時不成為缺氮狀態，可誘導藻類之細胞內的光合成產物之生產及/或蓄積。因此，若使用本發明之藻類，不需要為了誘導光合成產物蓄積而交換成不含有氮的培養液。
本發明之作用效果將與野生型作對比而說明如下。首先，於從屬營養條件(有乙酸等碳源的情形)成為缺氮狀態的情形，野生型之藻類於增殖期細胞內會稍微蓄積光合成產物，再於穩定期蓄積光合成產物，但細胞外幾乎未檢測出光合成產物。相對於此，本發明有關的藻類，無論於增殖期(對數增殖期)及穩定期任一者皆會生產並蓄積光合成產物，進而於細胞外會檢測出多量光合成產物。又，於從屬營養條件未成為缺氮狀態的情形，野生型之藻類於增殖期細胞內僅有一些蓄積光合成產物，於穩定期此蓄積更為降低，細胞外幾乎未能檢測出。另一方面，本發明有關的藻類，於增殖期及穩定期任一者皆會生產‧蓄積光合成產物，且於細胞外亦檢測出許多光合成產物。
其次，於獨立營養條件(依存於經由光合成的二氧化碳固定而增殖的條件)，一般而言，在野生型之藻類中，缺氮時之光合成產物蓄積誘導所需要的光量必須較從屬營養條件時多。相對於此，本發明有關的藻類，並未特別地增強光強度亦能持續產生光合成產物。當然，若照射的光越強則本發明有關的藻類亦更提升光合成產物之生產性。例如，就藻類而言，利用單胞藻屬的情形，由其特性，於光合成產物之生產照射較強的光者為有利的，但與野生型之藻類相比，本發明有關的藻類之特徵點可謂由於光量之光合成產物之蓄積限制係極為限定的特徵。
又，本發明之藻類有所謂培養密度被維持於低密度的特徴。因此，本發明之藻類係光之利用效率高。據此，即使以相同光量(亮度)，與同一種之野生型藻類相比，可使較多光合成產物生產‧蓄積。一般而言，於細胞密度適當的程度(例如，維持較野生型低)之情形，於光之利用效率之點具有有用性。即，光合成產物之生產能力係隨著細胞密度提昇，藉由於培養槽表層存在的細胞之“日陰效果”下，到達培養槽深層的光會減弱，故於此點有所謂成為達到頂點的問題，但本發明之藻類之培養密度與野生型相比被維持於小的狀態，因此可避免此等問題。
再者，本發明之藻類，因應培養時間，可線性地增加澱粉粒之蓄積。因此，藉由水之補給或添加培養基而將此等培養狀態維持，藉由所謂的連續培養，可連續地生產光合成產物(例如，呈澱粉粒連續地生產澱粉等)。
或者，本發明之藻類，與野生型相比，用以提升培養密度的空間餘地較大。經由人為的操作(例如，藉由過濾步驟等之細胞分散媒(例如，水分)減量等)，光合成產物之生產性至飽和的限度為止之前，使其培養密度提昇，亦可有效果地生產光合成產物。
又，本發明之藻類係休止細胞少。因此，若使用本發明之藻類製造生質能，產率為佳且可節省培養液。又，因廢棄物少，可減少廢棄物之處理費用(脫水、燃燒、掩埋等)，尤其於進行批次培養時為有利。又，廢棄物少者，與產率佳有關。具體而言，例如，酒醸造等發酵中的廢棄物中之固形物幾乎為細胞，但本發明之藻類伴隨澱粉粒之釋放，細胞會破裂、自體溶解，故死細胞之分解物成為其他細胞之營養，產率變佳。
再者，本發明之藻類因可使蓄積於藻類細胞內的光合成產物被排出細胞外，光合成產物之回收為容易。例如，光合成產物為澱粉時，經光合成所蓄積的澱粉可於不將藻類細胞破碎下，呈澱粉粒被排出細胞外。因此，若使用本發明之藻類來製造生質能，可比較容易地進行澱粉之純化。
由本發明藻類所生成的澱粉粒為微小者係其特徴。例如，相對於藉由玉米、馬鈴薯、小麥等所製作的一般的澱粉粒為平均粒徑10~50μm，藉由本發明藻類所生成的澱粉粒之平均粒徑為長徑1.3μm(標準偏差0.181)、短徑1.0μm(標準偏差0.204)之微小且大小均一的粒子。製造米或奎藜籽(quinoa)等平均粒徑為2~3μm左右的微小澱粉粒，彼等與玉米、馬鈴薯、小麥等所生產的澱粉粒同樣地，由於密著而形成組織化的胚乳。因此，將玉米、馬鈴薯、小麥、米、奎藜籽等作為原料，為了調製成為一個一個分開狀態的微小澱粉粒係有必要磨細等花費成本的處理。該微小澱粉粒於醫藥品之製造為有用的。即，若使用本發明之藻類，可大量生產微小且大小均一的澱粉粒，同時可比較容易地進行澱粉粒被排出藻類之細胞外的純化。再者，此等澱粉粒不作磨碎等處理且可成為一個一個分離的狀態。
如此，藉由GSH1過度表現株所生成的澱粉粒，與藉由玉米、馬鈴薯、小麥等所生產的一般的澱粉粒相比係為微小的。該微小澱粉粒有用於醫藥品之製造。具體而言，該微小澱粉粒較肺之細支氣管之管徑更小，故被期待利用作為用以使肺疾病治療藥送達至細支氣管之載體(組合治療藥與澱粉微小粒的乾粉末吸入劑)。
又，藉由使澱粉粒之表面呈現胜肽性的抗原，作為所謂的「食用疫苗」而活用者被期待(例如，Dauville'e et al. 2010,PLos One 5巻12號、e15424；特表2003-500060號公報(特願2000-620111號公報)已揭示使瘧疾抗原呈現於單胞藻屬之澱粉粒表面者)。
又，麩胱甘肽為調節細胞內之氧化還原狀態的物質，已知可作細胞或器官之分化調節劑之機能(參照國際公開第01/080638號小冊)、及可作植物生長調整輔助劑之機能(參照日本國公開專利公報「特開2004-352679號公報」)。
然而，藉由使藻類之葉綠體內麩胱甘肽濃度增加，不使成為缺氮狀態，同時可誘導藻類之細胞內中的光合成產物之蓄積，進而藻類細胞內所蓄積的光合成產物可被排出至細胞外等係由上述先前技術所知的麩胱甘肽之機能所完全無法預測者。
若使用本發明之藻類，與習知的技術比較下，光合成產物蓄積之誘導及光合成產物之回收兩者可效率佳地進行。因此，藉由於後述的生質能之製造方法中使用本發明之藻類，可較過去更便宜、效率佳地自藻類製造生質能。
[2.本發明有關的藻類之製造方法]
本發明有關的藻類之製造方法(以下，稱為「本發明之藻類之製造方法」)係為製造與上述野生型藻類比較下，葉綠體內之麩胱甘肽濃度及光合成產物生產性提升的藻類(本發明之藻類)之方法，只要至少包含使藻類葉綠體內之麩胱甘肽濃度增加之麩胱甘肽濃度增加步驟即可，其他條件、步驟等之構成並未限定。
以下具體說明關於本發明藻類之製造方法。
(1.麩胱甘肽濃度增加步驟)
麩胱甘肽濃度增加步驟為使藻類葉綠體內之麩胱甘肽濃度增加的步驟。
本文中，上述「使葉綠體內麩胱甘肽濃度增加」係意指與同一種之野生型藻類相比下，使葉綠體內之麩胱甘肽濃度增加者。換言之，麩胱甘肽濃度增加步驟後之藻類與同一種之野生型藻類相比下，具有高的麩胱甘肽濃度。藻類葉綠體內之麩胱甘肽濃度與該藻類之野生型株相比會增加者，可藉由於「1.本發明有關的藻類」之項目中所說明的方法來判定。
於麩胱甘肽濃度增加步驟，使葉綠體內麩胱甘肽濃度增加的方法，只要結果為使藻類葉綠體內麩胱甘肽濃度增加者即可，並未特別限制。例如，可藉由(i)於目的之藻類，使用習知的變異導入法而隨機導入變異的方法；(ii)於細胞內導入(依場合，於藻類之基因體中)使葉綠體內麩胱甘肽濃度增加之物質的方法等而取得。
以下，具體說明關於上述(i)及(ii)之方法。
(i)於藻類隨機導入變異的方法
於藻類隨機導入變異的方法並未特別限制，可適宜選擇習知的方法。具體而言，例如，可舉例將藻類以化學物質(例如，EMS、NTG等)處理的方法、利用放射線的方法、利用轉位子(transposon)的方法、利用T-DNA的方法、利用原核真核細胞間接合的方法、以基因槍等物理性地導入的方法等。藉由該手法，例如，於編碼GSH1、GSH2、ATP硫酸化酶、腺苷5’-磷硫酸還原酵素、亞硫酸還原酵素、半胱胺酸合成酵素、絲胺酸乙醯基轉移酵素等之葉綠體中參與麩胱甘肽之生合成系統的蛋白質的多核苷酸中導入變異，而提高蛋白質之表現量及/或活性，結果獲得葉綠體內之麩胱甘肽濃度增加的藻類者為宜。
篩選所欲之變異被導入的藻類的方法亦可利用習知的手法，並未特別限制。例如，可舉例利用直接測定上述葉綠體內之麩胱甘肽濃度的方法，而取得麩胱甘肽濃度增加的變異藻類的方法，或者取得GSH1、GSH2、ATP硫酸化酶、腺苷5’-磷硫酸還原酵素、亞硫酸還原酵素、半胱胺酸合成酵素、絲胺酸乙醯基轉移酵素等之蛋白質之表現量及/或活性增加的變異藻類的方法等。
(ii)於細胞內導入使葉綠體內麩胱甘肽濃度增加之物質的方法
就上述「使葉綠體內麩胱甘肽濃度增加之物質」而言，例如，藉由導入(A)編碼使藻類葉綠體內麩胱甘肽濃度的蛋白質的多核苷酸、(B)具有使藻類葉綠體內麩胱甘肽濃度降低的蛋白質表現量降低的機能的多核苷酸，可獲得增加葉綠體內麩胱甘肽濃度的藻類。上述(A)或(B)之多核苷酸可單獨使用，亦可合併使用。
又，本說明書中使用時，用語「多胜肽」可與「胜肽」或「蛋白質」交替使用。又，本說明書中使用時，用語「多核苷酸」可與「基因」、「核酸」或「核酸分子」交替使用，意圖指核苷酸之聚合體。
又，上述「導入多核苷酸」係指導入對象之多核苷酸存在於藻類細胞內為宜，亦包含導入對象之多核苷酸被插入(導入)藻類之基因體中的情形。多核苷酸被導入藻類細胞內者，可藉由向來習知的PCR法、南方氏雜合反應法、北方氏雜合反應法等確認。
藉由將上述(A)之多核苷酸之至少1種導入藻類細胞內，可使葉綠體內之麩胱甘肽濃度增加的蛋白質之表現量增加，其結果可使葉綠體內麩胱甘肽濃度增加。
就此等多核苷酸而言，較佳可例示如下，例如，編碼γ-麩胺醯基半胱胺酸合成酵素的多核苷酸(以下，亦有稱為「GSH1基因」的情形)、編碼麩胱甘肽合成酵素的多核苷酸(以下，亦有稱為「GSH2基因」的情形)、編碼ATP硫酸化酶的多核苷酸、編碼腺苷5’-磷硫酸還原酵素的多核苷酸、編碼亞硫酸還原酵素的多核苷酸、編碼半胱胺酸合成酵素的多核苷酸、編碼絲胺酸乙醯基轉移酵素的多核苷酸等。此等多核苷酸係來自植物者較佳，更佳為宿主藻類本身所具有的多核苷酸，但亦可適用來自與宿主藻類不同藻類的多核苷酸或來自其他高等植物之多核苷酸。
