WO2007034953A1

WO2007034953A1 - アシフルオルフェンに対する耐性を付与する活性を有するプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ及びその遺伝子

Info

Publication number: WO2007034953A1
Application number: PCT/JP2006/319001
Authority: WO
Inventors: Ayumi Tanaka; Ryouichi Tanaka; Kazushige Kato; Takako Fukagawa
Original assignee: Nippon Soda Co., Ltd.; Hokkaido University
Priority date: 2005-09-26
Filing date: 2006-09-25
Publication date: 2007-03-29
Also published as: BRPI0616416A2; US8580940B2; CN102021189A; US8129589B2; CN101278049A; US20090216004A1; EP1930434A4; EP1930434A1; CN102021189B; EP1930434B1; CN101278049B; JPWO2007034953A1; US20120184727A1; KR20080050618A

Abstract

アシフルオルフェン耐性を付与する活性を有するプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ、及びその遺伝子等を提供するものである。シロイヌナズナのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子をラン藻に導入し、トランスポゾンを用いてラン藻の遺伝子を破壊して、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子が破壊された株を選抜し、破壊されたプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子を特定し、破壊されたプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子を単離することにより、ラン藻のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子を同定する。この手法は、ラン藻由来のポルフィリノーゲンオキシダーゼなど、既知のタンパク質と相同な他の生物種由来のタンパク質が、他の生物種の遺伝子データベースでは見い出すことができない場合の遺伝子の単離手法として有効である。

Description

明細書

アシフルオルフエンに対する耐性を付与する活性を有するプロトポルフィリノ一ゲンォキシダーゼ及びその遺伝子

技術分野

[0001] 本発明は、アシフルォルフェン (ACIFLUORFEN)に対する而性を付与する活性を有するプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ、特にラン藻のプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ及びその遺伝子並びに該遺伝子を組み込んだ形質転換体等に関する

背景技術

[0002] プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼは、ヘムおよびクロロフィル合成の最終段階の反応、すなわちプロトポルフイリノーゲン IXから 6個の電子を奪ってプロトポルフイリン IXを合成する反応を触媒する酵素である。ヘムはヘモグロビン、シトクロムなどのへムタンパク質の補因子として、呼吸やエネルギー代謝、酸素ストレスに対する防御に不可欠な分子である。ヘム合成経路は微生物、植物、動物に共通して存在し、 δ -了ミノレブリン酸を前駆体としてヘムを合成する経路である。また、植物においてはヘムおよびクロロフィルは、 δ -アミノレブリン酸を前駆体としてプロトポルフィリン IXまで共通の経路で合成されており、プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼはこの 2つの合成経路の調節的な役割も担って、ると考えられて、る。陸上植物にお!、てクロロフィル代謝系を担うこのプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ酵素は、ジフエ-ルエーテル (以下 DPEと略することがある）系除草剤の標的酵素となる。 DPE系除草剤によってプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼの活性が阻害されると、該酵素の基質であるプロトボルフイリノーゲン IXが葉緑体中に蓄積していき、ついにはプロトポルフイリノーゲン IXが細胞質ゾル中に漏れ、そこでペルォキシダーゼによりそれが酸化されてプロトポルフィリン IXを生じる。プロトポルフィリン IX力光と酸素にさらされると、プロトポルフィリン IXは一重項酸素及びさらに別の反応性酸素種を生成させ得る。脂質の過酸ィ匕及びこれが必然的に伴う膜損傷の結果として、植物細胞は急速に死亡する（Lee et a 1., 1993, Plant Physiol, 102, 881)。一方、ラン藻では DPE系除草剤存在下でも生育が可能であることが知られて、たが、その要因やメカニズムは全く知られて、なかつた。

[0003] プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝子は!、くつかの生物ですでに単離されている。例えば、タバコの PPX1遺伝子（Genbank accession Y13465)、 PPX2遺伝子（ Genbank accession Y13466)、シロイヌナズナの PPOX遺伝子（Genbank accession D8 3139)、バチルスサブチリスの HemY遺伝子（Genbank accession M97208)、マウスの PPX遺伝子（Genbank accession D45185)、ヒトの PPX遺伝子（Genbank accession D3 8537)、サッカロマイセスセレピシェの PPX遺伝子（Genbank accession Z71381)、ェシエリヒアコリの hemG遺伝子（Genbank accession X68660)などが知られている。

[0004] プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼの利用法として、例えば特許文献 1は、 DPE 系除草剤に対する抵抗性を付与する枯草菌（Bacillus subtilis)に由来するプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼを植物体内で発現させる方法、及び該プロトポルフィリノ一ゲンォキシダーゼを発現するトランスジエニック植物を開示している。また、例えば特許文献 2は、植物の育種に適するポルフィリン生合成系の酵素タンパク質の遺伝子として、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana)植物から得られうる 1. 7kbpの長さを有する遺伝子であり、 5'末端から 1. 3kbpの部位に制限酵素 EcoRIの認識塩基配列 5 -GAATTC-3'が存在することを特徴とするプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝子を開示している。さらに、例えば特許文献 3は、ラット又はコナミドリムシ由来のプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ活性阻害能を評価するための簡便な方法として（1)プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ活性に基づく増殖能の欠損した宿主細胞に、宿主細胞内で機能可能なプロモーター、およびプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝子が機能可能な形で結合されてなる DNA断片が導入されてなり、前記 DNA断片に存在するプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝子を発現する形質転換体を、被験化合物の存在下または非存在下に、プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ活性に基づく増殖能の欠損を補完する化合物を実質的に含まない培地で培養して各条件下における該形質転換体の増殖度を測定する工程、（2)該増殖度の差異に基づき被験化合物の接触による前記形質転換体の増殖阻害度を求め、被験化合物のプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ活性阻害能を判定する工程、を含むことを特徴とする方法を開示して、る。

[0005] 一方、ラン藻では、その遺伝子データベースの解析から、大腸菌 hemK類似遺伝子がプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼであると推定されて、たが、ラン藻の該 hemK 類似遺伝子は、プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼでは無、ことがその後実際に明ら力となった。しかし、ラン藻の遺伝子データベースには、これまでに同定されている他の生物種のプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼと相同なタンパク質はラン藻では見い出されておらず、ラン藻のプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼは未だに単離されていな力つた（例えば非特許文献 1参照）。

[0006] 特許文献 1 :特願平 9— 107833号公報

特許文献 2 :特開平 9— 140381号公報

特許文献 3：特願平 11― 346787号公報

非特許文献 1：ドミトリ (Dmitrii V.Vavilin) ,ウィム (Wim F. J. Vermaas)「Regulation of t he tetrapyrrole biosynthetic pathway leading to heme and chlorophyll in plants and c yanobacteria (植物とラン藻におけるヘムおよびクロロフィルへと導くテトラピロール生合成経路の調節）」 Physiologia Plantarum第 115卷、第 9頁、 2002年

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0007] 上述のように、他の生物種由来の既知のプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼと相同なタンパク質は、ラン藻の遺伝子データベースでは見い出すことができず、ラン藻のプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼはこれまで単離されて、なかった。本発明の課題は、アシフルオルフエン耐性を付与する活性を有するプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ、及びその遺伝子、並びに該遺伝子を組み込んだ形質転換体等を提供することにある。

課題を解決するための手段

[0008] 本発明者らは、ラン藻由来のプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼの単離を目的として、プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ欠損大腸菌を用いた相補的スクリーニングを試みた。この方法は、プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼを欠損した大腸菌にラン藻ゲノム断片を導入して相補する遺伝子を探索し、ラン藻のプロトポルフイリノーゲン IXの酸ィ匕に関与する遺伝子を特定する方法である。使用したベクターは異なる力シロイヌナズナゃタバコ由来のプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝子は同様の方法を用、て単離された。前記相補的スクリ一ユングの概略を以下に示す。

[0009] まず、ラン藻（シネコシスティス PCC6803)力 DNAを取得した。 DNAライブラリーの作製の際にはファージベクターとして λ ΖΑΡΠベクター（STRATEGENE社製）を用いた。該ラン藻の全塩基配列は既に報告されているので (約 3,500kb)、ベクターのマルチクロー-ングサイトに含まれる 6種の制限酵素配列につ、て、該ラン藻のゲノム配列を調べたところ Xbal、 Spel、 EcoRIの 3種類がライブラリー作製に適していると考えられた。そこで、この 3種類の制限酵素処理を基本としてファージライブラリーを作製した。作製したライブラリーをプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ欠損大腸菌に導入し、その形質転換体のプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ活性を調べることによって、相補試験を行った力明らかな相補性を示すものは認められなカゝつた。この結果より、該ラン藻のプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼがこの 3種類の制限酵素配列を運悪く持っていた力該ラン藻のプロモーターがうまく働かな力つた等いくつかの可能性が考えられた。

[0010] そこで、新たに制限酵素 Tsp5091を用いた限定分解でライブラリーを作製し再度検討した。 Tsp5091は 4塩基認識の制限酵素である。前回のライブラリー作製に用いた 3 種類の制限酵素 (EcoRI、 Spel、 Xbal)は 6塩基認識であり、サイズの大き過ぎる断片がどうしても生じる。また、ラン藻プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼの遺伝子配列内にこれら制限酵素の認識配列が存在した場合、完全長のプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝子をクロー-ングできない。一方、 4塩基認識の制限酵素を用いて D

NAを完全に切断すると、数百 bpの細かい断片が大量にできてしまう。この問題を解決するために、 4塩基認識の制限酵素で不完全に DNAを切断する方法（限定分解）を用いてライブラリーを作製した。そのライブラリーを用いたが、大腸菌のプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ欠損能を相補することはできな力つた。

[0011] 次に、プラスミドの状態にすれば生育復帰が認められる力もしれないと考え、 Tsp50 91ラン藻ゲノムファージライブラリ一につ、て大量のプラスミドの切り出しを行!、、 Tsp5 091ラン藻ゲノムプラスミドライブラリーを作製して検討したが顕著に生育復帰するクローンは認められなかった。このことより、ラン藻プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼが大腸菌のプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ欠損を相補しな、か、または相補してヽても非常に軽微である可能性が考えられた。

[0012] そこで、本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意検討した結果、ラン藻がアシフルオルフエンに対する耐性を有するとヽぅ知見に基づき、トランスポゾンを利用したラン藻変異体スクリーニングを利用することにより、ラン藻 (シネコシスティス PCC6 803)由来のボルフイリノーゲンォキシダーゼを初めて単離し、そのボルフイリノーゲンォキシダーゼがアシフルォルフェン耐性を付与する活性を有して、ることを見、出すと共に、その遺伝子を同定することにより、本発明を完成するに至った。また、上記トランスポゾンを利用した遺伝子スクリーニングの手法は、ラン藻由来のボルフイリノーゲンォキシダーゼなど、既知のタンパク質と相同な他の生物種由来のタンパク質が、他の生物種の遺伝子データベースでは見い出すことができない場合の遺伝子の単離手法として有効であるとの知見を得て、本発明を完成するに至った。

[0013] すなわち本発明は、（1)アシフルオルフエンに対する耐性を生物に付与する活性を有し、かつラン藻由来であることを特徴とするプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼや、（2)ラン藻力シネコシスティス属に属するラン藻であることを特徴とする上記（1)記載のプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼや、（3)生物が、植物であることを特徴とする上記（1)又は（2)記載のプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼに関する。

[0014] また本発明は、（4)下記 (a)〜（c)のいずれかに示すタンパク質、（a)配列番号 2に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、 (b)配列番号 2に示されるアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列力もなり、かつアシフルォルフェンに対する耐性を生物に付与する活性を有することを特徴とする、プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ活性を有するタンパク質、（c)配列番号 2 に示されるアミノ酸配列に対する相同性が 20%以上であり、かつアシフルォルフェンに対する耐性を生物に付与する活性を有することを特徴とする、プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ活性を有するタンパク質や、（5)ラン藻由来であることを特徴とする上記 (4)記載のタンパク質に関する。

