JP6525290B2 - 新規タンパク質、新規遺伝子、発現ベクター、形質転換体、形質転換体の製造方法、および新規蛍光タンパク質のスクリーニング方法 - Google Patents
新規タンパク質、新規遺伝子、発現ベクター、形質転換体、形質転換体の製造方法、および新規蛍光タンパク質のスクリーニング方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6525290B2 JP6525290B2 JP2017525229A JP2017525229A JP6525290B2 JP 6525290 B2 JP6525290 B2 JP 6525290B2 JP 2017525229 A JP2017525229 A JP 2017525229A JP 2017525229 A JP2017525229 A JP 2017525229A JP 6525290 B2 JP6525290 B2 JP 6525290B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- amino acid
- xaa
- fluorescence
- wavelength
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 314
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 261
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 73
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 title claims description 62
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 title claims description 46
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 title claims description 45
- 238000012216 screening Methods 0.000 title claims description 15
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 222
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 121
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 115
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 115
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 115
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 105
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 32
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 32
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 15
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 10
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 179
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 59
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 43
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 41
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 24
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 24
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 21
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 20
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 16
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 15
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 15
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 14
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 12
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 12
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 11
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 11
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 10
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 9
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 8
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 8
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 7
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 7
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 6
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 6
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 5
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 241000219357 Cactaceae Species 0.000 description 4
- 240000007377 Petunia x hybrida Species 0.000 description 4
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 4
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 3
- 241001517197 Cattleya Species 0.000 description 3
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 3
- 241000732800 Cymbidium Species 0.000 description 3
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 3
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 3
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 241000190074 Oncidium Species 0.000 description 3
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 3
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 3
- 241001505935 Phalaenopsis Species 0.000 description 3
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000013465 asexual reproduction Methods 0.000 description 3
- 230000011681 asexual reproduction Effects 0.000 description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 2
- 241001649047 Calibrachoa Species 0.000 description 2
- 235000007516 Chrysanthemum Nutrition 0.000 description 2
- 241001573881 Corolla Species 0.000 description 2
- 241000612153 Cyclamen Species 0.000 description 2
- 241001523681 Dendrobium Species 0.000 description 2
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 240000006497 Dianthus caryophyllus Species 0.000 description 2
- 235000009355 Dianthus caryophyllus Nutrition 0.000 description 2
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 2
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 2
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 2
- 241000735332 Gerbera Species 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 2
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 2
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 2
- 241001287809 Nierembergia Species 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 241000233855 Orchidaceae Species 0.000 description 2
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 2
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 241000220317 Rosa Species 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 2
- 241001290864 Schoenoplectus Species 0.000 description 2
- 241000960400 Torenia Species 0.000 description 2
- 235000007212 Verbena X moechina Moldenke Nutrition 0.000 description 2
- 240000001519 Verbena officinalis Species 0.000 description 2
- 235000001594 Verbena polystachya Kunth Nutrition 0.000 description 2
- 235000007200 Verbena x perriana Moldenke Nutrition 0.000 description 2
- 235000002270 Verbena x stuprosa Moldenke Nutrition 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 229930186364 cyclamen Natural products 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 2
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 2
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 2
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- 108091005957 yellow fluorescent proteins Proteins 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KVKJFNUGVOFNGU-UHFFFAOYSA-N 3-carboxy-3,5-dihydroxy-5-oxopentanoate;diethyl-[2-[2-(2-ethyl-2-phenylbutanoyl)oxyethoxy]ethyl]azanium Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC([O-])=O.CC[NH+](CC)CCOCCOC(=O)C(CC)(CC)C1=CC=CC=C1 KVKJFNUGVOFNGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000208838 Asteraceae Species 0.000 description 1
- 241000883963 Astrophytum Species 0.000 description 1
- 241000606125 Bacteroides Species 0.000 description 1
- 241000219193 Brassicaceae Species 0.000 description 1
- 241001041049 Calibrachoa hybrid cultivar Species 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241001660259 Cereus <cactus> Species 0.000 description 1
- 240000005250 Chrysanthemum indicum Species 0.000 description 1
- 244000189548 Chrysanthemum x morifolium Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 240000009034 Cyclamen persicum Species 0.000 description 1
- 240000004638 Dendrobium nobile Species 0.000 description 1
- 240000007047 Dendrobium phalaenopsis Species 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 244000183914 Dianthus superbus Species 0.000 description 1
- 235000013535 Dianthus superbus Nutrition 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000883560 Echinocactus Species 0.000 description 1
- 241001660235 Echinocereus Species 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000445924 Epiphyllum <angiosperm> Species 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 241000511009 Eustoma exaltatum subsp. russellianum Species 0.000 description 1
- 241001071804 Gentianaceae Species 0.000 description 1
- 241000282816 Giraffa camelopardalis Species 0.000 description 1
- 244000211317 Glandularia x hybrida Species 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N Hygromycin-B Natural products OC1C(NC)CC(N)C(O)C1OC1C2OC3(C(C(O)C(O)C(C(N)CO)O3)O)OC2C(O)C(CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000040625 Melocactus Species 0.000 description 1
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 1
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 1
- 240000001439 Opuntia Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 235000000497 Primula Nutrition 0.000 description 1
- 244000028344 Primula vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000016311 Primula vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 241000208476 Primulaceae Species 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 description 1
- 241000589774 Pseudomonas sp. Species 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 235000011449 Rosa Nutrition 0.000 description 1
- 235000004789 Rosa xanthina Nutrition 0.000 description 1
- 241000220222 Rosaceae Species 0.000 description 1
- 241000207929 Scutellaria Species 0.000 description 1
- BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N Selenium Chemical compound [Se] BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000208292 Solanaceae Species 0.000 description 1
- 244000201702 Torenia fournieri Species 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 235000007244 Zea mays Nutrition 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010045569 atelocollagen Proteins 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N hygromycin B Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@H]2O[C@@]3([C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C(N)CO)O3)O)O[C@H]2[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N 0.000 description 1
- 229940097277 hygromycin b Drugs 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M lithium acetate Chemical compound [Li+].CC([O-])=O XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 239000006870 ms-medium Substances 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000033458 reproduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011669 selenium Substances 0.000 description 1
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 1
- 230000014639 sexual reproduction Effects 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000009417 vegetative reproduction Effects 0.000 description 1
- 238000013466 vegetative reproduction Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8209—Selection, visualisation of transformants, reporter constructs, e.g. antibiotic resistance markers