上述「γ-麩胺醯基半胱胺酸合成酵素(GSH1)」為藉由使麩胺酸於γ位與半胱胺酸形成醯胺鍵而合成γ-麩胺醯基半胱胺酸的酵素。又，上述「麩胱甘肽合成酵素(GSH2)」係藉由於γ-麩胺醯基半胱胺酸添加甘胺酸而合成麩胱甘肽的酵素。
就上述「GSH1基因」之具體例而言，並未特別限定，但就本發明使用的適合GSH1基因之1種而言，可使用本發明者們於實施例所使用的單胞藻屬之GSH1基因(CHLREDRAFT_181975)。單胞藻屬之GSH1由序列識別號1所示之胺基酸序列所構成，編碼此等的基因(全長cDNA)係由序列識別號3所示的鹼基序列所構成。序列識別號3所示的鹼基序列中，第134位~第136位為開始密碼子，第1571位~第1573位為終止密碼子。即，單胞藻屬GSH1基因係具有序列識別號3所示鹼基序列中為開放讀碼區(ORF)之第134位~第1573位。序列識別號2所示鹼基序列係單胞藻屬GSH1基因之ORF之鹼基序列。單胞藻屬GSH1基因之轉譯產物係於N末端區域具有葉綠體移行訊號胜肽。因此，單胞藻屬之GSH1基因之轉譯產物，即單胞藻屬之GSH1，通常存在於葉綠體。
即，於本發明，就於藻類中導入的核苷酸而言，較佳可舉例下述(a)~(d)之多核苷酸：
(a)　編碼由序列識別號1所示之胺基酸序列所構成的多胜肽的多核苷酸；
(b)　編碼於序列識別號1所示之胺基酸序列中1或數個胺基酸經刪除、取代或添加的胺基酸序列所構成，且具有γ-麩胺醯基半胱胺酸合成酵素活性的多胜肽的多核苷酸；
(c)　由序列識別號2所示之鹼基序列所構成的多核苷酸；
(d)　於與上述(a)~(c)之多核苷酸中任一者之多核苷酸互補的鹼基序列所構成的多核苷酸於嚴格條件下雜交，且編碼具有γ-麩胺醯基半胱胺酸合成酵素活性的多胜肽的多核苷酸。
又，序列識別號2係顯示編碼由序列識別號1所示之胺基酸序列所構成的多胜肽的鹼基序列之一例。
其中，上述「1或數個胺基酸經刪除、取代或添加」係指藉由部位特異的突然變異誘發法等之習知變異胜肽製作法，可刪除、取代或添加的程度的數目(較佳為10個以下，更佳為7個以下，再更佳為5個以下)之胺基酸經刪除、取代或添加。如此變異蛋白質可並未限定於具有藉由習知變異多胜肽製作法而人為地導入變異的蛋白質，亦可為單離純化天然存在的蛋白質。
蛋白質胺基酸序列中之幾個胺基酸於對此蛋白質的構造或機能不會有重大影響下可容易地被改變係本項技術領域所周知。再者，不僅使人為地改變，於天然蛋白質中存在著該蛋白質之構造或機能無重大變化的變異體亦為周知。
較佳變異體係具有保存性或非保存性胺基酸取代、刪除、或添加。較佳為沉默的取代(silent substitution)、添加、及刪除，特佳為保存性取代。此等並未使本發明有關的多胜肽活性變化。
可見之代表性保存性取代為脂肪族胺基酸Ala、Val、Leu、及Ile中之1個胺基酸取代為其他胺基酸，羥基殘基Ser及Thr之交換、酸性殘基Asp及Glu之交換、醯胺殘基Asn及Gln之間之取代、鹼基性殘基Lys及Arg之交換、及芳香族殘基Phe、Tyr之間的取代。
於本說明書，上述「嚴格條件」係指於序列間僅存在至少有90%之同源性，較佳至少95%之同源性，最佳至少97%之同源性時發生雜交。具體而言，例如，可舉例於雜交溶液(含50%甲醯胺、5×SSC(150mM之NaCl、15mM之檸檬酸三鈉)、50mM之磷酸鈉(pH7.6)、5×Denhardt's solution、10%硫酸葡聚糖、及20μg/ml之變性剪斷鮭魚精子DNA)中，於42℃培育一晚後，於約65℃，0.1×SSC中，將過濾器洗淨的條件。
雜交可以如Sambrook等人，Molecular Cloning,A Laboratory Manual,3rd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory(2001)記載的方法等之周知方法來進行。通常，溫度越高，鹽濃度越低則嚴格度變高(變的難以雜交)，可取得更高相同性的多核苷酸。
胺基酸序列或鹼基序列之同源性可使用Karlin及Altschul之規則系統BLAST(Karlin S,Altschul SF,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,87: 2264-2268(1990);Karlin S,Altschul SF,Proc. Natl. Acad Sci. USA,90: 5873-5877(1993))來決定。基於BLAST之規則系統之稱為BLASTN或BLASTX的程式已被開發(Altschul SF,et al.,J. Mol. Biol.,215: 403(1990))。
於本發明，上述「γ-麩胺醯基半胱胺酸合成酵素活性」係意指麩胺酸於γ位與半胱胺酸作醯胺鍵結的反應的觸媒的活性。「γ-麩胺醯基半胱胺酸合成酵素活性」係例如，一邊將溶液作氮取代等而執行氧化防止處理，一邊將破碎的藻類離心分離所獲得的上清液作為試料，將試料添加於含有半胱胺酸及麩胺酸、ATP的反應液後，於一定時間可求得合成的γ-麩胺醯基半胱胺酸量。此外，伴隨此反應，亦可定量求得生成的磷酸量。
就單胞藻屬以外之來自植物的GSH1基因而言，例如，已知擬南芥(Arabidopsis thaliana)(TAIR Accession Gene:2127172、Name AT4G23100.1)、百日草(Zinnia elegans Zinnia)(Genbank accession: AB158510)、米(Genbank accession: AJ508915)、煙草(Genbank accession: DQ444219)等之GSH1基因，此等亦可較佳地使用於本發明。此等基因之轉譯產物亦與單胞藻屬同樣地於N末端區域具有葉綠體移行訊號胜肽。
又，藉由將上述(B)之多核苷酸導入藻類細胞內，可使葉綠體內麩胱甘肽濃度降低的蛋白質之表現量減少，就其結果而言，可使葉綠體內之麩胱甘肽濃度增加。作為如此多核苷酸，例如，可舉例向來習知的RNA干涉(RNA interference；RNAi)法所使用的2股RNA(dsRNA)、siRNA(short interfering RNA)、此等之RNA之模板DNA等。
就上述「使藻類葉綠體內之麩胱甘肽濃度降低的蛋白質」而言，例如，可較佳例示CLT1等。上述「CLT1」係將麩胱甘肽由葉綠體輸送至細胞質的轉運蛋白(transporter)，最初於擬南芥中發現，命名為CLT1(參照Proc Natl Acad Sci USA(2010) vol. 107(5) 2331-2336)。即，就上述(B)之例示而言，可舉例意圖使CTL1等之麩胱甘肽轉運蛋白之表現量減少的多核苷酸。
本發明藻類之製造方法中所使用的「多核苷酸」可為來自基因體DNA，亦可為來自cDNA、化學合成的DNA。又，RNA亦可。可因應目的作適宜選擇。
就取得本發明之藻類之製造方法中所使用的多核苷酸的方法而言，例如，可舉例於取得GSH1基因的情形，經由習知技術，將編碼GSH1的DNA片段加以單離、選殖的方法。調製與編碼單胞藻屬之GSH1的DNA之鹼基序列之一部分特異性雜交的探針，而將基因體DNA庫或cDNA庫加以篩選者為宜。
或者，就取得於本發明藻類之製造方法所使用的多核苷酸的方法而言，可舉例使用PCR等增幅手段的方法。例如，取得GSH1基因的情形，編碼單胞藻屬之GSH1的cDNA中，5’端及3’端之序列(或其互相序列)中各自調製引子，使用此等引子而將基因體DNA(或cDNA)作為模板來進行PCR等，增幅兩引子間包夾的DNA領域，可大量地取得本發明所使用的編碼GSH1的DNA片段(GSH1基因)。GSH2基因或ATP硫酸化酶基因、腺苷5’-磷硫酸還原酵素基因、亞硫酸還原酵素基因、半胱胺酸合成酵素基因、絲胺酸乙醯基轉移酵素基因及CLT1基因亦可以同樣手法取得。
本發明藻類之製造方法所使用的多核苷酸可將所欲藻類作為供給源而取得。
於本發明藻類之製造方法，就將多核苷酸導入藻類的方法而言，並未特別限定。例如，藉由將具備該多核苷酸的表現載體導入，可將該多核苷酸導入藻類細胞內。又，就表現載體之構築方法而言，使用向來習知的方法為宜，並未特別限定。例如，可依據日本國公開專利公報「特開2007-43926號公報」及日本國公開專利公報「特開平10-0570868號公報」所揭示的表現載體之構築方法及藻類之轉形方法，構築於導入對象多核苷酸的上游處連結藻類細胞中有機能的啟動子，於下游處連結於藻類細胞中有機能的終止子的重組表現載體，而導入至藻類。
就上述「啟動子」而言，例如，可適合使用PsaD啟動子。PsaD啟動子係較GSH1基因之內因性啟動子之啟動子活性更強。因此，藉由使用PsaD啟動子，可使γ-麩胺醯基半胱胺酸合成酵素更多地表現。又，PsaD基因係與光合成有關的基因，若使用PsaD啟動子，所獲得的表現載體於導入藻類細胞內時，藉由照射光的強度可調節導入對象基因之表現量。
(2.其他步驟)
本發明藻類之製造方法除了上述「麩胱甘肽濃度增加步驟」之外，亦可包含篩選葉綠體內之麩胱甘肽濃度增加的藻類之篩選步驟。