[0015] また本発明は、（6)上記（1)〜（3)のいずれか記載のプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ、又は上記 (4)若しくは（5)記載のタンパク質をコードするプロトポルフィリノ一ゲンォキシダーゼ遺伝子 DN Aや、 (7)下記（d)又は（e)に示すプロトポルフィリノ一ゲンォキシダーゼ遺伝子 DNA、 (d)配列番号 1に示される塩基配列力なるプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝子 DNA、 (e)配列番号 1に示される塩基配列において、 1若しくは数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、かつアシフルォルフェンに対する耐性を生物に付与する活性を有することを特徴とする、プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝子 DNAや、 (8)配列番号 1に示される塩基配列に対して相補的な配列力もなる DNAとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし、かつアシフルォルフェンに対する耐性を生物に付与する活性を有することを特徴とする、プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝子 DNAや、（9)プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ活性を有するタンパク質が、ラン藻に由来することを特徴とする上記（7)又は（8)の、ずれか記載のプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝子 DNAに関する。

[0016] また本発明は、（10)上記（6)〜（9)のいずれか記載のプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝子 DNAが組み込まれた組換えベクターに関する。

[0017] また本発明は、（11)上記（10)記載の組換えベクターが導入されたことを特徴とする形質転換体や、（12)形質転換体が、アシフルオルフエンに対する耐性を有することを特徴とする上記（11)記載の形質転換体や、 (13)形質転換体が微生物であることを特徴とする上記（11)又は（12)記載の形質転換体や、（14)形質転換体が植物であることを特徴とする上記（11)又は（12)記載の形質転換体や、 (15)光合成能が向上したことを特徴とする上記（14)記載の形質転換体に関する。

[0018] また本発明は、（16)上記（11)〜（15)のいずれか記載の形質転換体を用いた、プロトボルフイリノーゲンォキシダーゼ阻害活性能の評価方法や、（17)上記（11)〜（1 6)の、ずれか記載の形質転換体を用いた、プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ阻害剤のスクリーニング方法に関する。

[0019] また本発明は、（18)以下の（f)〜 (j)の工程を含む、ラン藻のプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝子の単離方法、 (f)シロイヌナズナのプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝子をラン藻に導入する工程；（g)トランスポゾンを用いてラン藻の遺伝子を破壊する工程； (h)プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝子が破壊された株を選抜する工程； (i)破壊されたプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝子を特定する工程；（j)破壊されたプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝子を単離するェ程;に関する。

[0020] また本発明は、（19)上記 (4)又は（5)記載のタンパク質の、プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼとしての使用方法や、（20)上記 (4)又は（5)記載のタンパク質を、プロトボルフイリノーゲン IXと人為的に接触させてプロトポルフィリン IXに転換する方法や、（21)上記（6)〜（9)のいずれか記載の DNAの、プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝子としての使用方法や、 (22)上記（6)〜（9)の、ずれか記載の DNAを人為的に発現させ、その発現産物を、プロトポルフイリノーゲン IXと接触させてプロトボルフイリン IXに転換する方法に関する。

[0021] さらに本発明は、（23)以下の 1)〜5)の工程を含む、特定生物における所定の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子の単離方法、 1)特定生物以外の他の生物から所定の機能を相補するタンパク質をコードする遺伝子を、特定生物に導入して形質転換体を作製する工程; 2)形質転換体の遺伝子を変異処理等によりランダムに破壊して形質転換体の変異株を作製する工程； 3)所定の機能を相補するタンパク質に作用し、所定の機能を有するタンパク質に作用しない薬剤を用いて、あるいは、培養条件を変化させることにより、所定の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子が破壊された変異株を選抜する工程; 4)破壊された所定の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を特定する工程; 5)破壊された所定の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を単離する工程、に関する。

[0022] また本発明は、（24)変異処理が、トランスポゾンを用いた変異処理であることを特徴とする上記（23)記載の遺伝子の単離方法や、 (25)特定生物以外の他の生物から所定の機能を相補するタンパク質力シロイヌナズナのプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼであることを特徴とする上記（₂₃₎又は（₂₄₎記載の遺伝子の単離方法や

、（26)所定の機能を相補するタンパク質に作用し、所定の機能を有するタンパク質に作用しな、薬剤が、アシフルオルフエンであることを特徴とする上記（25)記載の遺伝子の単離方法や、（27)特定生物における所定の機能を有するタンパク質が、ラン藻のプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼであることを特徴とする上記（25)又は（26 )記載の遺伝子の単離方法に関する。

図面の簡単な説明

[0023] [図 1]配列番号 2に示されるアミノ酸配列と、ラン藻由来の機能未知の遺伝子がコードするアミノ酸配列とのアラインメント。

[図 2]配列番号 2に示されるアミノ酸配列と、他の生物由来の機能未知の遺伝子がコードするアミノ酸配列とのアラインメント。

[図 3]シネコシステイスの slrl790遺伝子破壊用コンストラクト（pslrl790SKM 6. 4kb) を示す図である。

[図 4]プロトポリフィリン IXのサンプル (A)、 slrl790の遺伝子破壊株の抽出液 (C)、および野生株の抽出液 (B)に関する、プロトポリフィリン IXのクロマトグラムを示す図である。

[図 5]pBI121の概略を示す図である。

[図 6]pBIslrl790の概略を示す図である。

発明を実施するための最良の形態

[0024] 本発明のプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼは、アシフルオルフエンに対する耐性を生物に付与する活性を有する。ここで、「アシフルオルフエンに対する耐性を生物に付与する活性を有するプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ」とは、適当な生物中に、そのプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼを導入し、該酵素をその生物中で適当に発現させた場合に、その生物のアシフルオルフエンに対する耐性が向上するようなプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼを意味する。その生物のアシフルオルフエンに対する耐性が向上したかどうかは、例えば、アシフルオルフエンの、その生物に対する 48時間後の LC50値が、該酵素を導入する前に比べて、該酵素を導入した後に向上したかどうかを確認することによって調べることができる。また、特に生物が植物であるときは、例えば、特定量のアシフルオルフエンを植物の栽培土壌に施用した場合に、前記酵素を植物中で適当に発現させる前の植物に比べて、前記酵素を植物中で適当に発現させた植物が黄化、褐変若しくは枯ィ匕する程度が低減することを確認したり、同程度の黄化、褐変若しくは枯ィ匕を生じさせるのに必要なアシフルォルフンの単位面積当たりの施用量力前記酵素を植物中で適当に発現させる前の植物に比べて、前記酵素を植物中で適当に発現させた植物において増加することを確認するなどして、その植物のアシフルオルフエンに対する耐性が向上したかどうかを調べることができる。なお、アシフルオルフエンに対する耐性の向上の程度は特に制限されないが、アシフルオルフエンの、その生物に対する 48時間後の LC50値、又は同程度の黄化、褐変若しくは枯ィ匕を生じさせるのに必要なアシフルオルフエンの単位面積当たりの施用量が、その生物に該酵素を導入する前に比べて 1. 1倍以上に向上することが好ましぐ 1. 5倍以上に向上することがより好ましぐ 2倍以上に向上することがさらに好ましぐ 3倍以上に向上することが最も好ましい。

[0025] また、本発明の「アシフルオルフエンに対する耐性を生物に付与する活性を有するプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ」には、該プロトポルフィリノ一ゲンォキシダーゼ自体が、アシフルオルフエンに対する耐性を有している場合も含まれる。ここで、「プロトボルフイリノーゲンォキシダーゼ自体力アシフルオルフエンに対する耐性を有している」とは、 1 μ Μのアシフルオルフエンを含む適当な溶媒中におけるプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼの比活性力アシフルオルフエン非存在下におけるプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼの比活性の 50分の 1以上、好ましくは 20分の 1以上、より好ましくは 10分の 1以上であることを意味する。ここで「プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ活性」とは、プロトポルフイリノーゲン IXを酸化してプロトポルフィリン IXを生成する酵素活性をヽぅ。あるタンパク質のプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ比活性は、そのタンパク質とプロトポルフイリノーゲン IXを適当なバッファー又は塩溶液中で接触させ、プロトポルフィリン IXの生成量を調べたりするなどして容易に確認することができる。また、「アシフルオルフエンに対する耐性を生物に付与する活性を有する」における「生物」は、特に制限されず、植物であっても微生物であってもよいが、植物であることが好ましぐ中でもシロイヌナズナ、タバコ、トウモロコシ、イネ、ムギ類（コムギ、ォォムギ等）、ィモ類 (ジャガイモ等)であることが好ましい。

[0026] 本発明のプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼは、アシフルオルフエンに対する耐性を生物に付与する活性を有している限り、ラン藻由来でなくてもよいが、ラン藻由来であってもよい。ラン藻は特に制限されないが、例えば、シネコシスティス属、アナべナ属、グロェォバクター属、プロクロロコッカス属、シネココッカス属、ロドシュードモナス属等に属するラン藻が挙げられ、より具体的には、シネコシスティス PCC6803、ァナベナ PCC7120、グロェォパクタービオラセウス PCC7421、プロクロロコッカスマリナス SS 120、プロクロロコッカスマリナス MIT9313、プロクロロコッカスマリナス M ED4、シネココッカス WH8102、ロドシユードモナスパルストリス等が挙げられる。これらのうち、シネコシスティス属に属するラン藻が好ましぐシネコシスティス PCC680 3がより好ましい。

[0027] 本発明において、「ラン藻に由来するプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ」とは、実際にラン藻に存在するプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼのほ力、そのプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼと同一である限り、形質転換等の手法を用いてラン藻以外の微生物等によって発現されたプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼも含む意味で用いられる。

[0028] 本発明のタンパク質は、（1)配列番号 2に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、（2)配列番号 2に示されるアミノ酸配列、配列番号 2のアミノ酸番号 1〜34及び 48 〜 176に記載のアミノ酸配列、並びに配列番号 2のアミノ酸番号 1〜34及び 48〜 19 3に記載のアミノ酸配列の、ずれかのアミノ酸配列にお、て、 1若しくは数個のァミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつアシフルオルフエンに対する耐性を生物に付与する活性を有し、かつプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ活性を有するタンパク質、及び、（3)配列番号 2に示されるアミノ酸配列、配列番号 2のアミノ酸番号 1〜34及び 48〜176に記載のアミノ酸配列、並びに配列番号 2のァミノ酸番号 1〜34及び 48〜 193に記載のアミノ酸配列の!/、ずれかのアミノ酸配列に対する相同性が 20%以上であり、かつアシフルオルフエンに対する耐性を生物に付与する活性を有し、かつプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ活性を有するタンパク質、のいずれかに示すタンパク質である。以下、これらの本発明のタンパク質を総称して「本件タンパク質」と、うことがある。

[0029] 本発明の上記タンパク質（2)は、配列番号 2に示されるアミノ酸配列、配列番号 2のアミノ酸番号 1〜34及び 48〜176に記載のアミノ酸配列、並びに配列番号 2のァミノ酸番号 1〜34及び 48〜 193に記載のアミノ酸配列の!/、ずれかのアミノ酸配列にお！/ヽて、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつアシフルォルフェンに対する耐性を生物に付与する活性を有し、かつプロトポルフィリノ一ゲンォキシダーゼ活性を有するタンパク質であれば特に制限されな、が、配列番号 2に示されるアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列力もなり、かつアシフルオルフエンに対する耐性を生物に付与する活性を有し、かつプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ活性を有するタンパク質や、配列番号 2のアミノ酸番号 1〜34及び 48〜 176に記載のアミノ酸配列にお!/ヽて、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ該アミノ酸番号 1〜34のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列と、該アミノ酸番号 48〜 176のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列との間に 10〜 16個、好ましくは 12〜 14 個、より好ましくは 13個の任意のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列力もなり、さらにァシフルオルフエンに対する耐性を生物に付与する活性を有し、かつプロトポルフィリノ一ゲンォキシダーゼ活性を有するタンパク質や、配列番号 2のアミノ酸番号 1〜 34及び 48〜 193に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ該アミノ酸番号 1〜34のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列と、該アミノ酸番号 48〜 193のアミノ酸配列に対応するアミノ酸との間に 10〜16個、好ましくは 12〜14個、より好ましくは 13個の任意のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列力なり、さらにアシフルオルフエンに対する耐性を生物に付与する活性を有し、かつプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ活性を有するタンパク質が好ましく挙げられる。ここで、アミノ酸番号 m〜nのアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列とは、アミノ酸番号 m〜nのアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列のことを意味する。