- C12N15/821—Non-antibiotic resistance markers, e.g. morphogenetic, metabolic markers
- C12N15/8212—Colour markers, e.g. beta-glucoronidase [GUS], green fluorescent protein [GFP], carotenoid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
- C07K14/43595—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from coelenteratae, e.g. medusae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Botany (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
本発明は、新規タンパク質、新規遺伝子、発現ベクター、形質転換体、形質転換体の製造方法、および新規蛍光タンパク質のスクリーニング方法に関する。
蛍光タンパク質として、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）やＹＦＰ（Ｙｅｌｌｏｗ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）等が、一般的に用いられている（非特許文献１）。前記蛍光タンパク質は、研究等の様々な用途に使用されている。しかしながら、各種用途に適した蛍光タンパク質が、必ずしも存在するわけではない。このため、新たな蛍光タンパク質が求められている。
Chalfie M et al., "Green fluorescent protein as a marker for gene expression", Science, February 1994, Vol.263, no.5148, p802-805.
そこで、本発明は、新たな蛍光タンパク質を提供することを目的とする。
本発明の新規タンパク質は、下記（Ｆ１）のタンパク質であることを特徴とする。
（Ｆ１） 配列番号１のアミノ酸配列からなり、
前記配列番号１のアミノ酸配列において、
５２番目のアミノ酸Ｘａａ５２が、任意のアミノ酸であり、
１３３番目のアミノ酸Ｘａａ１３３が、任意のアミノ酸であり、
１５４番目のアミノ酸Ｘａａ１５４が、任意のアミノ酸であるタンパク質
（Ｆ１） 配列番号１のアミノ酸配列からなり、
前記配列番号１のアミノ酸配列において、
５２番目のアミノ酸Ｘａａ５２が、任意のアミノ酸であり、
１３３番目のアミノ酸Ｘａａ１３３が、任意のアミノ酸であり、
１５４番目のアミノ酸Ｘａａ１５４が、任意のアミノ酸であるタンパク質
本発明の新規遺伝子は、下記（ｆ１）のポリヌクレオチドであることを特徴とする。
（ｆ１） 配列番号１４の塩基配列からなり、
前記配列番号１４の塩基配列において、
１５４番目の塩基Ｎ１５４、１５５番目の塩基Ｎ１５５、および１５６番目の塩基Ｎ１５６が、任意のアミノ酸をコードするコドンであり、
３９７番目の塩基Ｎ３９７、３９８番目の塩基Ｎ３９８、および３９９番目の塩基Ｎ３９９が、任意のアミノ酸をコードするコドンであり、
４６０番目の塩基Ｎ４６０、４６１番目の塩基Ｎ４６１、および４６２番目の塩基Ｎ４６２が、任意のアミノ酸をコードするコドンであるポリヌクレオチド
（ｆ１） 配列番号１４の塩基配列からなり、
前記配列番号１４の塩基配列において、
１５４番目の塩基Ｎ１５４、１５５番目の塩基Ｎ１５５、および１５６番目の塩基Ｎ１５６が、任意のアミノ酸をコードするコドンであり、
３９７番目の塩基Ｎ３９７、３９８番目の塩基Ｎ３９８、および３９９番目の塩基Ｎ３９９が、任意のアミノ酸をコードするコドンであり、
４６０番目の塩基Ｎ４６０、４６１番目の塩基Ｎ４６１、および４６２番目の塩基Ｎ４６２が、任意のアミノ酸をコードするコドンであるポリヌクレオチド
本発明の発現ベクターは、前記本発明の新規遺伝子を含むことを特徴とする。
本発明の形質転換体は、前記本発明の新規遺伝子を含むことを特徴とする。
本発明の形質転換体の製造方法は、宿主に、前記本発明の新規遺伝子を導入する導入工程を含むことを特徴とする。
本発明の新規蛍光タンパク質のスクリーニング方法は、前記本発明の新規タンパク質に変異を導入した候補タンパク質から、配列番号１のアミノ酸配列における５２番目のアミノ酸Ｘａａ５２に対応するアミノ酸が、任意のアミノ酸であり、
１３３番目のアミノ酸Ｘａａ１３３に対応するアミノ酸が、任意のアミノ酸であり、
１５４番目のアミノ酸Ｘａａ１５４に対応するアミノ酸が、任意のアミノ酸であり、且つ蛍光活性を有するタンパク質を選抜する選抜工程を含むことを特徴とする。
１３３番目のアミノ酸Ｘａａ１３３に対応するアミノ酸が、任意のアミノ酸であり、
１５４番目のアミノ酸Ｘａａ１５４に対応するアミノ酸が、任意のアミノ酸であり、且つ蛍光活性を有するタンパク質を選抜する選抜工程を含むことを特徴とする。
本発明によれば、新規な蛍光タンパク質を提供できる。
＜新規タンパク質＞
本発明の新規タンパク質は、前述のように、下記（Ｆ１）〜（Ｆ３）からなる群から選択された少なくとも一つであることを特徴とする。
（Ｆ１） 配列番号１のアミノ酸配列からなり、
前記配列番号１のアミノ酸配列において、
５２番目のアミノ酸Ｘａａ５２が、任意のアミノ酸であり、
１３３番目のアミノ酸Ｘａａ１３３が、任意のアミノ酸であり、
１５４番目のアミノ酸Ｘａａ１５４が、任意のアミノ酸であるタンパク質
（Ｆ２） 前記（Ｆ１）の５２番目のアミノ酸Ｘａａ５２、１３３番目のアミノ酸Ｘａａ１３３、および１５４番目のアミノ酸Ｘａａ１５４以外のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質
（Ｆ３） 前記（Ｆ１）の５２番目のアミノ酸Ｘａａ５２、１３３番目のアミノ酸Ｘａａ１３３、および１５４番目のアミノ酸Ｘａａ１５４以外のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質
本発明の新規タンパク質は、前述のように、下記（Ｆ１）〜（Ｆ３）からなる群から選択された少なくとも一つであることを特徴とする。
（Ｆ１） 配列番号１のアミノ酸配列からなり、
前記配列番号１のアミノ酸配列において、
５２番目のアミノ酸Ｘａａ５２が、任意のアミノ酸であり、
１３３番目のアミノ酸Ｘａａ１３３が、任意のアミノ酸であり、
１５４番目のアミノ酸Ｘａａ１５４が、任意のアミノ酸であるタンパク質
（Ｆ２） 前記（Ｆ１）の５２番目のアミノ酸Ｘａａ５２、１３３番目のアミノ酸Ｘａａ１３３、および１５４番目のアミノ酸Ｘａａ１５４以外のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質
（Ｆ３） 前記（Ｆ１）の５２番目のアミノ酸Ｘａａ５２、１３３番目のアミノ酸Ｘａａ１３３、および１５４番目のアミノ酸Ｘａａ１５４以外のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質
本発明者らは鋭意研究の結果、前記配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質において、５２番目、１３３番目、および１５４番目のアミノ酸が、前記タンパク質の蛍光活性と関連性を有することを見出した。具体的には、前記タンパク質の５２番目、１３３番目、および１５４番目のアミノ酸が、例えば、前記タンパク質の発色団と相互作用すると推定された。このため、本発明の新規タンパク質によれば、５２番目、１３３番目、および１５４番目のアミノ酸を任意のアミノ酸とすることにより、前記タンパク質の蛍光活性を調整でき、例えば、相対的に低い波長の励起光（例えば、紫外線（以下同様））においても、より強い蛍光を発するタンパク質や、同一強度の励起光で励起した際に、より強い蛍光を発するタンパク質を得られる。なお、上記推定は、本発明を何ら制限しない。
以下、前記新規タンパク質は、新規蛍光タンパク質ともいう。前記新規蛍光タンパク質は、本発明者らが新たに作製したタンパク質である。本発明において、前記新規蛍光タンパク質は、例えば、１種類のタンパク質を含んでもよいし、２種類以上のタンパク質を含んでもよい（以下、同様）。
前記（Ｆ１）における配列番号１のアミノ酸配列は、以下の通りである。以下のアミノ酸配列において、３箇所の四角で囲んだアミノ酸（Ｘ）は、１箇所目のアミノ酸が、Ｘａａ５２、２箇所目のアミノ酸が、Ｘａａ１３３、３箇所目のアミノ酸が、Ｘａａ１５４に対応するアミノ酸である。また、２箇所の下線を引いたアミノ酸（Ｘ）は、１箇所目のアミノ酸が、Ｘａａ１９８、２箇所目のアミノ酸が、Ｘａａ２０５に対応するアミノ酸である。
前記（Ｆ１）において、Ｘａａ５２は、任意のアミノ酸である。前記任意のアミノ酸は、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり、好ましくは、Ｃ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、またはＴであり、例えば、相対的に低い波長の励起光においても、より強い蛍光を発することから、より好ましくは、Ｃ、Ｍ、またはＴである。また、前記（Ｆ１）において、Ｘａａ５２は、例えば、同一強度の励起光で励起した際に、より強い蛍光を発することから、より好ましくは、Ｈである。
前記（Ｆ１）において、Ｘａａ１３３は、任意のアミノ酸である。前記任意のアミノ酸は、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり、好ましくは、Ｌ、Ｑ、Ｓ、またはＴである。また、前記（Ｆ１）において、Ｘａａ１３３は、例えば、同一強度の励起光で励起した際に、より強い蛍光を発することから、より好ましくは、Ｔである。
前記（Ｆ１）において、Ｘａａ１５４は、任意のアミノ酸である。前記任意のアミノ酸は、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり、好ましくは、Ａ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｖ、またはＹであり、例えば、相対的に低い波長の励起光においても、より強い蛍光を発することから、より好ましくは、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、またはＹである。また、前記（Ｆ１）において、Ｘａａ１５４は、例えば、同一強度の励起光で励起した際に、より強い蛍光を発することから、より好ましくは、Ｋである。
前記（Ｆ１）において、Ｘａａ５２、Ｘａａ１３３、およびＸａａ１５４の組合せは、特に制限されず、例えば、
Ｘａａ５２は、例えば、Ｃ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、またはＴであり、
Ｘａａ１３３は、例えば、Ｌ、Ｑ、Ｓ、またはＴであり、
Ｘａａ１５４は、例えば、Ａ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｖ、またはＹである。
Ｘａａ５２は、例えば、Ｃ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、またはＴであり、
Ｘａａ１３３は、例えば、Ｌ、Ｑ、Ｓ、またはＴであり、
Ｘａａ１５４は、例えば、Ａ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｖ、またはＹである。
前記（Ｆ１）において、Ｘａａ５２、Ｘａａ１３３、およびＸａａ１５４の組合せは、例えば、相対的に低い波長の励起光においても、より強い蛍光を発することから、好ましくは、
Ｘａａ５２は、例えば、Ｃ、Ｍ、またはＴであり、
Ｘａａ１３３は、例えば、Ｌ、Ｑ、Ｓ、またはＴであり、
Ｘａａ１５４は、例えば、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、またはＹである。
以下、前記（Ｆ１）がこのようなＸａａ５２、Ｘａａ１３３、およびＸａａ１５４の組合せを有する場合、前記（Ｆ１）を、（Ｂ１）ともいい、前記（Ｆ２）および（Ｆ３）において、前記（Ｆ１）が（Ｂ１）の場合、前記（Ｆ２）および（Ｆ３）を、それぞれ、（Ｂ２）および（Ｂ３）ともいう。また、以下の説明において、前記（Ｂ２）および（Ｂ３）は、例えば、前記（Ｆ２）および（Ｆ３）の説明において、（Ｆ１）を（Ｂ１）に、（Ｆ２）を（Ｂ２）に、（Ｆ３）を（Ｂ３）に、それぞれ読み替えて、その説明を援用できる。
Ｘａａ５２は、例えば、Ｃ、Ｍ、またはＴであり、
Ｘａａ１３３は、例えば、Ｌ、Ｑ、Ｓ、またはＴであり、
Ｘａａ１５４は、例えば、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、またはＹである。
以下、前記（Ｆ１）がこのようなＸａａ５２、Ｘａａ１３３、およびＸａａ１５４の組合せを有する場合、前記（Ｆ１）を、（Ｂ１）ともいい、前記（Ｆ２）および（Ｆ３）において、前記（Ｆ１）が（Ｂ１）の場合、前記（Ｆ２）および（Ｆ３）を、それぞれ、（Ｂ２）および（Ｂ３）ともいう。また、以下の説明において、前記（Ｂ２）および（Ｂ３）は、例えば、前記（Ｆ２）および（Ｆ３）の説明において、（Ｆ１）を（Ｂ１）に、（Ｆ２）を（Ｂ２）に、（Ｆ３）を（Ｂ３）に、それぞれ読み替えて、その説明を援用できる。
具体例として、本発明の新規タンパク質において、Ｘａａ５２、Ｘａａ１３３、およびＸａａ１５４の組合せは、例えば、下記（ａａ１）〜（ａａ１１）および（ａａ１２）のいずれか１つの組合せである。また、本発明の新規タンパク質において、Ｘａａ５２、Ｘａａ１３３、およびＸａａ１５４の組合せは、例えば、相対的に低い波長の励起光においても、より強い蛍光を発することから、下記（ａａ１）、（ａａ３）、（ａａ６）、（ａａ９）、（ａａ１０）、または（ａａ１２）が好ましく、下記（ａａ１）、または（ａａ９）の組合せがより好ましい。また、本発明の新規タンパク質において、Ｘａａ５２、Ｘａａ１３３、およびＸａａ１５４の組合せは、例えば、同一強度の励起光で励起した際に、より強い蛍光を発することから、下記（ａａ２）の組合せが好ましい。本発明の新規タンパク質は、例えば、Ｘａａ５２、Ｘａａ１３３、およびＸａａ１５４の組合せが、それぞれ、Ｈ、ＳおよびＲの組合せ、ならびにＤ、ＳおよびＲの組合せのタンパク質を除く。
本発明の新規タンパク質において、Ｘａａ２０５は、例えば、相対的に低い波長の励起光においても、より強い蛍光を発することから、Ｉに置換されていることが好ましい。また、本発明の新規タンパク質において、Ｘａａ１９８は、例えば、相対的に低い波長の励起光においても、より強い蛍光を発することから、ＬまたはＨに置換されていることが好ましい。前記新規タンパク質において、１９８番目および２０５番目のアミノ酸は、例えば、それぞれが、前記タンパク質の発色団と相互作用すると推定される。このため、１９８番目および２０５番目のアミノ酸の少なくとも一方について、上述の置換を行なうことにより、相対的に低い波長の励起光においても、より強い蛍光を発するタンパク質を得られると推定される。ただし、上記推定は、本発明を何ら制限しない。本発明の新規タンパク質において、Ｘａａ１９８およびＸａａ２０５は、例えば、相対的に低い波長の励起光においても、さらに強い蛍光を発することから、ＬおよびＩの組合せ、またはＨおよびＩの組合せに、それぞれ置換されていることがより好ましい。
前記（Ｆ１）のタンパク質は、例えば、配列番号２〜１３、３４〜６６、および６７からなる群から選択された少なくとも１つのアミノ酸配列からなるタンパク質があげられる。前記（Ｆ１）が配列番号２〜１３および３４〜６７のアミノ酸配列からなるタンパク質である場合、前記（Ｆ１）は、それぞれ、（Ｆ１−１）〜（Ｆ１−４６）ともいい、前記（Ｆ２）は、それぞれ、（Ｆ２−１）〜（Ｆ２−４６）ともいい、前記（Ｆ３）は、それぞれ、（Ｆ３−１）〜（Ｆ３−４６）ともいう。
前記（Ｂ１）のタンパク質は、例えば、配列番号２、４、７、１０、１１、１３、および３４〜６７からなる群から選択された少なくとも１つのアミノ酸配列からなるタンパク質があげられる。前記（Ｂ１）における各配列番号のアミノ酸配列からなるタンパク質の説明は、前記（Ｆ１）における各配列番号のアミノ酸配列からなるタンパク質の説明を援用できる。
前記（Ｆ１）における配列番号２〜１３および３４〜６７のアミノ酸配列は、以下の通りである。前記配列番号２〜１３のアミノ酸配列は、前記配列番号１のアミノ酸配列において、Ｘａａ５２、Ｘａａ１３３、およびＸａａ１５４の組合せが、それぞれ、前記（ａａ１）〜（ａａ１２）の組合せの場合に対応する。前記配列番号３４〜４８のアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列において、Ｘａａ５２、Ｘａａ１３３、およびＸａａ１５４の組合せが、前記（ａａ１）の組合せの場合に対応する。前記配列番号４９〜６７のアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列において、Ｘａａ５２、Ｘａａ１３３、およびＸａａ１５４の組合せが、前記（ａａ９）の組合せの場合に対応する。
前記（Ｆ２）のタンパク質は、例えば、前記（Ｆ１）のＸａａ５２、Ｘａａ１３３、およびＸａａ１５４が保存され、前記（Ｆ１）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質ということもできる。前記（Ｆ２）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（Ｆ２）が、前記蛍光活性を有する範囲であればよい。前記（Ｆ２）のアミノ酸配列において、「１もしくは数個」は、例えば、１〜４３個、１〜３３個、１〜２２個、１〜１１個、１〜９個、１〜７個、１〜５個、１〜３個、１または２個である。本発明において、個数の数値範囲は、例えば、その範囲に属する正の整数を全て開示するものである。つまり、例えば、「１〜５個」との記載は、「１、２、３、４、５個」の全ての開示を意味する（以下、同様）。前記（Ｆ１）において、Ｘａａ２０５が、Ｉに置換されている場合、前記（Ｆ２）のタンパク質は、前記（Ｆ１）のＸａａ２０５が保存されていることが好ましい。この場合、前記（Ｆ２）のタンパク質は、例えば、前記（Ｆ１）のＸａａ５２、Ｘａａ１３３、Ｘａａ１５４、およびＸａａ２０５が保存され、前記（Ｆ１）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質である。また、前記（Ｆ１）において、Ｘａａ１９８が、ＬまたはＨに置換されている場合、前記（Ｆ２）のタンパク質は、前記（Ｆ１）のＸａａ１９８が保存されていることが好ましい。この場合、前記（Ｆ２）のタンパク質は、例えば、前記（Ｆ１）のＸａａ５２、Ｘａａ１３３、Ｘａａ１５４、およびＸａａ１９８が保存され、前記（Ｆ１）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質である。前記（Ｆ１）において、Ｘａａ１９８およびＸａａ２０５が、ＬおよびＩの組合せ、またはＨおよびＩの組合せに、ぞれぞれ置換されている場合、前記（Ｆ２）のタンパク質は、前記（Ｆ１）のＸａａ１９８およびＸａａ２０５が保存されていることが好ましい。この場合、前記（Ｆ２）のタンパク質は、例えば、前記（Ｆ１）のＸａａ５２、Ｘａａ１３３、Ｘａａ１５４、Ｘａａ１９８、およびＸａａ２０５が保存され、前記（Ｆ１）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質である。前記「１もしくは数個」は、例えば、前述の説明を援用できる。
前記（Ｆ３）のタンパク質は、前記（Ｆ１）のＸａａ５２、Ｘａａ１３３、およびＸａａ１５４が保存され、前記（Ｆ１）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質ということもできる。前記（Ｆ３）において、「同一性」は、例えば、前記（Ｆ３）が、前記蛍光活性を有する範囲であればよい。前記（Ｆ３）のアミノ酸配列において、「同一性」は、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。前記「同一性」は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の解析ソフトウェアを用いて、デフォルトのパラメータにより算出できる（以下、同様）。前記（Ｆ１）において、Ｘａａ２０５が、Ｉに置換されている場合、前記（Ｆ３）のタンパク質は、前記（Ｆ１）のＸａａ２０５が保存されていることが好ましい。この場合、前記（Ｆ３）のタンパク質は、例えば、前記（Ｆ１）のＸａａ５２、Ｘａａ１３３、Ｘａａ１５４、およびＸａａ２０５が保存され、前記（Ｆ１）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質である。また、前記（Ｆ１）において、Ｘａａ１９８が、ＬまたはＨに置換されている場合、前記（Ｆ３）のタンパク質は、前記（Ｆ１）のＸａａ１９８が保存されていることが好ましい。この場合、前記（Ｆ３）のタンパク質は、例えば、前記（Ｆ１）のＸａａ５２、Ｘａａ１３３、Ｘａａ１５４、およびＸａａ１９８が保存され、前記（Ｆ１）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質である。前記（Ｆ１）において、Ｘａａ１９８およびＸａａ２０５が、ＬおよびＩの組合せ、またはＨおよびＩの組合せに、ぞれぞれ置換されている場合、前記（Ｆ３）のタンパク質は、前記（Ｆ１）のＸａａ１９８およびＸａａ２０５が保存されていることが好ましい。この場合、前記（Ｆ３）のタンパク質は、例えば、前記（Ｆ１）のＸａａ５２、Ｘａａ１３３、Ｘａａ１５４、Ｘａａ１９８、およびＸａａ２０５が保存され、前記（Ｆ１）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質である。前記「同一性」は、例えば、前述の説明を援用できる。
本発明の新規蛍光タンパク質は、例えば、以下のような化学的特性を有する。なお、以下で示す励起波長、励起極大波長、蛍光波長および蛍光極大波長は、例えば、３５０〜６５０ｎｍの波長の範囲における化学的特性である。
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：３８６〜５１４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５０６〜５２４ｎｍ
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：３８６〜５１４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５０６〜５２４ｎｍ
本発明の新規蛍光タンパク質が前記（Ｆ１−１）〜（Ｆ１−４６）である場合、前記（Ｆ１−１）〜（Ｆ１−４６）は、例えば、それぞれ、以下のような化学的特性を有する。なお、前記（Ｆ１−１）〜（Ｆ１−４６）の励起波長または蛍光波長において、複数の蛍光強度の極大値が存在する場合、複数の励起極大波長および蛍光極大波長を示している。
（Ｆ１−１）
励起波長：３５０〜５６０ｎｍ