例如，導入目的基因的轉形藻類係首先以卡那黴素(kanamycin)耐性或潮黴素(hygromycin)耐性等耐藥劑性標記的表現作為指標，使用向來習知的藥劑選擇法加以選擇。之後，藉由PCR法、南方氏雜合反應法、北方氏雜合反應法等，可確認是否目的基因被導入藻類中。例如，自轉形藻類調製DNA，對於導入的DNA設計特異的引子來進行PCR。之後，於增幅產物進行洋菜膠電泳、聚丙烯醯胺膠體電泳或微細管電泳等，藉由溴化乙啡啶(ethidium bromide)等染色，並檢測目的增幅產物，可確認轉形物。
葉綠體內麩胱甘肽濃度增加的個體之篩選，係使用上述的葉綠體內麩胱甘肽濃度之測定方法等為宜。
又，就葉綠體內之麩胱甘肽濃度增加的結果而言，光合成產物之生產性會提升，故葉綠體內麩胱甘肽濃度增加的藻類，係光合成產物之生產性提升的藻類可容易地理解。於經篩選的個體中光合成產物之生產性是否提升，可藉由上述的光合成產物之生產性之測定方法來確認。
[3.本發明有關的生質能之製造方法]
本發明有關的生質能之製造方法(以下，稱為「本發明之生質能之製造方法」)係使用與上述野生型藻類比較下，葉綠體內之麩胱甘肽濃度會增加的藻類(本發明之藻類)或藉由本發明之藻類之製造方法所製造的藻類而製造生質能的方法。
關於本發明之藻類，於「1.本發明有關的藻類」之項次中作說明，又，關於本發明藻類之製造方法，於「2.本發明有關的藻類之製造方法」之項次中說明，故此省略。
又，於本說明書，上述「質能」係指藻類藉由光合成而碳固定所產生的物質，例如，意指糖類(例如，澱粉)、油脂等，亦可改稱為「光合成產物」。
本發明生質能之製造方法係於藻類細胞內誘導光合成產物之生產或蓄積的方法，並未特別限制。例如，本發明生質能之製造方法為了誘導於藻類細胞內的光合成產物之生產或蓄積，亦可包含對上述藻類照射光之光照射步驟。
習知的方法為了誘導於藻類細胞內蓄積光合成產物，有必要於缺氮條件下，且為了促進光合成產物之顯著蓄積，有必要照射200μE/m2/秒以上之光量之光。然而，本發明生質能之製造方法，即使未特別調節光量亦可誘導光合成產物之蓄積，但較佳為對藻類照射1000μE/m2/秒以下，更佳為照射500μE/m2/秒以下，又更佳為照射400μE/m2/秒以下、300μE/m2/秒以下、200μE/m2/秒以下、150μE/m2/秒以下、100μE/m2/秒以下、80μE/m2/秒以下之光量。照射的光量越小，則能量效率越高，生產性會提升。本發明有關的藻類與過去的野生型之藻類相比下，即使光量少，於對於細胞內及細胞外可使光合成產物產生的點為優異。又，照射光量的下限並未特別限制，例如，現實上可設定40μE/m2/秒以上。
就用以照射上述範圍的光之光照射裝置而言，並不需要特別的光照射裝置。例如，太陽光；以鏡、光纖、過濾器、網孔等將太陽光於質及量地加以調節的光；可使用白熱燈、螢光燈、水銀燈、發光二極體等之人工光。又，照射的光可使用適合一般的藻類光合成的波長範圍的光，例如，400nm~700nm為較佳。
又，本發明生質能之製造方法中，為了誘導藻類細胞內光合成產物之生產或蓄積，不須於缺氮條件下培養藻類。因此，上述光照射步驟亦可於非缺氮的條件中進行。其中，上述「非缺氮的條件」係指於含有藻類用以生長之必要量之無機氮的培養液中培養。其中，藻類用以生長之必要量係指培養液中含有的無機氮以氮原子換算計為0.001~0.1重量%，較佳為0.005~0.05重量%。又，上述「無機氮」係指例如，氨氮、亞硝酸氮、硝酸氮等之氮。又，後述實施例中使用的TAP培養基中，培養液中所含有的無機氮以氮原子換算計為約0.01重量%。
就含有藻類用以生長之必要量之無機氮的培養液而言，使用用以培養藻類所通常使用的培養液為宜，並未特別限制。就此等培養液而言，例如，可舉例向來習知之TAP培養基、HSM培養基、ATCC897培養基等。
於一實施形態，經由將本發明之藻類於TAP培養基中一邊照射45μE/m2/秒之光一邊培養，可誘導澱粉於細胞內蓄積。於其他實施形態，經由將本發明之藻類於TAP培養基中一邊照射80μE/m2/秒之光一邊培養，可誘導澱粉蓄積於細胞內。
上述光照射步驟亦可於缺氮條件下進行。上述「缺氮條件」係指無機氮之含有量以氮原子換算計為較0.001重量%少的培養液中培養。雖未特別限制，但光照射步驟於缺氮條件下進行的情形，就不含有氮的培養液而言，例如，可適合地使用TAP N-free培養基。於一實施形態，本發明之藻類於缺氮條件下(TAP N-free培養基中)，經由一邊照射80μE/m2/秒之光一邊培養，可誘導澱粉蓄積於細胞內。
如上述，就本發明有關的藻類之特徴點而言，可舉例使光合成產物產生之際，缺氮狀態等之營養限制步驟並非必要的特徴點。即，本發明之生質能之製造方法係實質上並未實施缺氮狀態等之營養限制步驟(實質上並未包含缺氮狀態等之營養限制步驟)之態樣為可能的。藉由該特徴，可簡化步驟，並提升光合成產物之生產性。
又，光照射步驟亦可於獨立營養條件下進行。其中，上述「獨立營養條件」係所謂除了二氧化碳以外並未供給碳源下培養的條件。具體而言，例如，藉由將本發明之藻類於HSM培養液中，經一邊送入大氣一邊光照射的方法來培養，可於獨立營養條件下進行光照射步驟。又，就二氧化碳之供給源而言，並未限定於大氣，亦可能活用火力發電廠或製鐵廠等之煙道中所含的二氧化碳，而以較大氣更高濃度下將二氧化碳送入培養基，而提高生產性。
獨立營養條件下係由培養容器底部附近，將二氧化碳或含有二氧化碳的氣體送入(通氣)。二氧化碳於水中的擴散速度與大氣中相比下為極度地慢。因此，有必要攪拌培養基。藉由攪拌培養基，亦可對藻類均勻地照射光。因二氧化碳於水中成為陰離子，培養基之緩衝能力差時，經通氣而培養基傾向至酸性側，二氧化碳之溶解度會降低，而於光合成被利用變困難。因此，培養基保持於pH為中性附近或於鹼性側之具有緩衝能力者為較佳。就該培養基而言，較佳可舉例向來習知的HSM培養基等。
(2.其他步驟)
本發明之生質能之製造方法除了上述「光照射步驟」之外，亦可進一步包含回收光合成產物之步驟。
例如，光合成產物為澱粉的情形，若依據本發明生質能之製造方法，可將細胞內蓄積的澱粉呈澱粉粒被排出細胞外，故於回收光合成產物的步驟，將被排出細胞外的澱粉粒與藻類分離，回收經分離的澱粉粒為宜。分離被排出細胞外的澱粉粒及藻類的方法並未特別限制。例如，藉由經靜置的自然沉降、離心分離、過篩等，可進行基於澱粉粒及藻類之細胞之粒子徑及/或形狀等物理性質的分離手段。
又，本發明之生質能之製造方法係使用與藻類接觸下可使藻類吸收的物質，亦可使用使葉綠體內之麩胱甘肽濃度增加的藻類來進行。即，於使藻類葉綠體內之麩胱甘肽濃度增加的物質存在下，培養藻類的步驟的生質能之製造方法亦包含於本發明。
使藻類葉綠體內之麩胱甘肽濃度增加的物質，就與藻類接觸下可使藻類吸收的物質之具體例而言，例如，可舉例麩胱甘肽、麩胱甘肽抱合體、活性氧(例如過氧化氫等)、活性氮、多胺、氧化鈦、茉莉酸(jasmonic acid)、水楊酸、半胱胺酸、胱胺酸、重金屬鎘、鐵離子。又，多胺係作為過氧化氫之原料。氧化鈦係藉由光而生成活性氧。半胱胺酸、胱胺酸為麩胱甘肽之前驅體。關於重金屬鎘、鐵離子，過量投與者為較佳。尤其，考慮成本時，過氧化氫為較佳。
使藻類葉綠體內之麩胱甘肽濃度增加的物質，係與藻類接觸下可被藻類吸收的物質，例如，藻類光合成時所使用的培養液中，藉由含有該物質而使與藻類接觸下可被藻類吸收者。
本發明之生質能之製造方法因使用本發明藻類，或藉由本發明藻類之製造方法所製造的藻類來進行生質能之製造，如後述實施例所示，即使未於照射強光、作成缺氮狀態下培養藻類，亦可誘導藻類細胞內光合成產物之蓄積。又，藉由使葉綠體內之麩胱甘肽濃度增加，因可使藻類細胞內蓄積的光合成產物被排出細胞外，故光合成產物之回收為容易。即，依據本發明生質能之製造方法，與習知技術比較光合成產物蓄積之誘導及光合成產物之回收兩者，可容易、且效率佳地進行。因此，依據本發明之生質能之製造方法，可較過去更便宜地、效率佳地自藻類製造生質能。
本發明有關的藻類於葉綠體亦可增加選自γ-麩胺醯基半胱胺酸合成酵素、麩胱甘肽合成酵素、ATP硫酸化酶、腺苷5’-磷硫酸還原酵素、亞硫酸還原酵素、半胱胺酸合成酵素及絲胺酸乙醯基轉移酵素所組成之群中至少1種蛋白質之表現量及/或活性。
本發明有關的藻類亦可導入編碼選自上述γ-麩胺醯基半胱胺酸合成酵素、麩胱甘肽合成酵素、ATP硫酸化酶、腺苷5’-磷硫酸還原酵素、亞硫酸還原酵素、半胱胺酸合成酵素及絲胺酸乙醯基轉移酵素所組成之群中至少1種蛋白質的外因性多核苷酸。
本發明有關的藻類中，編碼上述γ-麩胺醯基半胱胺酸合成酵素的多核苷酸可選自以下之(a)~(d)所組成之群：
(a)編碼由序列識別號1所示之胺基酸序列所構成的多胜肽的多核苷酸；
(b)編碼由序列識別號1所示之胺基酸序列中1或數個胺基酸經刪除、取代或添加胺基酸序列所構成，且具有γ-麩胺醯基半胱胺酸合成酵素活性的多胜肽的多核苷酸；
(c)由序列識別號2所示之鹼基序列所構成之多核苷酸；
(d)與上述(a)~(c)之多核苷酸中任一者之多核苷酸互補的鹼基序列所構成的多核苷酸於嚴格條件下雜交、且編碼具有γ-麩胺醯基半胱胺酸合成酵素活性的多胜肽的多核苷酸。
本發明有關的藻類之製造方法中，上述麩胱甘肽濃度增加步驟亦可為於藻類導入編碼選自γ-麩胺醯基半胱胺酸合成酵素、麩胱甘肽合成酵素、ATP硫酸化酶、腺苷5’-磷硫酸還原酵素、亞硫酸還原酵素、半胱胺酸合成酵素及絲胺酸乙醯基轉移酵素所組成之群中至少1種蛋白質的外因性多核苷酸的步驟。
本發明有關的生質能之製造方法，亦可包含對上述藻類照射光的光照射步驟。