上記「1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」とは、例えば 1〜20個、好ましくは 1〜15個、より好ましくは 1〜： LO個、さらに好ましくは 1 〜5個、最も好ましくは 1〜3個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を意味する。 [0031] 本発明にお、て「プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ活性を有する」とは、プロトボルフイリノーゲン IXを酸ィ匕してプロトポルフィリン IXを生成する酵素活性を有することを、う。あるタンパク質がプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ活性を有するかどうかは、そのタンパク質とプロトポルフイリノーゲン IXを適当なバッファー又は塩溶液中で接触させ、プロトポルフィリン IXの生成を調べることで容易に確認することができる。

[0032] また、「アシフルオルフエンに対する耐性を生物に付与する活性を有するタンパク質」とは、適当な生物中に、そのタンパク質を導入し、そのタンパク質をその生物中で適当に発現させた場合に、その生物のアシフルオルフエンに対する耐性が向上するようなタンパク質を意味する。その生物のアシフルオルフエンに対する耐性が向上したかどうかは、例えば、アシフルオルフエンの、その生物に対する 48時間後の LC50値 1S そのタンパク質を導入する前に比べて、そのタンパク質を導入した後に向上した力どうかを確認することによって調べることができる。また、特に生物が植物であるときは、例えば、特定量のアシフルオルフエンを植物の栽培土壌に施用した場合に、前記タンパク質を植物中で適当に発現させる前の植物に比べて、前記タンパク質を植物中で適当に発現させた植物が黄化、褐変若しくは枯ィ匕する程度が低減することを確認したり、同程度の黄化、褐変若しくは枯ィ匕を生じさせるのに必要なアシフルオルフェンの単位面積当たりの施用量力前記タンパク質を植物中で適当に発現させる前の植物に比べて、前記タンパク質を植物中で適当に発現させた植物において増加することを確認するなどして、その植物のアシフルオルフエンに対する耐性が向上したかどうかを調べることができる。なお、アシフルオルフエンに対する耐性の向上の程度は特に制限されないが、アシフルオルフエンの、その生物に対する 48時間後の LC50値、又は同程度の黄化、褐変若しくは枯ィ匕を生じさせるのに必要なアシフルォルフェンの単位面積当たりの施用量力その生物にそのタンパク質を導入する前に比べて 1. 1倍以上に向上することが好ましぐ 1. 5倍以上に向上することがより好ましぐ 2倍以上に向上することがさらに好ましぐ 3倍以上に向上することが最も好ましい

[0033] また、本発明の「アシフルオルフエンに対する耐性を生物に付与する活性を有するタンパク質」には、そのタンパク質自体力アシフルオルフエンに対する耐性を有している場合も含まれる。ここで、「そのタンパク質自体力アシフルオルフエンに対する耐性を有している」とは、 1 μ Μのアシフルオルフエンを含む適当な溶媒中におけるそのタンパク質の比活性 (プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ活性に関する）力ァシフルオルフエン非存在下における比活性 (プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ活性に関する）の 50分の 1以上、好ましくは 20分の 1以上、より好ましくは 10分の 1以上であることを意味する。ここで「プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ活性」とは、プロトボルフイリノーゲン IXを酸化してプロトポルフィリン IXを生成する酵素活性を、う。あるタンパク質の比活性 (プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ活性に関する）は、そのタンパク質とプロトポルフイリノーゲン IXを適当なバッファー又は塩溶液中で接触させ、プロトポルフィリン IXの生成量を調べたりするなどして容易に確認することができる。また、「アシフルオルフエンに対する耐性を生物に付与する活性を有する」における「生物」は、特に制限されないが、植物及び微生物が好ましぐ植物が特に好ましい。本発明の上記タンパク（3)は、配列番号 2に示されるアミノ酸配列（slrl790)、配列番号 2のアミノ酸番号 1〜34及び 48〜176に記載のアミノ酸配列、並びに配列番号 2のアミノ酸番号 1〜34及び 48〜193に記載のアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列に対する相同性が 20%以上であり、かつアシフルオルフエンに対する耐性を生物に付与する活性を有し、かつプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ活性を有するタンパク質である限り特に制限されないが、配列番号 2に示されるアミノ酸配列、配列番号 2のアミノ酸番号 1〜34及び 48〜176に記載のアミノ酸配列、並びに配列番号 2 のアミノ酸番号 1〜34及び 48〜193に記載のアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列に対するその相同性は、 45%以上であることが好ましぐ 54%以上であることがより好ましぐ 65%以上であることがさらに好ましぐ 80%以上であることがより好ましぐ 90%以上であることがさらに好ましぐ 95%以上であることが最も好ましい。ここで、本発明にお、て「アミノ酸番号 o〜p及び q〜rに記載のアミノ酸配列に対する相同性力％以上」とは、アミノ酸番号 o〜pのアミノ酸配列とアミノ酸番号 q〜rのアミノ酸配列とをこの順に有し、かつアミノ酸番号 o〜pのアミノ酸配列とアミノ酸番号 q〜rのアミノ酸配列との間に 10〜16個、好ましくは 12〜14個、より好ましくは 13個の任意のァミノ酸配列を有するアミノ酸配列に対する相同性カ¾%以上であることを意味する。上記タンパク（3)における「アシフルオルフエンに対する耐性を生物に付与する活性を有するタンパク質」、及び「アシフルオルフエンに対する耐性を生物に付与する活性を有するタンパク質」並びにそれらの好ましい態様は、上記タンパク（2)におけるそれらのタンパク質と同様の意味である。

[0035] なお、本発明の配列番号 2に示されるアミノ酸配列と相同性の高いタンパク質を BL ASTで検索したところ、配列番号 2に示されるアミノ酸配列と相同性の高いアミノ酸配列をコードする機能未知の遺伝子がいくつ力示された。そのうち、ラン藻由来の機能未知の遺伝子を以下の表 1に示す。また、その遺伝子がコードするアミノ酸配列と、本発明の配列番号 2に示されるアミノ酸配列との相同性（％)も表 1に示す。これらも、本件タンパク質に含まれる。なお、本発明の配列番号 2に示されるアミノ酸配列は、後述の実施例に記載されて、るように、シネコシスティス PCC6803由来の slrl 790遺伝子にコードされるアミノ酸配列であることが本発明者らによって明ら力となったものである。

[0036] [表 1]

[0037] また、表 1に示した遺伝子がコードするアミノ酸配列のアラインメントを以下の図 1に示す。

[0038] 図 1のアラインメントでは、 7遺伝子すべてで共通するアミノ酸の下にアスタリスクを付している。また、 4〜6遺伝子で共通するアミノ酸の下にはドットを付している。表 1 及び図 1から分かるように、シネコシスティス PCC6803以外の 7種のラン藻のこれらのアミノ酸配列は、シネコシスティス PCC6803の slrl790遺伝子がコードするアミノ酸と相同性が高ぐさらに特定の領域がよく保存されている。したがって、シネコシスティス PCC6803の slrl790遺伝子以外のこれらの遺伝子がコードするタンパクも、シネコシスティス PCC6803の slrl790遺伝子がコードするタンパク（配列番号 2のアミノ酸配列）と同様に、アシフルオルフエンに対する耐性を生物に付与する活性を有するプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼであると予想される。なお、図 1のアラインメントから、本発明のプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼは、配列番号 2に示されるアミノ酸配列又は配列番号 1に示される塩基配列の中でも、配列番号 2のアミノ酸番号 1〜3 4及び 48〜193に記載のアミノ酸配列（配列番号 1の塩基番号 1〜102及び 142〜5 82に記載の塩基配列）、特に、配列番号 2のアミノ酸番号 1〜34及び 48〜176に記載のアミノ酸配列（配列番号 1の塩基番号 1〜102及び 142〜528に記載の塩基配列）の保存性が高ぐこれらの部分の配列が該酵素の性質に重要な役割を果たしていることが予想される。

[0039] また、配列番号 2に示されるアミノ酸配列と相同性の高いアミノ酸配列をコードする遺伝子として BLAST検索で示された遺伝子のうち、ラン藻以外の生物由来の遺伝子を以下の表 2に示す。これら遺伝子の発現産物も、本件タンパク質に含まれる。

[0040] [表 2]

[0041] また、表 2に示した遺伝子がコードするアミノ酸配列のアラインメントを以下の図 2に示す。

[0042] 図 2のアラインメントでは、 5遺伝子すべてで共通するアミノ酸の下にアスタリスクを付している。また、 3遺伝子で共通するアミノ酸の下にはドットを付している。表 2及び図 2から分かるように、シネコシスティス PCC6803以外の 4種の生物のこれらのァミノ酸配列は、シネコシスティス PCC6803の slrl790遺伝子がコードするアミノ酸と相同性が高ぐさらに特定の領域がよく保存されている。したがって、シネコシスティス PC C6803の slrl790遺伝子以外のこれらの遺伝子がコードするタンパクも、シネコシステイス PCC6803の slrl790遺伝子がコードするタンパク（配列番号 2のアミノ酸配列）と同様に、アシフルオルフエンに対する耐性を生物に付与する活性を有するプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼであると予想される。

[0043] 本発明はまた、上記の本件タンパク質のプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼとしての使用方法に関する。ここで、「プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼとしての使用」とは、例えば、本件タンパク質を、インビトロ又はインビボにおいて基質プロトポルフイリノーゲン IXと人為的に接触させて、反応生成物プロトポルフィリン IXが生成する反応に使用することなど意味し、本件タンパク質がプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ活性を有すると、う知見は本発明によりはじめて明らかにされた全く新、知見である。また本発明の本件タンパク質をプロトポルフイリノーゲン IXと人為的に接触させてプロトポルフィリン IXに転換する方法における「人為的に接触させる」とは、インビト口又はインビボにおいて人為的に接触させることを意味し、例えば、ラン藻細胞内における非人為的な接触は含まれな、。

[0044] 本発明のプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝子 DNAは、（1)本発明のプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ又は本件タンパク質をコードするプロトポルフィリノ一ゲンォキシダーゼ遺伝子 DNA、 (2)配列番号 1に示される塩基配列からなるプロトボルフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝子 DNA、（3)配列番号 1の塩基配列、配列番号 1の塩基番号 1〜102及び 142〜528に記載の塩基配列、並びに配列番号 1の塩基番号 1〜102及び 142〜582に記載の塩基配列のいずれかの塩基配列において、 1若しくは数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列を含み、かつアシフルオルフエンに対する耐性を生物に付与する活性を有することを特徴とする、プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするプロトポルフィリノ一ゲンォキシダーゼ遺伝子 DNA、及び、（4)配列番号 1の塩基配列、配列番号 1の塩基番号 1〜102及び 142〜528に記載の塩基配列、並びに配列番号 1の塩基番号 1〜102及び 142〜582に記載の塩基配列のいずれかの塩基配列に対して相補的な配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつアシフルオルフエンに対する耐性を生物に付与する活性を有することを特徴とする、プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするプロトポルフィリノ一ゲンォキシダーゼ遺伝子 DNA、の!、ずれかのプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝子 DNAである。これらの本発明のプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝子 DNAを総称して「本件遺伝子 DNA」 t\ヽぅことがある。