励起極大波長：３９６〜４０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
励起波長：３５０〜５６０ｎｍ
励起極大波長：３９６〜４０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
（Ｆ１−２）
励起波長：３５０〜６００ｎｍ
励起極大波長：５０１〜５０９ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
励起波長：３５０〜６００ｎｍ
励起極大波長：５０１〜５０９ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
（Ｆ１−３）
励起波長：３５０〜６２０ｎｍ
励起極大波長：３９６〜４０４ｎｍ、５０６〜５１４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１６〜５２４ｎｍ
励起波長：３５０〜６２０ｎｍ
励起極大波長：３９６〜４０４ｎｍ、５０６〜５１４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１６〜５２４ｎｍ
（Ｆ１−４）
励起波長：３５０〜６２５ｎｍ
励起極大波長：４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
励起波長：３５０〜６２５ｎｍ
励起極大波長：４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
（Ｆ１−５）
励起波長：３５０〜６１５ｎｍ
励起極大波長：５０１〜５０９ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
励起波長：３５０〜６１５ｎｍ
励起極大波長：５０１〜５０９ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
（Ｆ１−６）
励起波長：３５０〜６２５ｎｍ
励起極大波長：３９１〜３９９ｎｍ、５０６〜５１４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１６〜５２４ｎｍ
励起波長：３５０〜６２５ｎｍ
励起極大波長：３９１〜３９９ｎｍ、５０６〜５１４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１６〜５２４ｎｍ
（Ｆ１−７）
励起波長：３５０〜６２５ｎｍ
励起極大波長：４７６〜４８４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５０６〜５１４ｎｍ
励起波長：３５０〜６２５ｎｍ
励起極大波長：４７６〜４８４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５０６〜５１４ｎｍ
（Ｆ１−８）
励起波長：３５０〜６０５ｎｍ
励起極大波長：４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
励起波長：３５０〜６０５ｎｍ
励起極大波長：４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
（Ｆ１−９）
励起波長：３５０〜６１５ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
励起波長：３５０〜６１５ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
（Ｆ１−１０）
励起波長：３５０〜５９０ｎｍ
励起極大波長：３９１〜３９９ｎｍ、５０６〜５１４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１６〜５２４ｎｍ
励起波長：３５０〜５９０ｎｍ
励起極大波長：３９１〜３９９ｎｍ、５０６〜５１４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１６〜５２４ｎｍ
（Ｆ１−１１）
励起波長：３５０〜５７５ｎｍ
励起極大波長：４７６〜４８４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５０６〜５１４ｎｍ
励起波長：３５０〜５７５ｎｍ
励起極大波長：４７６〜４８４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５０６〜５１４ｎｍ
（Ｆ１−１２）
励起波長：３５０〜５９５ｎｍ
励起極大波長：３８６〜３９４ｎｍ、５０６〜５１４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１６〜５２４ｎｍ
励起波長：３５０〜５９５ｎｍ
励起極大波長：３８６〜３９４ｎｍ、５０６〜５１４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１６〜５２４ｎｍ
（Ｆ１−１３）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：３９６〜４０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：３９６〜４０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
（Ｆ１−１４）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
（Ｆ１−１５）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：３９６〜４０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：３９６〜４０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
（Ｆ１−１６）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：３９１〜３９９ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：３９１〜３９９ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
（Ｆ１−１７）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：３９６〜４０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：３９６〜４０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
（Ｆ１−１８）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：３９６〜４０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：３９６〜４０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
（Ｆ１−１９）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：３９６〜４０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：３９６〜４０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
（Ｆ１−２０）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：３９１〜３９９ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：３９１〜３９９ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
（Ｆ１−２１）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：３９１〜３９９ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：３９１〜３９９ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
（Ｆ１−２２）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：３９６〜４０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：３９６〜４０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
（Ｆ１−２３）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：３９１〜３９９ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：３９１〜３９９ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
（Ｆ１−２４）
励起波長：３５０〜６４５ｎｍ
励起極大波長：３９６〜４０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
励起波長：３５０〜６４５ｎｍ
励起極大波長：３９６〜４０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
（Ｆ１−２５）
励起波長：３５０〜５８０ｎｍ
励起極大波長：３９６〜４０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
励起波長：３５０〜５８０ｎｍ
励起極大波長：３９６〜４０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
（Ｆ１−２６）
励起波長：３５０〜５６０ｎｍ
励起極大波長：３９６〜４０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
励起波長：３５０〜５６０ｎｍ
励起極大波長：３９６〜４０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
（Ｆ１−２７）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：３９１〜３９９ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：３９１〜３９９ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
（Ｆ１−２８）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
（Ｆ１−２９）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
（Ｆ１−３０）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
（Ｆ１−３１）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
（Ｆ１−３２）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
（Ｆ１−３３）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
（Ｆ１−３４）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
（Ｆ１−３５）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０６〜４１４ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０６〜４１４ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
（Ｆ１−３６）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ、５０１〜５０９ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ、５０１〜５０９ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
（Ｆ１−３７）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
（Ｆ１−３８）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
（Ｆ１−３９）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４１６〜４２４ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４１６〜４２４ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
（Ｆ１−４０）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
（Ｆ１−４１）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
（Ｆ１−４２）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４１６〜４２４ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４１６〜４２４ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
（Ｆ１−４３）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４２１〜４２９ｎｍ、５０１〜５０９ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４２１〜４２９ｎｍ、５０１〜５０９ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
（Ｆ１−４４）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
（Ｆ１−４５）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
（Ｆ１−４６）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
前記励起波長、前記励起極大波長、前記蛍光波長、および前記蛍光極大波長の測定方法は、特に制限されず、例えば、ＪＩＳ Ｋ０１２０に基づいて行うことができる。前記励起波長、前記励起極大波長、前記蛍光波長、および前記蛍光極大波長の測定方法は、例えば、後述する実施例１の測定方法に準じて行ってもよい。
前記新規蛍光タンパク質は、蛍光活性を有していればよく、例えば、さらに、その他の活性を有してもよい。
＜新規遺伝子＞
本発明の新規遺伝子は、前述のように、下記（ｆ１）〜（ｆ７）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドからなることを特徴とする。
（ｆ１） 配列番号１４の塩基配列からなり、
前記配列番号１４の塩基配列において、
１５４番目の塩基Ｎ１５４、１５５番目の塩基Ｎ１５５、および１５６番目の塩基Ｎ１５６（以下、「Ｎ１５４Ｎ１５５Ｎ１５６コドン」ともいう。）が、任意のアミノ酸をコードするコドンであり、
３９７番目の塩基Ｎ３９７、３９８番目の塩基Ｎ３９８、および３９９番目の塩基Ｎ３９９（以下、「Ｎ３９７Ｎ３９８Ｎ３９９コドン」ともいう。）が、任意のアミノ酸をコードするコドンであり、
４６０番目の塩基Ｎ４６０、４６１番目の塩基Ｎ４６１、および４６２番目の塩基Ｎ４６２（以下、「Ｎ４６０Ｎ４６１Ｎ４６２コドン」ともいう。）が、任意のアミノ酸をコードするコドンであるポリヌクレオチド
（ｆ２） 前記（ｆ１）の１５４番目の塩基Ｎ１５４、１５５番目の塩基Ｎ１５５、１５６番目の塩基Ｎ１５６、３９７番目の塩基Ｎ３９７、３９８番目の塩基Ｎ３９８、３９９番目の塩基Ｎ３９９、４６０番目の塩基Ｎ４６０、４６１番目の塩基Ｎ４６１、および４６２番目の塩基Ｎ４６２以外の塩基配列において、
１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｆ３） 前記（ｆ１）の１５４番目の塩基Ｎ１５４、１５５番目の塩基Ｎ１５５、１５６番目の塩基Ｎ１５６、３９７番目の塩基Ｎ３９７、３９８番目の塩基Ｎ３９８、３９９番目の塩基Ｎ３９９、４６０番目の塩基Ｎ４６０、４６１番目の塩基Ｎ４６１、および４６２番目の塩基Ｎ４６２以外の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｆ４） 前記（ｆ１）の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列からなり、前記相補的な配列において、前記（ｆ１）の１５４番目の塩基Ｎ１５４、１５５番目の塩基Ｎ１５５、１５６番目の塩基Ｎ１５６、３９７番目の塩基Ｎ３９７、３９８番目の塩基Ｎ３９８、３９９番目の塩基Ｎ３９９、４６０番目の塩基Ｎ４６０、４６１番目の塩基Ｎ４６１、および４６２番目の塩基Ｎ４６２に対応する塩基が保存され、蛍光活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｆ５） 配列番号１のアミノ酸配列からなり、
前記配列番号１のアミノ酸配列において、
５２番目のアミノ酸Ｘａａ５２が、任意のアミノ酸であり、
１３３番目のアミノ酸Ｘａａ１３３が、任意のアミノ酸であり、
１５４番目のアミノ酸Ｘａａ１５４が、任意のアミノ酸であるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｆ６） 前記（ｆ５）の５２番目のアミノ酸Ｘａａ５２、１３３番目のアミノ酸Ｘａａ１３３、および１５４番目のアミノ酸Ｘａａ１５４以外のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｆ７） 前記（ｆ５）の５２番目のアミノ酸Ｘａａ５２、１３３番目のアミノ酸Ｘａａ１３３、および１５４番目のアミノ酸Ｘａａ１５４以外のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
本発明の新規遺伝子は、前述のように、下記（ｆ１）〜（ｆ７）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドからなることを特徴とする。
（ｆ１） 配列番号１４の塩基配列からなり、
前記配列番号１４の塩基配列において、
１５４番目の塩基Ｎ１５４、１５５番目の塩基Ｎ１５５、および１５６番目の塩基Ｎ１５６（以下、「Ｎ１５４Ｎ１５５Ｎ１５６コドン」ともいう。）が、任意のアミノ酸をコードするコドンであり、
３９７番目の塩基Ｎ３９７、３９８番目の塩基Ｎ３９８、および３９９番目の塩基Ｎ３９９（以下、「Ｎ３９７Ｎ３９８Ｎ３９９コドン」ともいう。）が、任意のアミノ酸をコードするコドンであり、
４６０番目の塩基Ｎ４６０、４６１番目の塩基Ｎ４６１、および４６２番目の塩基Ｎ４６２（以下、「Ｎ４６０Ｎ４６１Ｎ４６２コドン」ともいう。）が、任意のアミノ酸をコードするコドンであるポリヌクレオチド
（ｆ２） 前記（ｆ１）の１５４番目の塩基Ｎ１５４、１５５番目の塩基Ｎ１５５、１５６番目の塩基Ｎ１５６、３９７番目の塩基Ｎ３９７、３９８番目の塩基Ｎ３９８、３９９番目の塩基Ｎ３９９、４６０番目の塩基Ｎ４６０、４６１番目の塩基Ｎ４６１、および４６２番目の塩基Ｎ４６２以外の塩基配列において、
１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｆ３） 前記（ｆ１）の１５４番目の塩基Ｎ１５４、１５５番目の塩基Ｎ１５５、１５６番目の塩基Ｎ１５６、３９７番目の塩基Ｎ３９７、３９８番目の塩基Ｎ３９８、３９９番目の塩基Ｎ３９９、４６０番目の塩基Ｎ４６０、４６１番目の塩基Ｎ４６１、および４６２番目の塩基Ｎ４６２以外の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｆ４） 前記（ｆ１）の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列からなり、前記相補的な配列において、前記（ｆ１）の１５４番目の塩基Ｎ１５４、１５５番目の塩基Ｎ１５５、１５６番目の塩基Ｎ１５６、３９７番目の塩基Ｎ３９７、３９８番目の塩基Ｎ３９８、３９９番目の塩基Ｎ３９９、４６０番目の塩基Ｎ４６０、４６１番目の塩基Ｎ４６１、および４６２番目の塩基Ｎ４６２に対応する塩基が保存され、蛍光活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｆ５） 配列番号１のアミノ酸配列からなり、
前記配列番号１のアミノ酸配列において、
５２番目のアミノ酸Ｘａａ５２が、任意のアミノ酸であり、
１３３番目のアミノ酸Ｘａａ１３３が、任意のアミノ酸であり、
１５４番目のアミノ酸Ｘａａ１５４が、任意のアミノ酸であるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｆ６） 前記（ｆ５）の５２番目のアミノ酸Ｘａａ５２、１３３番目のアミノ酸Ｘａａ１３３、および１５４番目のアミノ酸Ｘａａ１５４以外のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｆ７） 前記（ｆ５）の５２番目のアミノ酸Ｘａａ５２、１３３番目のアミノ酸Ｘａａ１３３、および１５４番目のアミノ酸Ｘａａ１５４以外のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
前記新規遺伝子は、前記本発明の新規蛍光タンパク質をコードする遺伝子であることから、以下、新規蛍光タンパク質遺伝子ともいう。前記新規蛍光タンパク質遺伝子は、例えば、１種類のポリヌクレオチドを含んでもよいし、２種類以上のポリヌクレオチドを含んでもよい（以下、同様）。
前記（ｆ１）における配列番号１４の塩基配列は、以下の通りである。以下の塩基配列において、３箇所の四角で囲んだ塩基配列（ＮＮＮ）は、１箇所目の塩基配列が、Ｎ１５４Ｎ１５５Ｎ１５６コドン、２箇所目の塩基配列が、Ｎ３９７Ｎ３９８Ｎ３９９コドン、３箇所目の塩基配列が、Ｎ４６０Ｎ４６１Ｎ４６２コドンに対応する塩基配列である。２箇所の下線を引いたコドンは、１箇所目のコドンが、５９２番目の塩基Ｎ５９２、５９３番目の塩基Ｎ５９３、および５９４番目の塩基Ｎ５９４、２箇所目のコドンが、６１３番目の塩基Ｎ６１３、６１４番目の塩基Ｎ６１４、および６１５番目の塩基Ｎ６１５に対応するコドンである。