本發明有關的生質能之製造方法中，上述光照射步驟亦可於實質上非缺氮的條件中進行。
本發明並未限定於上述各實施形態，於申請專利範圍所示範圍內可有各種變更，適宜組合的相異實施形態中各別揭示的技術手段所獲得的實施形態亦包含於本發明之技術範圍。
[實施例]
以下，藉由實施例具體地說明本發明，但本發明並未被實施例限定。
[實施例1]
＜GSH1過度表現株之製作＞
製作將編碼來自單胞藻屬之γ-麩胺醯基半胱胺酸合成酵素(序列識別號1)的GSH1基因(序列識別號2)，與PsaD基因之啟動子(PsaD啟動子)的下游連結的質體。
具體而言，藉由將為單胞藻屬用載體的環狀DNA、pSP124S(參照Plant Journal(1998) Vol. 14(4): 441-447.)以限制酶EcoRI及EcoR5同時處理而開環，與序列識別號4之多核苷酸(約3.13仟個鹼基對)連結的同時使再度環狀化。此環狀DNA以習知方法，使用大腸菌而使增幅，由大腸菌提取‧純化。
序列識別號4所示的多核苷酸藉由以下方法製作。
(1)　將萊茵衣藻CC503株(分讓自美國杜克大學之單胞藻屬中心)於TAP培養基、24℃、50μE/m2/秒之條件下培養4日。自此培養物所收集的細胞作為材料，使用cDNA合成試藥套組(TakaraBio公司製，Solid phase cDNA synthesis kit)而調製cDNA之混合物。將此cDNA混合物作為模板，使用序列識別號5及6之寡核苷酸，藉由習知方法實施PCR反應(結合(annealing)溫度為58℃)，回收單胞藻屬GSH1基因與ORF接續且連續3‘UTR領域的呈約2.27仟個鹼基對之多核苷酸。再者，使用限制酶EcoR1將末端構造加工。
(2)　與上述(1)同樣地培養，將收集的CC503細胞作為材料，使用DNA提取試藥套組(日本基因公司製，Isoplant)而調製基因體DNA。將此基因體DNA作為模板，使用序列識別號7及8之寡核苷酸，藉由習知方法實施PCR反應(結合溫度為56℃)，回收呈約0.86仟個鹼基對之多核苷酸的單胞藻屬PsaD基因之啟動子領域。再者，使用限制酶Hpa1將末端構造加工。
(3)　將上述(1)及上述(2)所調製的2種類之多核苷酸片段，使用DNA連接酶(東洋紡績公司製，Ligation High)，藉由習知方法使連結。經以上實驗操作，一端為平滑末端(blunt end)，另一端為來自EcoR1的黏著性末端(sticky end)，PsaD啟動子-GSH1基因之多核苷酸片段可調整。序列識別號4所示之鹼基序列中，第853位~第855位為開始密碼子，第2294位~第2296位為終止密碼子。即，單胞藻屬GSH1基因係於序列識別號3所示之鹼基序列中，具有第853位~第2296位作為開放讀碼區(ORF)。
‧5’GCTCTCGCCTCAGGCGTT 3’(序列識別號5)
‧5’GGGGAATTCCTGAGCGAGGGCCTTACAAG 3’(序列識別號6)
‧5’ATCAGCACACACAGCAGGCTCAC 3’(序列識別號7)
‧5’TGTTAACCATTTTGGCTTGTTGTGAGTAGC 3'(序列識別號8)
將上述說明製作之含有PsaD啟動子-GSH1之多核苷酸的質體，藉由限制酶EcoR1加以線狀化，經由電穿孔(electroporation)法(參照Funct. Plant Biol.(2002)vol. 29: 231-241)，導入萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)CC503株(以下，稱為「單胞藻屬」)。該多核苷酸被插入基因體DNA，伴隨細胞複製而子世代會安定地繼受的轉形株(以下，稱為「GSH1過度表現株」)以CC503株獲得博來黴素(bleomycin)耐性者作為指標來選擇。對含該多核苷酸的質體DNA之基因體DNA之插入藉由PCR法來確認。
又，PsaD基因係與光合成有關的基因。因此，藉由變換照射的光強度，可調節PsaD啟動子之活性，調節GSH1基因之表現量。即，對GSH1過度表現株照射強光時，GSH1過度表現株中的外因性GSH1之表現量變多，照射弱光時，GSH1過度表現株中的外因性GSH1之表現量變少。
[實施例2]
將實施例1所製作的GSH1過度表現株，使用參-乙酸-磷酸(TAP)培養基、pH7(參照Proc. Natl. Acad. Sci. USA,54,1665-1669.)，於半從屬營養條件下培養，評價增殖能及澱粉產生能力。就對照組而言，使用野生型單胞藻屬株CC503株(以下，稱為「親株(野生型株)」)。各別試料之培養條件示於表1及表2。
於試料2及試料6，TAP培養基中添加的丁硫胺酸-亞碸亞胺(L-Buthionine-sulfoximine)(縮寫為BSO(型號B2515，Sigma-Aldrich公司製)係GSH合成酵素之抑制劑。
結果示於第1圖及第2圖。第1圖之(a)係表示GSH1過度表現株之增殖能力的圖，(b)係表示培養開始309小時後之培養液狀態的圖。第2圖之(a)係表示親株(野生型株)之增殖能例的圖，(b)係表示培養開始215小時後之培養液之狀態的圖。第1圖之(a)及第2圖之(a)之圖的縱軸表示光學密度(OD)，橫軸表示培養時間。縱軸所示的光學密度係藉由基於紅外線(950nm)之透過光量來測量OD值的裝置(TAITEC公司製、ODSensor-S/ODBo x-A)來測定。又，圖中記載的箭號係表示進行流動細胞儀(flow cytometry)(FCM)的時機。
如第1圖之(a)所示，試料1~4之細胞全部於半從屬營養條件下具有增殖能力。由於各別試料之增殖能力並無太大不同，確認外因性GSH1基因之表現對單胞藻屬之增殖並無影響。又，如第1圖之(b)所示，試料1或試料4被認為認培養液之白濁。
又，本實施例中所謂的「半從屬營養」係指培養基中以乙酸作為主要碳源來培養，但因照射光且未密封培養燒瓶，與乙酸相比下，對成長的貢獻度少，而大氣中之二氧化碳亦作為碳源來利用的狀態。
將被認為培養液白濁的試料4之培養液回收於微量管中，對於藉由離心分離所獲得的白色沉澱物進行碘澱粉反應。將此結果示於第1圖之(c)。如第1圖之(c)所示，自試料4回收的白色粒子因經由碘澱粉反應而著色為藍紫色，遂而明白澱粉會凝集。因此，被認為培養液白濁的試料1或試料4中，可知澱粉會產生。又，GSH1過度表現細胞內所產生的澱粉被認為呈澱粉粒被排出至細胞外。
另一方面，試料2或試料3不被認為培養液有白濁的現象。添加為GSH合成酵素之抑制劑的BSO的試料2中，由於BSO而試料2之GSH1過度表現株中的GSH之合成被抑制，故認為澱粉不會被排出至細胞外。又，照射較試料1或試料4更弱的光的試料3中，GSH1過度表現株中的外因性GSH1之表現量較試料1或試料4更少，於培養液被認為白濁的程度上，認為澱粉未被排出至細胞外。
相對於此，如第2圖之(a)所示，試料5~8之細胞全部於半從屬營養條件下具有增殖能力，但如第2圖之(b)所示，試料5~8中不認為培養液有白濁。即，親株(野生型株)係於TAP培養基，照射80μE/m2/秒以下之光量的光的培養條件下，澱粉粒未被排出至細胞外。
再者，為了進一步解析試料4之GSH1過度表現株及試料8之親株(野生型株)之狀態，進行流動細胞儀計數。具體而言，對各別細胞照射488nm之激發光，並於600nm附近測量螢光強度。該600nm附近之螢光相當於葉綠素(chlorophyll)之螢光。與葉綠素之螢光同時，使與作為用以測量細胞密度的內部標準Beckman Coulter製之螢光性微粒子(商品名：Flow count)共存，測量由488nm之激發光所發出的525nm~700nm之螢光。又，藉由測量前方散射光及側方散射光，測量細胞(粒子)之大小及細胞(粒子)內部之複雜度。
結果示於第3圖及第4圖。第3圖之(a)係表示試料8之親株(野生型株)中顯示葉綠素之螢光的細胞(粒子)之直方圖，(b)係表示試料8之親株(野生型株)之培養物中浮游粒子的大小及粒子內部之複雜度之相關圖。又，第4圖之(a)係表示試料4之GSH1過度表現株中顯示葉綠素之螢光的細胞(粒子)之直方圖，(b)係表示試料4之GSH1過度表現株之培養物中浮游粒子之大小與粒子內部之複雜度之相關圖。又，第3圖之(a)及第4圖之(a)之圖中記載的箭號係表示內部標準之高峰。又，第3圖之(b)及第4圖之(b)之圖中記載的四角框表示活細胞存在的劃分。
如第3圖之(a)及(b)所示，確認試料8之親株(野生型株)大部分細胞為具有葉綠體(葉綠素)之活細胞。
相對於此，如第4圖之(a)所示，試料4之GSH1過度表現株幾乎未檢測出葉綠素之螢光。而且，如第4圖之(b)所示，試料4之GSH1過度表現株僅有一些活細胞存在。於第4圖之(b)，四角框外存在的粒子被認為係被排出細胞外的澱粉粒。即，認為GSH1過度表現株中，細胞內產生的澱粉伴隨著細胞死亡，呈澱粉粒被排出至細胞外。
第3圖之(a)之圖及第4圖之(a)之圖中經「激發光(488nm)照射而發出來自葉綠素之螢光的粒子之密度」示於表3，經「激發光(488nm)照射而未發出來自葉綠素之螢光的粒子之密度」示於表4。又，表3及表4所示細胞(粒子)之個數係將內部標準之值作為基準而算出，以將培養液1mL所含粒子數除以10的3次方的數值表示。
[實施例3]