本発明の上記 DNA(2)は、配列番号 1に示される塩基配列、配列番号 1の塩基番号 1〜102及び 142〜528に記載の塩基配列、並びに配列番号 1の塩基番号 1〜1 02及び 142〜582に記載の塩基配列のいずれかの塩基配列において、 1若しくは数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列を含み、かつアシフルォルフェンに対する耐性を生物に付与する活性を有することを特徴とする、プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝子 DNAであれば特に制限されな!ヽが、配列番号 1に示される塩基配列において、 1若しくは数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、かつアシフルォルフェンに対する耐性を生物に付与する活性を有することを特徴とする、プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝子 DNAや、配列番号 1の塩基番号 1〜102及び 142〜528に記載の塩基配列において、 1若しくは数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列を含み、かつ該塩基番号 1〜102の塩基配列に対応する塩基配列と、該塩基番号 142〜528の塩基配列に対応する塩基配列との間に 30〜48 ( 但し 3の倍数に限る）個、好ましくは 36〜42 (但し 3の倍数に限る）個、より好ましくは 3 9個の任意の塩基配列を有する塩基配列力なり、さらにアシフルオルフンに対する耐性を生物に付与する活性を有することを特徴とする、プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝子 DNAや、配列番号 1の塩基番号 1〜102及び 142〜582に記載の塩基配列において、 1若しくは数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列を含み、かつ該塩基番号 1〜： L02の塩基配列に対応する塩基配列と、該塩基番号 142〜58 2の塩基配列に対応する塩基配列との間に 30〜48 (但し 3の倍数に限る）個、好ましくは 36〜42 (但し 3の倍数に限る）個、より好ましくは 39個の任意の塩基配列を有する塩基配列カゝらなり、さらにアシフルオルフエンに対する耐性を生物に付与する活性を有することを特徴とする、プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝子 DNAが好ましく挙げられる。ここで、塩基番号 m〜nの塩基配列に対応する塩基配列とは、塩基番号 m〜n の塩基配列において、 1若しくは数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列のことを意味する。

[0046] 上記「1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列」とは、例えば 1〜20個、好ましくは 1〜15個、より好ましくは 1〜10個、さらに好ましくは 1〜5個、最も好ましくは 1〜3個の任意の数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を意味する。

[0047] 例えば、これら 1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなる DNA (変異 DNA)は、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法により作製することもできる。具体的には、配列番号 1に示される塩基配列からなる DNAに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的な手法等を用いて、これら DNAに変異を導入することにより、変異 DNAを取得することができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であること力ら用であり、 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ecu, Cold Spring Har bor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989 (以後、モレキュラークロー- ング第 2版と略す)等に記載の方法に準じて行うことができる。この変異 DNAを適切な発現系を用いて発現させることにより、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列力もなるタンパク質を得ることができる。

[0048] 上記「ストリンジェントな条件でハイブリダィズする DNA」とは、 DNA又は RNAなどの核酸をプローブとして使用し、コロニ一'ハイブリダィゼーシヨン法、プラークハイブリダィゼーシヨン法、あるいはサザンブロットハイブリダィゼーシヨン法等を用いることにより得られる DNAを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来の DNA または該 DNAの断片を固定化したフィルターを用いて、 0. 7〜1. 0Mの NaCl存在下、 65°Cでハイブリダィゼーシヨンを行った後、 0. 1〜2倍程度の SSC溶液（1倍濃度の SSC溶液の組成は、 150mM塩化ナトリウム、 15mMクェン酸ナトリウム）を用い、 65°C条件下でフィルターを洗浄することにより同定できる DNAをあげることができる。ノ、イブリダィゼーシヨンは、モレキュラークローユング第 2版等に記載されている方法に準じて行うことができる。

[0049] 例えば、ストリンジェントな条件下でハイブリダィズすることができる DNAとしては、プローブとして使用する DNAの塩基配列と一定以上の相同性を有する DNAを挙げることができ、例えば、配列番号 1の塩基配列、配列番号 1の塩基番号 1〜102及び 142〜528に記載の塩基配列、並びに配列番号 1の塩基番号 1〜102及び 142〜5 82に記載の塩基配列のいずれかの塩基配列に対して 60%以上、好ましくは 70%以上、より好ましくは 80%以上、さらに好ましくは 90%以上、特に好ましくは 95%以上、最も好ましくは 98%以上の相同性を有する DNAを好適に例示することができる。ここで、本発明にお、て「塩基酸番号 s〜t及び u〜vに記載の塩基配列に対する相同性カ¾%以上」とは、塩基番号 s〜tの塩基配列と塩基番号 u〜vの塩基配列とをこの順に有し、かつ塩基番号 s〜tの塩基配列と塩基番号 u〜vの塩基配列との間に 30〜4 8 (但し 3の倍数に限る）個、好ましくは 36〜42 (但し 3の倍数に限る）個、より好ましくは 39個の任意の塩基配列を有する塩基配列に対する相同性カ¾%以上であることを意味する。また、ストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズすることができる DNAとして、配列番号 2に示されるアミノ酸配列、配列番号 2のアミノ酸番号 1〜34及び 48 〜 176に記載のアミノ酸配列、並びに配列番号 2のアミノ酸番号 1〜34及び 48〜 19 3に記載のアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列に対して 20%以上、好ましくは 45 %以上、より好ましくは 54%以上、さらに好ましくは 65%以上、より好ましくは 80%以上、さらに好ましくは 90%以上、最も好ましくは 95%以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする DNAを好適に例示することができる。

[0050] 本発明はまた、上記の本件 DNAのプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝子としての使用方法に関する。ここで、「プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝子としての使用」とは、例えば、本件 DNAをインビトロ又はインビボにおいて人為的に発現させ、その発現産物であるプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼを、基質プロトポルフイリノーゲン IXと接触させて反応生成物プロトポルフィリン IXを生成させる反応に使用することなど意味し、本件 DNAの発現産物がプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ活性を有すると、う知見は本発明によりはじめて明らかにされた全く新し、知見である。本件 DNAのプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝子として使用することにより、例えば、アシフルオルフエンに対して耐性を有していない生物に、アシフルオルフェン耐性を付与することができる。また本発明の本件 DNAを人為的に発現させ、その発現産物を、プロトポルフイリノーゲン IXと接触させてプロトポルフィリン IXに転換する方法における「人為的に発現させ」とは、インビトロ又はインビボにおいて人為的に発現させることを意味し、例えば、ラン藻細胞内における非人為的な発現は含まれない。

[0051] 本件タンパク質、本件遺伝子 DNAの単離方法は特に制限されず、分子遺伝学的方法、酵素学的方法など一般に知られている方法で得られたものであってもよいが、既知のプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼとの相同性が低いプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼをコードする遺伝子 DNAを単離する場合は、（f)シロイヌナズナのプロトボルフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝子をラン藻に導入する工程；（g)トランスポゾンを用いてラン藻の遺伝子を破壊する工程；（h)プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝子が破壊された株を選抜する工程； (i)破壊されたプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝子を特定する工程；（j)破壊されたプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝子を単離する工程を含む、プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝子の単離方法を用いるのが好ま、。

[0052] 採取源となる生物としては、アシフルオルフエンに対して耐性を有して、な、生物であってもよいが、アシフルオルフエンに対して耐性を有していることが好ましい。以下、アシフルォルフェンに対して耐性を有してヽる生物を採取源とした場合の方法を述べ。。

採取源となる生物のプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼが欠損しても、その生物が生育できるように、変異原処理前に、その生物の近縁の生物等に由来するプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝子を採取源となる生物にあらカゝじめ導入し、その近縁の生物等に由来するプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝子を、採取源となる生物内で発現させる。なお、その近縁の生物由来のプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼは、アシフルオルフエンに耐性を示さな、ことが確認されて、るものを用いる。次に、採取源となるその生物に対して、トランスポゾンを利用した変異原処理を行い、得られた変異体にっ、てアシフルオルフエン（ジフエ-ルエーテル系除草剤）を用いたスクリーニングを行う。採取源となる生物はアシフルオルフエンに耐性を示す力その近縁の生物等に由来するプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼはアシフルオルフェンに耐性を示さない (感受性を示す)。従って、その近縁の生物等に由来するプロトボルフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝子を導入した採取源 (プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ欠損株）は、アシフルオルフエンに感受性を示す。そこで、アシフルオルフェン処理しな、場合は通常に生育し、アシフルオルフエン処理した場合にアシフルォルフェン感受性を示した変異株を選抜する。例えば、実施例 3に記載の方法等により、アシフルオルフエンに感受性を示した株について、トランスポゾンの挿入位置を解析することによって遺伝子を特定することができる。このようにして、採取源由来のァシフルオルフエンに而性を示すプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼをコードする遺伝子を単離することができる。

[0053] 本発明にお、てプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝子の採取源として使用する生物は、既存のプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼと低い相同性を示す酵素を有するものが好まし、。本発明の既存のプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼと低い相同性を示す遺伝子とは、具体的には例えばタバコ PPX1遺伝子（Genbank acces sion Y13465)に対するアミノ酸レベルでの相同性が 20%未満である遺伝子を意味する。本発明にお、てプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝子の採取源として使用する生物としては、原核生物が好ましぐラン藻がより好ましぐ入手の容易さや扱い易さなどからシネコシステイス（Synechocystis sp. PCC6803)のグルコース而性株が最も好ましい。これらの菌株は、例えばパスツール研究所（Institute Pasteur)より容易に入手できる。この株の培養条件は、一般的に知られている方法によって行うことができるが、一定の光の存在下、 30°Cで BG11培地 [Hihara Y, et al. Plant Physiol(199 8) 117:pp.l205]に TES— KOH(pH-8.2)を最終 5mMとなるように調整して行うのが望ましい。

[0054] 本件遺伝子 DNAの取得方法や調製方法は特に限定されるものでなぐ本明細書中に開示した配列番号 1に示される塩基配列情報又は配列番号 2に示されるァミノ酸配列情報に基づいて適当なプローブやプライマーを調製し、それらを用いて例えばシネコシスティス PCC6803やそれ以外のラン藻等の生物のゲノム DNAライブラリ一等から目的の遺伝子を単離したり、常法に従って化学合成により調製することができる。また、ゲノム DNAの取得とそのクローユングなどはいずれも常法に従って実施することができる。本件遺伝子 DNAをゲノム DNAライブラリ一力ゝらスクリーニングする方法は、例えば、モレキュラークローユング第 2版に記載の方法等、当業者により常用される方法を挙げることができる。また、変異遺伝子又は相同遺伝子としては、配列番号 1に示される塩基配列又はその一部を有する DNA断片を利用し、他の生物体等より、該 DNAとホモロジ一が高、塩基配列をもつ DNAを適当な条件下でスクリ一-ングすることにより単離することができる。その他、前述の変異 DNAの作製方法により調製することちできる。

[0055] 本発明の組換えベクターとしては、本件遺伝子 DNAが組み込まれた組換えべクタ一であれば特に制限されず、本発明の組換えベクターは、本件遺伝子 DNAを発現ベクターに適切に導入することにより構築することができる。例えば、本件遺伝子 DN Aを適当なプロモーターの下流につないだ構造物を好適に例示することができる。発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製可能であるものや、あるいは宿主細胞の染色体中へ組込み可能であるものが好ましぐまた、本発明の遺伝子の発現に関与するプロモーター、ターミネータ一等の制御配列及び転写制御因子の遺伝子を含有して!/、るものを好適に使用することができる。

[0056] 細菌用の発現ベクターとしては、例えば、 pUC118(宝酒造社製)、 pUC19 [Gene,33, 103(1985)〕等の pUC系統や pGEMEX- Promega社製)等の pGEM系統、 pKK223- 2( Pharmacia社製)、 pBluescriptll SK(+)、 pBluescriptll SK(- XStratagene社製)等の公知又は市販のものを例示することができる。