前記（ｆ１）において、Ｎ１５４Ｎ１５５Ｎ１５６コドンは、任意のアミノ酸をコードするコドンである。前記任意のアミノ酸をコードするコドンは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹをコードするコドンであり、好ましくは、Ｃ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、またはＴをコードするコドンであり、例えば、相対的に低い波長の励起光においても、より強い蛍光を発することから、より好ましくは、Ｃ、Ｍ、またはＴをコードするコドンである。また、前記（ｆ１）において、Ｎ１５４Ｎ１５５Ｎ１５６コドンは、例えば、同一強度の励起光で励起した際に、より強い蛍光を発することから、より好ましくは、Ｈをコードするコドンである。
前記（ｆ１）において、Ｎ３９７Ｎ３９８Ｎ３９９コドンは、任意のアミノ酸をコードするコドンである。前記任意のアミノ酸をコードするコドンは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹをコードするコドンであり、好ましくは、Ｌ、Ｑ、Ｓ、またはＴをコードするコドンである。また、前記（ｆ１）において、Ｎ３９７Ｎ３９８Ｎ３９９コドンは、例えば、同一強度の励起光で励起した際に、より強い蛍光を発することから、より好ましくは、Ｔをコードするコドンである。
前記（ｆ１）において、Ｎ４６０Ｎ４６１Ｎ４６２コドンは、任意のアミノ酸をコードするコドンである。前記任意のアミノ酸をコードするコドンは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹをコードするコドンであり、好ましくは、Ａ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｖ、またはＹをコードするコドンであり、例えば、相対的に低い波長の励起光においても、より強い蛍光を発することから、より好ましくは、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、またはＹをコードするコドンである。また、前記（ｆ１）において、Ｎ４６０Ｎ４６１Ｎ４６２コドンは、例えば、同一強度の励起光で励起した際に、より強い蛍光を発することから、より好ましくは、Ｋをコードするコドンである。
前記（ｆ１）において、Ｎ１５４、Ｎ１５５、およびＮ１５６のコドン、Ｎ３９７、Ｎ３９８、およびＮ３９９のコドン、ならびにＮ４６０、Ｎ４６１、およびＮ４６２のコドンの組合せは、特に制限されず、例えば、
Ｎ１５４Ｎ１５５Ｎ１５６コドンは、Ｃ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、またはＴをコードするコドンであり、
Ｎ３９７Ｎ３９８Ｎ３９９コドンは、Ｌ、Ｑ、Ｓ、またはＴをコードするコドンであり、
Ｎ４６０Ｎ４６１Ｎ４６２コドンは、Ａ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｖ、またはＹをコードするコドンである。
Ｎ１５４Ｎ１５５Ｎ１５６コドンは、Ｃ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、またはＴをコードするコドンであり、
Ｎ３９７Ｎ３９８Ｎ３９９コドンは、Ｌ、Ｑ、Ｓ、またはＴをコードするコドンであり、
Ｎ４６０Ｎ４６１Ｎ４６２コドンは、Ａ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｖ、またはＹをコードするコドンである。
前記（ｆ１）において、Ｎ１５４、Ｎ１５５、およびＮ１５６のコドン、Ｎ３９７、Ｎ３９８、およびＮ３９９のコドン、ならびにＮ４６０、Ｎ４６１、およびＮ４６２のコドンの組合せは、例えば、前記新規蛍光タンパク質遺伝子がコードする新規蛍光タンパク質が、相対的に低い波長の励起光においても、より強い蛍光を発することから、好ましくは、
Ｎ１５４Ｎ１５５Ｎ１５６コドンは、Ｃ、Ｍ、またはＴをコードするコドンであり、
Ｎ３９７Ｎ３９８Ｎ３９９コドンは、Ｌ、Ｑ、Ｓ、またはＴをコードするコドンであり、
Ｎ４６０Ｎ４６１Ｎ４６２コドンは、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、またはＹをコードするコドンである。
以下、前記（ｆ１）がこのようなＸａａ５２、Ｘａａ１３３、およびＸａａ１５４の組合せを有する場合、前記（ｆ１）を、（ｂ１）ともいい、前記（ｆ２）〜（ｆ４）において、前記（ｆ１）が（ｂ１）の場合、前記（ｆ２）〜（ｆ４）を、それぞれ、（ｂ２）〜（ｂ４）ともいう。また、以下の説明において、前記（ｂ２）〜（ｂ４）は、例えば、前記（ｆ２）〜（ｆ４）の説明において、（ｆ１）を（ｂ１）に、（ｆ２）を（ｂ２）に、（ｆ３）を（ｂ３）に、（ｆ４）を（ｂ４）にそれぞれ読み替えて、その説明を援用できる。
Ｎ１５４Ｎ１５５Ｎ１５６コドンは、Ｃ、Ｍ、またはＴをコードするコドンであり、
Ｎ３９７Ｎ３９８Ｎ３９９コドンは、Ｌ、Ｑ、Ｓ、またはＴをコードするコドンであり、
Ｎ４６０Ｎ４６１Ｎ４６２コドンは、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、またはＹをコードするコドンである。
以下、前記（ｆ１）がこのようなＸａａ５２、Ｘａａ１３３、およびＸａａ１５４の組合せを有する場合、前記（ｆ１）を、（ｂ１）ともいい、前記（ｆ２）〜（ｆ４）において、前記（ｆ１）が（ｂ１）の場合、前記（ｆ２）〜（ｆ４）を、それぞれ、（ｂ２）〜（ｂ４）ともいう。また、以下の説明において、前記（ｂ２）〜（ｂ４）は、例えば、前記（ｆ２）〜（ｆ４）の説明において、（ｆ１）を（ｂ１）に、（ｆ２）を（ｂ２）に、（ｆ３）を（ｂ３）に、（ｆ４）を（ｂ４）にそれぞれ読み替えて、その説明を援用できる。
具体例として、本発明の新規蛍光タンパク質遺伝子において、Ｎ１５４、Ｎ１５５、およびＮ１５６のコドン、Ｎ３９７、Ｎ３９８、およびＮ３９９のコドン、ならびにＮ４６０、Ｎ４６１、およびＮ４６２のコドンの組合せは、例えば、下記（ａａ１’）〜（ａａ１１’）および（ａａ１２’）のいずれか１つのアミノ酸の組合せをコードするコドンの組合せである。本発明の新規蛍光タンパク質遺伝子において、Ｎ１５４Ｎ１５５Ｎ１５６コドン、Ｎ３９７Ｎ３９８Ｎ３９９コドン、およびＮ４６０Ｎ４６１Ｎ４６２コドンは、例えば、前記新規蛍光タンパク質遺伝子がコードする新規蛍光タンパク質が、相対的に低い波長の励起光においても、より強い蛍光を発することから、下記（ａａ１’）、（ａａ３’）、（ａａ６’）、（ａａ９’）、（ａａ１０’）、または（ａａ１２’）のアミノ酸の組合せをコードするコドンの組合せであることが好ましく、下記（ａａ１’）または（ａａ９’）のアミノ酸の組合せをコードするコドンの組合せであることが好ましい。また、本発明の新規蛍光タンパク質遺伝子において、Ｎ１５４Ｎ１５５Ｎ１５６コドン、Ｎ３９７Ｎ３９８Ｎ３９９コドン、およびＮ４６０Ｎ４６１Ｎ４６２コドンは、例えば、同一強度の励起光で励起した際に、より強い蛍光を発することから、下記（ａａ２’）のアミノ酸の組合せをコードするコドンの組合せであることが好ましい。本発明の新規遺伝子は、例えば、Ｎ１５４、Ｎ１５５、およびＮ１５６のコドン、Ｎ３９７、Ｎ３９８、およびＮ３９９のコドン、ならびにＮ４６０、Ｎ４６１、およびＮ４６２のコドンの組合せが、それぞれ、Ｈ、ＳおよびＲをコードするコドンの組合せ、ならびにＤ、ＳおよびＲをコードするコドンの組合せの遺伝子を除く。
本発明の新規蛍光タンパク質遺伝子において、Ｎ１５４Ｎ１５５Ｎ１５６コドン、Ｎ３９７Ｎ３９８Ｎ３９９コドン、およびＮ４６０Ｎ４６１Ｎ４６２コドンは、例えば、下記（ｎ１）〜（ｎ１７）および（ｎ１８）のいずれか１つの組合せである。本発明の新規蛍光タンパク質遺伝子において、Ｎ１５４Ｎ１５５Ｎ１５６コドン、Ｎ３９７Ｎ３９８Ｎ３９９コドン、およびＮ４６０Ｎ４６１Ｎ４６２コドンは、例えば、前記新規蛍光タンパク質遺伝子がコードする新規蛍光タンパク質が、相対的に低い波長の励起光においても、より強い蛍光を発することから、下記（ｎ１）、（ｎ２）、（ｎ３）、（ｎ６）、（ｎ１０）、（ｎ１１）、（ｎ１４）、（ｎ１５）、（ｎ１６）、および（ｎ１８）のいずれか１つの組合せが好ましく、相対的に低い波長の励起光において、さらに強い蛍光を発することから、下記（ｎ１）、（ｎ２）、（ｎ３）、（ｎ１４）および（ｎ１５）のいずれか１つの組合せが好ましい。また、本発明の新規蛍光タンパク質遺伝子において、Ｎ１５４Ｎ１５５Ｎ１５６コドン、Ｎ３９７Ｎ３９８Ｎ３９９コドン、およびＮ４６０Ｎ４６１Ｎ４６２コドンは、例えば、前記新規蛍光タンパク質遺伝子がコードする新規蛍光タンパク質が、同一強度の励起光で励起した際に、より強い蛍光を発することから、下記（ｎ４）または（ｎ５）の組合せが好ましい。
本発明の新規蛍光タンパク質遺伝子において、Ｎ６１３、Ｎ６１４、およびＮ６１５のコドンは、前記新規蛍光タンパク質遺伝子がコードする新規蛍光タンパク質が、相対的に低い波長の励起光においても、より強い蛍光を発することから、例えば、Ｉをコードするコドンに置換されていることが好ましい。この場合、Ｉをコードするコドンは、ＡＴＡであることが好ましい。また、本発明の新規蛍光タンパク質遺伝子において、Ｎ５９２、Ｎ５９３、およびＮ５９４のコドンは、前記新規蛍光タンパク質遺伝子がコードする新規蛍光タンパク質が、相対的に低い波長の励起光においても、より強い蛍光を発することから、例えば、ＬまたはＨをコードするコドンに置換されていることが好ましい。この場合、Ｌをコードするコドンは、ＣＴＣであることが好ましく、Ｈをコードするコドンは、ＣＡＣであることが好ましい。本発明の新規蛍光タンパク質遺伝子において、Ｎ５９２、Ｎ５９３、およびＮ５９４、ならびに、Ｎ６１３、Ｎ６１４、およびＮ６１５は、例えば、相対的に低い波長の励起光においても、さらに強い蛍光を発することから、ＬおよびＩをコードするコドンの組合せ、またはＨおよびＩをコードするコドンの組合せに置換されていることがより好ましい。この場合、ＬおよびＩをコードするコドンは、それぞれ、ＣＴＣおよびＡＴＡであることが好ましく、ＨおよびＩをコードするコドンは、それぞれ、ＣＡＣおよびＡＴＡであることが好ましい。
前記（ｆ１）のポリヌクレオチドは、例えば、配列番号１５〜３２、６８〜１００、および１０１からなる群から選択された少なくとも１つの塩基配列からなるポリヌクレオチドがあげられる。前記（ｆ１）が配列番号１５〜３２、および６８〜１０１からなる塩基配列である場合、前記（ｆ１）は、それぞれ、（ｆ１−１）〜（ｆ１−５２）ともいい、前記（ｆ２）は、それぞれ、（ｆ２−１）〜（ｆ２−５２）ともいい、前記（ｆ３）は、それぞれ、（ｆ３−１）〜（ｆ３−５２）ともいい、前記（ｆ４）は、それぞれ、（ｆ４−１）〜（ｆ４−５２）ともいい、前記（ｆ５）は、それぞれ、（ｆ５−１）〜（ｆ５−５２）ともいい、前記（ｆ６）は、それぞれ、（ｆ６−１）〜（ｆ６−５２）ともいい、前記（ｆ７）は、それぞれ、（ｆ７−１）〜（ｆ７−５２）ともいう。
前記（ｂ１）のポリヌクレオチドは、例えば、配列番号１５〜１７、２０、２４、２５、２８〜３０、３２、および６８〜１０１からなる群から選択された少なくとも１つの塩基配列からなるポリヌクレオチドがあげられる。前記（ｂ１）における各配列番号の塩基配列からなるポリヌクレオチドの説明は、前記（ｆ１）における各配列番号の塩基配列からなるポリヌクレオチドの説明を援用できる。
前記（ｆ１）における配列番号１５〜３２、および６８〜１０１の塩基配列は、以下の通りである。前記配列番号１５〜３２の塩基配列は、それぞれ、前記配列番号１４の塩基酸配列において、Ｎ１５４Ｎ１５５Ｎ１５６コドン、Ｎ３９７Ｎ３９８Ｎ３９９コドン、およびＮ４６０Ｎ４６１Ｎ４６２コドンが、前記（ｎ１）〜（ｎ１８）の場合に対応する。また、下記（ｆ１−１）〜（ｆ１−３）は、前記（Ｆ１−１）のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであり、下記（ｆ１−４）および（ｆ１−５）は、前記（Ｆ１−２）のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであり、下記（ｆ１−６）は、前記（Ｆ１−３）のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであり、下記（ｆ１−７）および（ｆ１−８）は、前記（Ｆ１−４）のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであり、下記（ｆ１−９）は、前記（Ｆ１−５）のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであり、下記（ｆ１−１０）および（ｆ１−１１）は、前記（Ｆ１−６）のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであり、下記（ｆ１−１２）は、前記（Ｆ１−７）のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであり、下記（ｆ１−１３）は、前記（Ｆ１−８）のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであり、下記（ｆ１−１４）および（ｆ１−１５）は、前記（Ｆ１−９）のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであり、下記（ｆ１−１６）は、前記（Ｆ１−１０）のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであり、下記（ｆ１−１７）は、前記（Ｆ１−１１）のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであり、下記（ｆ１−１８）は、前記（Ｆ１−１２）のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。前記配列番号６８〜８２の塩基配列は、前記配列番号１４の塩基配列においてＮ１５４Ｎ１５５Ｎ１５６コドン、Ｎ３９７Ｎ３９８Ｎ３９９コドン、およびＮ４６０Ｎ４６１Ｎ４６２コドンが、前記（ｎ３）の場合に対応する。また、下記（ｆ１−１９）〜（ｆ１−３３）は、それぞれ、前記（Ｆ１−１３）〜（Ｆ１−２７）のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。前記配列番号８３〜１０１の塩基配列は、前記配列番号１４の塩基配列においてＮ１５４Ｎ１５５Ｎ１５６コドン、Ｎ３９７Ｎ３９８Ｎ３９９コドン、およびＮ４６０Ｎ４６１Ｎ４６２コドンが、前記（ｎ１５）の場合に対応する。また、下記（ｆ１−３４）〜（ｆ１−５２）は、それぞれ、前記（Ｆ１−２８）〜（Ｆ１−４６）のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。
前記（ｆ２）のポリヌクレオチドは、例えば、前記（ｆ１）のＮ１５４、Ｎ１５５、Ｎ１５６、Ｎ３９７、Ｎ３９８、Ｎ３９９、Ｎ４６０、Ｎ４６１、およびＮ４６２が保存され、前記（ｆ１）のポリヌクレオチドにおいて、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドということもできる。前記（ｆ２）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（ｆ２）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、蛍光活性を有する範囲であればよい。前記（ｆ２）の「１もしくは数個」は、例えば、１〜１３２個、１〜９９個、１〜６６個、１〜３３個、１〜２６個、１〜２０個、１〜１３個、１〜７個、１個、２個、３個、または４個である。前記（ｆ１）において、Ｎ６１３、Ｎ６１４、およびＮ６１５が、Ｉをコードするコドンに置換されている場合、前記（ｆ２）のポリヌクレオチドは、前記（ｆ１）のＮ６１３、Ｎ６１４、およびＮ６１５が保存されていることが好ましい。この場合、前記（ｆ２）のポリヌクレオチドは、例えば、前記（ｆ１）のＮ１５４、Ｎ１５５、Ｎ１５６、Ｎ３９７、Ｎ３９８、Ｎ３９９、Ｎ４６０、Ｎ４６１、Ｎ４６２、Ｎ６１３、Ｎ６１４、およびＮ６１５が保存され、前記（ｆ１）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。また、前記（ｆ１）において、Ｎ５９２、Ｎ５９３およびＮ５９４が、ＬまたはＨをコードするコドンに置換されている場合、前記（ｆ２）のポリヌクレオチドは、前記（ｆ１）のＮ５９２、Ｎ５９３およびＮ５９４が保存されていることが好ましい。この場合、前記（ｆ２）のポリヌクレオチドは、例えば、前記（ｆ１）のＮ１５４、Ｎ１５５、Ｎ１５６、Ｎ３９７、Ｎ３９８、Ｎ３９９、Ｎ４６０、Ｎ４６１、Ｎ４６２、Ｎ５９２、Ｎ５９３およびＮ５９４が保存され、前記（ｆ１）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。前記（ｆ１）において、Ｎ５９２、Ｎ５９３およびＮ５９４、ならびに、Ｎ６１３、Ｎ６１４、およびＮ６１５が、ＬおよびＩをコードするコドンの組合せ、またはＨおよびＩをコードするコドンの組合せに、それぞれ置換されている場合、前記（ｆ２）のポリヌクレオチドは、前記（ｆ１）のＮ１５４、Ｎ１５５、Ｎ１５６、Ｎ３９７、Ｎ３９８、Ｎ３９９、Ｎ４６０、Ｎ４６１、Ｎ４６２、Ｎ５９２、Ｎ５９３、Ｎ５９４、Ｎ６１３、Ｎ６１４、およびＮ６１５が保存されていることが好ましい。この場合、前記（ｆ２）のポリヌクレオチドは、例えば、前記（ｆ１）のＮ１５４、Ｎ１５５、Ｎ１５６、Ｎ３９７、Ｎ３９８、Ｎ３９９、Ｎ４６０、Ｎ４６１、Ｎ４６２、Ｎ５９２、Ｎ５９３、Ｎ５９４、Ｎ６１３、Ｎ６１４、およびＮ６１５が保存され、前記（ｆ１）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。前記「１もしくは数個」は、例えば、前述の説明を援用できる。
前記（ｆ３）のポリヌクレオチドは、例えば、前記（ｆ１）のＮ１５４、Ｎ１５５、Ｎ１５６、Ｎ３９７、Ｎ３９８、Ｎ３９９、Ｎ４６０、Ｎ４６１、およびＮ４６２が保存され、前記（ｆ１）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドということもできる。前記（ｆ３）において、「同一性」は、例えば、前記（ｆ３）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、蛍光活性を有する範囲であればよい。前記（ｆ３）の同一性は、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。前記（ｆ１）において、Ｎ６１３、Ｎ６１４、およびＮ６１５が、Ｉをコードするコドンに置換されている場合、前記（ｆ３）のポリヌクレオチドは、前記（ｆ１）のＮ６１３、Ｎ６１４、およびＮ６１５が保存されていることが好ましい。この場合、前記（ｆ３）のポリヌクレオチドは、例えば、前記（ｆ１）のＮ１５４、Ｎ１５５、Ｎ１５６、Ｎ３９７、Ｎ３９８、Ｎ３９９、Ｎ４６０、Ｎ４６１、Ｎ４６２、Ｎ６１３、Ｎ６１４、およびＮ６１５が保存され、前記（ｆ１）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。また、前記（ｆ１）において、Ｎ５９２、Ｎ５９３およびＮ５９４が、ＬまたはＨをコードするコドンに置換されている場合、前記（ｆ３）のポリヌクレオチドは、前記（ｆ１）のＮ５９２、Ｎ５９３およびＮ５９４が保存されていることが好ましい。この場合、前記（ｆ３）のポリヌクレオチドは、例えば、前記（ｆ１）のＮ１５４、Ｎ１５５、Ｎ１５６、Ｎ３９７、Ｎ３９８、Ｎ３９９、Ｎ４６０、Ｎ４６１、Ｎ４６２、Ｎ５９２、Ｎ５９３およびＮ５９４が保存され、前記（ｆ１）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。前記（ｆ１）において、Ｎ５９２、Ｎ５９３およびＮ５９４、ならびに、Ｎ６１３、Ｎ６１４、およびＮ６１５が、ＬおよびＩをコードするコドンの組合せ、またはＨおよびＩをコードするコドンの組合せに、それぞれ置換されている場合、前記（ｆ３）のポリヌクレオチドは、前記（ｆ１）のＮ１５４、Ｎ１５５、Ｎ１５６、Ｎ３９７、Ｎ３９８、Ｎ３９９、Ｎ４６０、Ｎ４６１、Ｎ４６２、Ｎ５９２、Ｎ５９３、Ｎ５９４、Ｎ６１３、Ｎ６１４、およびＮ６１５が保存されていることが好ましい。この場合、前記（ｆ３）のポリヌクレオチドは、例えば、前記（ｆ１）のＮ１５４、Ｎ１５５、Ｎ１５６、Ｎ３９７、Ｎ３９８、Ｎ３９９、Ｎ４６０、Ｎ４６１、Ｎ４６２、Ｎ５９２、Ｎ５９３、Ｎ５９４、Ｎ６１３、Ｎ６１４、およびＮ６１５が保存され、前記（ｆ１）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。前記「同一性」は、例えば、前述の説明を援用できる。
前記（ｆ４）において、「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」は、例えば、前記（ｆ１）のポリヌクレオチドに対して、完全または部分的に相補的なポリヌクレオチドである。前記ハイブリダイズは、例えば、各種ハイブリダイゼーションアッセイにより検出できる。前記ハイブリダイゼーションアッセイは、特に制限されず、例えば、ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Molecular Cloning： A Laboratory Manual 2nd Ed.）」〔Cold Spring Harbor Laboratory Press （１９８９）〕等に記載されている方法を採用することもできる。
前記（ｆ４）において、「ストリンジェントな条件」は、例えば、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件、高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃の条件である。ストリンジェンシーの程度は、当業者であれば、例えば、温度、塩濃度、プローブの濃度および長さ、イオン強度、時間等の条件を適宜選択することで、設定可能である。「ストリンジェントな条件」は、例えば、前述したザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Molecular Cloning： A Laboratory Manual 2nd Ed.）」〔Cold Spring Harbor Laboratory Press （１９８９）〕等に記載の条件を採用することもできる。
前記（ｆ５）のポリヌクレオチドは、例えば、前記（ｆ５）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、蛍光活性を有する塩基配列であればよい。前記（ｆ５）のポリヌクレオチドの塩基配列は、例えば、前記配列番号１のアミノ酸配列、Ｘａａ５２、Ｘａａ１３３、およびＸａａ１５４のアミノ酸に基づいて、対応するコドンに置き換えることで設計可能である。前記（ｆ５）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、例えば、前記本発明の新規タンパク質における（Ｆ１）のタンパク質ということもでき、その説明を援用できる。