將實施例1所製作的GSH1過度表現株於缺氮條件下培養，評價增殖能力及澱粉粒之產生能力。具體而言，將GSH1過度表現株，使用與實施例2相同之TAP培養基，於光量17μE/m2/秒之連續光、24℃下8日，於旋轉台上振盪培養。之後，為了交換培養液而藉由離心分離(2000g、5分鐘)將細胞呈沉降物回收，將回收的細胞分成2等分，一方之細胞使用不含氮源的TAP N-free培養基(參照Gorman及Levine(Proc. Natl. Acad. Sci. USA,54,1665-1669.)發明之TAP培養基之組成中，氯化銨以同量之氯化鉀取代的培養基)作再懸浮，另一方之細胞使用含銨的通常TAP培養基作再懸濁。再懸濁時之細胞密度調整為使用TAP培養基的前培養終了時之細胞密度之約1.1倍。即，將前培養90mL所含的細胞以100mL之新培養基再懸濁。以光量80μE/m2/秒，於旋轉台上振盪培養，每一日分取培養物之一部分，評價增殖能力及澱粉產生能力。使用親株(野生型株、CC503株)作為對照組。各別試料之培養條件示於表5及6。
結果示於第5圖及第6圖。第5圖係表示試料9及試料10中「顯示葉綠素之螢光的細胞(粒子)之密度」及「未顯示葉綠素之螢光的細胞(粒子)之密度」之經時變化圖。第6圖係表示試料11及試料12中「顯示葉綠素之螢光的細胞(粒子)之密度」及「未顯示葉綠素之螢光的細胞(粒子)之密度」之經時變化圖。第5圖及第6圖之圖中，縱軸表示細胞(粒子)之密度，橫軸表示培養時間。培養時間表示交換培養液時為0小時。又，於第5圖及第6圖，上述「未顯示葉綠素之螢光的細胞(粒子)之密度」相當於「澱粉粒之密度」。又，於第5圖及第6圖，(b)及(c)之實例中「TAP normal」、「TAP N-free」各別意指「含氮源之TAP培養基」、「不含氮源之TAP培養基」。
如第5圖之(a)所示，於GSH1過度表現株，含有氮源的培養液中，具有葉綠體的細胞之密度於培養後開始後一旦增加，之後有減少的傾向。另一方面，於不含有氮源的培養液中，具有葉綠體的細胞幾乎未增殖。又，與培養液中之氮源之有無無關，澱粉粒之密度會經時地增加。再者，由於培養液中之細胞(具有葉綠體的細胞)之密度減少，澱粉粒之密度有增加的傾向。
相對於此，如第6圖之(a)所示，於親株(野生型株)，含有氮源的培養液中，細胞會增殖，但於不含有氮源的培養液中，細胞會緩慢地增殖。又，於親株(野生型株)，與培養液中之氮源之有無無關，澱粉粒之密度並未增加。於親株(野生型株)，已被報告缺氮條件下會發生澱粉蓄積。然而，通常，於培養單胞藻屬的條件之光強度(80μE/m2/秒)，即使於缺氮條件下，澱粉粒並不會被排出至細胞外。結果雖未顯示，但照射250μE/m2/秒之光的情形亦同樣地，親株(野生型株)中澱粉粒並未被排出至細胞外。
由試料9、10、11及12之培養液，以1日或2日之間隔，取出一部分定量樣品所含的澱粉。定量係使用Glucose Test Wako(和光純藥工業公司製)。其結果示於第5圖之(b)、(c)及第6圖之(b)、(c)。
如第5圖之(b)及第6圖之(b)所示，於缺氮條件之情形(TAP N-free培養基)，GSH1過度表現株及親株(野生型株)任一者於培養液中之澱粉濃度皆提高。另一方面，未於缺氮條件的情形(TAP培養基(含有N))，親株(野生型株)幾乎於培養基中澱粉濃度未提升，但於GSH1過度表現株，與缺氮條件之情形同樣地澱粉濃度是提升的。
又，於第5圖之(c)及第6圖之(c)，培養液中之澱粉量顯示以每100萬個具有葉綠體的細胞的數值所表現的結果。如相同圖所示，於GSH1過度表現株之細胞之生產性與親株(野生型株)相比，可知與缺氮條件之有無無關，而顯著提升。此係關於澱粉之蓄積，意指相對於為原料一部份的培養基成分的產率，GSH1過度表現株較親株(野生型株)優異。又，由細胞構成成分而成的廢棄物之表現量，亦意指GSH1過度表現株與親株(野生型株)相比為低，再者，關於澱粉之純化，亦意指GSH1過度表現株與親株(野生型株)相比為容易。又，使細胞由增殖階階移行至生產階段的情形，實際上因提高細胞密度亦為簡便，故每單位細胞的生產性提升，具有非常的優位性。
又，將與第5圖及第6圖所示的實驗相同的實驗獨立而重複進行的結果示於第19圖及第20圖。第19圖係表示與第5圖同樣地於試料9及試料10中「顯示葉綠素之螢光的細胞(粒子)之密度」及「未顯示葉綠素之螢光的細胞(粒子)之密度」之經時變化圖。第20圖係與第6圖同樣地，表示試料11及試料12中「顯示葉綠素之螢光的細胞(粒子)之密度」及「未顯示葉綠素之螢光的細胞(粒子)之密度」之經時變化圖。如第19圖及第20圖所示，重複進行與第5圖及第6圖所示實驗相同的實驗的情形，所獲得的結果顯示與第5圖及圖6所示結果相同的傾向，因此確認數據的再現性高。
[實施例4]
將實施例1所製作的GSH1過度表現株於獨立營養條件下培養，評價增殖能力及澱粉粒之產生能力。具體而言，將GSH1過度表現株，以TAP培養基作前培養後，接著移植至HSM培養基(參照Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1960) 46,83-91.)，藉由培養容器底附近插入的玻璃管一邊將無菌空氣送入，一邊照射光。培養液之攪拌係使用磁性攪拌器(Magnetic stirrer)。詳細的培養條件如表7。作為對照組，於相同條件，培養親株(野生型株)，並評價增殖能力及澱粉粒之產生能力。
為了將伴隨通氣而經由蒸散減少的培養基量大致維持於300mL，適時地補充滅菌水。
結果示於第7圖。第7圖之(a)係表示GSH1過度表現株及親株(野生型株)中「顯示葉綠體之螢光的細胞(粒子)之密度」及「未顯示葉綠體之螢光的細胞(粒子)之密度」之經時變化圖，(b)係表示每單位培養液之澱粉量之經時變化圖。於第7圖之(a)之圖，縱軸表示細胞(粒子)之密度，橫軸表示培養時間。培養時間係以獨立營養條件下開始培養時作為0小時間來表示。又，於第7圖之(a)圖，上述「未顯示葉綠體之螢光的細胞(粒子)之密度」相當於「澱粉粒之密度」。
如第7圖之(a)所示，於GSH1過度表現株，與親株(野生型株)比較時，儘管增加速度慢，但細胞密度仍會經時地增加。又，伴隨細胞密度之增加，澱粉粒之密度有經時地、直線性地增加的傾向。相對於此，於野生型株，細胞密度雖增加，但澱粉粒幾乎未被排出至細胞外。
再者，於獨立營養條件下培養後第10日之GSH1過度表現株及親株(野生型株)，進行碘澱粉反應。具體而言，自GSH1過度表現株之培養液1mL，細胞(粒子)藉由離心分離而回收。於親株(野生型株)亦同樣地自培養液回收細胞(粒子)。經回收的細胞(粒子)使用丙酮處理，自細胞除去葉綠素，之後，進行碘澱粉反應。自細胞除去葉綠素係為了容易看見碘澱粉反應之結果。
結果示於第8圖。第8圖係表示GSH1過度表現株及親株(野生型株)中碘澱粉反應之結果的圖。如第8圖所示，於GSH1過度表現株，藉由碘澱粉反應而白色粒子會著色為濃的藍紫色，故確認澱粉粒被排出至細胞外。又，於親株(野生型株)，雖著色弱，但認為有若干之碘澱粉反應。由此結果暗示，於獨立營養條件下，即使未於缺氮條件下，親株(野生型株)亦會產生某程度的澱粉。
於第7圖之(a)所示之獨立營養條件下之培養，使用每一日經時地採取的培養液樣本1mL，進行澱粉之定量。定量係使用Glucose Test Wako(和光純藥工業公司製)。
結果示於第7圖之(b)。於GSH1過度表現株，與親株(野生型株)比較時，澱粉之生產開始較早。又，於GSH1過度表現株，與經過相同培養時的親株(野生型株)作比較時，澱粉之生產量較多。例如，培養第10日之培養液中之澱粉濃度係培養液每1L，GSH1過度表現株為416.8mg，親株(野生型株)為196.4mg。因此，每單位培養液之生產性係GSH1過度表現株高親株(野生型株)之2倍以上。此意指關於澱粉之蓄積，相對於原料之一部份的培養基成分的產率，係GSH1過度表現株較親株(野生型株)為優異。又，由細胞構成成分而成的廢棄物之發生量亦意指GSH1過度表現株與親株(野生型株)相比為低，除此之外，亦表示關於澱粉之純化，GSH1過度表現株與親株(野生型株)相比為容易。再者，第7圖之(a)及(b)所示的實施例之結果暗示了相對於澱粉生產量，細胞增殖量被抑制，GSH1過度表現株與親株(野生型株)作比較，為可更有效利用培養基成分的株，就經由光合成而連續地進行澱粉生產時之細胞株而為為較佳。
[實施例5]
於100ml之TAP培養基中接種實施例1所製作的GSH1過度表現株，於80μE/m2/秒之連續光下培養。基於紅外線(950nm)之透過光量，連續監測OD值，於對數增殖期或穩定期採取培養液5mL，將採取的培養液移植到100mL之TAP培養基(繼代)，同樣地繼續培養。
第9圖係表示調查GSH1過度表現株之增殖能力的結果的圖。第9圖中所示箭號係其始點表示採取培養液的時點。又，第9圖中，「初代」意指初代培養，「繼代1」意指第1次繼代培養，「繼代2」意指第2次繼代培養，「繼代3」意指第3次繼代培養，「繼代4」意指第4次繼代培養。
如第9圖所示，GSH1過度表現株不僅於對數增殖期，而且即使進入穩定期後經過約150小時的培養，確認可作為種培養(Seed culture)而新增殖。又，初代培養(初代)之指數函數的成長區間之近似線係以y=0.0067 x -0.4287表示，R2=0.9959。又，繼代第1次(繼代1)之指數函數的成長區間之近似線係以y=0.0085 x -1.774表示，R2=0.9952。
惟，將進入穩定期後經過約150小時的培養作為種(Seed)的情形，與進入穩定期立即之培養作為種的情形作比較，增殖之開始上升延遲約18小時。由此結果發現，GSH1過度表現株於對數增殖期結束的時點，全部的細胞並未被交付細胞死亡的運命，故對數增殖期結束的集團中含有具增殖能力的細胞。即，發現了GSH1過度表現株係有可能以對數增殖期及穩定期之細胞作為種而重複地批次培養。
進一步詳細解析各增殖期中的GSH1過度表現株之特徴的結果示於第10圖。第10圖係表示調查各繼代時點之GSH1過度表現株的狀態的結果，(a)係表示進行第9圖所示「繼代1」時之GSH1過度表現株之細胞大小及細胞內部之複雜度之相關圖，(b)係表示進行第9圖所示「繼代2」時之GSH1過度表現株之細胞大小及細胞內部之複雜度之相關圖，(c)係表示進行第9圖所示「繼代3」時之GSH1過度表現株之細胞大小及細胞內部之複雜度之相關圖。
如第10圖所示，確認GSH1過度表現株於任一培養時期(對數增殖期及穩定期)皆放出澱粉粒。又，於第10圖之(a)~(c)之前方散射及側方散射之相關圖，左下角可辨認的粒子集團相當於澱粉粒。由第10圖之(a)~(c)，確認豐富地含有澱粉粒。由以上結果可知，於對數增殖期之培養物亦自GSH1過度表現株放出澱粉粒。
[實施例6]
於實施例1製作的GSH1過度表現株，觀察被放出細胞外的澱粉粒之形狀。具體而言，將被放出至細胞外的澱粉粒懸浮於1mL之0.01% Tween20(註冊商標，Sigma公司製，型號P1379)，再添加9mL之Percoll(註冊商標，Sigma公司製，型號P1644)而使分散，離心分離(9,100×g、30分鐘)並純化，將獲得的澱粉粒使用掃描型電子顯微鏡加以觀察。
第11圖係表示觀察自GSH1過度表現株被放出至細胞外的澱粉粒之形狀的結果的圖。第11圖之(a)係表示澱粉粒使用掃描型電子顯微鏡觀察的結果的圖。如第11圖之(a)所示，確認由GSH1過度表現株所生成的澱粉粒，其平均粒徑係長徑為1.3μm(標準偏差0.181)，短徑為1.0μm(標準偏差0.204)之微小且大小均一的粒子。由玉米、馬鈴薯、小麥等所生產的一般澱粉粒係平均粒徑為10~50μm，故可知由GSH1過度表現株所生成的澱粉粒係如何的微小。
如此，由GSH1過度表現株所生成的澱粉粒，與由玉米、馬鈴薯、小麥等製作的一般澱粉粒相比為微小的。該微小的澱粉粒有用於醫藥品之製造。
又，GSH1過度表現株中的澱粉粒放出係伴隨細胞破裂的放出。細胞破裂前後，會發生自體溶解(autolysis)，澱粉粒自體並未受到擔任自體溶解的酵素的分解。因此，GSH1過度表現株會獲得不純物少的澱粉粒。
具體而言，細胞並未自體溶解的情形，為了取出細胞內蓄積的澱粉粒，有必要藉由磨碎等化學、物理的手段而將細胞破壞的步驟，又破壞的細胞破片成為殘渣而混入澱粉粒。另一方面，細胞會自體溶解的情形，經酵素反應，高分子之蛋白質、碳水化物、膜系等會被分解為較低分子之物質，故細胞之破片的發生會變少。再者，所謂細胞不會殘留係指每單位原料(培養基成分)之澱粉粒之生產效率高，可謂產率佳。又，藉由自體溶解所生成的低分子物質被認為可利用於藻類之增殖，經由如此物質之再利用，認為可期待節省藻類增殖所必要的培養基。細胞之自體溶解於野生型株並未發生，僅發生於GSH1過度表現株。
又，第11圖之(b)係表示自GSH1過度表現株放出的澱粉粒中的碘澱粉反應之結果的圖，如第11圖之(b)所示，確認自GSH1過度表現株放出的澱粉粒與作為對照使用的玉米澱粉同樣地經由碘澱粉反應而著色為藍紫色。
又，第11圖之(c)係表示添加為GSH合成酵素之抑制劑的BSO的情形之GSH1過度表現株之澱粉產生能力的圖，未添加BSO的GSH1過度表現株中，確認相對於因GSH之合成未被被抑制而澱粉被排出至細胞外，添加BSO的GSH1過度表現株因經由BSO而GSH之合成被抑制，澱粉未被排出至細胞外。
[實施例7]
檢討GSH1過度表現株中的油脂產生能力。具體而言，將實施例1製作的GSH1過度表現株，於200mL之TAP培養基(含氮源)中，17μE/m2/秒之連續光下前培養4日。其次，將90mL之培養物所含細胞藉由離心分離(2,000g、5分鐘)而回收，將收集的細胞再懸浮於含新的氮源的TAP培養基(100mL)或未含新的氮源的TAP培養基(100mL)來進行培養基交換。之後，於80μE/m2/秒之連續光下歷經6日培養。前培養終了時及培養基交換後第6日之細胞以尼羅紅(nile red)染色，經染色的細胞供給至流動細胞儀。
作為對照組，使用GSH1過度表現株之親株的萊茵衣藻CC503株(野生型株)來進行相同實驗。
第12圖係表示調查GSH1過度表現株之油脂產生能力的結果，(a)係表示呈現親株(野生型株)中來自尼羅紅的螢光的細胞之直方圖，(b)係表示呈現GSH1過度表現株之來自尼羅紅之螢光的細胞之直方圖，(c)係表示前培養所含尼羅紅染色的親株(野生型株)藉由共焦點雷射顯微鏡觀察結果的圖，(d)係表示前培養所含尼羅紅染色的GSH1過度表現株之藉由共焦點雷射顯微鏡觀察結果的圖。又，於第12圖之(a)及(b)之上段直方圖，淡灰色高峰相當於以含有氮源的TAP培養基培養的細胞，白色的高峰相當於以不含氮源的TAP培養基培養的細胞，最右(螢光強度最強)之高峰係相當於為了決定粒子密度所添加的人工螢光珠(內部標準)。第12圖之(a)及(b)之下段直方圖相當於前培養所含尼羅紅染色的細胞。
如第12圖所示，GSH1過度表現株中，每單位細胞之螢光強度於4日培養的前培養(有氮源)之培養試料、與有氮源的培養基交換6日後之培養試料、及與不含氮源之培養基交換6日後之培養試料之此等3點任一者之培養試料，與親株比較下為增加。此結果顯示，與各個細胞所含油脂之量有關，GSH1過度表現株與親株(野生型株)相比下為多。具體而言，GSH1過度表現株中來自尼羅紅之螢光之螢光強度與親株(野生型株)相比強約10之0.5次方(約3，2倍)。
第13圖係表示調查GSH1過度表現株之狀態的結果，(a)係表示GSH1過度表現株之細胞大小與細胞內部之複雜度之相關圖，(b)係表示GSH1過度表現株之細胞大小與來自尼羅紅之螢光強度之相關圖，(c)係表示(b)之圖中關於四角所包圍的領域所含的細胞，細胞大小與細胞內部之複雜度之相關圖，(d)係表示親株(野生型株)之細胞大小與細胞內部之複雜度之相關圖。
如第13圖之(c)所示可知，對第13圖之(b)中發出強螢光的粒子集團(第13圖之(b)中之四角所包圍的領域內之粒子)設置閘門時，細胞會發出強光。另一方面，可知由細胞游離的微小粒子(即，屬澱粉粒的微小粒子之集團)為未發光者。由以上可確認，顯示與澱粉粒同程度之前方散射，且顯示與澱粉粒同程度之側方散射之微粒子之集團並未包含由油脂所構成的微粒子。
又，強烈發出來自尼羅紅之螢光的原因是細胞有以此形態殘留的情形，於細胞崩解，而含於其中的油脂自細胞游離的情形，以流動細胞儀(FCM)無法檢測出來(難以測出)。因此，認為隨著GSH1過度表現株之細胞崩解，GSH1過度表現株與親株(野生型株)之間之油脂量的差估計有可能較實際小。
因此，為了將GSH1過度表現株與親株(野生型株)之間的油脂量的差更明確化，自各別細胞提取脂肪酸，進行定量分析。具體而言，使用與供應至上述流動細胞儀的細胞相同的細胞(GSH1過度生產株於含氮源的TAP培養基或不含氮源的TAP培養基中，80μE/m2/秒之連續光下培養6日的細胞)，由GSH1過度表現株所產生的脂肪酸藉由Bligh及Dyer開發的方法(參照Can. J. Biochem. Physiol. 37(8): 911-917.)加以回收，將回收的脂肪酸甲酯化後，供給於氣相層析質量分析(GC/MS)。GC/MS中，添加作為內部標準之十五烷酸。十五烷酸係對全部試料添加相同量。就對照組而言，使用為GSH1過度表現株之親株的萊茵衣藻CC503株(野生型株)進行相同實驗。
即，供應至GC/MS之試料為以下4種類：
(i)氮存在下培養的親株(野生型株)
(ii)缺氮條件下培養的親株(野生型株)
(iii)氮存在下培養的GSH1過度表現株
(iv)缺氮條件下培養的GSH1過度表現株。
又，使用下列市售品作為脂肪酸之標準品。十五烷酸(GL Sciences公司製，型號1021-43150)、棕櫚酸(Sigma公司製，型號P0500)、棕櫚烯酸(palmitoleic acid)(Sigma公司製，型號P9417)、硬脂酸(Sigma公司製，型號S4751)、油酸(Sigma公司製，型號O1008)、亞麻油酸(linoleic acid)(Sigma公司製，型號L1376)、次亞麻油酸(linolenic acid)(Sigma公司製，型號L2376)。
第14圖係表示氣相層析質量分析結果的圖。如第14圖所示，於全部試料，可認出相當於標準品所含棕櫚酸(C16：0)的高峰。此結果確認於親株(野生型株)及GSH1過度表現株，產生為脂肪酸之棕櫚酸。
將親株(野生型株)及GSH1過度表現株所含油脂量定量的結果示於表8。
如表8所示，比較每100萬個細胞所含油脂量後，確認GSH1過度表現株所含油脂量與親株(野生型株)相比多5倍以上。由以上結果，確認於藻類藉由使葉綠體內之麩胱甘肽濃度增加而細胞所含油脂量會增加。
[實施例8]
萊茵衣藻sta6缺損變異株(亦稱為「sta6變異株」)已被報告與野生型(萊茵衣藻STA6)株相比，油脂含量較多。細胞內油脂之儲存體(oil body)以尼羅紅染色時，與野生型相比，sta6變異株較大，且含較多oil body(參照Wang et al.(2009) Eukaryotic Cell Vol. 8(12): 1856-1868.(非專利文獻1))。