また、細菌用のプロモーターとしては、例えば、 T7ファージプロモーター、 trpプロモ一ター (P trp), lacプロモーター (P lac), recAプロモーター、 λ PLプロモーター、 λ PR プロモーター、 lppプロモーター、 PSEプロモーター、 SP01プロモーター、 SP02プロモ一ター、 penPプロモーター等を挙げることができる。

[0057] 植物細胞用の発現ベクターとしては、例えば、 pIG121-Hm [Plant Cell Report, 15, 809-814(1995)]、 pBI121 [EMBO J. 6, 3901—3907(1987)〕、 pLAN411や pLAN421 (Pla nt Cell Reports 10(1991) 286-290)を例示することができる。また、植物用のプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイノレス 35Sプロモーター（Mol. Gen. Ge net (1990) 220, 389- 392)等が挙げられる。また、トウモロコシ由来アルコール脱水素酵素のプロモーター（Maydica 35 (1990) 353-357)、シロイヌナズナ由来 IRE遺伝子のプロモーター（特開 2000— 270873号公報）等を例示することができる。

[0058] 本発明の形質転換体としては、上記本発明の組換えベクターが導入された形質転換体であれば特に制限されず、宿主としては、細菌等の微生物や、植物、動物などを挙げることができる力微生物や植物が好ましい。細菌として、具体的には、例えばェシエリヒア属細菌、シユードノカルディア属細菌、ストレプトミセス属細菌、バチルス属細菌、ストレプトコッカス属細菌、スタフイロコッカス属細菌等を挙げることができる。また、植物として、具体的には、シロイヌナズナ、タバコ、トウモロコシ、イネ、ムギ類 (コムギ、ォォムギ等）、ィモ類 (ジャガイモ等)等を挙げることができる。

[0059] 上記本発明の組換えベクターを宿主微生物に導入する方法としては、モレキュラークロー-ング第 2版など多くの標準的な実験室マニュアルに記載されている方法、例えば、エレクト口ポレーシヨン、形質導入、形質転換等により行うことができる。また、上記本発明の組換えベクターを植物に導入する方法としては、パーティクルガン法、ェレクト口ポレーシヨン法、ァグロバタテリゥム法等を挙げることができる。

[0060] 本発明の組換えベクターが導入された形質転換体、好ましくは形質転換植物は、アシフルオルフエンに対する耐性を有していると考えられる。ここで、「アシフルオルフェンに対する耐性を有してヽる形質転換体」とは、本発明の組換えベクターを導入する前に比べて、アシフルオルフエンに対する耐性が向上した形質転換体を意味する。その形質転換体のアシフルオルフエンに対する耐性が向上したかどうかは、アシフルォルフェンの、その形質転換体に対する 48時間後の LC50値力その組換えべクターを導入する前に比べて、その組換えベクターを導入した後に向上した力どうかを確認することによって調べることができる。また、特に生物が植物であるときは、例えば、特定量のアシフルオルフエンを植物の栽培土壌に施用した場合に、前記組換えベクターを植物中で適当に発現させる前の植物に比べて、前記組換えベクターを植物中で適当に発現させた植物が黄化、褐変若しくは枯ィ匕する程度が低減することを確認したり、同程度の黄化、褐変若しくは枯ィ匕を生じさせるのに必要なアシフルオルフェンの単位面積当たりの施用量力前記組換えベクターを植物中で適当に発現させる前の植物に比べて、前記組換えベクターを植物中で適当に発現させた植物にお!、て増加することを確認するなどして、その植物のアシフルオルフエンに対する耐性が向上したかどうかを調べることができる。なお、アシフルオルフエンに対する耐性の向上の程度は特に制限されないが、アシフルオルフンの、その生物に対する 48 時間後の LC50値、又は同程度の黄化、褐変若しくは枯ィ匕を生じさせるのに必要なアシフルオルフエンの単位面積当たりの施用量が、その生物にその組換えベクターを導入する前に比べて 1. 1倍以上に向上することが好ましぐ 1. 5倍以上に向上することがより好ましぐ 2倍以上に向上することがさらに好ましぐ 3倍以上に向上することが最も好ましい。

[0061] 例えば、本発明の形質転換体を適当な培地で培養することによって、本件タンパク質を培養物中に生成蓄積させ、さらに、該培養物から本件タンパク質を採取することにより、本件タンパク質を大量に製造することが可能である。また、形質転難物の場合、農薬'除草剤としてのアシフルオルフエンを撒布したとき、栽培目的の形質転 ^¾物は生存するが、アシフルオルフエン感受性の雑草は死滅し、選択的に栽培目的の形質転^ ¾物を育成することができる。

[0062] 本発明の形質転換植物は、光合成能が向上していなくてもよいが、光合成能が向上して、ることが好ましく、アシフルオルフエン存在下での光合成能が向上して、ることがより好ましい。本発明の形質転,物は、プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼが多く発現することから光合成能が向上することが期待できる。光合成能が向上しているかどうかは、本発明の組換えベクターを導入する前の宿主植物の光合成能と、導入後の形質転換植物の光合成能を比較することにより、確認することができる。ここで、光合成能が向上しているかどうかは、光合成蒸散測定装置による測定値から算出された光合成速度を比較したり、一定期間同条件で培養した後の植物体の乾燥重量を比較するなどして確認することができる。

[0063] 本発明の形質転換体は、プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ阻害活性能の評価方法に使用することができる。該評価方法は特に制限されないが、例えば、（1)該形質転換体の宿主を被検物質存在下で培養して生育曲線を記録し；（2)該形質転換体を（1)と同様の被検物質存在下で培養して生育曲線を記録し；（3)段階（1)と段階 (2)で記録した生育曲線を比較することを含む評価方法が挙げられる。

[0064] また、本発明の形質転換体は、プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ阻害剤のスクリーニング方法にも使用することができる。該スクリーニング方法としては、例えば、上記の評価方法と同様の方法が挙げられる。

[0065] なお、アシフルオルフエンは、ジフエ-ルエーテル系除草剤の 1種である。本件タンノク質は、アシフルオルフエンに対する耐性を生物に付与する活性を有して！/、るので、作用機作が類似している他のジフヱ-ルエーテル系除草剤に対する耐性を、その生物に付与する活性についても有していると考えられる。同様のことが、本件プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ及び本発明の形質転換体についても当てはまると考えられる。

[0066] 次に、本発明の特定生物 (例えば、ラン藻）における所定の機能を有するタンパク質 (例えば、プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ)をコードする遺伝子の単離方法について説明する。この遺伝子の単離方法は以下の 1)〜5)の工程を含み、既知のタンパク質（例えば、シロイヌナズナ由来のプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ）と相同な他の生物種由来のタンパク質 (例えば、ラン藻由来のプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ）力他の生物種の遺伝子データベースでは見い出すことができない場合の遺伝子の単離手法として特に有効である。

1)特定生物以外の他の生物から所定の機能を相補するタンパク質をコードする遺伝子を、特定生物に導入して形質転換体を作製する工程

2)形質転換体の遺伝子をランダムに破壊して形質転換体の変異株を作製する工程

3)所定の機能を相補するタンパク質に作用し、所定の機能を有するタンパク質に作用しない薬剤を用いて、あるいは、培養条件を変化させることにより、所定の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子が破壊された変異株を選抜する工程

4)破壊された所定の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を特定する工程

5)破壊された所定の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を単離する工程 [0067] 上記変異処理として、ェチルメタンスルホネート（EMS)、 N—メチルー N -トロー N -トロソグァ-ジン（NTG) , 2,6-ジァミノプリン（DAP)等の薬剤を用、て細胞を処理する変異処理や、紫外線を用いて細胞を処理する変異処理を挙げることもできるが、遺伝子レベルの変異を導入できるトランスポソームを用いる変異処理を好適に例示することができる。トランスポソームはトランスポゾンとトランスポゼースの複合体であり、多くの微生物に遺伝子レベルの変異を容易に導入できるものである（Hoffina n, L.M., Jendrisak, J.J., Meis, R.J., し oryshin, I.Y. and Rezhikof, b.W. Genetica, 108 , 19-24 (2000) ) ₀例えば、トランスポソームを用いる方法として、 EZ::TN™く ΚΑΝ-2ΧΓ np Transposome (EPICENTRE社製）などを用いる方法が知られて、る。

[0068] トランスポゾンを用いる突然変異誘発法は、遺伝子解析の強力なツールとして当技術分野で公知である。遺伝子破壊株は例えばトランスポゾンによって導入された特定の抗生物質に対する耐性マーカーなどによって選抜することができる。

こうして得られた遺伝子破壊株についてさらに、所定の機能を相補するタンパク質に作用し、所定の機能を有するタンパク質に作用しない薬剤を用いて、あるいは、培養条件を変化させ、スクリーニングすることにより、所定の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子がトランスポゾンの導入により破壊された変異株を選抜することができる。このトランスポゾンに隣接するヌクレオチド配列は、例えばチェーンターミネーション法（Sanger F.S. et al, Proc.Natl.Acad.Sci.,USAゝ 75:5463- 5467 (1977) )によって決定することができる。このようにトランスポゾンタグの挿入位置の解析を行うことにより、破壊された所定の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を特定することができる。

[0069] 上記「所定の機能を相補するタンパク質に作用し、所定の機能を有するタンパク質に作用しない薬剤」としては、シロイヌナズナ由来のプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼに作用し、ラン藻由来のプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼに作用しないァシフルオルフエン（ジフエ-ルエーテル系）、ピラフルフェンェチル（フエ-ルビラゾール系）、フルミオキサジン (ジカルボキシイミド系）を好適に挙げることができる。

[0070] ところで、ヘムとクロロフィルは共通した前駆体である δ アミノレブリン酸 (ALA)から合成される。植物や大腸菌等では ALAは、 1)グルタミン酸にダルタミル— tRNAシンターゼが作用しダルタミル tRNAが生成するステップ、 2)生成したダルタミル t RNAにグルタミル tRNAレダクターゼが作用しグルタミン酸 1ーセミアルデヒドが生成するステップ、 3)生成したグルタミン酸 1ーセミアルデヒドにグルタミン酸 1セミアルデヒドアミノムターゼを含む 3段階の反応" C5型"で合成される力動物ゃァグロバタテリア属細菌ではスクシ-ル CoAとグリシンに ALAシンターゼが作用して ALAが生成する 1段階の反応" C4型"で合成される。上記のように、ァグロバクテリア属細菌は "C4型"で ALAを合成し、その酵素 ALAシンターゼの存在自体は既知であるがその遺伝子が同定されていない場合、植物由来のダルタミル tRN Aシンターゼ、グルタミル tRN Aレダクターゼ及びグルタミン酸 1セミアルデヒドアミノムターゼをコードする遺伝子をァグロバクテリア属細菌にコ 'インフエクシヨンし、形質転換ァグロバタテリァ属細菌の遺伝子をトランスポゾン等によってランダムに破壊して変異株を作製し、その変異株の中から、グルタミン酸 1セミアルデヒドアミノムターゼ阻害剤であるするギャバクリンの非存在下で生育し、ギヤパクリンの存在下で死滅する変異株を選抜し、当該選抜した変異株のトランスポゾンタグの挿入位置の解析を行うことにより、ァグロノクテリア属細菌由来の ALAシンターゼ遺伝子を同定することができる。したがって、前記「所定の機能を相補するタンパク質に作用し、所定の機能を有するタンパク質に作用しない薬剤」として、植物や大腸菌由来のグルタミン酸 1セミアルデヒドアミノムターゼに作用し、動物ゃァグロバクテリア属細菌由来の δ アミノレブリン酸 (ALA) シンターゼに作用しないギヤバクリンを挙げることができる。