前記（ｆ５）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質、すなわち前記（Ｆ１）のＸａａ５２、Ｘａａ１３３、およびＸａａ１５４のアミノ酸の組合せが、前記（Ｂ１）のＸａａ５２、Ｘａａ１３３、およびＸａａ１５４のアミノ酸の組合せである場合、前記（ｆ５）を、（ｂ５）ともいい、前記（ｆ６）および（ｆ７）において、前記（ｆ５）が（ｂ５）の場合、前記（ｆ６）および（ｆ７）を、それぞれ（ｂ６）および（ｂ７）ともいう。また、以下の説明において、また、以下の説明において、前記（ｂ６）および（ｂ７）は、例えば、前記（ｆ６）および（ｆ７）の説明において、（ｆ６）を（ｂ６）に、（ｆ７）を（ｂ７）に、（Ｆ２）を（Ｂ２）に、（Ｆ３）を（Ｂ３）に、それぞれ読み替えて、その説明を援用できる。
前記（ｆ６）において、アミノ酸配列に関する「１もしくは数個」は、例えば、前記（ｆ６）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、蛍光活性を有する範囲であればよい。前記（ｆ６）の「１もしくは数個」は、例えば、１〜４３個、１〜３３個、１〜２２個、１〜１１個、１〜９個、１〜７個、１〜５個、１〜３個、１または２個である。前記（ｆ６）のタンパク質は、前記本発明の新規タンパク質における前記（Ｆ２）のタンパク質ということもでき、その説明を援用できる。
前記（ｆ７）において、アミノ酸配列に関する「同一性」は、例えば、前記（ｆ７）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、蛍光活性を有する範囲であればよい。前記（ｆ７）の同一性は、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。前記（ｆ７）のタンパク質は、前記本発明の新規タンパク質における前記（Ｆ３）のタンパク質ということもでき、その説明を援用できる。
本発明において、前記各種ポリヌクレオチドは、例えば、公知の遺伝子工学的手法または合成手法によって製造できる。
＜新規タンパク質の発現ベクター＞
本発明の発現ベクターは、前述のように、前記本発明の新規遺伝子を含むことを特徴とする。本発明の発現ベクターによれば、例えば、前記発現ベクターを前記宿主に導入することで、前記本発明の新規タンパク質を容易に製造できる。本発明の発現ベクターは、例えば、前記本発明の新規遺伝子の説明等を援用できる。
本発明の発現ベクターは、前述のように、前記本発明の新規遺伝子を含むことを特徴とする。本発明の発現ベクターによれば、例えば、前記発現ベクターを前記宿主に導入することで、前記本発明の新規タンパク質を容易に製造できる。本発明の発現ベクターは、例えば、前記本発明の新規遺伝子の説明等を援用できる。
前記発現ベクターは、例えば、前記本発明の新規遺伝子である前記ポリヌクレオチドがコードする新規タンパク質を発現可能なように、機能的に、前記ポリヌクレオチドを含んでいればよく、その他の構成は、特に制限されない。
前記発現ベクターは、例えば、骨格となるベクター（以下、「基本ベクター」ともいう。）に、前記ポリヌクレオチドを挿入することで作製できる。前記ベクターの種類は、特に制限されず、例えば、前記宿主の種類に応じて、適宜決定できる。前記ベクターは、ウイルスベクターおよび非ウイルスベクターがあげられる。前記ベクターは、例えば、バイナリーベクターが好ましい。植物に形質転換を行う場合、前記ベクターは、Ｔ−ＤＮＡ型バイナリーベクターが好ましい。アグロバクテリウムを使用する方法により、植物に形質転換を行う場合、前記ベクターは、例えば、ｐＢＩ１２１ベクター、ｐＰＺＰ２０２ベクター、ｐＢＩＮＰＬＵＳベクター、ｐＢＩＮ１９ベクター、ｐＢＩＧ２１１３Ｎ、ｐＢＩＧ２１１３ＳＦ、ｐＲＩ１０１ＤＮＡベクター（ＴａＫａＲａ社製）、ｐＲＩ２０１ＤＮＡベクター（ＴａＫａＲａ社製）、ｐＲＩ９０９ＤＮＡベクター（ＴａＫａＲａ社製）、ｐＲＩ９１０ＤＮＡベクター（ＴａＫａＲａ社製）等があげられる。大腸菌等の微生物に形質転換を行う場合、前記ベクターは、例えば、ｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクター（ノバジェン社）、ｐＱＥ−８０Ｌベクター（ＱＩＡＧＥＮ社）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫベクター、ｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＧＥＸ−６Ｐ−１ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、ｐｃＤＮＡ３．２／Ｖ５−ＧＷ／Ｄ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＥＧＦＰベクター、ｐｃＤＮＡ３．１−ｈｙｇｒｏ（−）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等があげられる。
前記発現ベクターは、例えば、前記ポリヌクレオチドの発現および前記ポリヌクレオチドがコードする前記本発明の新規タンパク質の発現を調節する、調節配列を有することが好ましい。前記調節配列は、例えば、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル配列、複製起点配列（ｏｒｉ）等があげられる。前記発現ベクターにおいて、前記調節配列の配置は特に制限されない。前記発現ベクターにおいて、前記調節配列は、例えば、前記ポリヌクレオチドの発現およびこれがコードする前記新規タンパク質の発現を、機能的に調節できるように配置されていればよく、公知の方法に基づいて配置できる。前記調節配列は、例えば、前記基本ベクターが予め備える配列を利用してもよいし、前記基本ベクターに、さらに、前記調節配列を挿入してもよいし、前記基本ベクターが備える調節配列を、他の調節配列に置き換えてもよい。
前記発現ベクターは、例えば、さらに、選択マーカーのコード配列を有してもよい。前記選択マーカーは、例えば、薬剤耐性マーカー、蛍光タンパク質マーカー、酵素マーカー、細胞表面レセプターマーカー等があげられる。
＜新規タンパク質の製造方法＞
本発明の新規タンパク質の製造方法は、特に制限されず、例えば、遺伝子工学的手法により製造してもよいし、公知の合成方法により製造してもよい。前者の場合、本発明の製造方法は、前記本発明の新規遺伝子を発現させる発現工程を含む。これにより、本発明の新規タンパク質の製造方法は、例えば、前記本発明の新規蛍光タンパク質を容易に製造できる。
本発明の新規タンパク質の製造方法は、特に制限されず、例えば、遺伝子工学的手法により製造してもよいし、公知の合成方法により製造してもよい。前者の場合、本発明の製造方法は、前記本発明の新規遺伝子を発現させる発現工程を含む。これにより、本発明の新規タンパク質の製造方法は、例えば、前記本発明の新規蛍光タンパク質を容易に製造できる。
前記本発明の新規遺伝子であるポリヌクレオチドの発現は、例えば、前記本発明の発現ベクターを使用して行ってもよい。
前記ポリヌクレオチドを発現させる方法は、特に制限されず、公知の方法が採用でき、例えば、無細胞タンパク質合成系を使用してもよいし、宿主を使用してもよい。
前者の場合、無細胞タンパク質合成系において前記ポリヌクレオチドを発現させることが好ましい。この場合、前記ポリヌクレオチドの発現には、発現ベクターを使用してもよい。前記無細胞タンパク質合成系は、例えば、細胞抽出液と、各種成分を含むバッファーと、目的のポリヌクレオチドが導入された発現ベクターとを用いて、公知の方法により行うことができ、例えば、市販の試薬キットが使用できる。
後者の場合、例えば、前記ポリヌクレオチドが導入された前記宿主を使用し、前記宿主の培養により、前記宿主において前記ポリヌクレオチドを発現させることが好ましい。このように、例えば、前記ポリヌクレオチドを宿主に導入することで、本発明の新規タンパク質を合成する形質転換体を製造でき、また、前記形質転換体の培養により、本発明の新規タンパク質を合成できる。
前記宿主は、例えば、微生物、植物、動物、昆虫またはこれらの培養細胞等の非ヒト宿主、単離したヒト細胞またはその培養細胞等があげられ、好ましくは、植物である。前記宿主が植物の場合、前記植物は、例えば、植物体またはその部分であってもよい。前記植物体の部分は、例えば、器官、組織、細胞または栄養繁殖体等があげられる。前記器官は、例えば、花弁、花冠、花、葉、種子、果実、茎、根等があげられる。前記組織は、例えば、前記器官の部分である。前記細胞は、例えば、前記植物体またはその組織から採取した細胞、前記細胞の培養細胞、プロトプラスト、カルス等があげられる。前記植物の由来は、特に制限されず、例えば、アブラナ科、ナス科、イネ科、マメ科、バラ科、ナデシコ科、キク科、リンドウ科、ゴマノハグサ科、クマツヅラ科、サクラソウ科、サボテン科、ラン科等があげられる。前記アブラナ科は、例えば、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）等のシロイヌナズナ属等があげられる。前記ナス科は、例えば、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）等のタバコ属、ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ×ｈｙｂｒｉｄａ）等のツクバネアサガオ属（Ｐｅｔｕｎｉａ）、ニーレンベルギア（Ｎｉｅｒｅｍｂｅｒｇｉａ ｈｉｐｐｏａｍａｎｉｃａ）等のアマモドキ属、カリブラコア（Ｃａｌｉｂｒａｃｈｏａ ｈｙｂｒｉｄ Ｃｕｌｔｉｖａｒ）等のカリブラコア属等があげられる。前記イネ科は、例えば、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）等のトウモロコシ属、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）等のイネ属等があげられる。前記マメ科は、例えば、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）等のダイズ属等があげられる。前記バラ科は、例えば、バラ（Ｒｏｓａ）等のバラ属があげられる。前記ナデシコ科は、例えば、カーネーション（Ｄｉａｎｔｈｕｓ ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ）等のナデシコ属等があげられる。前記キク科は、例えば、栽培ギク（Ｃｈｒｙｓａｎｔｅｍｕｍ ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ）等のキク属、ガーベラ（Ｇｅｒｂｅｒａ ｃｖｓ．）等のガーベラ（オオセンボンヤリ）属等があげられる。前記リンドウ科は、例えば、トルコキキョウ（Ｅｕｓｔｏｍａ ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ）等のユーストマ属等があげられる。前記ゴマノハグサ科は、例えば、トレニア（Ｔｏｒｅｎｉａ ｆｏｕｒｎｉｅｒｉ）等のトレニア属等があげられる。前記クマツヅラ科は、例えば、バーベナ（Ｇａｒｄｅｎ ｖｅｒｂｅｎａ）等のバーベナ属等があげられる。前記サクラソウ科は、例えば、シクラメン（Ｃｙｃｌａｍｅｎ ｐｅｒｓｉｃｕｍ）等のシクラメン属等があげられる。前記サボテン科は、例えば、アウストロキリンドロプンティア属、アストロフィツム属、エキノカクツス属、エキノセレウス属、エキノプシス属、エピフィラム属、オプンティア属、カニバサボテン属、カマエセレウス属、キリンドロプンティア属、ギムノカリキウム属、シャコバサボテン属、セレニセレウス属、テフロカクツス属、ネオブクスバウミア属、ネオライモンディア属、ノパレア属、フェロカクツス属、マミラリア属、メロカクツス属、リプサリス属、ロセオカクツス属、ロフォフォラ属等があげられる。前記ラン科は、例えば、ファレノプシス（Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ ｃｖｓ．）等のファレノプシス（コチョウラン）属、シンビジウム（Ｃｙｍｂｉｄｉｕｍ ｃｖｓ．）等のシンビジウム（シュンラン）属、デンドロビウムのノビル系（Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｎｏｂｉｌｅ ｈｙｂｒｉｄｓ）、デンドロビウムのデンファレ系（Ｄ． ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ ｈｙｂｒｉｄｓ）等のデンドロビウム（セッコク）属、オンシジウム（Ｏｎｃｉｄｉｕｍ ｃｖｓ．）等のオンシジウム属、カトレア（Ｃａｔｔｌｅｙａ ｃｖｓ．）等のカトレア属等があげられる。前記微生物は、例えば、真核生物、原核生物等があげられる。前記原核生物は、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属等の細菌があげられる。前記真核生物は、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等の酵母等があげられる。前記動物細胞は、例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等があげられ、前記昆虫細胞は、例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１等があげられる。
前記ポリヌクレオチドを前記宿主に導入する方法、すわなち、前記宿主の形質転換の方法は、特に制限されず、例えば、前記発現ベクターを用いて導入する方法でもよいし、前記発現ベクターを用いずに導入する公知の方法でもよい。後者の場合、前記導入方法は、例えば、前記宿主の種類に応じて、適宜設定できる。前記導入方法は、例えば、ヒートショック法、酢酸リチウム法、パーティクルガン等の遺伝子銃による導入法、リン酸カルシウム法、ポリエチレングリコール法、リポソームを用いるリポフェクション法、エレクトロポレーション法、超音波核酸導入法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、微小ガラス管等を用いた直接注入法、ハイドロダイナミック法、カチオニックリポソーム法、導入補助剤を用いる方法、アグロバクテリウムを介する方法等があげられる。前記リポソームは、例えば、リポフェクタミンおよびカチオニックリポソーム等があげられ、前記導入補助剤は、例えば、アテロコラーゲン、ナノ粒子およびポリマー等があげられる。前記宿主が植物の場合、前記導入方法は、アグロバクテリウムを介する方法が好ましい。前記本発明の新規遺伝子であるポリヌクレオチドは、例えば、前記本発明の発現ベクターにより前記宿主に導入してもよい。
前記宿主の培養の方法は、特に制限されず、前記宿主の種類に応じて適宜設定できる。前記宿主の培養に使用する培地は、特に制限されず、前記宿主の種類に応じて適宜決定できる。
前記宿主の培養に使用する培地の形態は、特に制限されず、例えば、固体培地、液体培地、寒天培地等、従来公知の培地を適宜使用できる。前記培地に含まれる成分は、特に制限されない。前記培地は、例えば、市販の培地を含んでもよい。前記宿主が植物である場合、前記植物の市販培地は、特に制限されず、例えば、Murashige-Skoog（ＭＳ）培地等があげられる。前記宿主が植物細胞である場合、前記植物細胞の市販培地は、特に制限されず、例えば、ハイポネックス培地、ＭＳ培地、Gamborg B5（Ｂ５）培地、White培地等があげられる。前記宿主が微生物である場合、前記微生物の市販培地は、特に制限されず、例えば、ＬＢ培地、スーパーブロス培地、Ｍ９培地等があげられる。前記培地は、例えば、１種類を単独で使用してもよいし、２種類以上を併用してもよい。前記培地のｐＨは、特に制限されず、例えば、ｐＨ６〜８の範囲、ｐＨ６．５〜７．５の範囲である。
前記宿主の培養方法は、特に制限されず、例えば、前記宿主の種類に応じて、適宜決定できる。前記宿主が植物の場合、前記培養方法は、例えば、前記植物を土壌栽培、水性栽培する方法等があげられる。前記植物が植物細胞の場合、前記培養方法は、例えば、カルス培養、根の培養、胚珠培養、胚培養等があげられる。
前記宿主の培養時の培養温度は、特に制限されず、例えば、前記宿主の種類に応じて、適宜決定できる。前記宿主が植物の場合、前記培養温度は、例えば、植物の生育可能温度、生育最適温度等があげられる。具体的には、前記培養温度は、例えば、１５〜４０℃の範囲、３０〜３７℃の範囲等で行うことができる。前記宿主が植物細胞の場合、前記培養温度は、例えば、植物細胞の生育可能温度、生育最適温度等があげられる。具体的には、前記培養温度は、例えば、１５〜４０℃の範囲、３０〜３７℃の範囲等で行うことができる。
前記宿主は、例えば、好気的条件下で培養してもよく、嫌気的条件下で培養してもよい。前記好気的条件または嫌気的条件は、特に制限されず、従来公知の方法を用いて設定できる。
＜形質転換体＞
本発明の形質転換体は、前述のように、前記本発明の新規遺伝子を含むことを特徴とする。本発明の形質転換体は、前記本発明の新規遺伝子を含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の形質転換体は、前記本発明の新規遺伝子を含むため、例えば、蛍光活性を有する。本発明の形質転換体は、例えば、前記本発明の新規タンパク質等の説明を援用できる。
本発明の形質転換体は、前述のように、前記本発明の新規遺伝子を含むことを特徴とする。本発明の形質転換体は、前記本発明の新規遺伝子を含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の形質転換体は、前記本発明の新規遺伝子を含むため、例えば、蛍光活性を有する。本発明の形質転換体は、例えば、前記本発明の新規タンパク質等の説明を援用できる。
本発明において、前記形質転換体は、特に制限されず、動物、植物等があげられるが、植物が好ましい。前記形質転換体が動物である場合、前記形質転換体としては、例えば、ヒト大腸がん細胞等のがん細胞があげられる。前記形質転換体が植物である場合、前記植物および植物の由来は、特に制限されず、例えば、前述の説明を援用できる。具体的に、前記植物は、例えば、植物体またはその部分であってもよい。前記植物体の部分は、例えば、器官、組織、細胞または栄養繁殖体等があげられる。前記器官は、例えば、花弁、花冠、花、葉、種子、果実、茎、根等があげられる。前記組織は、例えば、前記器官の部分である。前記細胞は、例えば、前記植物体またはその組織から採取した細胞、前記細胞の培養細胞、プロトプラスト、カルス等があげられる。
本発明において、前記形質転換体が植物の場合、本発明の形質転換体は、例えば、さらに繁殖させることができる。この際、本発明の形質転換体は、前記繁殖材料として使用できる。前記繁殖材料は、特に制限されず、例えば、前記形質転換体の全体でもよいし、部分でもよい。前記形質転換体が、前記植物体またはその部分の場合、前記繁殖材料は、例えば、種子、果実、シュート、塊茎等の茎、塊根等の根、株、プロトプラスト、カルス等があげられる。
本発明の形質転換体の繁殖方法は、特に制限されず、公知の方法が採用できる。前記繁殖方法は、例えば、有性生殖および無性生殖のいずれでもよく、好ましくは無性生殖である。前記無性生殖による繁殖は、例えば、栄養繁殖（vegetative propagation）があげられ、栄養生殖（vegetative reproduction）ともいう。前記栄養繁殖の方法は、特に制限されず、前記植物体またはその部分の場合、例えば、挿し芽、挿し木による繁殖、器官からの植物個体への細分化、カルスによる増殖等があげられる。前記器官は、例えば、前述したような葉、茎、根等が利用できる。
前記形質転換体を栄養繁殖することにより得られる繁殖体を、以下、本発明の栄養繁殖体という。本発明の栄養繁殖体は、前記本発明の形質転換体と同一の性質を有することが好ましい。本発明の栄養繁殖体は、前記形質転換体と同様に、特に制限されず、例えば、植物体またはその部分があげられる。
また、前記形質転換体を有性生殖した場合、例えば、種子、これから生育した生育体等の子孫が得られる。本発明の子孫は、前記本発明の形質転換体と同一の性質を得ることが好ましい。本発明の子孫は、例えば、前記形質転換体と同様に、例えば、植物体またはその部分のいずれでもよい。
本発明の形質転換体は、例えば、さらに加工してもよい。加工する前記形質転換体の種類は、特に制限されず、例えば、花、葉、枝等があげられる。前記形質転換体の加工品は、特に制限されず、例えば、花、葉、枝等を乾燥させたポプリ、押し花、ドライフラワー、プリザーブドフラワー、樹脂密封品等があげられる。また、本発明の加工品は、例えば、前記形質転換体の栄養繁殖体、器官、組織または細胞の加工品でもよい。
＜形質転換体の製造方法＞
本発明の形質転換体の製造方法は、前述のように、宿主に、本発明の新規遺伝子を導入する導入工程を含むことを特徴とする。本発明の形質転換体の製造方法は、宿主に、本発明の新規遺伝子を導入する導入工程を含むことを特徴とし、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の形質転換体の製造方法によれば、例えば、前記本発明の形質転換体を容易に製造できる。
本発明の形質転換体の製造方法は、前述のように、宿主に、本発明の新規遺伝子を導入する導入工程を含むことを特徴とする。本発明の形質転換体の製造方法は、宿主に、本発明の新規遺伝子を導入する導入工程を含むことを特徴とし、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の形質転換体の製造方法によれば、例えば、前記本発明の形質転換体を容易に製造できる。
本発明の形質転換体の製造方法は、さらに、前記宿主に、前記新規遺伝子を発現させる発現工程を含んでいてもよい。
前記導入工程において、本発明の新規遺伝子を前記宿主に導入する方法は、特に制限されず、例えば、前記本発明の新規タンパク質の製造方法における前記ポリヌクレオチドを前記宿主に導入する方法の説明を援用できる。本発明の製造方法において、前記宿主は、植物が好ましい。
前記発現工程は、例えば、宿主内で、本発明の新規遺伝子から本発明の新規タンパク質を発現させる工程である。前記発現工程において、前記宿主は、例えば、本発明の新規遺伝子または前記発現ベクターが導入された形質転換体であることが好ましく、前記形質転換体の培養により、前記宿主において本発明の新規タンパク質を発現させることが好ましい。
前記宿主が植物の場合、本発明の形質転換体の製造方法は、さらに、前記導入工程により得られた形質転換体を繁殖する繁殖工程を含んでもよい。前記繁殖工程における繁殖方法は、例えば、前述の説明を援用できる。また、本発明の形質転換体の製造方法は、繁殖した形質転換体から採種する採種工程を含んでもよく、さらに、前記採種工程で得られた種子から生育体を生育する生育工程を含んでもよい。
＜新規蛍光タンパク質のスクリーニング方法＞
本発明の新規蛍光タンパク質のスクリーニング方法（以下、「本発明のスクリーニング方法」ともいう。）は、前述のように、前記本発明の新規タンパク質に変異を導入した候補タンパク質から、配列番号１のアミノ酸配列における５２番目のアミノ酸Ｘａａ５２に対応するアミノ酸が、任意のアミノ酸であり、
１３３番目のアミノ酸Ｘａａ１３３に対応するアミノ酸が、任意のアミノ酸であり、
１５４番目のアミノ酸Ｘａａ１５４に対応するアミノ酸が、任意のアミノ酸であり、且つ蛍光活性を有するタンパク質を選抜する選抜工程を含むことを特徴とし、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明のスクリーニング方法によれば、例えば、蛍光活性を有するタンパク質を容易にスクリーニングできる。本発明のスクリーニング方法は、例えば、前記本発明の新規タンパク質、新規遺伝子、発現ベクター、および製造方法等の説明を援用できる。