因此，使用sta6缺損變異株作為親株來製作GSH1過度表現株。具體而言，除了使用為sta6變異株的CC4333株(單胞藻屬中心，美國，受讓自杜克大學)替代萊茵衣藻CC503株之外，以與實施例1相同方法製作GSH1過度表現株(稱為「GSH1過度表現株(sta6-背景)」)。
第15圖係表示調查GSH1過度表現株(sta6-背景)及其親株(sta6-)之狀態的結果，(a)係表示親株(sta6-)之細胞之大小與細胞內部之複雜度之相關圖，(b)係表示GSH1過度表現株(sta6-背景)之細胞大小與細胞內部之複雜度之相關圖。
如第15圖所示，關於前方散射與側方散射之相關圖，不認為GSH1過度表現株(sta6-背景)與親株(sta6-)之間有差異。此係意指只要以流動細胞儀觀測，GSH1過度表現株(sta6-背景)與親株(sta6-)之間，關於細胞大小或細胞內構造不認為有差異。
其次，於100ml之TAP培養基中接種GSH1過度表現株(sta6-背景)，於17μE/m2/秒之連續光下5日進行前培養。之後，經由將90mL之培養物所含的細胞離心分離(2，000g、5分鐘)而收集。經由將經收集的細胞再懸浮於90mL之含新氮源的TAP培養基、或90mL之不含新氮源的TAP培養基，進行培養基交換，再於80μE/m2/秒之連續光下培養3日。前培養終了時及培養基交換後第3日之細胞以尼羅紅染色，將染色的細胞供應至流動細胞儀。作為對照組，使用為GSH1過度表現株(sta6-背景)之親株sta6變異株(CC4333株、sta6-)進行相同實驗。
第16圖係表示調查前培養後及培養基交換後第3日之GSH1過度表現株(sta6-背景)及其親株(sta6-)之油脂產生能力的結果，(a)係表示前培養後之GSH1過度表現株(sta6-背景)及其親株(sta6-)中呈現來自尼羅紅的螢光的細胞之直方圖，(b)係表示培養基交換後第3日之GSH1過度表現株(sta6-背景)及其親株(sta6-)中呈示來自尼羅紅之螢光的細胞之直方圖。又，於第16圖之(a)及(b)，親株(sta6-)之結果以濃灰色之直方圖表示，GSH1過度表現株(sta6-背景)之結果以淡灰色之直方圖表示。
如第16圖之(b)所示，培養基交換後第3日之GSH1過度表現株(sta6-背景)株，與親株(sta6-)相比，螢光強度之分布域向強的一方(右側)位移。此係因GSH1過度表現株(sta6-背景)株與親株(sta6-)相比顯示細胞內之油脂含量多。
以上結果確認藉由使藻類葉綠體內之麩胱甘肽濃度增加，細胞所含油脂量會增加。
[實施例9]
將實施例1製作的GSH1過度表現株接種於參-乙酸-磷酸(TAP)培養基、pH7(參照Proc. Natl. Acad. Sci. USA,54,1665-1669.)，置於24℃培養箱內，給予振盪，並於照射100μE/m2/秒之連續光之所謂半從屬營養條件下培養。每2日，收集1mL之培養物所含細胞，組成則使用80%丙酮/20%水所組成的溶媒將葉綠素a及葉綠素b提取。使用分光光度計，測量波長645nm、663nm中的吸光度，由此等值藉由Porra等人提倡的計算式(參照Biochim. Biophys. Acta(1989)、975巻、384-394)，算出葉綠素a及葉綠素b之量。
第17圖係表示調查實施例1製作的GSH1過度表現株之葉綠素量的結果的圖。如第17圖所示，葉綠素總量(葉綠素a量與葉綠素b量之和)係自培養第4日至培養第10日，伴隨細胞增殖而增加，但之後，主要是由於葉綠素a之分解而減少。葉綠素總量係於培養第10日達到最大值的每單位培養液3.8μg/mL。此係較親株(野生型株)之葉綠素總量7.6μg/mL為小。即，每單位培養液之葉綠素總量係於整個全培養期間，GSH1過度表現株較親株(野生型株)少。
每單位培養液之葉綠素總量小者，可謂由於藻體過度光吸收所致的光能量損失為小。換言之，於相同光量下實施液體培養的情形，每單位培養液之葉綠素總量為小者，但可謂可將光農量送至培養較深部。已報告使葉綠素b之量減少，而光化學系2之葉綠素天線尺寸(antenna size)會變小的研究(參照田中等人(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95巻、12719-12723；Polle等人(2000) Planta 211巻、335-344)。使葉綠素b量減少的操作亦有使光能量送達至培養較深部的效果。
使與光合成有關的色素總量、構成比變化係暗示對光合成產物之生產性提升有貢獻。
如第17圖所示，經由GSH1之過度發現，使色素之總量、色素之構成比變為可能，因此，暗示GSH1之過度表現對光合成產物之生產性提升有貢獻。
[實施例10]
以於藍藻(藍綠藻)(聚球藻屬，Synechococcus)使來自大腸菌之為γ麩胺醯基半胱胺酸合成酵素基因的gshA表現為目的，經以下步驟而作成重組DNA分子。
(1)將大腸菌載體pACYC187(日本Gene製，型號313-02201，序列識別號9)之第3700號之鹼基腺嘌呤取代為胞嘧啶，製作限制酶SmaI的識別位置。接著，將此載體以2種類之限制酶SmaI及SalI處理，調製含有氯黴素(chloramphenicol)耐性基因及複製起始位(origin)(p15Aori)之約2.7kb的DNA片段。
(2)，以大腸菌JM109株之基因體DNA作為模板，使用2種類之引子DNA(序列識別號12及序列識別號13)，藉由PCR法調製含gshA基因之約1.6kb的DNA片段(序列識別號10)。所獲得的PCR片段以限制酶XhoI處理。
(3)以步驟(1)及(2)調製的DNA片段藉由T4DNA連接酶連結，使用大腸菌使增幅。調查經各種限制酶的分解物大小，確認完成具有為目的之氯黴素耐性基因(以下，縮寫為CAT)之下游處具有gshA的構造(以下，稱為「CAT-gshA之基因匣」)的質體。將此質體命名為「pACYC184R-SmaI-E.c.gshA」。
(4)其次，選殖於藍綠藻內將被指稱為驅使自律的DNA複製的複製領域的基因領域。具體而言，參考相關文獻(Akiyama等人(1999)DNA RESEARCH 5巻,327-334)，藉由PCR法使藍綠藻(聚球藻屬，Synechococcus)PCC7002株(American Type Culture Collection，ATCC27264)之菌體內存在的質體pAQ1所含的複製領域(序列識別號11)增幅。使用的2種類PCR引子之序列示於序列識別號14及序列識別號15。將所獲得之約3.4kb之PCR片段及質體載體pZero2(註冊商標，Ivitrogen公司)以限制酶EcoRV開環的DNA片段藉由T4DNA連接酶連結，使用大腸菌而使增幅。調查經各種限制酶之分解物大小，確認完成具有於目的藍綠藻內可自律地DNA複製的基因領域的質體。將此質體命名為「pZero2-pAQ1-ori」。
(5)最終地，使大腸菌gshA負載於經由CAT之引入(lead-through)表現的基因匣於藍綠藻內自律地複製的質體上。具體而言，將步驟(3)製作的pACYC184R-SmaI-E.c.gshA作為模板，使用2種類之PCR引子(序列識別號16及序列識別號17)，藉由PCR法而使增幅。將所獲得的約2.7kb之PCR片段、及步驟(4)所製作的pZero2-pAQ1-ori以限制酶StuI分解所產生的約6.2kb之DNA片段，藉由T4DNA連接酶連結，使用大腸菌而使增幅。調查經各種限制酶之分解物大小，確認完成於目的藍綠藻內具有可能自律地複製DNA複製的基因領域及CAT-gshA的基因匣的質體。將此質體命名為「pSyn5」。
(6)構築將pSyn5導入藍綠藻的實驗之對照實驗所使用的質體。此係為僅具有CAT，且不具有gshA的質體。具體而言，將pACYC184作為模板，使用2種類之PCR引子(序列識別號16及序列識別號18)，以PCR法增幅。所獲得的約1.1kb之PCR片段、及步驟(4)所製作的pZero2-pAQ1-ori以限制酶StuI分解所產生的約6.2kb DNA片段，藉由T4DNA連接酶連結，並使用大腸菌而使增幅。調查經各種限制酶之分解物大小，確認完成於目的藍綠藻內具有可成自律地複製DNA的基因領域及CAT基因的質體。將此質體命名為「pSyn3」。
以習知方法(參照Fringaard等人(2004)Methods in Molecular Biology、274巻、325-340)將質體pSyn5及pSyn3各別導入藍綠藻Synechococcus PC7002株。將經導入各別質體的轉形體命名為「E.c.gshA plus株」、「E.c.gshA minus株」。E.c.gshA plus株具有來自大腸菌之γ麩胺醯基半胱胺酸合成酵素的機能。另一方面，E.c.gshA minus株並不存有來自大腸菌之γ麩胺醯基半胱胺酸合成酵素。
將此等2種類之藍綠藻各別接種於80mL之DAIGO培養基(純水1L中溶解DAIGO IMK培養基(日本製藥製，型號398-01333)500mg、人工海水SP(日本製藥製，型號395-01343)36g、三羥基甲基胺基甲烷(Nacalai製，型號35434-21)1g、碳酸氫鈉(和光純藥製，型號198-01315)1g、氯黴素(和光純藥製，型號034-10572)10mg，經過濾滅菌者)，一邊通大氣一邊攪拌，保溫於30℃，照射70μE/μE/m2/秒之連續光，並培養3日。
藉由將培養物1mL中所含細胞離心分離加以收集，懸浮於水0.2mL。其次，添加丙酮0.8mL，並激烈攪拌，提取色素。藉由離心分離將細胞殘渣去除，使用分光光度計測量澄清的色素溶液之吸光光譜。
第18圖係表示調查自藍綠藻之轉形體E.c.gshA plus株及E.c.gshA minus株提取的色素類之吸光光譜的結果的圖。第18圖18之(a)係表示E.c.gshA plus株之吸光光譜圖，(b)係表示E.c.gshA minus株之吸光光譜圖，(c)係表示自E.c.gshA plus株之光譜減去E.c.gshA minus株之光譜的光譜圖。與實施例9所獲得的結果相同地，藍綠藻之情形，E.c.gshA plus株與E.c.gshA minus株相比，顯示色素組成有變化(第18圖)。由此顯示，於藍綠藻中使γ麩胺醯基半胱胺酸合成酶過度表現時，亦獲得對與實施例1製作的GSH1過度表現株同樣的光合成的效果。
[產業上之利用可能性]
依據本發明，可較過去更便宜地、效率佳地由藻類製造生質能。生質能正被期待利用作為生質燃料之原料。因此，本發明於能源產業等之廣範產業具有可利用性。
[第1圖]　係表示調查實施例1所製作的GSH1過度表現株之增殖能力及澱粉產生能力結果的圖，(a)為表示GSH1過度表現株之增殖能力的圖，(b)為表示培養開始309小時後之培養液狀態的圖，(c)為表示試料4中碘澱粉反應結果的圖。
[第2圖]　係表示親株(野生型株)之增殖能力及澱粉產生能力結果的圖，(a)為表示親株(野生型株)之增殖能力的圖，(b)為表示培養開始215小時後之培養液狀態的圖。
[第3圖]　表示調查試料8之親株(野生型株)狀態的結果，(a)為表示試料8之親株(野生型株)中來自葉綠素的螢光細胞(粒子)之直方圖，(b)為表示試料8之親株(野生型株)培養物中浮游粒子的大小與粒子內部的複雜度之相關圖。
[第4圖]　表示調查試料4之GSH1過度表現株狀態的結果，(a)為表示試料4之GSH1過度表現株中顯示葉綠素的螢光細胞(粒子)之直方圖，(b)為表示試料4之GSH1過度表現株之培養物中浮游粒子之大小與粒子內部之複雜度的相關的圖。
[第5圖]　(a)為表示顯示試料9及試料10中來自葉綠素之螢光的粒子，即細胞之密度，及未顯示來自葉綠素之螢光的粒子，即澱粉粒之密度，之經時變化圖，(b)為表示試料9及試料10中每單位培養液的澱粉量的經時變化圖，(c)為表示試料9及試料10中每單位細胞的澱粉量的經時變化圖。又，(b)及(c)之實例中「TAP normal」、「TAP N-free」各自表示「含氮源的TAP培養基」、「不含氮源的TAP培養基」之意義。
[第6圖]　(a)為表示顯示試料11及試料12中來自葉綠素之螢光的粒子，即細胞之密度，及未顯示來自葉綠素的螢光的粒子，即澱粉粒之密度，之經時變化圖，(b)為表示試料11及試料12中每單位培養液之澱粉量的經時變化圖，(c)為表示試料11及試料12中每單位細胞之澱粉量的經時變化圖。又，(b)及(c)之實例中「TAP normal」、「TAP N-free」各自表示「含氮源的TAP培養基」、「不含氮源的TAP培養基」之意義。
[第7圖]　(a)為表示顯示GSH1過度表現株及親株(野生型株)中，來自葉綠素之螢光的粒子密度及未顯示來自葉綠素之螢光的粒子密度之經時變化圖，(b)為表示每單位培養液之澱粉量的經時變化圖。
[第8圖]　表示GSH1過度表現株及親株(野生型株)中碘澱粉反應結果的圖。
[第9圖]　表示調查GSH1過度表現株之增殖能力結果的圖。
[第10圖]　為表示調查各繼代時點之GSH1過度表現株狀態的結果，(a)為表示第9圖所示之進行「繼代1」時之GSH1過度表現株之細胞大小與細胞內部之複雜度的相關圖，(b)為表示第9圖所示之進行「繼代2」時之GSH1過度表現株之細胞大小與細胞內部之複雜度之相關圖，(c)為表示第9圖所示進行「繼代3」時之GSH1過度表現株之細胞大小與細胞內部的複雜度之相關圖。
[第11圖]　為表示觀察自GSH1過度表現株釋放至細胞外的澱粉粒形狀之結果的圖，(a)為表示使用掃描式電子顯微鏡觀察澱粉粒結果的圖，(b)為表示自GSH1過度表現株釋放的澱粉粒之碘澱粉反應結果的圖，(c)為表示於培養基添加GSH合成酵素之抑制劑BSO使終濃度成為8mM時，GSH1過度表現株之澱粉產生能力的圖。
[第12圖]　為表示調查GSH1過度表現株之油脂產生能力的結果，(a)為表示親株(野生型株)中顯示來自尼羅紅的螢光細胞之直方圖，(b)為表示GSH1過度表現株中顯示來自尼羅紅之螢光細胞之直方圖，(c)為表示經尼羅紅染色的親株(野生型株)之共焦點雷射顯微鏡觀察結果的圖，(d)為表示經尼羅紅染色的GSH1過度表現株之共焦點雷射顯微鏡觀察結果的圖。
[第13圖]　為表示調查GSH1過度表現株狀態的結果，(a)為表示GSH1過度表現株之細胞大小與細胞內部的複雜度的相關圖，(b)為表示GSH1過度表現株之細胞大小與來自尼羅紅之螢光強度之相關圖，(c)為關於(b)之圖中四角包圍領域所含的細胞之細胞大小與細胞內部之複雜度之相關圖，(d)為表示親株(野生型株)之細胞大小與細胞內部之複雜度之相關圖。
[第14圖]　表示氣相層析質量分析結果的圖。
[第15圖]　表示調查GSH1過度表現株(sta6-背景)及其親株(sta6-)狀態的結果，(a)為表示親株(sta6-)之細胞大小與細胞內部之複雜度的相關圖，(b)為表示GSH1過度表現株(sta6-背景)株之細胞大小與細胞內部之複雜度之相關圖。
[第16圖]　表示調查前培養後及培養基交換後第3日之GSH1過度表現(sta6-背景)及其親株(sta6-)之油脂產生能力的結果，(a)為表示前培養後之GSH1過度表現株(sta6-背景)及其親株(sta6-)中顯示來自尼羅紅之螢光細胞的直方圖，(b)為表示培養基交換後第3日之GSH1過度表現株(sta6-背景)及其親株(sta6-株)中顯示來自尼羅紅之螢光細胞之直方圖。
[第17圖]　表示調查實施例1所製作的GSH1過度表現株之葉綠素量結果的圖。
[第18圖]　為調查自藍綠藻之轉形體E‧c‧gshA plus株及E‧c‧gshA minus株萃取的色素類之吸光光譜的結果，(a)為表示E‧c‧gshA plus株之吸光光譜圖，(b)為表示E‧c‧gshA minus株之吸光光譜圖，(c)為表示自E‧c‧gshA plus株之光譜減去E‧c‧gshA minus株之光譜的光譜圖。
[第19圖]　(a)為表示試料9及試料10中顯示來自葉綠素的螢光粒子，即細胞之密度，及未顯示來自葉綠素的螢光粒子，即澱粉粒之密度，兩者之經時變化圖，(b)為表示試料9及試料10中每單位培養液之澱粉量的經時變化圖，(c)為表示試料9及試料10中每單位細胞之澱粉量的經時變化圖。又，(b)及(c)之實例中「TAP normal」、「TAP N-free」各別意指「含氮源的TAP培養基」、「不含氮源的TAP培養基」。
[第20圖]　(a)為表示試料11及試料12中顯示來自葉綠素的螢光粒子，即細胞之密度，及未顯示來自葉綠素之螢光粒子，即澱粉粒之密度，兩者之經時變化圖，(b)為表示試料11及試料12中每單位培養液之澱粉量的經時變化圖，(c)為表示試料11及試料12中每單位細胞之澱粉量的經時變化圖。又，(b)及(c)之實例中「TAP normal」、「TAP N-free」各自意指「含氮源的TAP培養基」、「不含氮源的TAP培養基」。
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Claims (5)

  1. 一種藻類之製造方法，其包含：導入步驟，將編碼γ-麩胺醯基半胱胺酸合成酵素的多核苷酸導入藻類；栽培步驟，栽培導入上述多核苷酸的藻類；及篩選步驟，與在相同條件下裁培之上述藻類同種的野生型藻類之葉綠體的麩胱甘肽濃度比較，篩選葉綠體內的麩胱甘肽濃度增加之藻類；上述篩選步驟中，包含：(1)測定上述葉綠體內之麩胱甘肽濃度，將測定的麩胱甘肽濃度，與在相同條件下栽培之上述藻類同種的野生型藻類之葉綠體的麩胱甘肽濃度比較；或(2)測定經上述多核苷酸編碼的外因性蛋白質的表現量及/或活性，將測定的表現量及/或活性，與上述藻類同種的野生型藻類中的經上述多核苷酸編碼的外因性蛋白質的表現量及/或活性比較；其中，上述編碼γ-麩胺醯基半胱胺酸合成酵素的多核苷酸，係選自以下(a)~(b)所構成之群組：(a)編碼序列識別號1所示之胺基酸序列所構成的多胜肽之多核甘酸；(b)編碼序列識別號2所示之鹼基序列所構成的多核苷酸。
  2. 一種澱粉或油脂的製造方法，其包含：培養步驟，係培養如申請專利範圍第1項所述藻類之製造 方法所製造的藻類。
  3. 如申請專利範圍第2項所述澱粉或油脂的製造方法，其中更包含：光照射步驟，對上述藻類照射光。
  4. 如申請專利範圍第3項所述澱粉或油脂的製造方法，其中更包含：該光照射步驟，係於非缺氮的條件下進行。
  5. 如申專利範圍第2至4項中任一項所述之澱粉或油脂的製造方法，其中更包含：回收步驟，回收上述藻類所含之油脂或培養上述藻類之培養液中所含有的澱粉。
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