また、培養条件を変化させることにより、所定の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子が破壊された変異株を選抜する方法としては、例えば、温度条件により選抜する場合は、遺伝子破壊株を通常の培養温度と高温 (もしくは低温)で培養して生育に差が認められる変異株を選抜する方法や、例えば、光条件により選抜する場合は、遺伝子破壊株を通常の光条件と強光下 (もしくは弱光下)で培養して生育に差が認められる変異株を選抜する方法や、例えば、 pH条件により選抜する場合は、遺伝子破壊株を通常の pH条件と高 pH (もしくは低 pH)条件下で培養し生育に差が認められる変異株を選抜する方法などを例示することができる。

以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの実施例により限定されるものではない。

実施例 1

[0072] (ラン藻へのシロイヌナズナ由来プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝子の導入）シロイヌナズナのロゼット葉から、 RNeasy RNA extraction kit (Qiagen社製）を用いて全 RNAを抽出した。得られた全 RNAからポリ (A)+mRNAを常法によって精製した。得られたポリ (A)+mRNAを铸型とし、 ReverTra- Plus- Kit (TOYOBO社製）を用いて、 cDNAを合成した。合成した cDNAを铸型とし、制限酵素 Asel部位を持つプライマー ATHPPOX.Aself (配列番号 3)及びプライマー ATHPPOX.r (配列番号 4)並びに TaKaRaLA Taqポリメラーゼ（Takara社製）を用いて、シロイヌナズナのプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝子（1.6kbp)を PCRで増幅した後、その PCR産物を Aselで切断した。 PCRは、変性（94°C、 30秒）、アニーリング（52°C、 45秒）、伸長（72°C、 1 20秒）を 28サイクル行った。

[0073] ベクターは、ラン藻への形質転換に利用でき、カナマイシン耐性を持つ pFSlOを使用した [Jansson, et al. Methods Enzymol (1998) 297:ppl66]_Gこの pFSlOベクターを制限酵素 Ndelと Hindiで切断し、前述のプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝子の PCR産物と連結し、組換えベクターを作製した。この組換えベクターをヒートショック法で大腸菌 CFM109)に形質転換し、カナマイシンを含む LB寒天培地で選抜した。現れたコロニーを、カナマイシンを含む LB液体培地で培養し、その培養物カゝらプラスミドを精製した。後の工程であるトランスポゾンを用いた変異原処理ではカナマイシン耐性を選択マーカーとして利用する。そのためカナマイシン耐性遺伝子を除去し、新たに別の抗生物質耐性遺伝子 (クロラムフエ-コール耐性遺伝子)を導入する必要がある。

[0074] pFSlOベクターを铸型とし、 Xbal部位を持つプライマー Chloram.r (配列番号 5)とプライマー SPE2Xbal.r (配列番号 6)並びに Pyrobest Taqポリメラーゼ（Takara社製）を用いて一次 PCRを行った。 PCRは、変性（98°C、 10秒）、アニーリング（55°C、 45秒 )、伸長（72°C、 30秒、）を 25サイクノレ行った。この PCRにより、約 500bpの PCR産物が得られた。次に、クロラムフエ-コール耐性遺伝子を铸型とし、先ほど得られた PC R産物及びプライマー Chloram. Xbal.f (配列番号 7)並びに Pyrobest Taqポリメラーゼ (Takara社製）を用いて二次 PCRを行った。 PCRは、変性（98°C、 10秒）、ァユーリング（50°C、 45秒）、伸長（72°C、 90秒）を 25サイクル行った。該 PCRにより得られたク口ラムフエ-コール耐性遺伝子を含む PCR産物を、制限酵素 Xbalで切断した。

[0075] 一方、シロイヌナズナのプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝子と pFSlOベクタ一とを連結した前述の組換えベクターも制限酵素 Xbalで切断し、カナマイシン耐性遺伝子を除去後、前述の Xbalで切断したクロラムフエ-コール耐性遺伝子断片と連結し、新たな組換えベクターを得た。この組換えベクターを、前述と同様の方法で大腸菌 (JM109)に形質転換し、クロラムフエ-コールを含む LB寒天培地で選抜した。現れたコロニーを、クロラムフエ-コールを含む LB液体培地で培養し、その培養物からプラスミドを精製した。このプラスミドでシネコシスティス PCC6803を形質転換し、シロイヌナズナ由来プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼを発現させたシネコシステイス (以下「AT株」と呼ぶことがある）を作製した。なお、シネコシスティス PCC6803の形質転換の方法は、文献 [Williams JG. Methods Enzymol (1998) 167:pp766]の方法に従った o

実施例 2

[0076] (トランスポゾンを利用したラン藻変異体の作製）

シネコシスティス PCC6803から抽出したゲノムを Tsp5091で限定分解し、ラムダ'ザップ IIベクターキット（Stratagene社製）を用いて、ゲノムプラスミドライブラリーを作製した。 EZ::TNTMく KAN— 2〉 Insertion Kit (Epicentre社製）を用いて、ゲノムプラスミドライブラリーに対してトランスポゾンを in vitroで挿入した。トランスポゾンの挿入方法は、 E picentre社が開示するマニュアルに従った。このトランスポゾンタグの挿入されたシネコシスティスゲノムプラスミドライブラリーを用いて、 AT株に対し相同組み換えによる形質転換を行ヽ、シロイヌナズナ由来プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼを発現させた上でのシネコシステイス変異体を作製した。

実施例 3

[0077] (ラン藻プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ欠損株のスクリーニング）

アシフルォルフェンに対する感受性を選択マーカーとして用いて、実施例 2で作製したシネコシステイス変異体の中から、ラン藻プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ欠損株のスクリーニングを行った。具体的には、以下のような手順で行った。

アシフルオルフエンを終濃度 500 Mとなるように含む BG11寒天培地に、実施例 2で作製したシネコシステイス変異体を接種し、白色蛍光灯による連続光照射 (光強度 30 mol s-lm-2)下、 30°Cで 2週間、静置培養を行った。また、同様の培養を、アシフルオルフエンを含まな!/、BG11寒天培地を用いて行った。これらの培養の結果を踏まえ、アシフルオルフエン非存在下では生育する力アシフルオルフエン存在下では死滅する変異体として 9株が選抜された。この 9株のうち、アシフルオルフエン存在下での生育の阻害の程度が最も高力つた菌株を 3216株と命名し、以下に説明するように、トランスポゾンタグの挿入位置を解析したところ、タンパク質 sir 1790の転写調節領域と推定される位置にトランスポゾンタグが挿入されていた。

(ラン藻変異体の遺伝子解析）

トランスポゾンタグ挿入位置を確認する方法として 2パターンを想定した。

(1)使用したトランスポゾンはタグとしてカナマイシン耐性遺伝子が導入されて、るので、この抗生物質耐性を利用して選抜する。

具体的には、変異株より DNAを取得し、カナマイシン耐性遺伝子に含まれていない制限酵素配列を利用して DNAを断片化する。 DNAを切断した同様の制限酵素でカナマイシン耐性遺伝子を持たなヽベクターを切断する。それらを連結させて大腸菌へ形質転換し、カナマイシンを含んだ培地上で生育してきたクローンにつ、てプラスミドを精製し、シーケンスを解析する。

(2) inverse PCR法を用いる。（1)と同じく変異株より DNAを取得し、トランスポゾンタグに含まれて、な、制限酵素配列を利用して断片化する。これをセルフライゲーションさせ (環状ィ匕させる）、トランスポゾンタグの外側に向力プライマーを設計して PCR 反応を行、、増幅した PCR産物にっ、てシーケンスを解析する。

まずは（1)に示した抗生物質耐性を利用した方法で検討した。

(1)カナマイシン耐性を利用した検討

<ラン藻変異体 DNA抽出 >

ラン藻変異体（3216株）を BG11液体培地にて 30°C、明所にて 12日間培養した。培養終了後、集菌し SDS法を用いて抽出したところ約 800 gのラン藻変異体 DNAを得た。

<制限酵素による切断 >

制限酵素としては EcoRl、 Saclをそれぞれ用い、ラン藻変異体 DNAおよびベクター（ PUC118)を切断した。制限酵素処理終了後、断片化したラン藻変異体 DNAはスピンカラムにて精製した。ベクターに関してはセルフライゲーシヨンを防ぐためにアル力リフォスファターゼ処理を行った。

<ライゲーシヨン >

データベース力上記の 3種類の制限酵素で切断すると得られる平均断片長は EcoR 1では 6kb、 Saclでは 10kbであった。平均断片長を参考にインサート Zベクターのモル比を 3Z 1と 9Z 1に調整し 12°C、 16時間でライゲーションした。

<大腸菌への形質転換 >

ライゲーシヨン液の一部を用いてヒートショック法にて大腸菌 CFM109)に形質転換し、カナマイシンを含む LB寒天培地で選抜した。その結果、カナマイシンを含む LB寒天培地ではコロニーは認められなかつた。

また、ライゲーシヨンの際のインサート Zベクターの混合比率をインサート大過剰にしても同様の結果であった。抗生物質耐性を利用した選抜方法は理論的には可能なはずであるが、今回の場合、例えはインサート zベクター比の条件が合わな力つた等の問題が考えられる。条件検討の余地はあった力（2)で示した inverse PCR法で検討すること〖こした。

(2) inverse PCR法を利用した検討

表現型の強力つた 3216株について検討した。 DNA取得は上記と同様の方法で行い、制限酵素としては EcoRl、 Kpnlを用いた。制限酵素処理終了後、 DNA断片をスピンカラムにて精製した。

<セルフライゲーシヨン >

スピンカラムにて精製した DNA断片を用いて 12°C、 16時間でセルフライゲーシヨンさせた。

< 1stおよび 2nd PCR>

inverse PCR法の場合、非特異的なバンドの増幅させてしまう懸念があつたので、 PC R反応は 2段階に分けて行うことにした。

プライマーはトランスポゾンタグの外側に向力うプライマーを 2組設計した。

なお、 2nd PCRのプライマーはキット付属のシーケンスプライマーを使用した。

(1st PCR用プライマー）

ΚΑΝ-2-fr (配列番号 17)

ΚΑΝ-2-rev (配列番号 18)

(2nd PCR用プライマー）

KAN-2FP1 (配列番号 19)

KAN-2RP1 (配列番号 20)

セルフライゲーシヨンさせたゲノム断片をテンプレートとして 1st PCRを行った。 1st PC R条件は 98°C10秒 (変性）、 55°C30秒 (アニーリング）、 72°C7分 (伸長）を 30サイクルで EX taq polymerase(Takara社製)を使用し、プライマー濃度は最終各 0. 5 μ Μで行った。

テンプレートの最終濃度は上記ライゲーシヨン液 50倍希釈、 250倍希釈、 1250倍希釈の 3段階で検討した。 PCR産物を 5 1取り、ァガロースゲル電気泳動で確認した。電気泳動の結果、 EcoRlで切断したテンプレートを用いた場合のみ 7kb付近に特異的なバンドの増幅が認められた。プライマー除去のため、 1st PCR産物をスピンカラムにて精製し、 2nd PCRのテンプレートとした。

2nd PCR条件は 98°C10秒（変性）、 60°C30秒（アニーリング）、 72°C5分（伸長）を 3 サイクルした後、 98°C10秒 (変性）、 58°C30秒 (アニーリング）、 72°C5分 (伸長）を 2 0サイクルで EX taq polymerase(Takara社製)を使用し、プライマー濃度は最終各 0. 5 μ Μで行った。

PCR産物を 5 μ 1取り、ァガロースゲル電気泳動で確認した。

その結果、プライマー設計の通り、 1st PCR産物より数百 bp低い位置にバンドの増幅は認められた力同時に非特異的なバンドの増幅も認められた。

く TAクロー-ングおよびプラスミドの精製 >

2nd PCRの条件検討を行った力非特異的なバンドの増幅を抑えることができなかつたので 1st PCRで特異的に増幅した 7kb付近のバンドについてゲル回収を行った。これをインサートとして TAクロー-ング (pGEM-T Easyベクター使用、 Promega社製)を行い、ヒートショック法にて大腸菌 CFM109)に形質転換し、アンピシリンを含む LB寒天培地で選抜した。プレート上に現れたコロニーを 4つ選抜し、アンピシリンを含む L B液体培地で培養し、ミニプレップ法にてプラスミドの精製を行った。 pGEM-T Easy ベクターは EcoRl処理により、インサートの切り出しができるので精製したプラスミドを EcoRl処理し、ァガロースゲル電気泳動で確認した。