本発明の新規蛍光タンパク質のスクリーニング方法（以下、「本発明のスクリーニング方法」ともいう。）は、前述のように、前記本発明の新規タンパク質に変異を導入した候補タンパク質から、配列番号１のアミノ酸配列における５２番目のアミノ酸Ｘａａ５２に対応するアミノ酸が、任意のアミノ酸であり、
１３３番目のアミノ酸Ｘａａ１３３に対応するアミノ酸が、任意のアミノ酸であり、
１５４番目のアミノ酸Ｘａａ１５４に対応するアミノ酸が、任意のアミノ酸であり、且つ蛍光活性を有するタンパク質を選抜する選抜工程を含むことを特徴とし、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明のスクリーニング方法によれば、例えば、蛍光活性を有するタンパク質を容易にスクリーニングできる。本発明のスクリーニング方法は、例えば、前記本発明の新規タンパク質、新規遺伝子、発現ベクター、および製造方法等の説明を援用できる。
前記候補タンパク質は、前記本発明の新規タンパク質に変異を導入したタンパク質である。前記新規タンパク質に導入する変異の種類は、特に制限されず、例えば、アミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加である。具体例として、前記候補タンパク質は、例えば、前記新規タンパク質のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、または前記新規タンパク質のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質があげられる。
前記候補タンパク質のアミノ酸配列において、「１もしくは数個」は、例えば、１〜４３個、１〜３３個、１〜２２個、１〜１１個、１〜９個、１〜７個、１〜５個、１〜３個、１または２個である。
前記候補タンパク質のアミノ酸配列において、「同一性」は、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記候補タンパク質は、前記候補タンパク質のアミノ酸配列に基づき、公知のタンパク質の合成方法により製造してもよいし、遺伝子工学的手法により製造してもよい。後者の場合、本発明のスクリーニング方法は、例えば、前記新規タンパク質をコードする塩基配列、すなわち、本発明の新規遺伝子に変異を導入し、変異ポリヌクレオチドを作製する変異工程、前記変異ポリヌクレオチドから前記候補タンパク質を発現させる発現工程を含む。
前記変異工程において、前記新規遺伝子に導入する変異は、特に制限されず、例えば、塩基の欠失、置換、挿入および／または付加である。前記新規遺伝子への変異の導入方法は、特に制限されず、例えば、公知のポリヌクレオチドへの変異導入方法により実施でき、具体例として、前記本発明の新規遺伝子のポリヌクレオチドのランダムな断片化とＰＣＲを用いる再結合により、遺伝子を再構築する方法（いわゆる、ＤＮＡシャフリング法）等があげられる。
前記発現工程において、前記変異ポリヌクレオチドを発現させる方法は、特に制限されず、例えば、前述の本発明の新規タンパク質の製造方法の説明を援用でき、無細胞タンパク質合成系を使用してもよいし、宿主を使用してもよい。前記宿主は、例えば、原核生物、特に、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を用いることが好ましい。
本発明のスクリーニング方法は、例えば、前記発現工程において得られた候補タンパク質を精製する工程を含んでもよい。前記精製方法は、特に制限されず、例えば、塩析、各種カラムクロマトグラフィー等があげられる。前記各種精製工程において使用する溶媒は、特に制限されず、例えば、緩衝液が使用できる。本発明のスクリーニング方法は、例えば、前記発現工程において得られた候補タンパク質を、そのまま後述する選抜工程で使用してもよいし、部分的に精製した部分精製候補タンパク質を使用してもよいし、単一に精製した精製候補タンパク質を使用してもよい。
前記選抜工程は、候補タンパク質から、配列番号１のアミノ酸配列における５２番目のアミノ酸Ｘａａ５２に対応するアミノ酸が、任意のアミノ酸であり、１３３番目のアミノ酸Ｘａａ１３３に対応するアミノ酸が、任意のアミノ酸であり、１５４番目のアミノ酸Ｘａａ１５４に対応するアミノ酸が、任意のアミノ酸であり、且つ蛍光活性を有するタンパク質を選抜する工程である。
前記選抜工程において、選抜された候補タンパク質のＸａａ５２に対応するアミノ酸は、任意のアミノ酸である。前記任意のアミノ酸は、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり、好ましくは、Ｃ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、またはＴであり、例えば、相対的に低い波長の励起光においても、より強い蛍光を発することから、より好ましくは、Ｃ、Ｍ、またはＴである。また、前記選抜された候補タンパク質において、Ｘａａ５２は、例えば、同一強度の励起光で励起した際に、より強い蛍光を発することから、より好ましくは、Ｈである。
前記選抜された候補タンパク質のＸａａ１３３は、任意のアミノ酸である。前記任意のアミノ酸は、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり、好ましくは、Ｌ、Ｑ、Ｓ、またはＴである。また、前記選抜された候補タンパク質において、Ｘａａ１３３は、例えば、同一強度の励起光で励起した際に、より強い蛍光を発することから、より好ましくは、Ｔである。
前記選抜された候補タンパク質において、Ｘａａ１５４は、任意のアミノ酸である。前記任意のアミノ酸は、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり、好ましくは、Ａ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｖ、またはＹであり、例えば、相対的に低い波長の励起光においても、より強い蛍光を発することから、より好ましくは、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、またはＹである。また、前記選抜された候補タンパク質において、Ｘａａ１５４は、例えば、同一強度の励起光で励起した際に、より強い蛍光を発することから、より好ましくは、Ｋである。
前記選抜工程において、前記選抜された候補タンパク質は、例えば、前記配列番号１のアミノ酸配列におけるＸａａ５２に対応するアミノ酸が、Ｃ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、またはＴであり、
Ｘａａ１３３に対応するアミノ酸が、Ｌ、Ｑ、Ｓ、またはＴであり、
Ｘａａ１５４に対応するアミノ酸が、Ａ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｖ、またはＹであり、且つ蛍光活性を有するタンパク質である。
Ｘａａ１３３に対応するアミノ酸が、Ｌ、Ｑ、Ｓ、またはＴであり、
Ｘａａ１５４に対応するアミノ酸が、Ａ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｖ、またはＹであり、且つ蛍光活性を有するタンパク質である。
前記選抜工程において、前記選抜された候補タンパク質は、例えば、前記配列番号１のアミノ酸配列におけるＸａａ５２、Ｘａａ１３３、およびＸａａ１５４に対応するアミノ酸の組合せが、下記（ａａ１）〜（ａａ１１）および（ａａ１２）のいずれか１つの組合せであり、且つ蛍光活性を有するタンパク質である。また、前記選抜工程において、前記選抜された候補タンパク質は、Ｘａａ５２、Ｘａａ１３３、およびＸａａ１５４の組合せが、例えば、相対的に低い波長の励起光においても、より強い蛍光を発することから、下記（ａａ１）、（ａａ３）、（ａａ６）、（ａａ９）、（ａａ１０）、または（ａａ１２）の組合せであり、且つ蛍光活性を有することが好ましく、下記（ａａ１）、または（ａａ９）の組合せであり、且つ蛍光活性を有することが好ましい。また、前記選抜工程において、前記選抜された候補タンパク質は、Ｘａａ５２、Ｘａａ１３３、およびＸａａ１５４の組合せが、例えば、同一強度の励起光で励起した際に、より強い蛍光を発することから、下記（ａａ２）の組合せであり、且つ蛍光活性を有することが好ましい。
前記選抜工程において、前記選抜された候補タンパク質は、Ｘａａ２０５が、例えば、相対的に低い波長の励起光においても、より強い蛍光を発することから、Ｉに置換されており、且つ蛍光活性を有することが好ましい。また、前記選抜工程において、前記選抜された候補タンパク質は、Ｘａａ１９８が、例えば、相対的に低い波長の励起光においても、より強い蛍光を発することから、ＬまたはＨに置換されており、且つ蛍光活性を有することが好ましい。前記選抜工程において、前記選抜された候補タンパク質は、Ｘａａ１９８およびＸａａ２０５は、例えば、相対的に低い波長の励起光においても、さらに強い蛍光を発することから、ＬおよびＩの組合せ、またはＨおよびＩの組合せに、それぞれ置換されており、且つ蛍光活性を有することが好ましい。
前記選抜工程において、前記候補タンパク質のアミノ酸配列の同定方法は、特に制限されず、例えば、公知のアミノ酸の同定方法により実施できる。前記候補タンパク質を前記変異ポリヌクレオチドから発現させる場合、前記候補タンパク質のアミノ酸配列は、例えば、前記変異ポリヌクレオチドの塩基配列のコドンを対応するアミノ酸配列に置き換えることで同定してもよい。
前記選抜工程において、前記候補タンパク質の蛍光活性の確認方法は、特に制限されず、公知の蛍光活性の確認方法が使用でき、例えば、公知の光学測定機器を用い、各励起波長の励起光により生じる蛍光のスペクトルを測定することにより確認できる。前記候補タンパク質を前記大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に発現させている場合、前記蛍光活性の確認方法は、特に制限されず、例えば、ＬＥＤＵＶ（Ｌｉｇｈｔ Ｅｍｉｔｔｉｎｇ Ｄｉｏｄｅ Ｕｌｔｒａ Ｖｉｏｌｅｔ）光源およびＵＶ透過フィルタを用いて、確認できる。
本発明のスクリーニング方法は、前記選抜工程において、前記配列番号１のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質を選抜することが好ましい。前記「同一性」は、例えば、前記選抜された候補タンパク質が、前記蛍光活性を有する範囲であればよい。前記「同一性」は、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
次に、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。
［実施例１］
本発明の新規タンパク質が蛍光活性を有することを確認した。
本発明の新規タンパク質が蛍光活性を有することを確認した。
（１）発現ベクターの構築
新規蛍光タンパク質（配列番号２〜１３）をコードする新規遺伝子（配列番号１７、１８、２０、２１、２３、２５〜２７および２９〜３２）をそれぞれ含む１２種類のベクター挿入配列（配列番号３３）は、化学合成により取得した。前記ベクター挿入配列において、かっこで囲んだ下線部の塩基配列が、前記新規蛍光タンパク質をコードする前記新規遺伝子に対応する塩基配列である。前記ベクター挿入配列における四角で囲んだＮ１５４Ｎ１５５Ｎ１５６コドン、Ｎ３９７Ｎ３９８Ｎ３９９コドン、およびＮ４６０Ｎ４６１Ｎ４６２コドンと、前記新規蛍光タンパク質と、前記新規遺伝子との関係を下記表５に示す。また、Ｎ１５４Ｎ１５５Ｎ１５６コドン、Ｎ３９７Ｎ３９８Ｎ３９９コドン、およびＮ４６０Ｎ４６１Ｎ４６２コドンが、（ｆ１−３）、（ｆ１−４）、（ｆ１−６）、（ｆ１−７）、（ｆ１−９）、（ｆ１−１１）〜（ｆ１−１３）および（ｆ１−１５）〜（ｆ１−１８）であるベクター挿入配列を、それぞれ、（ｆ１−３）、（ｆ１−４）、（ｆ１−６）、（ｆ１−７）、（ｆ１−９）、（ｆ１−１１）〜（ｆ１−１３）および（ｆ１−１５）〜（ｆ１−１８）ベクター挿入配列とした。
新規蛍光タンパク質（配列番号２〜１３）をコードする新規遺伝子（配列番号１７、１８、２０、２１、２３、２５〜２７および２９〜３２）をそれぞれ含む１２種類のベクター挿入配列（配列番号３３）は、化学合成により取得した。前記ベクター挿入配列において、かっこで囲んだ下線部の塩基配列が、前記新規蛍光タンパク質をコードする前記新規遺伝子に対応する塩基配列である。前記ベクター挿入配列における四角で囲んだＮ１５４Ｎ１５５Ｎ１５６コドン、Ｎ３９７Ｎ３９８Ｎ３９９コドン、およびＮ４６０Ｎ４６１Ｎ４６２コドンと、前記新規蛍光タンパク質と、前記新規遺伝子との関係を下記表５に示す。また、Ｎ１５４Ｎ１５５Ｎ１５６コドン、Ｎ３９７Ｎ３９８Ｎ３９９コドン、およびＮ４６０Ｎ４６１Ｎ４６２コドンが、（ｆ１−３）、（ｆ１−４）、（ｆ１−６）、（ｆ１−７）、（ｆ１−９）、（ｆ１−１１）〜（ｆ１−１３）および（ｆ１−１５）〜（ｆ１−１８）であるベクター挿入配列を、それぞれ、（ｆ１−３）、（ｆ１−４）、（ｆ１−６）、（ｆ１−７）、（ｆ１−９）、（ｆ１−１１）〜（ｆ１−１３）および（ｆ１−１５）〜（ｆ１−１８）ベクター挿入配列とした。
前記（ｆ１−３）、（ｆ１−４）、（ｆ１−６）、（ｆ１−７）、（ｆ１−９）、（ｆ１−１１）〜（ｆ１−１３）および（ｆ１−１５）〜（ｆ１−１８）ベクター挿入配列を、それぞれ、制限酵素ＨｉｎｄIIIおよびＥｃｏＲＩを用いて切断し、前記制限酵素で切断したｐＥＧＦＰベクター（ＣＬＯＮＴＥＣ社製）に連結した。前記（ｆ１−３）、（ｆ１−４）、（ｆ１−６）、（ｆ１−７）、（ｆ１−９）、（ｆ１−１１）〜（ｆ１−１３）および（ｆ１−１５）〜（ｆ１−１８）のベクター挿入配列を挿入したベクターを、それぞれ、（ｆ１−３）、（ｆ１−４）、（ｆ１−６）、（ｆ１−７）、（ｆ１−９）、（ｆ１−１１）〜（ｆ１−１３）および（ｆ１−１５）〜（ｆ１−１８）発現ベクターとした。なお、発現ベクター構築は、Ｇｅｎｅ Ｓｃｒｉｐｔ社が行った。
（２）大腸菌への導入
大腸菌ＤＨ５α株に、前記（ｆ１−３）、（ｆ１−４）、（ｆ１−６）、（ｆ１−７）、（ｆ１−９）、（ｆ１−１１）〜（ｆ１−１３）および（ｆ１−１５）〜（ｆ１−１８）発現ベクターを、それぞれ単独で、ヒートショック法により形質導入した。得られた形質転換体を、抗生物質（アンピシリン）１００μｇ／ｍＬを含有するＬＢ培地を用いて、３７℃で１０時間培養した。そして、培養した菌体を集菌し、得られたペレットを、プロテアーゼ阻害剤（ｃＯｍｐｌｅｔｅ，ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ、ロシュ社製）を１錠含むＰＢＳ溶液４０ｍＬを用いて、２回洗浄した。前記洗浄後のペレットを、前記プロテアーゼ阻害剤を含むＰＢＳ溶液８００μＬに懸濁した。つぎに、得られた懸濁液を、超音波ホモジナイザー（ＱＳＯＮＩＣＡ、ワケンビーテック株式会社製）を用いて、Ａｍｐ２５％、１分間の条件で、２回超音波処理した。そして、前記処理後の懸濁液を、１３００ｒｐｍ、４℃の条件で、１０分間遠心し、得られた上清を回収した。以下、前記（ｆ１−３）、（ｆ１−４）、（ｆ１−６）、（ｆ１−７）、（ｆ１−９）、（ｆ１−１１）〜（ｆ１−１３）および（ｆ１−１５）〜（ｆ１−１８）発現ベクターを導入した形質転換体から得られた上清を、それぞれ、（Ｆ１−１）〜（Ｆ１−１２）タンパク質とした。前記各上清中のタンパク質濃度は、前記各上清に、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ Ｒａｄ社製）を添加後、マイクロプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標） Ｍ１０００Ｐｒｏ、ＴＥＣＡＮ社製）を用いて、５９５ｎｍにおける吸光度を測定することにより決定した。
大腸菌ＤＨ５α株に、前記（ｆ１−３）、（ｆ１−４）、（ｆ１−６）、（ｆ１−７）、（ｆ１−９）、（ｆ１−１１）〜（ｆ１−１３）および（ｆ１−１５）〜（ｆ１−１８）発現ベクターを、それぞれ単独で、ヒートショック法により形質導入した。得られた形質転換体を、抗生物質（アンピシリン）１００μｇ／ｍＬを含有するＬＢ培地を用いて、３７℃で１０時間培養した。そして、培養した菌体を集菌し、得られたペレットを、プロテアーゼ阻害剤（ｃＯｍｐｌｅｔｅ，ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ、ロシュ社製）を１錠含むＰＢＳ溶液４０ｍＬを用いて、２回洗浄した。前記洗浄後のペレットを、前記プロテアーゼ阻害剤を含むＰＢＳ溶液８００μＬに懸濁した。つぎに、得られた懸濁液を、超音波ホモジナイザー（ＱＳＯＮＩＣＡ、ワケンビーテック株式会社製）を用いて、Ａｍｐ２５％、１分間の条件で、２回超音波処理した。そして、前記処理後の懸濁液を、１３００ｒｐｍ、４℃の条件で、１０分間遠心し、得られた上清を回収した。以下、前記（ｆ１−３）、（ｆ１−４）、（ｆ１−６）、（ｆ１−７）、（ｆ１−９）、（ｆ１−１１）〜（ｆ１−１３）および（ｆ１−１５）〜（ｆ１−１８）発現ベクターを導入した形質転換体から得られた上清を、それぞれ、（Ｆ１−１）〜（Ｆ１−１２）タンパク質とした。前記各上清中のタンパク質濃度は、前記各上清に、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ Ｒａｄ社製）を添加後、マイクロプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標） Ｍ１０００Ｐｒｏ、ＴＥＣＡＮ社製）を用いて、５９５ｎｍにおける吸光度を測定することにより決定した。
（３）蛍光活性の測定
前記（２）の上清を、前記（２）で得られた各上清のタンパク質濃度に基づき、前記各上清中のタンパク質濃度が、０．２ｍｇ／ｍＬとなるように希釈した。前記希釈後の各上清５０μＬについて、前記マイクロプレートリーダーを用い、下記測定条件で蛍光強度（ＦＩ）を測定した。また、ネガティブコントロールは、前記発現ベクターに代えて、前記ｐＵＣベクターを形質導入した以外は同様にして、測定した。
前記（２）の上清を、前記（２）で得られた各上清のタンパク質濃度に基づき、前記各上清中のタンパク質濃度が、０．２ｍｇ／ｍＬとなるように希釈した。前記希釈後の各上清５０μＬについて、前記マイクロプレートリーダーを用い、下記測定条件で蛍光強度（ＦＩ）を測定した。また、ネガティブコントロールは、前記発現ベクターに代えて、前記ｐＵＣベクターを形質導入した以外は同様にして、測定した。
（測定条件）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ（バンド幅：５ｎｍ）
蛍光（検出）波長：３５０〜６５０ｎｍ（バンド幅：５ｎｍ）
レーザー強度（Ｇａｉｎ）：１０５
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ（バンド幅：５ｎｍ）
蛍光（検出）波長：３５０〜６５０ｎｍ（バンド幅：５ｎｍ）
レーザー強度（Ｇａｉｎ）：１０５
励起波長（Ｅｘ）が３７５ｎｍであり、蛍光波長（Ｅｍ）が５１５ｎｍの場合の結果を下記表６Ａに、励起波長が４０５ｎｍであり、蛍光波長が５１５ｎｍの場合の結果を下記表６Ｂに、励起波長が５００ｎｍであり、蛍光波長が５２５ｎｍの場合の結果を下記表６Ｃに、励起波長が５１０ｎｍであり、蛍光波長が５３５ｎｍの場合の結果を下記表６Ｄに示す。前記表６Ａ〜Ｄに示すように、（Ｆ１−１）〜（Ｆ１−１２）タンパク質は、いずれの波長においても蛍光活性を示した。これに対して、ネガティブコントロール（ｐＵＣ）は、蛍光活性を示さなかった。また、前記表６Ａに示すように、励起波長が３７５ｎｍであり、蛍光波長が５１５ｎｍの場合、（Ｆ１−１）〜（Ｆ１−６）、（Ｆ１−９）、（Ｆ１−１０）、および（Ｆ１−１２）タンパク質の蛍光活性が強く、（Ｆ１−９）タンパク質の蛍光活性が特に強かった。前記表６Ｂに示すように、励起波長が４０５ｎｍであり、蛍光波長が５１５ｎｍの場合、（Ｆ１−１）、（Ｆ１−２）、（Ｆ１−４）、および（Ｆ１−９）タンパク質の蛍光活性が強く、（Ｆ１−９）タンパク質の蛍光活性が特に強かった。前記表６Ｃに示すように、励起波長が５００ｎｍであり、蛍光波長が５２５ｎｍの場合、（Ｆ１−２）タンパク質の蛍光活性が強かった。前記表６Ｄに示すように、励起波長が５１０ｎｍであり、蛍光波長が５３５ｎｍの場合、（Ｆ１−２）タンパク質の蛍光活性が強かった。なお、表には示していないが、前記発現ベクターに代えて、前記（Ｆ１−１）のアミノ酸配列をコードする（ｆ１−１）および（ｆ１−２）のポリヌクレオチド、前記（Ｆ１−２）のアミノ酸配列をコードする（ｆ１−５）のポリヌクレオチド、前記（Ｆ１−４）のアミノ酸配列をコードする（ｆ１−８）のポリヌクレオチド、前記（Ｆ１−６）のアミノ酸配列をコードする（ｆ１−１０）のポリヌクレオチド、ならびに前記（Ｆ１−９）のアミノ酸配列をコードする（ｆ１−１４）のポリヌクレオチドをそれぞれ含む発現ベクターを用い場合においても同様に蛍光活性を示した。これらの結果から、本発明の新規蛍光タンパク質が、蛍光活性を有することがわかった。
また、励起波長の全範囲および蛍光波長の全範囲の測定結果を図１ＡおよびＢに示す。図１ＡおよびＢは、異なる励起波長および蛍光波長における蛍光強度を示すグラフである。図１Ａにおいて、（Ａ）〜（Ｇ）は、それぞれ、（Ｆ１−１）〜（Ｆ１−７）タンパク質の結果を示し、図１Ｂにおいて、（Ｈ）〜（Ｎ）は、それぞれ（Ｆ１−８）〜（Ｆ１−１２）タンパク質、およびネガティブコントロール（ｐＵＣ）の結果、ならびに各グラフにおける各軸の説明を示す。図１Ｂの（Ｎ）に示すように、図１Ａの（Ａ）〜（Ｇ）および図１Ｂの（Ｈ）〜（Ｎ）において、Ｘ軸方向が、励起波長を示し、Ｙ軸方向が、蛍光波長を示し、Ｚ軸方向が、蛍光強度を示す。図１ＡおよびＢの（Ａ）〜（Ｌ）に示すように、（Ｆ１−１）〜（Ｆ１−１２）タンパク質は、蛍光活性を示した。これに対して、図１Ｂの（Ｍ）に示すように、ネガティブコントロールは、蛍光活性を示さなかった。また、図１Ａの（Ｂ）に示すように、（Ｆ１−２）タンパク質は、同一強度の励起光で励起した際に、他のタンパク質と比較してより強い蛍光活性を示した。
さらに、図１Ａの（Ａ）、（Ｃ）および（Ｆ）、ならびに図１Ｂの（Ｉ）、（Ｊ）および（Ｌ）に矢印で示すように、（Ｆ１−１）タンパク質、（Ｆ１−３）タンパク質、（Ｆ１−６）タンパク質、（Ｆ１−９）タンパク質、（Ｆ１−１０）タンパク質、および（Ｆ１−１２）タンパク質は、他のタンパク質と比較して相対的に低い励起波長（３５０〜４３５ｎｍ）においてもより強い蛍光活性を示した。具体的に、前記（Ｆ１−１）タンパク質、（Ｆ１−３）タンパク質、（Ｆ１−６）タンパク質、（Ｆ１−９）タンパク質、（Ｆ１−１０）タンパク質、および（Ｆ１−１２）タンパク質は、下記表７の励起波長で励起した場合においても、５２０ｎｍ付近の蛍光を発した。なお、前記表７において、励起極大波長は、励起波長が３５０〜４３５ｎｍの場合において、蛍光強度が極大値となる励起波長である。
これらの結果から、本発明の新規蛍光タンパク質が、蛍光活性を有することがわかった。
［実施例２］
本発明のスクリーニング方法により、新規蛍光タンパク質をスクリーニングできることを確認した。