電気泳動の結果、プラスミド 1および 2は 5kb、 3kb (ベクター）、 1. 8kb付近にバンドが認められた。インサート由来のバンドの合計サイズは 7kb程度であり、目的のクローンであると判断した。プラスミド 1および 2について EcoRl処理でベクター由来も含め切断されたバンドが 3つ認められたのは、最初のライゲーシヨンの段階で環状ではなぐコンカテマ一を形成した可能性が考えられる。シーケンス解析には問題がないのでプラスミド 1につ、てシーケンス反応を行った。

<シーケンス >

プラスミド 1につヽてジデォキシ法によるサイクルシーケンスで塩基配列を解析した。シーケンスプライマーとしては 2nd PCRで用いた KAN- 2FP1および KAN- 2RP1を使用した。使用したシーケンスプライマーはトランスポゾンタグの DNA領域とァニールするため、得られるシーケンスデータの始めの部分はトランスポゾンタグの DNA領域となる。 inverted repeatシーケンスはトランスポゾン挿入クローンのターゲット DNAとトランスポゾンタグの接点で見つかる 19bp Transposon Mosaic End Transposase認識配列であり、このシーケンスはターゲットとトランスポゾンタグを識別する目印にできる。また、 Transposaseによって触媒されるトランスポゾン挿入は、挿入したトランスポゾンの側面を守るために 9-bpのターゲットサイト重複配列を生成する。

これらを参考にして得られたシーケンスを解析するとトランスポゾンタグはラン藻ゲノムの 256677番目の T力ら 256685番目の Gの間（Mosaic end配列および 9- bp重複配列確認）に挿入されていることが確認できた。この位置は ORF領域には含まれていないが、下流にある推定タンパク質 slrl790(256698-257279, 193aa)の転写調節領域であると考えられた。

アシフルオルフン非存在下では成育する力アシフルオルフン存在下では死滅する 9変異株のうち、 3216株以外の 8株についても、同様の解析をおこなったところ、いずれの株も 3216株と同様の遺伝子（slrl790)にトランスポゾンタグが挿入されていた。

実施例 4

[0080] (推定タンパク質 slrl 790の遺伝子破壊株の作製）

slrl790遺伝子（シネコシスティスゲノム 256698から 257279の 600bp)がプロトポルフィリノ一ゲンォキシダーゼをコードしているのかどうかを確認するために、 slrl790のコード領域にカナマイシン耐性遺伝子を挿入した組換えベクターを用いて、シネコシステイス PCC6803の slrl790遺伝子にっ、て遺伝子破壊を行った。ラン藻の形質転換は相同組換えで行うので、 _slrl790遺伝子の上流 700bpおよび下流 600bpの配列（シネコシスティスゲノム 255999から 257920の 1. 9kbp)をもとにプライマーを設計した。シネコシスティス PCC6803から抽出した DNAを铸型とし、それらのプライマー Slrl 790 km EcoRl f (配列番号 8)及びプライマー Sir 1790 km Hind3 r (配列番号 9)、並びに T aKaRa EX Taqポリメラーゼ（Takara社製）を用いた PCRにより、 slrl790遺伝子の上流 700bpおよび下流 600bpの配列を含む配列を増幅させ、 PCR産物を得た。 PCRは、変性（98。C、 10秒）、アニーリング（55。C、 30秒）、伸長（72。C、 120秒）を 28サイクル行った。得られた PCR産物を pGEM- T Easyベクター（Promega社製）に連結した。

[0081] slrl790遺伝子を含む配列が連結されたベクターをヒートショック法にて大腸菌 (JM 109)に形質転換し、アンピシリンを含む LB寒天培地で選抜した。現れたコロニーを、アンピシリンを含む LB液体培地で培養し、その培養物からプラスミド (pslrl790S)を精製した。次に、トランスポゾンタグに含まれるカナマイシン耐性遺伝子（1. 3kbp)を铸型とし、 Nhel部位を持つプライマー Km Nhel f (配列番号 10)及びプライマー Km N hel r (配列番号 11)並びに TaKaRa EX Taqポリメラーゼ（Takara社製）を用いた PCR により、カナマイシン耐性遺伝子を含む PCR産物を増幅させた。 PCRは、変性（98 。C、 10秒）、アニーリング（58°C、 30秒）、伸長（72°C、 80秒）を 28サイクル行った。得られた PCR産物を Nhelで切断し、それを、ベクター内の slrl790遺伝子中流の Nhe 1部位に連結した。これをヒートショック法にて大腸菌 CFM109)に形質転換し、カナマイシンを含む LB寒天培地で選抜した。現れたコロニーを、カナマイシンを含む LB液体培地で培養し、その培養物力もプラスミド (pslrl790SKM)を精製した。 slrl790遺伝子破壊用のこのコンストラクトを図 3に示す。シネコシスティス PCC6803を、この pslrl 790SKMで形質転換し、その形質転換体を、カナマイシンを含む BG 11寒天培地で培養して、 sir 1790遺伝子破壊株を選抜した。なお、シネコシスティス PCC6803の形質転換の方法は、文献 [Williams JG. Methods Enzymol (1998) 167:pp766]の方法に従った o

実施例 5

[0082] (推定タンパク質 slrl 790の遺伝子破壊株の解析）

プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼが破壊された場合、基質であるプロトポルフィリノ一ゲン IXが蓄積することが予想される力プロトポルフイリノーゲン IXは非常に不安定であるために、抽出過程において空気中の酸素と反応し容易にプロトポルフイリン IXに酸ィ匕されるため、空気中で抽出操作を行った後のプロトポルフィリン IXの量を測定することによって、プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼが破壊されたどうかを判定することができる。 slrl790の遺伝子破壊株についてのプロトポルフィリン IX量の測定は以下のような方法で行った。

[0083] 実施例 4で得られた sir 1790遺伝子破壊株を試験管を用いて、白色蛍光灯による連続光照射（光強度 30 mol s— 下、 30°Cで 1週間、通気した BG 11液体培地 50 mlで培養し、培養液を得た。得られた培養液から、 90%アセトンを用いて、プロトポルフィリン IXを含む色素を抽出し、色素抽出液を得た。この色素抽出液を HPLCにセットし、 1. 2mlZ分のフローレート、カラムオーブン 40°Cの条件下、ォクチルシリカ力ラム (Waters Symmetry C8(l 50 X 4. 6mm》及びメタノール（溶出剤）を用いて HPL C分析を行った（ポンプ LC- 10ATVP及びオートサンプラー SIL-10ADVPは (株)島津製作所社製)。プロトポルフィリン IXのモニタリングは、励起波長 405nm、蛍光波長 6 33nmで行った (蛍光検出器 RF— 10AXL は (株)島津製作所社製)。その結果を図 4 の C)に示す。また、 slrl790遺伝子破壊株の代わりに、その遺伝子破壊を行っていなぃシネコシスティス PCC6803を用いて同様の解析を行った結果を図 4の B)に示す。また、プロトポルフィリン IXのサンプルのクロマトグラムを図 4の A)に示す。

[0084] 図 4の結果から、 slrl790遺伝子破壊株では、その遺伝子破壊を行ってヽな、株に比べて、 20倍以上のプロトポルフィリン IXの蓄積が認められた。このことと、ラン藻のプロトポルフイリノーゲン IXあるいはプロトポリフィリン IXの代謝に関与する酵素のうち、同定されていないのはプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼのみであることとを考え合わせると、 slrl790がプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼをコードしていることが明らカとなった。なお、 slrl790は、既知のプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼとの相同性は極めて低い。 slrl790に対する、既知のプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼのアミノ酸レベルでの相同性を以下の表 3に示す。

[表 3]

実施例 6

[0086] (ラン藻プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ slrl790のシロイヌナズナヘの導入）植物用発現ベクターとして PBI121を使用した。 pBI121の概略図を図 5に示す。

植物のプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼは葉緑体、ミトコンドリアに存在する酵素であるが、今回は slrl790が葉緑体で発現するようにシロイヌナズナ由来クロロフィル a ォキシゲナーゼ (CAO, Genbank accession BT002075)の葉緑体移行シグナルを slrl 790遺伝子に連結して導入した。移行シグナルの予測は、 TargetP(http:〃胃 w.cbs.d tu.dk/services/TargetP/)を利用した。具体的には以下のような手順で行った。

[0087] pBI121ベクター（14. 8kbp)を制限酵素 BamHlおよび Saclを用いて GUS遺伝子（ 1. 9kbp)を除き、残りのベクター部分（12. 9kbp)をゲル回収にて精製した。また、 C AO由来の葉緑体移行シグナル (0. 2kbp)は、実施例 1で得られたシロイヌナナズナ cDNAを铸型として、制限酵素 BamHl、 Sacl認識部位をそれぞれ持つプライマー Ba mSma CAO fr. (配列番号 12)と Sac CAO rev. (配列番号 13)並びに KOD- Plus-ポリメラーゼ (TOYOBO社製）を用いて PCRで増幅させた。 PCRは、変性（94°C、 15秒）、アニーリング（55°C、 30秒）、伸長（68°C、 15秒）を 30サイクル行った。

[0088] こうして得た PCR産物を、アンピシリン而性を持つ pTA2ベクター（TOYOBO社製、 K OD- Plus-用 TAクローユングベクター、 2. 9kbp)へ連結後、ヒートショック法にて大腸菌 (JM109)に形質転換し、アンピシリンを含む LB寒天培地で選抜した。現れたコロニーをアンピシリンを含む LB液体培地で培養し、プラスミド (pTACAO)を精製した。プラスミド pTACAOを制限酵素 BamHlおよび Saclを用いて切断し、 CAO由来の葉緑体移行シグナルの切り出しを行い、ゲル回収にて精製した。この精製した CAO由来の葉緑体移行シグナルをインサートとして、先に GUS遺伝子を除去した pBI121ベタターに連結した。これをヒートショック法にて大腸菌 CFM109)に形質転換後、カナマイシンを含む LB寒天培地で選抜した。現れたコロニーをカナマイシンを含む LB液体培地で培養し、プラスミド (pBICAO、 13. lkbp)を精製した。 pBICAOは制限酵素 Sac 1にて切断し、セルフライゲーシヨンを防ぐため CIP処理後、ゲル回収にてベクター断片を精製した。

[0089] 次に slrl790遺伝子（0. 6kbp)はシネコシステイスから抽出したゲノムを铸型とし、制限酵素 Sacl認識部位を持つプライマー、 Sac slrl790fr. (配列番号 14)と Sac sir 1790 r ev. (配列番号 15)並びに KOD- Plus-ポリメラーゼ（TOYOBO社製）を用いて PCRで増幅させた。 PCRは、変性（94°C、 15秒）、アニーリング（55°C、 30秒）、伸長（68°C 、 35秒）を 30サイクル行った。こうして得た PCR産物をアンピシリン耐性を持つ pTA2 ベクターへ連結後、ヒートショック法にて大腸菌 C1M109)に形質転換し、アンピシリンを含む LB寒天培地で選抜した。現れたコロニーをアンピシリンを含む LB液体培地で培養し、プラスミド (pTAslrl790Sac)を精製した。プラスミド pTAslrl790Sacを制限酵素 Saclを用いて切断し、 slrl790遺伝子の切り出しを行い、ゲル回収にて精製した。この精製した slrl790遺伝子をインサートとして、先に制限酵素 Saclにて切断した pBICAO に連結した。これをヒートショック法にて大腸菌 CFM109)に形質転換後、カナマイシンを含む LB寒天培地で選抜した。現れたコロニーをカナマイシンを含む LB液体培地で培養し、プラスミド（pBIslr 1790、 13. 6kbp)を精製した。 pBIslrl790の概略図を図 6に示す。

[0090] 次に凍結法にて pBIslr 1790を導入した Agrobacterium tumefaciens C58株を用いて、 in planta法にてシロイヌナズナを形質転換した。

まず、 pBIslr 1790を保持した Agrobacterium tumefaciens C58株の菌体濃度が OD60 0 = 0. 8 - 1. 0付近となるように 300mLの形質転換ノッファー（5% sucrose, 0. 0 2% SilwetL- 77)に懸濁した。次ぎに、蕾の付いたポット植えのシロイヌナズナの地上部を前記懸濁液に 30秒間浸漬し、その後、各ポットをビニール袋で 2日間覆つた。覆いを取った後、さらに栽培を続け、種子を得た。栽培はグロースチャンバ一（24 h明、温度 22°C、光強度 mols— lm— 2)内で行った。得られた種子を殺菌し、 35ppmのカナマイシン、 0. 6%の寒天を含む 1/2濃度の Murashige— Skoogの培地 [T. Murashige and F. Skoog Physiol.Plant(1962) 15: pp473]に播種し、开質転換体を得た (sir系)。この形質転換体を土に移植し、グロースチャンバ一内で栽培し、 2世代目の種子を得た。

実施例 7

[0091] (形質転換体のアシフルオルフンに対する耐性効果）

アシフルオルフンに対する耐性効果は形質転換体 2世代目のうち、遺伝子導入が確認できたものについてアシフルオルフエンに対する耐性を検討した。

遺伝子導入の有無については以下の手法により確認した。

[0092] グロースチャンバ一内で草丈 1 2cm程度まで生育させた形質転換シロイヌナズナ sir系より、葉を直径 2mm程度それぞれの形質転換体より回収し、ゲノム DNAを抽出した。このゲノム DNAを铸型とし、導入した遺伝子の N末端および C末端とァニールするプライマー AtCAO-tra-up (配列番号 16)と Sac sir 1790 rev. (配列番号 15)並びに Taq DNA polymerase (SIGMA社製）を用いて PCRで増幅させ、ァガロースゲル電気泳動にてバンドの有無を確認した。 PCRは、変性（95°C、 30秒）、アニーリング（5 5°C、 45秒）、伸長（72°C、 60秒）を 40サイクル行った。 [0093] 遺伝子導入が確認できた形質転換体について、アシフルオルフエンに対する耐性効果を検討した。アシフルオルフエンはジメチルホルムアミドおよびポリオキシェチレンソルビタン系界面活性剤を混合、溶解して有効成分 4%となるように乳剤を作成した。これをアシフルオルフエン濃度が最終 10 Mとなるように水で希釈し、マイクロピペットを用いて、グロースチャンバ一内で草丈 1— 2cm程度まで生育させたシロイヌナズナ野生株および遺伝子導入を確認した形質転換シロイヌナズナ sir系の葉面にそれぞれ 5 μ 1滴下処理した。

調査は薬液処理 7日後まで継続して行、、壊死の程度を目視にて評価した (0— 5の 6段階評価、 0は影響なし)。処理 7曰後の結果を表 4に示した。その結果、シロイヌナズナ野生株と比較して、 slrl790を導入したシロイヌナズナはアシフルオルフエンに対する耐性が確認できた。

[0094] [表 4] 表 4 s l r l 790導入シロイヌナズナのアシフルオルフ _v ォス耐件^平 (^理 ₇日後）アシフ ^ル" "フエ ~~

¾₌₌₌₌₌_ 10 M処理

シロイヌナズナ野生株

s i r 52 1

s i r 146 i 完全枯死を 5、影響なしを 0として 0-5の 6段階で目視にて評価した。実施例 8

[0095] (プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ阻害剤の阻害能試験）

実施例 1で得られた AT株および実施例 4の方法で AT株の slrl790遺伝子を破壊した AT Δ sir 1790株を用いた。培地は前記の BG11液体培地を使用し、遺伝子の欠落および復帰変異を抑えるため、 AT株にはプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼと同時にクロラムフエ二コール耐性遺伝子も導入してあるのでクロラムフエ二コールを、 AT Δ slrl790株はその遺伝子破壊の際にカナマイシン耐性遺伝子を導入してるのでカナマイシンをそれぞれ最終 25 μ g/mlとなるように添カ卩した。 BG11液体培地で振とう前培養を行った増殖期の AT株、 AT Δ sir 1790株を集菌し、抗生物質を加えた新たな BG11液体培地に A730が 0. 1となるように懸濁して検討に用いた。 [0096] 披験化合物の原体を DMSOに溶解し、各ゥエルに最終薬剤処理濃度が 1. 0 X 10 _⁴Mから 1. 0 Χ 10^_9· ⁵Μとなるように添加した (最終 DMSO濃度 0. 5%)。試験は 9 6穴プレート 1ゥエルあたり 100 μ 1スケールで実施し、培養温度 30°C、光強度 10001 u_xの条件下で振とう培養した。試験開始 6日後に濁度を測定し、溶媒処理区と比較して pI50値を算出した。

pI50値 =—log (50%活性阻害処理濃度 (M) )

[0097] (除草処理活性）

200cm²のポットに土壌を充填し、表層にィヌビュの種子を播き、軽く覆土後、草丈力〜 10cmになるまで温室内で生育させた。各披験化合物の水希釈液を所定の薬量になるように、 1000リットル ha散布量相当量で小型噴霧器にてィヌビュの茎葉部に散布した。温室内で育成させ、処理 2週間後にィヌビュの除草効果を下記の調查基準に従って調査し、殺草指数で表した。結果を以下の表に示す。

[0098] [表 5] 調査基準

※し 3 , 5 , 7、 9の数値は、各々 0と 2、 2と 4、 4と 6、 6と 8、 8と 1 0の中間の値を示す。

[0099] [表 6」

[0100] [表 7] 披験化合物

[0101] AT Δ slrl790株はジフエ-ルエーテル系型プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ阻害剤であるアシフルオルフエン以外の剤にも感受性を示し、プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ阻害剤全般的に阻害活性を示した。また、各披験化合物の AT A slrl79 0株に対する pI50値の傾向はそれぞれの茎葉処理活性を反映するものであり、プロトボルフイリノーゲンォキシダーゼ阻害活性能の評価に有効であるといえる。

実施例 9

[0102] (プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ阻害剤に特異的な化合物スクリーニング法）上記の実施例カゝらプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ阻害剤は AT株に感受性を示さず、 AT A slrl790株には感受性を示した。一方、非プロトポルフイリノーゲン阻害剤用 AT株および AT Δ slrl 790株の両方にも同程度の阻害活性を示した。このように AT株と AT Δ slrl790株の化合物に対する阻害能を比較することにより、各披験化合物のプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ阻害能を判定する。産業条の利用可能性

[0103] 本発明のプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼは既知の該酵素とかなり異なる構造を有するため、新規なプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ阻害除草剤の選抜への応用が期待できる。また、本発明のプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼは、プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ阻害除草剤に対する耐性を有する光合成植物の育種若しくはストレス環境条件に抵抗性を有する植物の育種への応用が期待できる。さらに、本発明の遺伝子の単離方法によると、既知のタンパク質と相同な他の生物種由来のタンパク質力他の生物種の遺伝子データベースでは見い出すことができなヽ場合であっても、他の生物種の遺伝子を単離することができる有効手法を提供することができる。

Claims

請求の範囲

[1] アシフルオルフエンに対する耐性を生物に付与する活性を有し、かつラン藻由来であることを特徴とするプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ。

[2] ラン藻が、シネコシスティス属に属するラン藻であることを特徴とする請求項 1記載のプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ。

[3] 生物が、植物であることを特徴とする請求項 1又は 2記載のプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ。

[4] 下記 (a)〜（c)のいずれかに示すタンパク質。

(a)配列番号 2に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質

(b)配列番号 2に示されるアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列カゝらなり、かつアシフルオルフエンに対する耐性を生物に付与する活性を有することを特徴とする、プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ活性を有するタンパク質

(c)配列番号 2に示されるアミノ酸配列に対する相同性が 20%以上であり、かつァシフルオルフエンに対する耐性を生物に付与する活性を有することを特徴とする、プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ活性を有するタンパク質

[5] ラン藻由来であることを特徴とする請求項 4記載のタンパク質。

[6] 請求項 1〜3のいずれか記載のプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ、又は請求項 4 若しくは 5記載のタンパク質をコードするプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝子

DNA₀

[7] 下記（d)又は（e)に示すプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝子 DNA。

(d)配列番号 1に示される塩基配列からなるプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝子 DNA

(e)配列番号 1に示される塩基配列において、 1若しくは数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列力もなり、かつアシフルオルフエンに対する耐性を生物に付与する活性を有し、かつプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝子 DNA

[8] 配列番号 1に示される塩基配列に対して相補的な配列力なる DNAとストリンジントな条件下でノヽイブリダィズし、かつアシフルオルフエンに対する耐性を生物に付与する活性を有し、かつプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝子 DNA。

[9] プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ活性を有するタンパク質力ラン藻に由来することを特徴とする請求項 7又は 8のいずれか記載のプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝子 DNA。

[10] 請求項 6〜9の!、ずれか記載のプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝子 DNAが組み込まれた組換えベクター。

[11] 請求項 10記載の組換えベクターが導入されたことを特徴とする形質転換体。

[12] 形質転換体が、アシフルオルフンに対する耐性を有することを特徴とする請求項 1

1記載の形質転換体。

[13] 形質転換体が微生物であることを特徴とする請求項 11又は 12記載の形質転換体。

[14] 形質転換体が植物であることを特徴とする請求項 11又は 12記載の形質転換体。

[15] 光合成能が向上したことを特徴とする請求項 14記載の形質転換体。

[16] 請求項 11〜15のいずれか記載の形質転換体を用いた、プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ阻害活性能の評価方法。

[17] 請求項 11〜16のいずれか記載の形質転換体を用いた、プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ阻害剤のスクリーニング方法。

[18] 以下の（f)〜 (j)の工程を含む、ラン藻のプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝子の単離方法。

(f)シロイヌナズナのプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝子をラン藻に導入する工程

(g)トランスポゾンを用いてラン藻の遺伝子を破壊する工程

(h)プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝子が破壊された株を選抜する工程

(i)破壊されたプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝子を特定する工程

(j)破壊されたプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝子を単離する工程

[19] 請求項 4又は 5記載のタンパク質の、プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼとしての使用方法。

[20] 請求項 4又は 5記載のタンパク質を、プロトポルフイリノーゲン IXと人為的に接触させてプロトポルフイリン IXに転換する方法。

[21] 請求項 6〜9のいずれか記載の DNAの、プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝子としての使用方法。

[22] 請求項 6〜9のいずれか記載の DNAを人為的に発現させ、その発現産物を、プロトボルフイリノーゲン IXと接触させてプロトポルフィリン IXに転換する方法。

[23] 以下の 1)〜5)の工程を含む、特定生物における所定の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子の単離方法。

5)破壊された所定の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を単離する工程

[24] 変異処理が、トランスポゾンを用いた変異処理であることを特徴とする請求項 23記載の遺伝子の単離方法。

[25] 特定生物以外の他の生物から所定の機能を相補するタンパク質が、シロイヌナズナのプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼであることを特徴とする請求項 23又は 24記載の遺伝子の単離方法。

[26] 所定の機能を相補するタンパク質に作用し、所定の機能を有するタンパク質に作用しな、薬剤が、アシフルオルフエンであることを特徴とする請求項 25記載の遺伝子の単離方法。

[27] 特定生物における所定の機能を有するタンパク質が、ラン藻のプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼであることを特徴とする請求項 25又は 26記載の遺伝子の単離方法。