本発明のスクリーニング方法により、新規蛍光タンパク質をスクリーニングできることを確認した。
（１）発現ベクターの構築
ＤＮＡシャフリング法を用いて、変異ポリヌクレオチドを作製し、前記変異ポリヌクレオチドをベクターに連結して、変異ポリヌクレオチド発現ベクターを構築した。具体的には、以下のようにして行った。まず、（ｆ１−３）のポリヌクレオチド（配列番号１７）および（ｆ１−１５）のポリヌクレオチド（配列番号２９）を、以下のプライマーセットを用いて、１ｓｔＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）により増幅し、１ｓｔＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲ反応液は、ＴａＫａＲａ ＥＸ Ｔａｑ（登録商標）（タカラバイオ社製）のキットを用い、説明書に従って調製した。
ＤＮＡシャフリング法を用いて、変異ポリヌクレオチドを作製し、前記変異ポリヌクレオチドをベクターに連結して、変異ポリヌクレオチド発現ベクターを構築した。具体的には、以下のようにして行った。まず、（ｆ１−３）のポリヌクレオチド（配列番号１７）および（ｆ１−１５）のポリヌクレオチド（配列番号２９）を、以下のプライマーセットを用いて、１ｓｔＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）により増幅し、１ｓｔＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲ反応液は、ＴａＫａＲａ ＥＸ Ｔａｑ（登録商標）（タカラバイオ社製）のキットを用い、説明書に従って調製した。
プライマーセット
プライマー配列１（配列番号１０２）
5'-ATGCTTCCGGCTCGTATGTTG-3'
プライマー配列２（配列番号１０３）
5'-GTACGGCCGACTAGTAGGCC-3'
プライマー配列１（配列番号１０２）
5'-ATGCTTCCGGCTCGTATGTTG-3'
プライマー配列２（配列番号１０３）
5'-GTACGGCCGACTAGTAGGCC-3'
前記１ｓｔＰＣＲ産物１．９μｇを、デオキシリボヌクレアーゼ（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ、ＤＮａｓｅ）が入った以下の組成の緩衝液に懸濁し、２５℃で２０分間反応させ、さらに、９０℃で１０分間反応させることにより、ＤＮＡの断片化を行った。
［緩衝液の組成］
総量 ４０μＬ
ＤＮａｓｅI（ＴａＫａＲａ 社製）
０．０５Ｕ （（ｆ１−３）のポリヌクレオチドのＰＣＲ産物）
０．０２５Ｕ （（ｆ１−１５）のポリヌクレオチドのＰＣＲ産物）
Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＭｎＣｌ２ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ｐＨ７．４
総量 ４０μＬ
ＤＮａｓｅI（ＴａＫａＲａ 社製）
０．０５Ｕ （（ｆ１−３）のポリヌクレオチドのＰＣＲ産物）
０．０２５Ｕ （（ｆ１−１５）のポリヌクレオチドのＰＣＲ産物）
Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＭｎＣｌ２ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ｐＨ７．４
断片化されたＤＮＡそれぞれを、アガロースゲル電気泳動およびゲル抽出により精製した。そして、得られた精製物を、液中濃度が１０〜３０μｇ／μＬとなるように前記ＰＣＲ反応液に添加し、２ｎｄＰＣＲにより増幅し、多数の２ｎｄＰＣＲ産物を得た。なお、２ｎｄＰＣＲにおいては、前記プライマーセットを用いなかった。そして、前記多数の２ｎｄＰＣＲ産物の５０分の１の量を、それぞれ、前記ＰＣＲ反応液に添加し、前記プライマーセットを用いて、３ｒｄＰＣＲにより増幅し、変異ポリヌクレオチドを得た。前記変異ポリヌクレオチドを、前記制限酵素を用いて切断し、前記制限酵素で切断した前記ｐＥＧＦＰベクターに連結した。前記変異ポリヌクレオチドを挿入したベクターを、変異ポリヌクレオチド発現ベクターとした。このようにして、多数の変異ポリヌクレオチド発現ベクターを得た。
（２）大腸菌への導入
大腸菌ＪＭ１０９株に、前記変異ポリヌクレオチド発現ベクターを、それぞれ単独で、ヒートショック法により形質導入した。得られた形質転換体を、抗生物質（アンピシリン）１００μｇ／ｍＬを含有するＬＢ培地を用いて、約１０００コロニーが生えるまで３７℃で一晩（１８時間）培養した。
大腸菌ＪＭ１０９株に、前記変異ポリヌクレオチド発現ベクターを、それぞれ単独で、ヒートショック法により形質導入した。得られた形質転換体を、抗生物質（アンピシリン）１００μｇ／ｍＬを含有するＬＢ培地を用いて、約１０００コロニーが生えるまで３７℃で一晩（１８時間）培養した。
（３）蛍光活性の確認
そして、培養した菌体を集菌し、光源として、ＬＥＤＵＶ光源（ＮＳ３７５ＬＩＭ、ナイトライド・セミコンダクター社製）、フィルタとして、ＵＬ３６０（オーエムジー社製）を用いて、前記菌体の蛍光活性を確認した。蛍光活性が確認できた前記菌体について、プラスミドを精製し、本実施例２（１）および（２）の操作を、３回繰り返した後に、同様にして、菌体の蛍光活性を確認した。
そして、培養した菌体を集菌し、光源として、ＬＥＤＵＶ光源（ＮＳ３７５ＬＩＭ、ナイトライド・セミコンダクター社製）、フィルタとして、ＵＬ３６０（オーエムジー社製）を用いて、前記菌体の蛍光活性を確認した。蛍光活性が確認できた前記菌体について、プラスミドを精製し、本実施例２（１）および（２）の操作を、３回繰り返した後に、同様にして、菌体の蛍光活性を確認した。
（４）大腸菌のシーケンス
前記（３）で蛍光活性が確認できた菌体のコロニーを収集し、プラスミドを精製し、以下の条件でダイレクトシーケンスに供した。その結果、蛍光活性が確認できた前記菌体は、前記本発明の新規遺伝子（配列番号６８〜１０１）を有していることが確認できた。これらの結果から、本発明のスクリーニング方法により、本発明の新規蛍光タンパク質をスクリーニングできることがわかった。
前記（３）で蛍光活性が確認できた菌体のコロニーを収集し、プラスミドを精製し、以下の条件でダイレクトシーケンスに供した。その結果、蛍光活性が確認できた前記菌体は、前記本発明の新規遺伝子（配列番号６８〜１０１）を有していることが確認できた。これらの結果から、本発明のスクリーニング方法により、本発明の新規蛍光タンパク質をスクリーニングできることがわかった。
［ダイレクトシーケンスの条件］
シーケンサー ABI 3130xl（Applied Biosystems社製）
シーケンス試薬 BigDye Terminator V1-1 cycle sequencing kit（Applied Biosystems社製）
シーケンスプライマー
プライマー配列１（配列番号１０２）
5'-ATGCTTCCGGCTCGTATGTTG-3'
プライマー配列２（配列番号１０３）
5'-GTACGGCCGACTAGTAGGCC-3'
シーケンサー ABI 3130xl（Applied Biosystems社製）
シーケンス試薬 BigDye Terminator V1-1 cycle sequencing kit（Applied Biosystems社製）
シーケンスプライマー
プライマー配列１（配列番号１０２）
5'-ATGCTTCCGGCTCGTATGTTG-3'
プライマー配列２（配列番号１０３）
5'-GTACGGCCGACTAGTAGGCC-3'
［実施例３］
本発明の新規タンパク質が蛍光活性を有することを確認した。なお、実験条件、実験方法等の記載は、特に記載がない限り、前記実施例１と同様とした。
本発明の新規タンパク質が蛍光活性を有することを確認した。なお、実験条件、実験方法等の記載は、特に記載がない限り、前記実施例１と同様とした。
（１）発現ベクターの構築
新規蛍光タンパク質（配列番号３４〜４８）をコードする新規遺伝子（配列番号６８〜８２、（ｆ１−１９）〜（ｆ１−３３））の塩基配列の５’末端に５’末端配列（5’-AAGCTTG-3’）を、３’末端に３’末端配列（5’-AATTC-3’）を付加した１４種類のベクター挿入配列は、それぞれ化学合成により取得した。また、新規蛍光タンパク質（配列番号４９〜６７）をコードする新規遺伝子（配列番号８３〜１０１、（ｆ１−３４）〜（ｆ１−５２））の塩基配列の５’末端に前記５’末端配列（5’-AAGCTTG-3’）を、３’末端に前記３’末端配列（5’-AATTC-3’）を付加した１９種類のベクター挿入配列は、それぞれ化学合成により取得した。前記新規遺伝子が、（ｆ１−１９）〜（ｆ１−５２）であるベクター挿入配列を、それぞれ、（ｆ１−１９）〜（ｆ１−５２）ベクター挿入配列とした。
新規蛍光タンパク質（配列番号３４〜４８）をコードする新規遺伝子（配列番号６８〜８２、（ｆ１−１９）〜（ｆ１−３３））の塩基配列の５’末端に５’末端配列（5’-AAGCTTG-3’）を、３’末端に３’末端配列（5’-AATTC-3’）を付加した１４種類のベクター挿入配列は、それぞれ化学合成により取得した。また、新規蛍光タンパク質（配列番号４９〜６７）をコードする新規遺伝子（配列番号８３〜１０１、（ｆ１−３４）〜（ｆ１−５２））の塩基配列の５’末端に前記５’末端配列（5’-AAGCTTG-3’）を、３’末端に前記３’末端配列（5’-AATTC-3’）を付加した１９種類のベクター挿入配列は、それぞれ化学合成により取得した。前記新規遺伝子が、（ｆ１−１９）〜（ｆ１−５２）であるベクター挿入配列を、それぞれ、（ｆ１−１９）〜（ｆ１−５２）ベクター挿入配列とした。
前記（ｆ１−１９）〜（ｆ１−５２）ベクター挿入配列を、それぞれ、前記制限酵素を用いて切断し、前記制限酵素で切断した前記ｐＥＧＦＰベクターに連結した。前記（ｆ１−１９）〜（ｆ１−５２）のベクター挿入配列を挿入したベクターを、それぞれ、（ｆ１−１９）〜（ｆ１−５２）発現ベクターとした。
（２）大腸菌への導入
下記に示す実験条件以外は、前記実施例１（２）と同様にして、前記（ｆ１−１９）〜（ｆ１−５２）発現ベクターを、前記大腸菌ＤＨ５α株に導入し、前記（ｆ１−１９）〜（ｆ１−５２）を導入した形質転換体から得られた上清を、それぞれ、（Ｆ１−１３）〜（Ｆ１−４６）タンパク質とし、前記各上清中のタンパク質濃度を、吸光度を測定することにより決定した。実験条件は、前記形質転換体の培養時間は１６〜１８時間とし、洗浄後のペレットを懸濁するＰＢＳ溶液は１．５ｍＬとし、得られた懸濁液を、前記超音波ホモジナイザーを用いて、Ａｍｐ３５％、１０秒／３０秒、２分間の条件で、４回の超音波処理とした。前記超音波処理後の懸濁液の遠心条件は、３０００ｒｐｍ、４℃の条件で、１０分間とした。前記各上清中のタンパク質濃度は、前記マイクロプレートリーダーを用いて、５６２ｎｍにおける吸光度を測定することにより決定した。
下記に示す実験条件以外は、前記実施例１（２）と同様にして、前記（ｆ１−１９）〜（ｆ１−５２）発現ベクターを、前記大腸菌ＤＨ５α株に導入し、前記（ｆ１−１９）〜（ｆ１−５２）を導入した形質転換体から得られた上清を、それぞれ、（Ｆ１−１３）〜（Ｆ１−４６）タンパク質とし、前記各上清中のタンパク質濃度を、吸光度を測定することにより決定した。実験条件は、前記形質転換体の培養時間は１６〜１８時間とし、洗浄後のペレットを懸濁するＰＢＳ溶液は１．５ｍＬとし、得られた懸濁液を、前記超音波ホモジナイザーを用いて、Ａｍｐ３５％、１０秒／３０秒、２分間の条件で、４回の超音波処理とした。前記超音波処理後の懸濁液の遠心条件は、３０００ｒｐｍ、４℃の条件で、１０分間とした。前記各上清中のタンパク質濃度は、前記マイクロプレートリーダーを用いて、５６２ｎｍにおける吸光度を測定することにより決定した。
（３）蛍光活性の測定
前記（２）の上清を、前記（２）で得られた各上清のタンパク質濃度に基づき、前記各上清中のタンパク質濃度が、１．５〜２．０ｍｇ／ｍＬとなるように希釈した。前記希釈後の各上清５０〜７０μＬについて、前記マイクロプレートリーダーを用い、前記実施例１（３）と同様の測定条件で蛍光強度（ＦＩ）を測定した。また、コントロールは、前記発現ベクターに代えて、前記（ｆ１−３）発現ベクターおよび前記（ｆ１−１５）発現ベクターを形質導入し、前記（Ｆ１−１）タンパク質および前記（Ｆ１−９）タンパク質を得た以外は同様にして、測定した。
前記（２）の上清を、前記（２）で得られた各上清のタンパク質濃度に基づき、前記各上清中のタンパク質濃度が、１．５〜２．０ｍｇ／ｍＬとなるように希釈した。前記希釈後の各上清５０〜７０μＬについて、前記マイクロプレートリーダーを用い、前記実施例１（３）と同様の測定条件で蛍光強度（ＦＩ）を測定した。また、コントロールは、前記発現ベクターに代えて、前記（ｆ１−３）発現ベクターおよび前記（ｆ１−１５）発現ベクターを形質導入し、前記（Ｆ１−１）タンパク質および前記（Ｆ１−９）タンパク質を得た以外は同様にして、測定した。
（Ｆ１−１３）〜（Ｆ１−２７）タンパク質、（Ｆ１−１）タンパク質および（Ｆ１−９）タンパク質についての結果を下記表８Ａに、（Ｆ１−２８）〜（Ｆ１−４６）タンパク質、（Ｆ１−１）タンパク質および（Ｆ１−９）タンパク質についての結果を下記表８Ｂに、（Ｆ１−２８）〜（Ｆ１−４６）タンパク質および（Ｆ１−９）の結果を下記表８Ｃに示す。下記表８Ａ〜Ｃは、前記各タンパク質について、励起波長（Ｅｘ）の値、蛍光波長（Ｅｍ）の値および蛍光強度（ＦＩ）の値を示す。前記表８Ａに示すように、（Ｆ１−１３）〜（Ｆ１−２７）タンパク質は、（Ｆ１−１）タンパク質および（Ｆ１−９）タンパク質と比較し、より強い蛍光活性を示した。特に、（Ｆ１−１４）〜（Ｆ１−２７）タンパク質は、極めて強い蛍光活性を示した。また、表８Ｂに示すように、（Ｆ１−２８）〜（Ｆ１−４６）タンパク質は、（Ｆ１−１）タンパク質および（Ｆ１−９）タンパク質と比較して、より強い蛍光活性を示した。そして、前記表８Ｃに示すように、（Ｆ１−２８）〜（Ｆ１−４６）タンパク質は、（Ｆ１−９）タンパク質と比較して、より強い蛍光活性を示した。これらの結果から、本発明の新規蛍光タンパク質が、蛍光活性を有することがわかった。
また、励起波長の全範囲および蛍光波長の全範囲の測定結果を図２および図３に示す。図２および図３は、異なる励起波長および蛍光波長における蛍光強度を示すグラフである。図２Ａにおいて、（Ａ）〜（Ｆ）は、それぞれ、（Ｆ１−１３）〜（Ｆ１−１８）タンパク質の結果を示し、図２Ｂにおいて、（Ｇ）〜（Ｌ）は、それぞれ、（Ｆ１−１９）〜（Ｆ１−２４）タンパク質の結果を示し、図２Ｃにおいて、（Ｍ）〜（Ｑ）は、それぞれ、（Ｆ１−２５）〜（Ｆ１−２７）、（Ｆ１−１）、および（Ｆ１−９）タンパク質の結果を示す。図３Ａにおいて、（Ａ）〜（Ｆ）は、それぞれ、（Ｆ１−２８）〜（Ｆ１−３３）タンパク質の結果を示し、図３Ｂにおいて、（Ｇ）〜（Ｌ）は、それぞれ、（Ｆ１−３４）〜（Ｆ１−３９）タンパク質の結果を示し、図３Ｃにおいて、（Ｍ）〜（Ｒ）は、それぞれ、（Ｆ１−４０）〜（Ｆ１−４５）タンパク質の結果を示し、図３Ｄにおいて、（Ｓ）〜（Ｕ）は、それぞれ、（Ｆ１−４６）、（Ｆ１−１）、および（Ｆ１−９）タンパク質の結果を示す。図１Ｂの（Ｎ）に示したように、図２Ａ〜Ｃの（Ａ）〜（Ｑ）および図３Ａ〜Ｄの（Ａ）〜（Ｕ）において、Ｘ軸方向が、励起波長を示し、Ｙ軸方向が、蛍光波長を示し、Ｚ軸方向が、蛍光強度を示す。図２Ａ〜Ｃの（Ａ）〜（Ｏ）および図３Ａ〜Ｄの（Ａ）〜（Ｓ）に示すように、（Ｆ１−１３）〜（Ｆ１−２７）タンパク質および（Ｆ１−２８）〜（Ｆ１−４６）タンパク質は、（Ｆ１−１）および（Ｆ１−９）タンパク質と比較して、より強い蛍光活性を示した。特に、図２Ａ〜Ｃの（Ｂ）〜（Ｏ）に示すように、（Ｆ１−１４）〜（Ｆ１−２７）タンパク質は、極めて強い蛍光活性を示した。これらの結果から、本発明の新規蛍光タンパク質が、蛍光活性を有することがわかった。
［実施例４］
本発明の新規タンパク質が蛍光活性を有することを確認した。なお、実験条件、実験方法等の記載は、特に記載がない限り、前記実施例１と同様とした。
本発明の新規タンパク質が蛍光活性を有することを確認した。なお、実験条件、実験方法等の記載は、特に記載がない限り、前記実施例１と同様とした。
各タンパク質のＮ末端に、ヒスチジン６残基からなるタグ（６×Ｈｉｓタグ）を付加した以外は、前記実施例１と同様にして、（Ｆ１−１）、（Ｆ１−２）、（Ｆ１−９）、（Ｆ１−２７）および（Ｆ１−４２）タンパク質の上清を得た。前記上清を、ＴＡＬＯＮ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ Ｍｅｔａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｓｅｓｉｎ（ＴａＫａＲａ社製）の使用説明書に従って、タンパク質精製し、（Ｆ１−１）、（Ｆ１−２）、（Ｆ１−９）、（Ｆ１−２７）および（Ｆ１−４２）タンパク質をそれぞれ含む溶出液を得た。前記各溶出液中のタンパク質濃度が、０．２ｍｇ／ｍＬとなるように希釈した。前記希釈後の各上清５０μＬについて、前記マイクロプレートリーダーを用い、下記測定条件で蛍光強度（ＦＩ）を測定した。
（測定条件）
励起波長：５０５〜５２０ｎｍ（バンド幅：１ｎｍ）
蛍光（検出）波長：３５０〜５２５ｎｍ（バンド幅：１ｎｍ）
レーザー強度（Ｇａｉｎ）：１０５
励起波長：５０５〜５２０ｎｍ（バンド幅：１ｎｍ）
蛍光（検出）波長：３５０〜５２５ｎｍ（バンド幅：１ｎｍ）
レーザー強度（Ｇａｉｎ）：１０５
励起波長（Ｅｘ）が４００ｎｍ付近であり、蛍光波長（Ｅｍ）が５１５ｎｍ付近の場合の、（Ｆ１−１）、（Ｆ１−９）、（Ｆ１−２７）および（Ｆ１−４２）タンパク質の結果を下記表９Ａに、励起波長（Ｅｘ）が５０７ｎｍであり、蛍光波長（Ｅｍ）が５１５ｎｍ付近の場合の、（Ｆ１−２）、（Ｆ１−９）および（Ｆ１−４２）タンパク質の結果を下記表９Ｂに示す。前記表９Ａに示すように、（Ｆ１−２７）および（Ｆ１−４２）タンパク質は、（Ｆ１−１）および（Ｆ１−９）タンパク質と比較し、より強い蛍光活性を示した。特に、（Ｆ１−２７）タンパク質は、極めて強い蛍光活性を示した。また、前記表９Ｂに示すように、（Ｆ１−２）および（Ｆ１−４２）タンパク質は、（Ｆ１−９）タンパク質と比較し、より強い蛍光活性を示した。これらの結果から、本発明の新規蛍光タンパク質が、蛍光活性を有することがわかった。
また、励起波長の全範囲および蛍光波長の全範囲の測定結果を図４に示す。図４は、異なる励起波長および蛍光波長における蛍光強度を示すグラフである。図４において、（Ａ）〜（Ｅ）は、それぞれ、（Ｆ１−１）、（Ｆ１−２）、（Ｆ１−９）、（Ｆ１−２７）および（Ｆ１−４２）タンパク質の結果を示す。図１Ｂの（Ｎ）に示したように、図４の（Ａ）〜（Ｅ）において、Ｘ軸方向が、励起波長を示し、Ｙ軸方向が、蛍光波長を示し、Ｚ軸方向が、蛍光強度を示す。図４に示すように、（Ｆ１−１）、（Ｆ１−２）、（Ｆ１−９）、（Ｆ１−２７）および（Ｆ１−４２）タンパク質は、蛍光活性を示した。また、（Ｆ１−１）、（Ｆ１−２７）および（Ｆ１−４２）タンパク質は、相対的に低い励起波長（４００ｎｍ付近）においてもより強い蛍光活性を示し、特に、（Ｆ１−２７）タンパク質は、極めて強い蛍光活性を示した。これらの結果から、本発明の新規蛍光タンパク質が、蛍光活性を有することがわかった。
［実施例５］
本発明の新規タンパク質が蛍光活性を有することを確認した。なお、実験条件、実験方法等の記載は、特に記載がない限り、前記実施例１と同様とした。
本発明の新規タンパク質が蛍光活性を有することを確認した。なお、実験条件、実験方法等の記載は、特に記載がない限り、前記実施例１と同様とした。
（１）発現ベクターの構築
新規蛍光タンパク質（配列番号３、４８、６３）をコードする新規遺伝子（配列番号１８、８２、９７）のＮ末端に、Ｈｉｓタグ配列を付加した配列をそれぞれ含むベクター挿入配列（それぞれ、配列番号１０４、１０５、１０６）は、化学合成により取得した。前記ベクター挿入配列において、かっこで囲んだ下線部の塩基配列が、前記新規蛍光タンパク質をコードする前記新規遺伝子に対応する塩基配列であり、かっこで囲んだ外における下線部の塩基配列が、Ｈｉｓタグ配列である。前記ベクター挿入配列における四角で囲んだＮ５９２Ｎ５９３Ｎ５９４コドンおよびＮ６１３Ｎ６１４Ｎ６１５コドンと、前記新規蛍光タンパク質と、前記新規遺伝子との関係を下記表１０に示す。また、Ｎ５９２Ｎ５９３Ｎ５９４コドンおよびＮ６１３Ｎ６１４Ｎ６１５コドンが、（ｆ１−４）、（ｆ１−３３）、および（ｆ１−４８）であるベクター挿入配列を、それぞれ、（ｆ１−４）、（ｆ１−３３）、および（ｆ１−４８）ベクター挿入配列とした。
新規蛍光タンパク質（配列番号３、４８、６３）をコードする新規遺伝子（配列番号１８、８２、９７）のＮ末端に、Ｈｉｓタグ配列を付加した配列をそれぞれ含むベクター挿入配列（それぞれ、配列番号１０４、１０５、１０６）は、化学合成により取得した。前記ベクター挿入配列において、かっこで囲んだ下線部の塩基配列が、前記新規蛍光タンパク質をコードする前記新規遺伝子に対応する塩基配列であり、かっこで囲んだ外における下線部の塩基配列が、Ｈｉｓタグ配列である。前記ベクター挿入配列における四角で囲んだＮ５９２Ｎ５９３Ｎ５９４コドンおよびＮ６１３Ｎ６１４Ｎ６１５コドンと、前記新規蛍光タンパク質と、前記新規遺伝子との関係を下記表１０に示す。また、Ｎ５９２Ｎ５９３Ｎ５９４コドンおよびＮ６１３Ｎ６１４Ｎ６１５コドンが、（ｆ１−４）、（ｆ１−３３）、および（ｆ１−４８）であるベクター挿入配列を、それぞれ、（ｆ１−４）、（ｆ１−３３）、および（ｆ１−４８）ベクター挿入配列とした。
前記（ｆ１−４）、（ｆ１−３３）、および（ｆ１−４８）ベクター挿入配列を、それぞれ、制限酵素ＨｉｎｄIIIおよびＸｂａＩを用いて切断し、前記制限酵素で切断したｐｃＤＮＡ３．１−ｈｙｇｒｏ（−）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に連結した。前記（ｆ１−４）、（ｆ１−３３）、および（ｆ１−４８）ベクター挿入配列を挿入したベクターを、それぞれ、（ｆ１−４）、（ｆ１−３３）、および（ｆ１−４８）発現ベクターとした。
（２）プラスミドＤＮＡの増幅および精製
前記実施例１（２）と同様にして、前記（ｆ１−４）、（ｆ１−３３）、および（ｆ１−４８）発現ベクターを、大腸菌ＤＨ５α株に導入し、前記大腸菌を３７℃、５％ＣＯ２下で１０時間培養することにより、前記（ｆ１−４）、（ｆ１−３３）、および（ｆ１−４８）遺伝子を含むプラスミドＤＮＡを増幅した。そして、Ｍｉｄｉ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用い、添付のプロトコルに従って、前記（ｆ１−４）、（ｆ１−３３）、および（ｆ１−４８）遺伝子を含むプラスミドＤＮＡを精製した。
前記実施例１（２）と同様にして、前記（ｆ１−４）、（ｆ１−３３）、および（ｆ１−４８）発現ベクターを、大腸菌ＤＨ５α株に導入し、前記大腸菌を３７℃、５％ＣＯ２下で１０時間培養することにより、前記（ｆ１−４）、（ｆ１−３３）、および（ｆ１−４８）遺伝子を含むプラスミドＤＮＡを増幅した。そして、Ｍｉｄｉ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用い、添付のプロトコルに従って、前記（ｆ１−４）、（ｆ１−３３）、および（ｆ１−４８）遺伝子を含むプラスミドＤＮＡを精製した。
（３）大腸がん細胞へのプラスミドＤＮＡの導入（トランスフェクション）
まず、ヒト大腸がん由来ＨＣＴ１１６細胞（ＤＳファーマバイオメディカル）を、６穴プレートに、約７０％コンフルエントとなるように播種した。培地は、ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ改変培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を使用し、培養条件は、３７℃、５％ＣＯ２下とした。前記ウェル中の細胞を２４時間培養した後、精製した前記（ｆ１−４）、（ｆ１−３３）、（ｆ１−４８）遺伝子を含むプラスミドＤＮＡを、トランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（商品名、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用い、添付プロトコルに従って、トランスフェクションした。なお、前記ウェルあたりの組成は、以下のように設定した。前記（ｆ１−４）、（ｆ１−３３）、および（ｆ１−４８）遺伝子を含むプラスミドＤＮＡを含む前記がん細胞を、それぞれ、（Ｆ１−２）、（Ｆ１−２７）、および（Ｆ１−４２）タンパク質発現がん細胞とした。
まず、ヒト大腸がん由来ＨＣＴ１１６細胞（ＤＳファーマバイオメディカル）を、６穴プレートに、約７０％コンフルエントとなるように播種した。培地は、ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ改変培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を使用し、培養条件は、３７℃、５％ＣＯ２下とした。前記ウェル中の細胞を２４時間培養した後、精製した前記（ｆ１−４）、（ｆ１−３３）、（ｆ１−４８）遺伝子を含むプラスミドＤＮＡを、トランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（商品名、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用い、添付プロトコルに従って、トランスフェクションした。なお、前記ウェルあたりの組成は、以下のように設定した。前記（ｆ１−４）、（ｆ１−３３）、および（ｆ１−４８）遺伝子を含むプラスミドＤＮＡを含む前記がん細胞を、それぞれ、（Ｆ１−２）、（Ｆ１−２７）、および（Ｆ１−４２）タンパク質発現がん細胞とした。
（ウェルあたりの組成）
培養液 ３０００μＬ
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００ １０μＬ
Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製） ２５０μＬ
プラスミドＤＮＡ ２．５μｇ
培養液 ３０００μＬ
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００ １０μＬ
Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製） ２５０μＬ
プラスミドＤＮＡ ２．５μｇ
（４）ＦＡＣＳ解析による蛍光活性の測定
トランスフェクション後、前記ウェル中の細胞を、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間培養した後、ハイグロマイシンＢ溶液（Wako社製）を、５００μｇ／ｍＬとなるように各ウェルに添加し、さらに、１４日間培養した。培養後、前記ウェル中の細胞から、FACSaria III（BD Biosciences社製）を用いて、約２×１０５〜１×１０６細胞の蛍光シグナル陽性細胞を分取（ソーティング）し、分取した細胞を、３７℃、５％ＣＯ２下でさらに５日間培養した。そして、培養した細胞を、以下に示す条件で、ＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）解析に供した。コントロールは、前記発現ベクターを導入しない以外は、同様にして解析に供した。
トランスフェクション後、前記ウェル中の細胞を、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間培養した後、ハイグロマイシンＢ溶液（Wako社製）を、５００μｇ／ｍＬとなるように各ウェルに添加し、さらに、１４日間培養した。培養後、前記ウェル中の細胞から、FACSaria III（BD Biosciences社製）を用いて、約２×１０５〜１×１０６細胞の蛍光シグナル陽性細胞を分取（ソーティング）し、分取した細胞を、３７℃、５％ＣＯ２下でさらに５日間培養した。そして、培養した細胞を、以下に示す条件で、ＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）解析に供した。コントロールは、前記発現ベクターを導入しない以外は、同様にして解析に供した。
（ＦＡＣＳ解析の条件）
測定装置 FACSaria III（BD Biosciences社製）
フィルタ設定
488 nm blue laser; 502 nm LP mirror with a 530/30 nm band pass filter
405 nm violet laser;502 nm LP mirror with a 530/30 nm band pass filter
測定装置 FACSaria III（BD Biosciences社製）
フィルタ設定
488 nm blue laser; 502 nm LP mirror with a 530/30 nm band pass filter
405 nm violet laser;502 nm LP mirror with a 530/30 nm band pass filter
これらの結果を、図５に示す。図５は、前記各フィルタで取得した各タンパク質発現がん細胞の蛍光活性を示すグラフである。図５において、縦軸は、細胞数を示し、横軸は、蛍光強度を示し、図中の実線で示すヒストグラムは、各タンパク質発現がん細胞の結果を示し、グレーで示すヒストグラムは、コントロールの結果を示す。図５に示すように、コントロールは、蛍光活性を示すピークが観察されなかったのに対し、Ｖ５００のフィルタで解析した（Ｆ１−２７）および（Ｆ１−４２）タンパク質発現がん細胞、ならびにＦＩＴＣのフィルタで解析した（Ｆ１−２）および（Ｆ１−４２）タンパク質発現がん細胞では、蛍光活性を示すピークが観察された。これらの結果から、本発明の新規蛍光タンパク質が、蛍光活性を有することがわかった。
つぎに、Ｖ５００のフィルタで解析した（Ｆ１−２７）および（Ｆ１−４２）タンパク質発現がん細胞、ならびにＦＩＴＣのフィルタで解析した（Ｆ１−２）および（Ｆ１−４２）タンパク質発現がん細胞における蛍光強度のＭＦＩ（mean fluorescence intensity）を計算した結果を、下記表１１に示す。前記表１１に示すように、Ｖ５００のフィルタで解析した（Ｆ１−２７）および（Ｆ１−４２）タンパク質発現がん細胞、ならびにＦＩＴＣのフィルタで解析した（Ｆ１−２）および（Ｆ１−４２）タンパク質発現がん細胞は、いずれも高いＭＦＩを示した。これらの結果から、本発明の新規蛍光タンパク質が、優れた蛍光活性を有することがわかった。
以上、実施形態および実施例を参照して本発明を説明したが、本発明は、上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本発明の構成や詳細には、本発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をできる。
この出願は、２０１５年６月１９日に出願された日本出願特願２０１５−１２４２２９および２０１６年４月２８日に出願された日本出願特願２０１６−０９２０９５を基礎とする優先権を主張し、その開示のすべてをここに取り込む。
本発明によれば、新規な蛍光タンパク質を提供できる。このため、本発明は、例えば、生命科学分野、医療分野、農芸分野等の分野において、極めて有用な技術といえる。
Claims (8)
- 下記（Ｆ１）または（Ｆ３）のタンパク質であることを特徴とする、新規タンパク質。
（Ｆ１） 配列番号１のアミノ酸配列からなり、
前記配列番号１のアミノ酸配列において、
５２番目のアミノ酸Ｘａａ５２ 、１３３番目のアミノ酸Ｘａａ１３３ 、および１５４番目のアミノ酸Ｘａａ１５４ の組合せが、下記（ａａ１）〜（ａａ６）、（ａａ９）、（ａａ１０）および（ａａ１２）のいずれか１つの組合せであるタンパク質
（Ｆ３）前記（Ｆ１）のＸａａ５２、Ｘａａ１３３、およびＸａａ１５４が保存され、前記（Ｆ１）のアミノ酸配列に対して、９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質
- 配列番号１のアミノ酸配列において、２０５番目のアミノ酸Ｘａａ２０５が、Ｉに置換された、請求項１記載の新規タンパク質。
- 配列番号１のアミノ酸配列において、１９８番目のアミノ酸Ｘａａ１９８が、Ｌに置換された、請求項１または２記載の新規タンパク質。
- 下記（ｆ１）、（ｆ３）、（ｆ５）または（ｆ７）のポリヌクレオチドであることを特徴とする、新規遺伝子。
（ｆ１） 配列番号１４の塩基配列からなり、
前記配列番号１４の塩基配列において、
１５４番目の塩基Ｎ１５４、１５５番目の塩基Ｎ１５５、および１５６番目の塩基Ｎ１５６ のコドン、
３９７番目の塩基Ｎ３９７、３９８番目の塩基Ｎ３９８、および３９９番目の塩基Ｎ３９９ のコドン、および
４６０番目の塩基Ｎ４６０、４６１番目の塩基Ｎ４６１、および４６２番目の塩基Ｎ４６２ のコドンの組合せが、下記（ａａ１’）〜（ａａ６’）、（ａａ９’）、（ａａ１０’）および（ａａ１２’）のいずれか１つのアミノ酸の組合せをコードするコドンの組合せであるポリヌクレオチド
（ｆ３）前記（ｆ１）の１５４番目の塩基Ｎ１５４、１５５番目の塩基Ｎ１５５、１５６番目の塩基Ｎ１５６、３９７番目の塩基Ｎ３９７、３９８番目の塩基Ｎ３９８、３９９番目の塩基Ｎ３９９、４６０番目の塩基Ｎ４６０、４６１番目の塩基Ｎ４６１、および４６２番目の塩基Ｎ４６２以外の塩基配列に対して、９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｆ５） 配列番号１のアミノ酸配列からなり、
前記配列番号１のアミノ酸配列において、
５２番目のアミノ酸Ｘａａ ５２ 、１３３番目のアミノ酸Ｘａａ １３３ 、および１５４番目のアミノ酸Ｘａａ １５４ の組合せが、下記（ａａ１）〜（ａａ６）、（ａａ９）、（ａａ１０）および（ａａ１２）のいずれか１つの組合せであるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｆ７） 前記（ｆ５）のＸａａ ５２ 、Ｘａａ １３３ 、およびＸａａ １５４ が保存され、前記（ｆ５）のタンパク質に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
- 請求項４記載の新規遺伝子を含むことを特徴とする、発現ベクター。
- 請求項４記載の新規遺伝子を含むことを特徴とする、形質転換体。
- 宿主に、請求項４記載の新規遺伝子を導入する導入工程を含むことを特徴とする、形質転換体の製造方法。
- 請求項１から３のいずれか一項に記載の新規タンパク質に変異を導入した候補タンパク質から、配列番号１のアミノ酸配列における
５２番目のアミノ酸Ｘａａ５２に対応するアミノ酸、
１３３番目のアミノ酸Ｘａａ１３３に対応するアミノ酸、および
１５４番目のアミノ酸Ｘａａ１５４に対応するアミノ酸の組合せが、下記（ａａ１）〜（ａａ６）、（ａａ９）、（ａａ１０）および（ａａ１２）のいずれか１つの組合せであり、且つ蛍光活性を有するタンパク質を選抜する選抜工程を含むことを特徴とする、新規蛍光タンパク質のスクリーニング方法。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2015124229 | 2015-06-19 | ||
| JP2015124229 | 2015-06-19 | ||
| JP2016092095 | 2016-04-28 | ||
| JP2016092095 | 2016-04-28 | ||
| PCT/JP2016/067586 WO2016204123A1 (ja) | 2015-06-19 | 2016-06-13 | 新規タンパク質、新規遺伝子、発現ベクター、形質転換体、形質転換体の製造方法、および新規蛍光タンパク質のスクリーニング方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2016204123A1 JPWO2016204123A1 (ja) | 2018-03-08 |
| JP6525290B2 true JP6525290B2 (ja) | 2019-06-05 |
Family
ID=57545433
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2017525229A Active JP6525290B2 (ja) | 2015-06-19 | 2016-06-13 | 新規タンパク質、新規遺伝子、発現ベクター、形質転換体、形質転換体の製造方法、および新規蛍光タンパク質のスクリーニング方法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10900045B2 (ja) |
| EP (1) | EP3312277A4 (ja) |
| JP (1) | JP6525290B2 (ja) |
| CN (1) | CN107849554B (ja) |
| TW (1) | TWI680984B (ja) |
| WO (1) | WO2016204123A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP7031929B2 (ja) * | 2018-03-15 | 2022-03-08 | Ｎｅｃソリューションイノベータ株式会社 | 新規タンパク質および新規遺伝子 |
| WO2019187218A1 (ja) * | 2018-03-30 | 2019-10-03 | Ｎｅｃソリューションイノベータ株式会社 | 新規タンパク質、新規遺伝子、形質転換体、形質転換体の製造方法、および新規蛍光タンパク質のスクリーニング方法 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6194548B1 (en) | 1998-01-23 | 2001-02-27 | Takashi Osumi | Green fluorescent proteins and blue fluorescent proteins |
| JPH11266883A (ja) * | 1998-01-23 | 1999-10-05 | Takashi Osumi | 蛍光性タンパク質ｇｆｐおよびｂｆｐ |
| US7151745B2 (en) * | 2001-11-08 | 2006-12-19 | Broadcom Corporation | Scalable synchronous packet transmit scheduler |
| US7083931B2 (en) | 2003-04-04 | 2006-08-01 | Stratagene California | Renilla GFP mutants with increased fluorescent intensity and spectral shift |
| WO2005100565A1 (ja) | 2004-03-31 | 2005-10-27 | Nec Soft Ltd. | 新規な蛍光性タンパク質とそれをコードする遺伝子 |
| JP4863280B2 (ja) | 2004-03-31 | 2012-01-25 | Ｎｅｃソフト株式会社 | 新規な蛍光性タンパク質とそれをコードする遺伝子 |
| US8278120B2 (en) * | 2006-01-26 | 2012-10-02 | Nec Soft, Ltd. | Method of changing fluorescence wavelength of fluorescent protein |
| JP4741994B2 (ja) * | 2006-07-25 | 2011-08-10 | Ｎｅｃソフト株式会社 | 蛍光タンパク質の園芸植物への応用 |
-
2016
- 2016-06-13 CN CN201680035550.4A patent/CN107849554B/zh active Active
- 2016-06-13 US US15/737,517 patent/US10900045B2/en active Active
- 2016-06-13 EP EP16811597.0A patent/EP3312277A4/en not_active Withdrawn
- 2016-06-13 JP JP2017525229A patent/JP6525290B2/ja active Active
- 2016-06-13 WO PCT/JP2016/067586 patent/WO2016204123A1/ja unknown
- 2016-06-17 TW TW105119073A patent/TWI680984B/zh active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| TW201710281A (zh) | 2017-03-16 |
| JPWO2016204123A1 (ja) | 2018-03-08 |
| EP3312277A1 (en) | 2018-04-25 |
| US10900045B2 (en) | 2021-01-26 |
| CN107849554A (zh) | 2018-03-27 |
| TWI680984B (zh) | 2020-01-01 |
| CN107849554B (zh) | 2021-10-12 |
| US20180187206A1 (en) | 2018-07-05 |
| EP3312277A4 (en) | 2018-11-07 |
| WO2016204123A1 (ja) | 2016-12-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR20180028532A (ko) | 식물에서 제초제 내성을 위한 방법 및 조성물 | |
| CN107119060A (zh) | 草甘膦抗性植物和相关方法 | |
| CN112639086B (zh) | 抗除草剂基因、多肽及其在植物育种中的应用 | |
| US8203032B2 (en) | Application of fluorescent protein to garden plant | |
| WO2018043219A1 (ja) | Ｃａｓタンパク質発現カセット | |
| JP6525290B2 (ja) | 新規タンパク質、新規遺伝子、発現ベクター、形質転換体、形質転換体の製造方法、および新規蛍光タンパク質のスクリーニング方法 | |
| WO2007034953A1 (ja) | アシフルオルフェンに対する耐性を付与する活性を有するプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ及びその遺伝子 | |
| CN109825482B (zh) | 抗除草剂基因及其在植物育种中的应用 | |
| JP2008253250A (ja) | ツユクサのフラボノイド３’，５’−水酸化酵素遺伝子 | |
| JP4677568B2 (ja) | 窒素固定活性の高い根粒を着生する植物の作出法 | |
| CN109929019A (zh) | 一种与植物耐盐碱相关蛋白GsERF7及其编码基因与应用 | |
| Levy et al. | Transient Agrobacterium-mediated gene expression in the Arabidopsis hydroponics root system for subcellular localization studies | |
| JP7031929B2 (ja) | 新規タンパク質および新規遺伝子 | |
| JP6933409B2 (ja) | 新規タンパク質、新規遺伝子、形質転換体、形質転換体の製造方法、および新規蛍光タンパク質のスクリーニング方法 | |
| US11466285B2 (en) | Plants comprising herbicide-resistant event sequences, plant materials, and methods for detection thereof | |
| WO2018100803A1 (ja) | 蛍光タンパク質複合体、および蛍光タンパク質の発光方法 | |
| JP7482563B1 (ja) | シイノトモシビタケ由来の発光関連遺伝子 | |
| JP4464879B2 (ja) | 根粒の形成開始に関与する遺伝子とその利用 | |
| WO2012028673A1 (en) | Spontaneous organogenesis in plants | |
| WO2021070549A1 (ja) | コムギのゲノム編集方法、及びその利用 | |
| JP5002167B2 (ja) | ストレス耐性に関与する遺伝子 | |
| Kim et al. | Efficient Regeneration of Transgenic Rice from Embryogenic Callus via Agrobacterium-Mediated Transformation: A Case Study using GFP and Apple MdFT1 Genes | |
| JPWO2005026345A1 (ja) | 植物矮小化遺伝子 | |
| JPWO2015174414A1 (ja) | 翻訳エンハンサー |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20171117 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20171117 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20181016 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20181205 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20190402 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20190425 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6525290 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |