WO2001036606A2 - Protoporphyrinogen-ix-oxidase und seine verwendung - Google Patents

Protoporphyrinogen-ix-oxidase und seine verwendung Download PDF

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plant
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Bernhard Grimm
Inna Lermontova
Valeria Voronetskaja
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Basf Plant Science Gmbh
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    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance

Definitions

  • the invention relates to DNA sequences SEQ-ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 or SEQ-ID No. 7 containing the coding region of a ⁇ plant protoporphyrinogen IX oxidase.
  • the invention further relates to DNA sequences which are identified by the DNA sequence SEQ-ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 or SEQ-ID No.
  • the invention relates to a protein with protoporphyrinogen IX oxidase activity with the amino acid sequence SEQ-ID No. 2, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6 or SEQ-ID No. 8.
  • the invention also relates to the use of a DNA sequence SEQ-ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 or SEQ-ID No.
  • the invention also includes plants resistant to peroxidizing inhibitors of protoporphyrinogen IX oxidase, characterized in that a DNA sequence SEQ-ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 or SEQ-ID No. V is expressed.
  • the invention also includes the use of the DNA sequence Accession No. D 83139 from Arabidopsis thaliana, the overexpression of which also causes the resistance of these plants to peroxidizing inhibitors of protoporphyrinogen IX oxidase.
  • 5-aminolevulinate is produced from glutamate in three successive steps, while animals and yeasts, succinyl-CoA and glycine condense a carboxyl group by means of the ALA synthase.
  • Protoporphyrinogen IX oxidase is a flavin-containing enzyme and catalyzes the 6-electron oxidation of protoporphyrinogen IX.
  • the enzyme In the plastids, the enzyme is in the thylakoid membranes and. to a large extent localized in the envelope membrane (25% of the total activity) (Matringe et al., J. Biol. Che., 267 (1992), 4646-4651).
  • protoporphyrinogen IX oxidase appears to be bound to the outside of the inner membrane analogous to the animal enzyme (Ferreira et al., J. Biol. Chem.
  • Protoporphyrinogen IX-oxidizing enzyme activities with resistance to the typical herbicides of protoporphyrinogen IX oxidase have also been demonstrated in the plasma membrane of roots and etiolated tissue, in microsomes, in the endoplasmic reticulum and in soluble extracts from tobacco cell cultures (Jacobs et al ., Plant Physiol 97 (1991), 197-203; Lee et al., Plant Physiol. 102 (1993), 881-889; Retzlaff and Böger, Pest. Biochem. Physiol. 54 (1996), 105-114; Yamamoto et al., Pest. Biochem. Physiol. 50 (1994), 72-82).
  • rin (ogen) IX produces reactive substances that can only be insufficiently detoxified in this environment and cause photodynamic damage.
  • Plant protoporphyrinogen IX oxidase cDNA clones were obtained by functional complementation of the protoporphyrin IX accumulating E. coli hemG mutant (WO 95/34659; Narita et al., Gene 182 (1996), 169-175; Lermontova et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94 (1997), 8895-8900).
  • the encoded peptides show significant similarity to HemY, a protein from Bacillus to which protoporphyrinogen IX oxidase activity could be assigned for the first time (Hansson and Hederstedt, J. Bacteriol. 174 (1992), 8081-8093).
  • modified protoporphyrinogen IX oxidase nucleic acid sequences are brought into these crop plants, the protein products of which are more tolerant of herbicides used in agriculture. This means that these useful plants continue to have functional protoporphyrinogen IX oxidase protein when in contact with a herbicide.
  • protoporphyrinogen IX oxidase genes which confer resistance to peroxidizing inhibitors from plants for the production of plants and which are tolerant of inhibitors of protoporphyrinogen IX oxidase.
  • the object was achieved by isolating a cDNA from tobacco which codes for the plastid protoporphyrinogen IX oxidase and subsequently selecting mutated protoporphyrinogen IX oxidase I genes which code for an inhibitor-resistant protoporphyrinogen IX oxidase, see example 1.
  • Four resistance to inhibitors of the protoporphyrinogen IX oxidase-producing mutations in the protoporphyrino gene IX oxidase I gene were characterized (clone # 36, # 38, # 51 and # 65) and the sequence of the resistant form of the protoporphyrinogen IX -Oxidase determined, see Examples 2 and 3 and sequence listing SEQ-ID No. l r No. 2, no. 3, no. 4, no. 5 and no. 6th
  • Arabidopsis which codes for the plastid protoporphyrinogen IX oxidase and subsequent selection of a mutated protoporphyrinogen IX oxidase I gene which codes for an inhibitor-resistant protoporphyrinogen IX oxidase, see Example 6.
  • a resistance to inhibitors of the protoporphyrinogen IX oxidase-producing mutation in the protoporphyrinogen IX oxidase I gene from Arabidopsis thaliana was characterized (clone AC ⁇ 8) and the sequence of the resistant form of the protoporphyrinogen IX oxidase was determined, see Example 6 and sequence listing SEQ ID No. 7 and No. 8th.
  • the invention also relates to expression cassettes, the sequence of which codes for a form of the protoporphyrinogen IX oxidase from tobacco which is resistant to peroxidizing inhibitors of protoporphinogen IX oxidase or its functional equivalent.
  • the nucleic acid sequence can e.g. be a DNA or a cDNA sequence.
  • an expression cassette according to the invention also contain regulatory nucleic acid sequences which control the expression of the coding sequence in the host cell.
  • an expression cassette according to the invention comprises upstream, i.e. at the 5 'end of the coding sequence, a promoter and downstream, i.e. at the 3 'end, a polyadenylation signal and, if appropriate, further regulatory elements which are operatively linked to the gene sequence in between for the resistant form of protoporphyrinogen IX oxidase according to the invention.
  • An operative link is understood to mean the sequential arrangement of promoter, coding sequence, terminator and, if appropriate, further regulatory elements in such a way that each of the regulatory elements can fulfill its function as intended in the expression of the coding sequence.
  • An expression cassette according to the invention is produced by fusing a suitable promoter with a suitable DNA sequence coding for the resistant form of the protoporphyrinogen IX oxidase according to the invention and a polyadenylation signal according to common recombination and cloning techniques, as described, for example, in T. Maniatis, EF Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) and in T.J. Silhavy, M.L. Ber an and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) and in Ausubel, F.M. et al. , Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987).
  • the invention also relates to functionally equivalent DNA sequences which code for a gene which mediates resistance to peroxidizing inhibitors of protoporphyrinogen IX oxidase and which, based on the total length of the DNA sequence, have a sequence homology with the DNA sequence SEQ-ID NO. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID NO. 5 or SEQ-ID No. 7 have from 40 to 100%.
  • Preferred objects of the invention are functionally equivalent DNA sequences which code for a gene which mediates resistance to peroxidizing inhibitors of protoporphyrinogen IX oxidase and which, based on the total length of the DNA sequence, have a sequence - homology with the DNA sequence SEQ-ID NO. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 or SEQ-ID No. 7 have from 60 to 100%.
  • a particularly preferred object of the invention are functionally equivalent DNA sequences which code for a gene which mediates resistance to peroxidizing inhibitors of protoporphyrinogen IX oxidase and which, based on the total length of the DNA sequence, have sequence homology with the DNA sequence SEQ-ID NO. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID NO. 5 or SEQ-ID No. 7 have from 80 to 100%. ,
  • Functionally equivalent sequences which code for a gene which mediates resistance to peroxidizing inhibitors of protoporphyrinogen IX oxidase are, according to the invention, those sequences which, despite a different nucleotide sequence, still have the desired functions.
  • Functional equivalents thus include naturally occurring variants of the sequences described here, as well as artificial, e.g. B. artificial nucleotide sequences obtained by chemical synthesis and adapted to the codon use of a plant.
  • a functional equivalent is understood to mean, in particular, natural or artificial mutations of an originally isolated gene of the DNA sequence SEQ-ID No. for a peroxidizing inhibitor of the Protopor phyrinogen-IX-Oxidase. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 or SEQ-ID No. 7, which also shows the desired function. Mutations include substitutions, additions, deletions, exchanges or insertions of one or more nucleotide residues. Thus, for example, the present invention also encompasses those nucleotide sequences which are obtained by modifying this nucleotide sequence. The aim of such a modification can e.g. B. the further limitation of the coding Seque z or z contained therein. B. also the insertion of further restriction enzyme sites.
  • Another object of the invention is a protein from tobacco or Arabidopsis thaliana characterized by the amino acid sequence SEQ-ID NO. 2, SEQ ID No. 4, SEQ ID NO. 6 or SEQ-ID No. 8 or derivatives or parts of this protein with resistance to peroxidizing inhibitors of protoporphyrinogen IX oxidase — the protoporphyrinogen IX oxidase activity.
  • the invention also relates to vegetable proteins with protoporphyrinogen IX oxidase activity which mediates resistance to peroxidizing inhibitors of protoporphyrinogen IX oxidase and has an amino acid sequence homology to the tobacco or Arabidopsis thaliana protoporphyrinogen IX oxidase of the sequences SEQ-ID NO. 2, SEQ ID No. 4, SEQ ID NO. 6 or SEQ-ID No. 8 out of 20 - 100% identity.
  • Vegetable proteins with resistance to peroxidizing inhibitors of protoporphyrinogen IX oxidase are preferred — the protoporphyrinogen IX oxidase activity with an amino acid sequence homology to the tobacco protoporphyrinogen IX oxidase of the sequences SEQ-ID NO. 2, SEQ ID No. 4 or SEQ ID NO. 6 out of 50 - 100% identity.
  • Vegetable proteins with protoporphyrinogen IX oxidase activity imparting resistance to peroxidizing inhibitors of protoporphyrinogen IX oxidase with an amino acid sequence homology to the tobacco protoporphyrinogen IX oxidase of the sequences SEQ-ID NO are particularly preferred. 2, SEQ ID No. 4 or SEQ ID NO. 6 of 80 - 100% identity.
  • Protoporphyrinogen IX oxidase inhibitors impart resistance — protoporphyrinogen IX oxidase activity with an amino acid sequence homology to the Arabidopsis thaliana protoporphyrinogen IX oxidase of the sequence SEQ-ID NO. 8 out of 50 - 100% identity.
  • Vegetable proteins with protoporphyrinogen IX oxidase activity imparting resistance to peroxidizing inhibitors of protoporphyrinogen IX oxidase with an amino acid sequence homology to the Arabidopsis thaliana protoporphyrinogen IX oxidase of the sequence SEQ-ID NO are particularly preferred. 8 out of 80 - 100% identity.
  • the effectiveness of the expression of the transgenically expressed resistance-imparting protoporphyrinogen IX oxidase gene can be determined, for example, in vitro by proliferation or by a germination test.
  • the type and level of expression of the resistance-imparting protoporphyrinogen IX oxidase gene and its effect on the resistance to inhibitors of protoporphyrinogen IX oxicLase can be tested on test plants in greenhouse experiments.
  • the invention also relates to transgenic plants transformed with an expression cassette containing the DNA sequence SEQ-ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID NO. 5 or SEQ-ID No. 7, which is obtained by additional expression of the DNA sequence SEQ-ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID NO. 5 or SEQ-ID No. 7 have become tolerant of peroxidizing inhibitors of protoporphyrinogen IX oxidase, as well as transgenic cells, tissues, parts and propagation material of such plants.
  • the invention furthermore relates to seeds of the plants described above and reproductive material from transformed organisms of the type described above.
  • increasing resistance means, for example, the artificially acquired ability of increased tolerance to peroxidizing inhibitors of protoporphyrinogen IX oxidase by functional overexpression of the resistance-imparting protoporphyrinogen IX oxidase gene of the DNA sequence SEQ -ID no. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 or SEQ-ID No. 7 in the plant compared to the non-genetically modified plant for the duration of at least one plant generation.
  • Sequences are particularly preferred which ensure targeting in the apoplasts, in plastids, the vacuole, the mitochondrium, the endoplasmic reticulum (ER) or, due to the lack of corresponding operative sequences, ensuring that they remain in the compartment of formation, the cytosol ( Kermode, Crit. Rev. Plant Sei. 15, 4 (1996), 285-423).
  • the plant expression cassette can be built into the binary vector BinAR-TX, see example 2 and figure 2.
  • Any promoter which can control the expression of foreign genes in plants is in principle suitable as a promoter of the expression cassette according to the invention.
  • a plant promoter or a promoter derived from a plant virus is preferably used.
  • the CaMV is particularly preferred
  • the expression cassette according to the invention can also contain a chemically inducible promoter through which the expression of the exogenous resistance-mediating protoporphyrinogen IX oxidase
  • promoters as e.g. the PRPl promoter (Ward et al., Plant Mol Biol. (1993) 22, 361-366), a promoter inducible by salicylic acid (WO 95/19443), one inducible by benzenesulfonamide (EP 388186), one by tetracycline-indu
  • promoters are particularly preferred which ensure expression in special tissues or parts of plants in which the biosynthesis of chlorophyll and urine takes place. Promoters that ensure leaf-specific expression should be mentioned in particular. These are the
  • a foreign protein 40 can be stably expressed up to a proportion of 0.67% of the total soluble seed protein in the seeds of transgenic tobacco plants (Fiedler and Conrad, Bio / Technology (1995) 10, 1090-1094).
  • the expression cassette according to the invention can therefore contain, for example, a seed-specific promoter (preferably the Phaseolin 45 promoter, the USP or LEB4 promoter), the LEB4 signal peptide, the gene to be expressed and an ER retention signal 1.
  • the inserted nucleotide sequence coding for a protoporphyrinogen IX oxidase resistant to peroxidizing inhibitors of the protoporphyrinogen IX oxidase can be produced synthetically or can be obtained naturally or contain a mixture of synthetic and natural DNA components.
  • synthetic nucleotide sequences with codons are generated which are preferred by plants. These codons preferred by plants can be determined from codons with the highest protein frequency, which are expressed in most interesting plant species.
  • various DNA fragments can be manipulated in order to obtain a nucleotide sequence which expediently reads in the correct direction and which is equipped with a correct reading grid. To connect the DNA fragments to one another, adapters or linkers can be attached to the fragments.
  • artificial DNA sequences are suitable as long as they have the desired property of increasing resistance to peroxidizing inhibitors, as described above, for example
  • protoporphyrinogen IX oxidase in the plant by overexpression a resistance-mediating protoporphyrinogen IX oxidase gene in cultivated plants.
  • Such artificial DNA sequences can be determined, for example, by back-translation by means of molecular modeling of proteins constructed which have protoporphyrinogen IX oxide activity or by in vitro selection. Coding DNA sequences which are obtained by back-translating a polypeptide sequence according to the codon usage specific for the host plant are particularly suitable. The specific codon usage can easily be determined by a person familiar with plant genetic methods by computer evaluations of other, known genes of the plant to be transformed.
  • Suitable equivalent nucleic acid sequences according to the invention are sequences which code for fusion proteins, part of the fusion protein being a plant protoporphyrinogen IX oxidase polypeptide or a functionally equivalent part thereof.
  • the second part of the fusion protein can e.g. B. be another polypeptide with enzymatic activity or an antigenic polypeptide sequence with the help thereof
  • protoporphyrinogen IX oxidase expression is possible (e.g. myc-tag or his-tag).
  • this is preferably a regulatory protein sequence, such as B. a signal or transit peptide that directs the protoporphyrinogen IX oxidase protein to the desired site of action.
  • the promoter and terminator regions according to the invention should expediently be provided in the transcription direction with a linker or polylinker which contains one or more restriction sites for the insertion of this sequence.
  • the linker has 1 to 10, usually 1 to 8, preferably 2 to 6, restriction sites.
  • the linker has a size of less than 100 bp, often less than 60 bp, but at least 5 bp within the regulatory ranges.
  • the promoter according to the invention can be native or homologous as well as foreign or heterologous to the host plant.
  • the expression cassette according to the invention contains in the 5 '-3' transcription direction the promoter according to the invention, any sequence and a region for the transcriptional termination. Different termination areas are interchangeable.
  • Preferred polyadenylation signals are plant polyadenylation signals, preferably those which essentially correspond to T-DN - polyadenylation signals from Agrobacterium t ⁇ mefaciens, in particular gene 3 of T-DNA (octopine synthase) of the Ti plasmid pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984) 835 ff) or functional equivalents.
  • an expression cassette according to the invention is inserted as an insert in a recombinant vector whose vector DNA contains additional functional regulation signals, for example sequences for replication or integration .
  • Suitable vectors are inter alia in "Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology" (CRC Press), Chap. 6/7, p.71-119.
  • transformation The transfer of foreign genes into the genome of a plant is called transformation.
  • the methods described for the transformation and regeneration of plants are used
  • Plant tissues or plant cells are used for transient or stable transformation. Suitable methods are the protoplast transformation by polyethylene glycol-induced DNA uptake, the biolistic approach with the gene cannon, electroporation, the incubation of dry embryos in DNA-containing solution, microinjection and the gene transfer mediated by Agrobacterium. The methods mentioned are described, for example, in B. Jenes et al. , Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, edited by SD Kung and R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 and in Potrykus Annu. Right Plant Physiol. Plant Molec.Biol. 42 (1991) 205-225).
  • the construct to be expressed is preferably cloned into a vector which is suitable for transforming Agrobacterium tumefaci ens, for example pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711).
  • Agrobacteria can also be used in a known manner for transforming plants, in particular crop plants, such as cereals, corn, soybeans, rice, cotton, sugar beet, canola, sunflower, flax, hemp, potatoes, tobacco, tomato, rapeseed, alfalfa, lettuce and the different tree, nut and wine species as well as legumes are used, e.g. by bathing wounded leaves or leaf pieces in an agrobacterial solution and then cultivating them in suitable media.
  • crop plants such as cereals, corn, soybeans, rice, cotton, sugar beet, canola, sunflower, flax, hemp, potatoes, tobacco, tomato, rapeseed, alfalfa, lettuce and the different tree, nut and wine species as well as legumes are used, e.g. by bathing wounded leaves or leaf pieces in an agrobacterial solution and then cultivating them in suitable media.
  • the biosythesis site of chlorophylls and heme is generally the leaf tissue, so that leaf-specific expression of the resistance-mediating protoporphyrinogen IX oxidase gene makes sense.
  • the chlorophyll and heme biosynthesis need not be restricted to the leaf tissue, but also in all other parts of the plant, for example in fatty seeds - tissue-specific.
  • constitutive expression of the exogenous resistance-mediating protoporphyrinogen IX oxidase gene is advantageous.
  • inducible expression may also appear desirable.
  • the expression cassettes according to the invention can be cloned into suitable vectors which enable their multiplication, for example in E. coli.
  • suitable cloning vectors include pBR332, pUC series, Ml3mp series and pACYC184.
  • Binary vectors which can replicate both in E. coli and in agrobacteria are particularly suitable.
  • Another object of the invention relates to the use of an expression cassette according to the invention for the transformation of plants, plant cells, plant tissues or parts of plants.
  • the aim of the use is preferably to increase the resistance by expressing a resistance-imparting protoporphyrinogen IX oxidase with the DNA sequence SEQ-ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 or SEQ-ID No. 7 in the plant.
  • protoporphyrinogen IX oxidase I As an alternative to a modified, herbicide-tolerant protoporphyrinogen IX oxidase I sequence, it was shown that overproduction of the unchanged protoporphyrinogen IX oxidase I from Arabidopsis thaliana in a plant also leads to an increased tolerance to herbicides, see Example 5. This was done the Arabidopsis protoporphyrinogen IX oxidase I was consistently overexpressed in tobacco and the plants obtained were tested for increased tolerance to acifluorfen. There was no photodynamic damage in these plants. In in-vitro assays, protoporphyrinogen IX oxidase I enzyme activity was significantly increased compared to wild-type plants.
  • the expression can take place specifically in the leaves, in the seeds or in other parts of the plant.
  • Such transgenic plants, their reproductive material and their plant cells, tissue or parts are a further object of the present invention.
  • Peroxidizing inhibitors of protoporphyrinogen IX oxidase are, for example, the following compounds:
  • Diphenyl ethers such as acifluorfen, acifluorfen-sodium, aclonifen, bifenox, chloronitrofen (CNP), ethoxyfen, fluorodifen,
  • Oxadiazoles such as oxadiargyl or oxadiazon; cyclic imides, such as azafenidin, butafenacil, carfentrazone-ethyl, cinidon-ethyl, flumiclorac-pentyl, flumioxazin, flumopropyn, flupropacil, fluthiacet-methyl, sulfentrazone or
  • Protoporphyrinogen IX oxidase inhibitors can be found in transgenic cultures which have a DNA sequence SEQ-ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 or SEQ-ID No. 7 encoding a protoporphyrinogen IX oxidase resistant to protoporphyrinogen IX oxidase inhibitors, such as maize, cereals, rice and soybeans, very well combating weeds and grass weeds without damaging the crop; an effect that occurs especially at low application rates.
  • transgenic crop plants expressing a DNA sequence coding for a protoporphyrinogen IX oxidase which is resistant to inhibitors of protoporphyrinogen IX oxidase are also suitable:
  • inhibitors of protoporphyrinogen IX oxidase can also be found in transgenic cultures which have the DNA sequence SEQ-ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 or SEQ-ID No. 7 express are used, which are tolerant to the action of other herbicides by breeding or genetic engineering methods.
  • the present invention relates to the use of the resistance-mediating protoporphyrinogen IX oxidase gene of SEQ-ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 or SEQ-ID No. 7 for the production of plants tolerant of peroxidizing inhibitors of protoporphyrinogen IX oxidase, and the use of protoporphyrinogen IX oxidase resistant to peroxidizing inhibitors of protoporphyrinogen IX oxidase of the amino acid sequences SEQ-ID No. 2, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6 or SEQ-ID No. 8 to set up an enzymatic test system for the identification of novel inhibitors of protoporphyrinogen IX oxidase.
  • the present invention also relates to the use of the DNA sequence SEQ-ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 or SEQ-ID No. 7 for the production of a selection system, characterized in that the DNA sequence is incorporated into a transformation vector, is transformed with this plant cells and then the transformed plant cells or plants are selected for peroxidizing inhibitors of protoporphyrinogen IX oxidase ,
  • Cloning methods such as Restriction cleavages, agarose gel electrophoresis, purification of DNA fragments, transfer of nucleic acids to nitrocellulose and nylon membranes, linking of DNA fragments, transformation of Escherichia coli cells, cultivation of bacteria and sequence analysis of recombinant DNA were carried out as in Sambrook et al. (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6).
  • the sequencing of recombinant DNA molecules was carried out with a laser fluorescence DNA sequencer from ABI according to the method of Sanger (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463-5467). Fragments resulting from a polymerase chain reaction were sequenced and checked in order to avoid polymerase errors in constructs to be expressed.
  • RNA was extracted according to Chomczinsky, P. and Sacchi, N. (Anal. Biochem. 162 (1987), 156-159). For the analysis, 20 ⁇ g RNA were separated in a 1.5% agarose gel containing formaldehyde and transferred to nylon membranes (Hybond, Amersham). The detection of specific transcripts was carried out as described for Amasino (Anal. Biochem. 152 (1986), 304). The DNA fragments used as a probe were radioactively marked using a random primed DNA labeling kit (Röche, Mannheim) and hybridized according to standard methods (see Hybond user instructions, Amersham). Hyridization signals were made visible by autoradiography using X-OMAT AR films from Kodak.
  • DNA-modifying enzymes and molecular biological kits were developed by the companies AGS (Heidelberg), Amersham (Braunschweig), Biometra (Göttingen), Röche (Mannheim), Genomed (Bad Oeynnhausen), New England Biolabs (Schwalbach / Taunus), Novagen (Madison, Wisconsin, USA), Perkin-Elmer (Weiterstadt), Pharmacia (Freiburg), Qiagen (Hilden) and Stratagene (Heidelberg) related. Unless otherwise stated, they were used according to the manufacturer's instructions.
  • E. coli, XL-1 Blue The bacterial strains used below (E. coli, XL-1 Blue) were obtained from Stratagene.
  • E. coli AT 2465 was obtained from the coli genetic stock center (Yale University, New Haven).
  • the Agrobacterium strain used for plant transformation (Agrobacterium tumefaciens, C58C1 with the plasmid pGV2260 or pGV3850kan) was developed by Deblaere et al. (Nucl. Acids Res. 13 (1985), 4777).
  • the LBA4404 agrobacterial strain (Clontech) or other suitable strains can be used.
  • the vectors pUC19 (Yanish-Perron, Gene 33 (1985), 103-119), pBluescript SK- (Stratagene), pGEM-T (Promega), pZerO (Invitrogen), pBinl9 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711-8720) and pBinAR (Höfgen and Willmitzer, Plant Science 66 (1990), 221-230) can be used.
  • Agrobacterium tumefaciens was carried out according to the method of Höfgen and Willmitzer (Nucl. Acid Res. 16 (1988), 9877).
  • the agrobacteria were grown in YEB medium (Vervliet et al., J. Gen. Virol. 26 (1975), 33).
  • the analysis of proteins in the SDS polyacrylamide gel electrophoresis, their transfer and detection (Western analysis) were carried out as in Sa brook et al. (1989).
  • Recombinant phagemids (pBluescript) were cut out of a Lambda ZAP II tobacco (SRl) cDNA library (Stratagene). After transformation of the E. coli hemG mutant (strain R751; Nishimura et al., DNA Res.
  • the cDNA encoding plastid protoporphyrinogen IX oxidase I consists of 1644 nucleotides, including 29 and 21S bases of the 5 'and 3' untranslated region, respectively.
  • the open reader frame codes for 548 amino acids, which give a molecular weight of 59138 Da.
  • This protoporphyrinogen IX oxidase I pro- Tein sequence from tobacco has sequence identities of 71.2% to the homologous protein from Arabidopsis (Ward and Volrath, 1996), 28.1% to Bacillus HemY (Hansson and Hedderstedt, 1992), 24.6% to the protein from the mouse (Dailey et al., Arch. Biochem Biophys. 5 324 (1995), 379-384) or 19.3% of the protein from yeast (Camadro, J.-M. & Labbe, P., J. Biol. Chem. 271 (1996), 9120-9128) ,
  • protoporphyrinogen IX oxidase I cDNA sequence was used in pBluescript KS for the transformation of XL-Red E. coli cells (stratogenes). Different strategies have been used for mutagenesis:
  • the transformed cells were washed away from the agar 5 and either then immediately subjected to a plasmid preparation or incubated for another 5 hours in liquid LB at 37 ° C. before the plasmid -DNA was extracted from the bacterial cell ⁇ .
  • the transformed E. coli XL-Red cells were grown immediately in liquid LB medium and then plasmid DNA was isolated using the midi or maxi preparation method.
  • Competent HemG mutant cells were transformed with the pooled plasmid DNA and the bacteria were thrown on an LB plate with ampicillin (50 ⁇ g / ml) for the control and, alternatively, on LB plates with ampicillin and 100 ⁇ M acif (without adding hemin ) plated out.
  • 0 plasmid DNA was isolated from the bacterial colonies, which grew in the presence of Acifluorfen within 72 h of incubation at 37 ° C., and the plasmids were again transformed into hemG cells. After this retransformation, about 20% of the bacterial clones were found to be resistant to protoporphyriogen IX oxidase inhibitors with a peroxidizing effect.
  • the plasmid DNA was isolated again and the sequence of the protoporphyrinogen IX oxidase I cDNA determined. Approximately 250 colonies were isolated that can grow on LB + 100 ⁇ M acifluorfen. The protoporphyrinogen IX oxidase I cIM ⁇ from 70 clones. Sequence sequenced in the plasmids. Among these clones, 0 4 cDNA sequences were identified which have a point mutation in the coding region compared to the wild-type sequence, see Table 1.
  • Lines # 36 and # 38 both have a base difference in position 1222 from A to G. This changes a triplet in the cDNA sequence and the encoded amino acid at position 408 from ACA (Thr) to GCA (Ala).
  • Clone # 51 has a base exchange at position 1465 from T to C with the result that the amino acid Phe (TTT) is converted to Leu (CTT) at position 489.
  • Clone # 65 contained a base exchange from T to C at position 1565, this changes the amino acid Val (GTA) zi Ala (GCA) in the amino acid sequence at position 522.
  • the mutated cDNAs were isolated, inserted again in pBluescript and then used to transform the hemG E. coli mutant.
  • the growth of the hemG derivatives with expression of an mutated protoporphyrinogen IX oxidase I sequence was tested in medium with two concentrations of acifluorfen and without herbicide.
  • the hemG mutant which expresses the wild-type pro-tophyrinogen IX oxidase I gene from tobacco, served as a control.
  • the cell density of a 20 ml culture that was inoculated with 0.5 ml of an overnight culture was determined in each case after 24 h of incubation at 37 ° C. in LB medium.
  • Figure 1 shows the cell densities of the 4 different bacterial cultures (wild-type, clones # 38, # 51 and # 65) without and under herbicide action and confirms the synthesis of an acifluorfen-resistant, mutated enzyme in clones # 38, # 51 and # 65.
  • the mutated protoporphyrinogen IX oxidase I DNA sequences were cut out of the vector using the restriction enzymes Kpn I and Bam HI in the multiple cloning interface of the pBluescript vector and in the sense orientation in the binary Vector BinAr-TX (Höfgen and Willmitzer, Plant Science 66 (1990), 221-230), a pBIB derivative (Becker, Nucleic Acid Res. 18 (1990), 203), which was digested with the same restriction endonucleases, behind the Ca_MV-35S promoter ligated into it, see Figure 2.
  • any vector suitable for plant transformation can be used to produce a chimeric gene consisting of a fusion of the CaMV 35S promoter or another promoter which ensures transcription and translation in plant cells, and DNA sequences which encode for the mutant protoporphyrinogen IX oxidase I proteins.
  • the recombinant vectors pProtopor-phyrinogen IX oxidase I # 38, pProtoporphyrinogen IX oxidase I # 51 and pProtoporphyrinogen IX oxidase I # 65 were then transformed into Agrobacterium tumefaciens (strain GV2260) and used to transform Arabidopsis thaliana.
  • a 4 ml overnight culture was first inoculated with a colony of the agrobacterial culture which contains one of the plasmids, with which a 400 ml culture was then inoculated (in each case LB culture with 80 ⁇ g kanamycin / ml, 25 ⁇ g / ml rifampicin; Overnight incubation, 30 ° C, 220 rp).
  • the culture was centrifuged in the GSA rotor at 8,000 rpm for 20 min.
  • the bacterial pellet was taken up in infiltration medium (1/2 MS medium,
  • the suspension was placed in a plant box (Duchefa) and the Silwett was added.
  • the plant box was placed in a desiccator with 8-12 plants, a vacuum was applied three times for 5 minutes each, and each was ventilated suddenly after 5 minutes.
  • the plants were then placed in humidified soil in plant trays and grown under long-day conditions (22-24 ° C, at night 19 ° C / 65% relative humidity). The seeds were harvested after 6 weeks.
  • transgenic Arabidopsis thaliana plants can be generated by root transformation.
  • white root shoots were used after a maximum of 8 weeks of growth.
  • the plants from the sterile culture were extracted from the germination medium (1 MS medium, 1% sucrose, 100 mg / l inositol, 1.0 mg / 1 thiamine, 0.5 mg / 1 pyridoxine, 0.5 mg / 1 nicotinic acid, 5 g MES, pH 5.7, 0.8% agar) and the roots are separated from the rest of the plant.
  • Root pieces 0.5 cm long were transferred to 10-20 ml of liquid callus-inducing medium (see above without agar), mixed with 1 ml of an overnight agrobacterial culture (at 28 ° C., 200 rpm in LB) and then shaken for 2 minutes , The root explants were freed of excess medium on filter paper, then placed on the callus-inducing medium + agar.
  • the explants were shaken in liquid medium with betabactyl and on: shoot-inducing medium (with 5 mg / 1 2-isopentenyl-adenine phosphate and 0.15 mg / 1 indole-3-acetic acid, 50 mg / 1 kanamycin, 500 mg / 1 Betabactyl) designed. After about 5 weeks and changing the medium 1-2 times, small green shoots were transferred to the germinating medium (see above) and regenerated into whole plants.
  • shoot-inducing medium with 5 mg / 1 2-isopentenyl-adenine phosphate and 0.15 mg / 1 indole-3-acetic acid, 50 mg / 1 kanamycin, 500 mg / 1 Betabactyl
  • Transgenic plants were transformed as described in Example 2 and the regenerated shoots were grown on MS medium with 30O nM acifluorfen (+ 50 mg / ml kanamycin) in order to select lines tolerant of acifluorfen.
  • Tl seeds were sterilized in sterile culture on MS medium at 21 ° C. in the short day (8 hours light / 16 hours darkness) to 50 nm and 100 nm acifluorfen.
  • Some of the transformants showed normal growth in the presence of the inhibitor compared to wild-type control cultures, see Table 2.
  • the transformants with acifluorfen resistance showed neither a change in their phenotype in terms of their phenotype nor a change in growth rate in comparison with control plants on MS medium without acifluorfen.
  • FIG. 3 shows the Northern blot analysis of transgenic plants and the wild-type plant.
  • the transgenic RNA content in various transgenic Acifluorfen-resistant Arabidopsis lines was determined using a radio-labeled DNA probe for the tobacco protoporphyrinogen IX oxidase I cDNA.
  • Hybridization of the same Northern blot filter with the Arabidopsis cDNA for protoporphyrinogen IX oxidase I resulted total RNA in all of the transgenic lines and the control plant in. 45 of an RNA band.
  • the intensity for the endogenous protoporphyrin - gene IX oxidase I RNA was the same or weaker in the transgenic lines compared to the control.
  • transgenic Arabidopsis lines which have the gene # 51, which codes for an Acif luorf en-resistant protoporphyrinogen IX oxidase I, were subjected to Northern blot analysis with the Arabidopsis probe for protoporphyrinogen IX oxidase II cDNA subjected.
  • Wild-type and transgenic lines contain comparatively similar amounts of protoporphyrinogen IX oxidase II RNA, see Figure 4.
  • Figure 4 shows protoporphyrinogen IX oxidase II RNA contents in Tl lines of the Arabidopsis protoporphyrinogen IX oxidase I mutant # 51 and the control.
  • FIG. 5 shows a Western blot analysis in various transgenic, aciforfuide-resistant Arabidopsis lines, in which the mutated tobacco protoporphyrinogen IX oxidase I gene # 51 is expressed and the wild type plant and its protoporphyrinogen oxidase I- Salary .
  • the tobacco cDNA sequence of the protoporphyrinogen IX oxidase I mutants # 38, # 51 and # 65 was amplified in a PCR using a sense primer 5 'GACCCATGGTTGCCAAAGATTACAGTTC and an antisense primer 5' GACGGATCCTCATTTGTATGCATACCGAGAC (conditions: 1 min 94 ° C, conditions: 1 min 94 ° C) 2 min 60 ° C, 3 min 72 ° C for 25 cycles).
  • a gene sequence which codes for the putative processed protein was amplified (from position 53 with a valine).
  • the DNA fragment was cut with Nco I / BamH I and inserted into the expression vector pQE 60 (Quiagen), which was cut with the same restriction enzymes. The insertion was made in the reader men starting with the initiation codon contained in the Nco I recognition sequence. SG 13009 served as E. coli expressionss.
  • the recombinant protein was produced after isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside induction (IPTG, ImM final concentration) during the exponential growth of the bacteria at 37 ° C. for a period of 4 hours.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside induction
  • the enzyme assay was carried out according to Smith and Griffiths (1993), Methods in Plant Biochemistry, eds. Dey, PM and Harborne, JB (Academic Press, London), 299-344. Aliquots of the bacterial extracts were in the assay buffer (50 mM Tris / HCl, pH 7.5; ImM EDTA; 5 MM DTT; 0.03% Tween 80) after cell disruption by ultrasound for 5 and 10 min at 30 ° C with 2 ⁇ M protoporphyrinogen incubated in the dark.
  • the protoporphyrin IX formed was measured fluorometrically at ⁇ 405 nm ex and ⁇ 632 nm em on the LS 50B fluorescence spectrophotometer (Perkin-Elmer). The auto-oxidation of the protoporphyrinogen was determined by incubating the substrate with heat-denatured protein extract. The acifluorfen effects on wild-type and mutant protein were determined under the same assay conditions.
  • protoporphyrinogen IX oxidase I As an alternative to a modified, herbicide-tolerant protoporphyrinogen IX oxidase I sequence, it was shown that an overproduction of the unchanged protoporphyrinogen IX oxidase I in a plant already leads to an increased tolerance to herbicides.
  • the Arabidopsis protoporphyrinogen IX oxidase I was constitutively overexpressed in tobacco and the plants obtained were tested for increased tolerance to acifluorfen. Photodynami - see no damage in these plants.
  • protoporphyrinogen IX oxidase I enzyme activity was significantly increased compared to wild-type plants.
  • Wild-type and transgenic tobacco plants were grown in growth chambers at intervals of 12 h light and 12 h dark (100 ⁇ mol photons m -2 s _1 ) at 25 S C. Leaves were harvested from 4-6 week old plants and stored at -80 S C in liquid nitrogen. All experiments were done performed with primary transformants, individual primary transformants were obtained by vegetative propagation.
  • the plasmid was transformed into agrobacteria (strain GV 2260) and with them in turn transformed tobacco (leaf disk transformation; Horsch et al., Science 228 (1985), 1229-1231).
  • the presence of the transgenes was determined by Southern blot (as described in Sambrook et al., 1989) and PCR.
  • protoporphyrin IX To detect the steady-state levels of protoporphyrin IX in transgenic and wild-type plants under the action of acifluorfen, 100 mg of leaf material in 1 ml of methanol / acetone / 0.1 N NaOH (9: 10: 1 v / v) were worked up and the homogenate for 10 min Centrifuged at 10,000g. Protoporphyrinogen IX was oxidized by adding 25 ⁇ l IM acetic acid and 25 ⁇ l 2-butane peroxide per 1 ml sample zi ⁇ protoporphyrin IX.
  • Porphyrins were separated at a flow rate of 1 ml / min by HPLC (RP 18 column, Novapak C18, 4 ⁇ m particle size, 4.6 ⁇ 250 mm; Waters Chromatography, Millipore Corp.). Porphyrins were eluted by a linear gradient from solvent B (90% methanol, 0. IM ammonium acetate, pH 5.2) to solvent A (10% methanol, 0. IM ammonium acetate, pH 5.2). The eluate was detected by a fluorescence detector at ⁇ ex 405nm and ⁇ em 625nm. Protoporphyrin IX was identified and quantified using standards (Kruse et al., EMBO J. 14 (1995), 3712-3720).
  • Leaf disks detected as an indicator of the amount of protoporphyrinogen IX oxidase present (Lee et al., Plant Physiologe 102 (1993), 881-889).
  • Four tobacco leaf disks with a diameter of 9 mm were isolated from leaves 5 and 6 (counted from the shoot tip of the plant) of 4-week-old wild type and protoporphyrinogen IX oxidase I overexpressing plants and either at 25 a C in the dark for 20 h (A ) or for 20 h in the dark and 6 h in light (B, C) in 5 ml 1% sucrose and ImM 2- (N-morpholino-) -ethanesulfonic acid (pH 6.5) with different concentrations of acifluorfen, see Figure 6 Porphyrins were extracted and their levels measured as described.
  • FIG. 6 shows the amounts of protoporphyrin IX in herbicide-treated wild type and protoporphyrinogen IX oxidase I overexpressing plants (A, B).
  • Figure C shows the effect of the accumulating porphyrins on the cell membranes. The peroxidative degradation of porphyrins in the cytoplasm affects the integrity of membranes. The extent of the ion emission is used to quantify the phytotoxicity of a herbicide.
  • the control plants show an at least three times higher protoporphyrin IX content than transgenic plants at each acifluorfen concentration.
  • the membrane permeability (C) did not change significantly due to the addition of herbicides in transgenic plants, whereas wild-type plants showed a strong increase in leakage current from a herbicide concentration of 1 ⁇ M.
  • a 5-week-old transgenic plant with protoporphyrinogen IX oxidase I overproduction (line S7) and a wild-type plant were completely sprayed with 20 ml of a 10 ⁇ M acifluorfen solution. Porphyrin levels in both plants were determined 18 h, 3, 5 and 7 days after treatment. On the first day of measurement, the protoporphyrin levels in the transgenic plant were 20-40% lower than in the wild type plant. Protoporphyrin IX levels decreased continuously from day 1 to 7 after treatment in both plants.
  • Figure 7 shows the transgenic plant on the left and the wild type plant on the right 3 days after spraying with acifluorfen solution. The selected transgenic plant showed no necrosis after treatment, while the wild-type plant had strong leaf necrosis.
  • the seeds are then germinated on soil and seeds are obtained from the resulting plants (M (0) generation). These seeds are either grown on sterile nutrient medium (MS medium) containing lOOnM Acifluorfen or germinated again in soil. Seedlings are selected from the sterile culture after 10 days and show growth in the presence of the herbicide.
  • MS medium sterile nutrient medium
  • SEQ ID No. 7 shows the DNA sequence of the Acifluorfen-resistant Arabidopsis thaliana mutant Aci8. At position 1360, the mutant shows an A to G exchange with the wild-type plant. This results in a methionine to valine exchange at amino acid 458 at the amino acid level, see SEQ-ID No. 8th .
  • Plant material e.g. leaves, 100 mg
  • Plant material is ground in 1 ml of methanol / acetone / 0.1 N NaOH (9: 10: 1 v / v) and the homogenate is centrifuged at 10,000 g for 10 min to remove cell fragments and proteins.
  • Protoporphyrinogen IX is oxidized to protoporphyrin IX by the addition of 25 ⁇ l I M acetic acid and 25 ⁇ l 2-butanone peroxide per ml of purified homogenate.
  • Porphyrins are separated by HPLC in a RP-18 column (Novapak C18, 4 ⁇ m pore size, 4.6X250 mm; Waters Chromatography, Millipore Corp.) at a flow rate of 1 ml / min. Porphyrins are eluted in a linear gradient from solvent B (90% methanol, 0.1 M ammonium acetate, pH 5.2) to solvent A (10% methanol, 0.1 M ammonium acetate pH, 5.2).
  • the column eluate is measured by a fluorescence detector (Model 474, Waters) with an extinction of 405nm and an emission of 625nm.
  • Protoporphyrin IX is identified and quantified by porphyrin standards as described (Kruse et al., 1995, EMBO J. 14: 3712-3720).

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft DNA-Sequenzen codierend für ein Polypeptid, das gegen peroxidierende Hemmstoffe der Protoporphrinogen-IX-Oxidase resistent ist.

Description

Erzeugung von gegen peroxidierende Hemmstoffe der Protoporphyrinogen-IX-Oxidase resistenten Pflanzen
Beschreibung
Die Erfindung betrifft DNA-Sequenzen SEQ-ID No. 1, SEQ-ID No . 3, SEQ-ID No . 5 oder SEQ-ID No. 7 enthaltend die Kodierregion einer¬ pflanzlichen Protoporphyrinogen-IX-Oxidase. Ferner betrifft die Erfindung DNA-Sequenzen, die mit der DNA-Sequenz SEQ-ID No. 1, SEQ-ID No. 3, SEQ-ID No . 5 oder SEQ-ID No . 7 oder Teilen davon oder Derivaten, die durch Insertion, Deletion oder Substitution von diesen Sequenzen abgeleitet sind, hybridisiert und für ein Protein kodiert, das die biologische Aktivität einer gegen pero — xidierende Hemmstoffe der Protoporphyrinogen-IX-Oxidase resistenten Protoporphyrinogen-IX-Oxidase besitzt. Des weiteren betriff t die Erfindung ein Protein mit Protoporphyrinogen-IX-Oxidase-Akt± - vität mit der Aminosäuresequenz SEQ-ID No . 2, SEQ-ID No. 4, SEQ-ID No . 6 oder SEQ-ID No . 8. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung einer DNA-Sequenz SEQ-ID No. 1, SEQ-ID No . 3, SEQ-ID No. 5 oder SEQ-ID No . 7 zur Einführung in pflanzliche Zellen, wobei diese Sequenz mit Steuerelementen, die die Transkription uncl Translation in den Zellen gewährleisten, verknüpft ist und die Expression einer translatierbaren mRNA, kodierend für die Syn- these einer pflanzlichen Protoporphyrinogen-IX-Oxidase, die resi- stent ist gegen peroxidierende Hemmstoffe der Protoporphyrinogen- IX-Oxidase, bewirkt. Die Erfindung umfaßt auch gegen peroxidierende Hemmstoffe der Protoporphyrinogen-IX-Oxidase resistente Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, daß in der Pflanze eine DNA-Se- quenz SEQ-ID No . 1, SEQ-ID No. 3, SEQ-ID No . 5 oder SEQ-ID No . V exprimiert wird. Andererseits umfaßt die Erfindung auch die Verwendung der DNA-Sequenz Accession No. D 83139 aus Arabidopsis thaliana, deren Überexpression in Pflanzen ebenfalls die Resistenz dieser Pflanzen gegen peroxidierende Hemmstoffe der Protoporphyrinogen-IX-Oxidase bewirkt.
In allen Organismen ist der Stoff echselweg vom 5-Aminolävulinat zu Tetrapyrrolen verbreitet. Pflanzen weisen die größte Vielfalt an Tetrapyrrolendprodukten aus . Sie enthalten nicht nur wie Tiere, Hefen und Mikroorganismen Protohäm, das als Cofaktor in den vielfältigsten Reaktionswegen für Atmung, Entgiftung, und in Schutzsystemen etc. fungiert, sondern synthetisieren auch Chlorophyll, um die absorbierte Lichtenergie in chemisch-verwertbare Energie umzuwandeln. In Pflanzen wird 5-Aminolävulinat in drei nacheinander folgenden Schritten aus Glutamat erzeugt, während Tiere und Hefen, Succinyl-CoA und Glycin unter Abspaltung eine Carboxylgruppe mittels der ALA-Synthase kondensieren. Ein weite — rer Unterschied zwischen Tier und Pflanze ist der Ort des Tetra— pyrrolstof fwechsels . In den tierischen Eukaryonten beginnt der Syntheseweg in den Mitochondrien mit der ALA-Synthase , die nachfolgenden Enzyme sind im Zytoplasma lokalisiert. Ab Coproporphy— rinogen Oxidase liegen die letzten Enzyme wieder in den Mitochondrien vor. In Pflanzen ist der gesamte Stoffwechselweg zum Chlorophyll und Häm im Chloroplasten lokalisiert. Die beiden letzten Enzymschritte der Hämsynthese sind auch in den pflanzlichen Mitochondrien nachgewiesen worden. Das bedeutet, daß für die Proto- porphyrinogen-IX-Oxidase und die Ferrochelatase eine Isoform sowohl in den Plastiden als auch in den Mitochondrien vorliegt.
Die Protoporphyrinogen-IX-Oxidase ist ein Flavin-haltiges Enzym und katalysiert die 6-Elektronen-Oxidation des Protoporphyrinogen IX. In den Plastiden ist das Enzym in den Thylakoidmembranen und. zu einem großen Anteil in der Hüllmembran (25% der Gesamtaktivität) lokalisiert (Matringe et al . , J. Biol . Che . , 267(1992), 4646-4651) . In den Mitochondrien scheint die Protoporphyrinogen-IX- Oxidase analog zum tierischen Enzym an der Außenseite der inneren Membran gebunden zu sein (Ferreira et al . , J. Biol. Chem.
263(1988) , 3835-3839) . Protoporphyrinogen IX-oxidierende Enzymal — tivitäten mit Resistenzen gegen die typischen Herbizide der Protoporphyrinogen-IX-Oxidase sind auch in der Plasmamembran von Wurzel und etioliertem Gewebe, in Mikrosomen, im Endoplasmatischen Reti — kulum und in löslichen Extrakten von Tabakzellkulturen nachgewiesen worden (Jacobs et al . , Plant Physiol 97(1991), 197-203; Lee et al., Plant Physiol. 102(1993), 881-889; Retzlaff and Böger , Pest. Biochem. Physiol. 54(1996), 105-114; Yamamoto et al., Pest . Biochem. Physiol. 50(1994) , 72-82) . Es muß aber angemerkt werden, daß diese zusätzlichen Aktivitäten von vermutlich wenig charakterisierten, unspezif ischen Peroxidasen stammen. Auf reinigungen der Protoporphyrinogen-IX-Oxidase waren wegen ihrer geringen Löslichke±t in wäßrigen Phasen und dem schnellen Verlust der Enzymaktivität erfolglos, bis kürzlich von einer Aufreinigung aus Spinat berich— tet wurde (Che et al . , Plant Physiol., 114(1997), Poster 741).
Mit der Erkenntnis, daß das Enzym der Angriffspunkt der Diphenyl — Äther-Herbizide ist, den einzigen kommerziell verwerteten Inhibitoren in der Chlorophyllbiosynthese mit photodynamischer Wirkung , steigerte sich das Interesse an biochemischer und molekularbiolo — gischer Charakterisierung des Enzyms immens. Die Wirkung der Protoporphyrinogen-IX-Oxidase Hemmstoffe blieb lange unverstanden. Nach Herbizideinsatz reicherte sich überraschend das Katalyseprodukt Protoporphyrin IX an. Es wird angenommen, daß zunächst das akkumulierende Protoporphyrinogen IX aus den Plastiden aktiv transfe — riert wird oder herausdiffundiert und sich dann in den Membranen anderer Kompartimente anreichert (Lehnen et al . , Pestic. Biochem . Physiol. 37 ( 1990 ), 329-248 ) . Das photoreaktive Protoporphy- rin(ogen) IX erzeugt bei weiterer Oxidierung reaktive Substanzen, die in dieser Umgebung nur unzureichend detoxif iziert werden können und photodynamische Schädigungen verursachen. cDNA-Klone für pflanzliche Protoporphyrinogen-IX-Oxidase wurden durch funktionelle Komplementierung der Protoporphyrin IX-akkumulierenden E. coli hemG Mutante erhalten ( WO 95/34659; Narita et al . , Gene 182(1996) , 169-175; Lermontova et al., Proc . Natl . Acad. Sei. USA. 94(1997) , 8895-8900) . Die kodierten Peptide zeigen signifikante Ähnlichkeit zum HemY, einem Protein aus Bacillus, dem erstmalig Protoporphyrinogen-IX-Oxidase Aktivität zugeordnet werden konnte (Hansson and Hederstedt, J. Bacteriol. 174(1992), 8081-8093) . Um Nutzpflanzen tolerant gegenüber Herbiziden zu machen, werden in diese Nutzpflanzen veränderte Protoporphyrinogen-IX-Oxidase Nuklein — säuresequenzen gebracht, deren Proteinprodukte toleranter gegen in der Landwirtschaft eingesetzte Herbizide sind. Damit besitzen diese Nutzpflanzen bei Kontakt mit einem Herbizid weiterhin funktionsfähiges Protoporphyrinogen-IX-Oxidase Protein.
Beispiele für gegen Hemmstoffe der Protoporphyrinogen-IX-Oxidase resistente Pflanzen sind in WO 95/34659, WO 97/32011,
WO 98/29554, WO 98/33927, WO 99/13087, US 5,767,373 beschrieben.
Aufgabe der Erfindung war die Isolierung weiterer gegen peroxidierende Hemmstoffe resistenzvermittelnder Protoporphyrinogen- IX— Oxidase Gene aus Pflanzen zur Herstellung von Pflanzen, die tolerant gegenüber Inhibitoren der Protoporphyrinogen-IX-Oxidase sind.
Die Aufgabe wurde gelöst durch Isolierung einer cDNA aus Tabak, die für die plastidäre Protoporphyrinogen-IX-Oxidase kodiert und anschließender Selektion von mutierten Protoporphyrinogen-IX-Oxidase I Genen, die für eine Hemmstof f-resistente Protoporphyrinogen-IX- Oxidase kodieren, siehe Beispiel 1. Vier Resistenz gegen Hemmstoffe deir Protoporphyrinogen-IX-Oxidase erzeugende Mutationen im Protoporphyrino — gen-IX-Oxidase I Gen wurden charakterisiert (Klon #36, #38, #51 und #65 ) und die Sequenz der resistenten Form der Protoporphyrinogen-IX-Oxidase ermittelt, siehe Beispiel 2 und 3 sowie Sequenzprotokolle SEQ-ID No . lr No . 2 , No . 3 , No . 4 , No . 5 und No . 6.
Die Aufgabe wurde auch gelöst durch Isolierung einer cDNA aus
Arabidopsis, die für die plastidäre Protoporphyrinogen-IX-Oxidase kodiert und anschließender Selektion eines mutierten Protoporphy — rinogen-IX-Oxidase I Genes, das für eine Hemmstof f-resistente Protoporphyrinogen-IX-Oxidase kodiert, siehe Beispiel 6. Eine Resistenz gegen Hemmstoffe der Protoporphyrinogen-IX-Oxidase erzeugende Mutation im Protoporphyrinogen-IX-Oxidase I Gen aus Arabidopsis thaliana wurde charakterisiert (Klon AC±8) und die Sequenz der resistenten Form der Protoporphyrinogen-IX-Oxidase ermittelt, siehe Beispiel 6 sowie Sequenzprotokoll SEQ-ID No. 7 und No . 8.
Gegenstand der Erfindung sind auch Expressionskassetten, deren Sequenz für eine gegen peroxidierende Hemmstoffe der Protoporphy— rinogen-IX-Oxidase resistente Form der Protoporphyrinogen-IX-Oxidase aus Tabak oder deren funktionelles Äquivalent kodiert. Die Nukleinsäuresequenz kann dabei z.B. eine DNA- oder eine cDNA-Se- quenz sein.
Die erfindungsgemäßen Expressionskassetten beinhalten außerdem regulative Nukleinsäuresequenzen, welche die Expression der kodierenden Sequenz in der Wirtszelle steuern. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt eine erfindungsgemäße Expressionskassette stromaufwärts, d.h. am 5 ' -Ende der kodierenden Sequenz, einen Promotor und stromabwärts, d.h. am 3 '-Ende, ein Polyadeny- lierungssignal und gegebenenfalls weitere regulatorische Elemente, welche mit der dazwischenliegenden Gensequenz für die erfindungsgemäße resistente Form der Protoporphyrinogen-IX-Oxidase operativ verknüpft sind. Unter einer operativen Verknüpfung ver- steht man die sequenzielle Anordnung von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und ggf. weiterer regulativer Elemente derart, daß jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann.
Die Herstellung einer erfindungsgemäßen Expressionskassette erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einer geeigneten für die erfindungsgemäße resistente Form der Protoporphyrinogen-IX-Oxidase kodierende DNA Sequenz und einem Polyadenylie- rungssignal nach gängigen Rekombinations- und Klonierungstechni- ken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T.J. Silhavy, M.L. Ber an und L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F.M. et al . , Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987) beschrieben sind.
Gegenstand der Erfindung sind auch funktioneil äquivalente DNA- Sequenzen, die für ein gegen peroxidierende Hemmstoffe der Protoporphyrinogen-IX-Oxidase resistenzvermittelndes-Gen kodieren und die bezogen auf die Gesamtlänge der DNA-Sequenz eine Sequenzhomologie mit der DNA-Sequenz SEQ-ID NO . 1, SEQ-ID No . 3 , SEQ-ID NO . 5 oder SEQ-ID No . 7 von 40 bis 100 % aufweisen.
Bevorzugter Gegenstand der Erfindung sind funktioneil äquivalente DNA- Sequenzen, die für ein gegen peroxidierende Hemmstoffe der Protoporphyrinogen-IX-Oxidase resistenzvermittelndes Gen kodieren und die bezogen auf die Gesamtlänge der DNA-Sequenz eine Sequenz — homologie mit der DNA-Sequenz SEQ-ID NO . 1 , SEQ-ID No . 3, SEQ-ID No . 5 oder SEQ-ID No . 7 von 60 bis 100 % aufweisen .
Besonders bevorzugter Gegenstand der Erfindung sind funktionell äquivalente DNA-Sequenzen, die für ein gegen peroxidierende Hemmstoffe der Protoporphyrinogen-IX-Oxidase resistenzvermittelndes Gen kodieren und die bezogen auf die Gesamtlänge der DNA-Sequenz eine Sequenzhomologie mit der DNA-Sequenz SEQ-ID NO . 1, SEQ-ID No . 3 , SEQ-ID NO . 5 oder SEQ-ID No . 7 von 80 bis 100 % aufweisen. .
Funktionell äquivalente Sequenzen, die für ein gegen peroxidie- rende Hemmstoffe der Protoporphyrinogen-IX-Oxidase resistenzver— ittelndes Gen kodieren, sind erfindungsgemäß solche Sequenzen, welche trotz abweichender Nukleotidsequenz noch die gewünschten Funktionen besitzen. Funktionelle Äquivalente umfassen somit natürlich vorkommende Varianten der hierin beschriebenen Sequenzen sowie künstliche, z . B . durch chemische Synthese erhaltene, an den Kodon-Gebrauch einer Pflanze angepaßte , künstliche Nukleotid-Se — quenzen.
Unter einem funktioneilen Äquivalent versteht man insbesondere auch natürliche oder künstliche Mutationen einer ursprünglich isolierten für ein gegen peroxidierende Hemmstoffe der Protopor phyrinogen-IX-Oxidase resistenzvermittelndes Gen der DNA-Sequenz SEQ-ID No . 1 , SEQ-ID No . 3 , SEQ-ID No . 5 oder SEQ-ID No. 7 , wei che weiterhin die gewünschte Funktion zeigt . Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen, Vertauschungen oder In— sertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste . Somit werden beispielsweise auch solche Nukleotidsequenzen durch die vorliegende Erfindung mit umfaßt , welche man durch Modifikation dieser Nukleotidsequenz erhält . Ziel einer solchen Modifikation kann z . B . die weitere Eingrenzung der darin enthaltenen kodierenden Seque z oder z . B . auch die Einfügung weiterer Restriktionsenzym-Schnitt - stellen sein .
Funktionelle Äquivalente sind auch solche Varianten, deren Funk- tion, verglichen mit dem Ausgangsgen bzw. Genfragment, abgeschwächt oder verstärkt ist . Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Protein aus Tabak bzw. Arabidopsis thaliana gekennzeichnet durch die Aminosäuresequenz SEQ-ID NO . 2 , SEQ-ID No . 4 , SEQ-ID NO . 6 oder SEQ-ID No . 8 bzw. Derivate oder Teile dieses Proteins mit gegen peroxidierende Hemmstof fe der Protoporphyrinogen-IX-Oxidase resistenzvermitteln— der Protoporphyrinogen-IX-Oxidase Aktivität .
Gegenstand der Erfindung sind auch pflanzliche Proteine mit gegen peroxidierende Hemmstoffe der Protoporphyrinogen-IX-Oxidase resi— stenzvermittelnder Protoporphyrinogen-IX-Oxidase Aktivität mit einer Aminosäuresequenzhomologie zu der Tabak bzw. Arabidopsis thaliana Protoporphyrinogen-IX-Oxidase der Sequenzen SEQ-ID NO . 2 , SEQ-ID No . 4 , SEQ-ID NO . 6 oder SEQ-ID No . 8 von 20 - 100 % Identität .
Bevorzugt sind pflanzliche Proteine mit gegen peroxidierende Hemmstoffe der Protoporphyrinogen-IX-Oxidase resistenzvermitteln— der Protoporphyrinogen-IX-Oxidase Aktivität mit einer Aminosäuresequenzhomologie zu der Tabak Protoporphyrinogen-IX-Oxidase der Sequenzen SEQ-ID NO . 2 , SEQ-ID No . 4 oder SEQ-ID NO . 6 von 50 - 100 % Identität .
Besonders bevorzugt sind pflanzliche Proteine mit gegen peroxidierende Hemmstoffe der Protoporphyrinogen-IX-Oxidase resistenz- vermittelnder Protoporphyrinogen-IX-Oxidase Aktivität mit einer Aminosäuresequenzhomologie zu der Tabak Protoporphyrinogen-IX- Oxidase der Sequenzen SEQ-ID NO . 2 , SEQ-ID No . 4 oder SEQ-ID NO. 6 von 80 - 100 % Identität .
Bevorzugt sind pflanzliche Proteine mit gegen peroxidierende
Hemmstoffe der Protoporphyrinogen-IX-Oxidase resistenzvermitteln— der Protoporphyrinogen-IX-Oxidase Aktivität mit einer Aminosäuresequenzhomologie zu der Arabidopsis thaliana Protoporphyrinogen- IX-Oxidase der Sequenz SEQ-ID NO . 8 von 50 - 100 % Identität .
Besonders bevorzugt sind pflanzliche Proteine mit gegen peroxidierende Hemmstoffe der Protoporphyrinogen-IX-Oxidase resistenzvermittelnder Protoporphyrinogen-IX-Oxidase Aktivität mit einer Aminosäuresequenzhomologie zu der Arabidopsis thaliana Protopor- phyrinogen-IX-Oxidase der Sequenz SEQ-ID NO . 8 von 80 - 100 % Identität .
Durch Überexpression der für eine resistenzvermittelnde Protoporphyrinogen-IX-Oxidase kodierenden Gensequenz SEQ-ID NO . 1, SEQ-ID No . 3 , SEQ-ID NO . 5 oder SEQ-ID No . 7 in einer Pflanze wird eine erhöhte Resistenz gegenüber Inhibitoren der Protoporphyrinogen- IX-Oxidase erreicht. Die derart hergestellten transgenen Pflanzen sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
Die Wirksamkeit der Expression des transgen exprimierten resi- stenzvermittelnden Protoporphyrinogen-IX-Oxidase Gens kann beispielsweise in vitro durch Sproßmeristemvermehrung oder durch einen Keimungstest ermittelt werden. Zudem kann eine in Art und Höhe veränderte Expression des resistenzvermittelnden Protoporphyrinogen-IX-Oxidase Gens und deren Auswirkung auf die Resistenz gegenüber Hemmstoffen der Protoporphyrinogen-IX-OxicLase an Testpflanzen in Gewächshausversuchen getestet werden.
Gegenstand der Erfindung sind auch transgene Pflanzen, transformiert mit einer Expressionskassette, enthaltend die DNA-Sequenz SEQ-ID No. 1, SEQ-ID No. 3, SEQ-ID NO. 5 oder SEQ-ID No. 7, die durch zusätzliche Expression der DNA-Sequenz SEQ-ID No. 1, SEQ-ID No. 3, SEQ-ID NO. 5 oder SEQ-ID No . 7 tolerant gegenüber peroxi- dierend wirkenden Inhibitoren der Protoporphyrinogen-IX-Oxidase geworden sind, sowie transgene Zellen, Gewebe, Teile und Vermeh- rungsgut solcher Pflanzen. Besonders bevorzugt sind dabei transgene Kulturpflanzen enthaltend eine DNA-Sequenz SEQ— ID No. 1, SEQ-ID No. 3, SEQ-ID No. 5 oder SEQ-ID No . 7, wie z.B. Gerste, Weizen, Roggen, Mais, Soja, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Canola, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Kartoffel, Tabak, Tomate, Raps, Al- falfa, Salat und die verschiedenen Baum-, Nuß- und Weinspezies, sowie Leguminosen.
Gegenstand der Erfindung sind ferner Samen der zuvor beschriebenen Pflanzen sowie fortpflanzungsfähiges Material von transfor- mierten Organismen der vorher beschriebenen Art.
Erhöhung der Resistenz bedeutet beispielsweise im Ra.hmen der vor — liegenden Erfindung die künstlich erworbene Fähigkeit einer erhöhten Verträglichkeit gegen peroxidierende Hemmsto fe der Proto — porphyrinogen- IX-Oxidase durch funktioneile Überexpression des resistenzvermittelnden Protoporphyrinogen- IX-Oxidas -Gens der DNA-Sequenz SEQ-ID No . 1, SEQ-ID No . 3, SEQ-ID No . 5 oder SEQ-ID No . 7 in der Pflanze gegenüber der nicht gentechnisch modifizierten Pflanze für die Dauer mindestens einer Pf lanzenceneration.
Insbesondere bevorzugt sind Sequenzen, die ein Tarcjeting in den Apoplasten, in Plastiden, die Vakuole, das Mitochondrium, das En — doplasmatische Retikulum (ER) oder durch ein Fehlen entsprechender operativer Sequenzen einen Verbleib im Kompartiment des Ent- Stehens, dem Zytosol, gewährleisten (Kermode, Crit . Rev. Plant Sei. 15, 4 (1996) , 285-423) . Beispielhaf t kann die pflanzliche Expressionskasset in den binären Vektor BinAR-TX eingebaut werden, siehe Beispi el 2 und Abbildung 2 .
5 Als Promotor der er findungs gemäßen Expressionskasset te ist grundsätzlich j eder Promotor geeignet , der die Expression von Fremdge nen in Pf lanzen steuern kann . Vorzugsweise verwendet man insbesondere einen pflanzlichen Promotor oder einen Promo tor , der einem Pflanzenvirus entstammt . Insbesondere bevorzugt ist der CaMV
10 35S-Promotor aus dem Blumenkohl-Mosaik-Virus ( Franck et al . , Cel l 21 ( 1980 ) , 285-294 ) . Dieser Promotor enthält unterschiedliche Erkennungssequenzen für transkriptionale Ef fektoren , die in ihrer Gesamtheit zu einer permanenten und konstitutiven Expression des eingeführten Gens führen ( Benfey et al . , EMBO J . 8 ( 1989 ) ,
15 2195-2202 ) .
Die erfindungsgemäße Expressionskassette kann auch einen chemisch), induzierbaren Promotor enthalten, durch den die Expression des exogenen resistenzvermittelnden Protoporphyrinogen-IX-Oxidase-
20 Gens in der Pflanze zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert werden kann. Derartige Promotoren wie z.B. der PRPl-Promotor (Ward et al., Plant.Mol. Biol. (1993) 22, 361-366), ein durch Salizylsäure induzierbarer Promotor (WO 95/19443), ein durch Benzenesu- fonamid-induzierbarer (EP 388186) , ein durch Tetrazyklin-indu-
25 zierbarer (Gatz et al . , Plant J. (1992) 2, 397-404), ein durch Abscisinsäure-induzierbarer (EP0335528) bzw. ein durch Ethanol- oder Cyclohexanon-induzierbarer (WO 93/21334) Promotor sind in der Literatur beschrieben und können u.a. verwendet werden.
30 Weiterhin sind insbesonders solche Promotoren bevorzugt, die die Expression in speziellen Geweben oder Pflanzenteilen sicherstellen, in denen die Biosynthese des Chlorophylls und des Harns stattfindet. Insbesondere zu nennen sind Promotoren, die eine blattspezifische Expression gewährleisten. Zu nennen sind der
35 Promotor der cytosolischen FBPase aus Kartoffel oder der ST-LSI Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al . , EMBO J. , (1989) 8, 2445-245) .
Mit Hilfe eines samenspezifischen Promotors kann ein Fremdprotein 40 stabil bis zu einem Anteil von 0,67% des gesamten löslichen Samenproteins in den Samen transgener Tabakpflanzen exprimiert werden (Fiedler und Conrad, Bio/Technology (1995) 10, 1090-1094). Die erfindungsgemäße Expressionskassette kann daher beispielsweise einen samenspezifischen Promotor (bevorzugt den Phaseolin- 45 Promotor, den USP- oder LEB4-Promotor) , das LEB4-Signalpeptid, das zu exprimierende Gen und ein ER-Retentionssigna.1 enthalten. Die inserierte Nukleotid-Sequenz kodierend für eine gegen peroxidierende Hemmstof fe der Protoporphyrinogen-IX-Oxidas e resistenzvermittelnde Protoporphyrinogen-IX-Oxidase kann synthetisch hergestellt oder natürlich gewonnen sein oder eine Mischung aus syn— thetischen und natürlichen DNA-Bestandteilen enthalten . Im allgemeinen werden synthetische Nukleotid-Sequenzen mit Kodons erzeugt , die von Pflanzen bevorzugt werden . Diese von Pflanzen bevorzugten Kodons können aus Kodons mit der höchsten Proteinhäufigkeit bestimmt werden, die in den meisten interessanten Pflan- zenspezies exprimiert werden . Bei der Präparation einer Expressionskassette können verschiedene DNA-Fragmente manipuliert werden, um eine Nukleotid-Sequenz zu erhalten, die zweckmäßigerweise in der korrekten Richtung liest und die mit einem korrekten Lese — raster ausgestattet ist . Für die Verbindung der DNA— Fragmente miteinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden .
Außerdem sind artifizielle DNA-Sequenzen geeignet , solange sie , wie oben beispielsweise beschrieben , die gewünschte Eigenschaft der Erhöhung der Resistenz gegen peroxidierende Hemmstoffe der
Protoporphyrinogen-IX-Oxidase in der Pflanze durch Überexpression, eines reistenzvermittelnden Protoporphyrinogen- IX-Oxidase-Gens ix Kulturpflanzen vermitteln . Solche artif iziellen DNA— Sequenzen können beispielsweise durch Rückübersetzung mittels Molecular Mo — delling konstruierter Proteine , die Protoporphyrinogen- IX-Oxi- dase-Aktivität aufweisen oder durch in vitro-Selektion ermittelt werden . Besonders geeignet sind kodierende DNA-Sequenzen, die durch Rückübersetzung einer Polypeptidsequenz gemäß der für die Wirtspflanze spezifischen Kodon-Nutzung erhalten wurden. Die spe — zifische Kodon-Nutzung kann ein mit pflanzengenetischen Methoden- vertrauter Fachmann durch Computerauswertungen anderer , bekannter Gene der zu transformierenden Pflanze leicht ermitteln .
Als weitere erfindungsgemäße geeignete äquivalente Nukleinsäure — Sequenzen sind zu nennen Sequenzen, welche für Fus ionsproteine kodieren , wobei Bestandteil des Fusionsproteins ein pflanzliches Protoporphyrinogen- IX-Oxidase-Polypeptid oder ein funktionell äquivalenter Teil davon ist . Der zweite Teil des Fusionsproteins kann z . B . ein weiteres Polypeptid mit enzymatischer Aktivität sein oder eine antigene Polypeptidsequenz mit deren Hilfe ein
Nachweis auf Protoporphyrinogen-IX-Oxidase-Express ion möglich is t ( z . B . myc-tag oder his-tag ) . Bevorzugt handelt es sich dabei j e — doch um eine regulative Proteinsequenz , wie z . B . ein Signal- oder Transitpeptid, das das Protoporphyrinogen- IX-Oxidase-Protein an den gewünschten Wirkort leitet . Zweckmäßigerweise sollten die erfindungsgemäßen Promotor- und die Terminator-Regionen in Transkriptionsrichtung mit einem Linker oder Polylinker, der eine oder mehrere Restriktionsstellen für die Insertion dieser Sequenz enthält, versehen werden. In der Re- gel hat der Linker 1 bis 10, meistens 1 bis 8, vorzugsweise 2 bis 6 Restriktionsstellen. Im allgemeinen hat der Linker innerhalb der regulatorischen Bereiche eine Größe von weniger als 100 bp, häufig weniger als 60 bp, mindestens jedoch 5 bp. Der erfindungs— gemäße Promotor kann sowohl nativ bzw. homolog als auch fremdar- tig bzw. heterolog zur Wirtspflanze sein. Die erfindungsgemäße Expressionskassette beinhaltet in der 5 ' -3 ' -Transkriptionsrichtung den erfindungsgemäßen Promotor, eine beliebige Sequenz und eine Region für die transkriptionale Termination. Verschiedene Terminationsbereiche sind gegeneinander beliebig austauschbar.
Ferner können Manipulationen, die passende Restriktionsschnittstellen bereitstellen oder die überflüssige DNA oder Restriktionsschnittstellen entfernen, eingesetzt werden. Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen wie z . B . Transitionen und Trans - Versionen in Frage kommen, können in vi ro-Mutagenese , "primerre - pair" , Restriktion oder Ligation verwendet werden . Bei geeigneten Manipulationen, wie z . B . Restriktion, "chewing-back" oder Auffül len von Überhängen für "bluntends" , können komplementäre Enden der Fragmente für die Ligation zur Verfügung gestellt werden .
Bevorzugte Polyadenylierungssignale sind pflanzliche Polyadeny- lierungssignale, vorzugsweise solche, die im wesentlichen T-DN — Polyadenylierungssignale aus Agrobacterium tυmefaciens, insbesondere des Gens 3 der T-DNA (Octopin Synthase) des Ti-Plasmids pTiACH5 entsprechen (Gielen et al . , EMBO J. 3 (1984) 835 ff) oder funktioneile Äquivalente.
Zur Transformation einer Wirtspflanze mit einer für eine gegen peroxidierende Hemmstoffe resistenzvermittelnde Protoporphyrino — gen-IX-Oxidase kodierenden DNA wird eine erfindungsgemäße Expressionskassette als Insertion in einen rekombinanten Vektor eingebaut, dessen Vektor-DNA zusätzliche funktionelle Regulationssi— gnale, beispielsweise Sequenzen für Replikation oder Integration enthält. Geeignete Vektoren sind unter anderem in "Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology" (CRC Press), Kap. 6/7, S.71-119 beschrieben.
Die Übertragung von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird als Transformation bezeichnet. Es werden dabei die beschriebenen Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus
Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stab len Transformation genutzt. Geeignete Methoden sind die Protoplast en- transformation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnahme, der biolistische Ansatz mit der Genkanone, die Elektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung, die Mikroinjektion und der durch Agrobacterium vermittelte Gentrans- fer. Die genannten Verfahren sind beispielsweise in B. Jenes et al . , Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S.D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 sowie in Potrykus Annu. Re . Plant Physiol. Plant Molec.Biol. 42 (1991) 205-225) beschrieben. Vorzugsweise wird das zu exprimierende Konstrukt in einen Vektor kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium tumefaci ens zu transformieren, beispielsweise pBinl9 (Bevan et al . , Nucl . Acids Res. 12 (1984) 8711) .
Mit einer erfindungsgemäßen Expressionskassette transformierte
Agrobakterien können ebenfalls in bekannter Weise zur Transforma— tion von Pflanzen, insbesondere von Kulturpflanzen, wie Getreide, Mais, Soja, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Canola, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Kartoffel, Tabak, Tomate, Raps, Alfalfa, Salat und den verschiedenen Baum-, Nuß- und Weinspezies sowie Leguminosen verwendet werden, z.B. indem verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschließend in geeigne— ten Medien kultiviert werden.
Der Biosytheseort von Chlorophyllen und Häm ist im allgemeinen das Blattgewebe, so daß eine blattspezifische Expression des resistenzvermittelnden Protoporphyrinogen-IX-Oxidase—Gens sinnvoll ist. Es ist jedoch naheliegend, daß die Chlorophyll— und Häm- Biosynthese nicht auf das Blattgewebe beschränkt sein muß, son- dern auch in allen übrigen Teilen der Pflanze beispielsweise in fetthaltigen Samen - gewebespezifisch erfolgen kann.
Darüberhinaus ist eine konstitutive Expression des exogenen resi— stenzver ittelnden Protoporphyrinogen-IX-Oxidase-Gens von Vor- teil. Andererseits kann aber auch eine induzierbare Expression wünschenswert erscheinen.
Unter Verwendung der oben zitierten Rekombinations— und Klonie- rungstechniken können die erfindungsgemäßen Expressionskassetten in geeignete Vektoren kloniert werden, die ihre Vermehrung, beispielsweise in E. coli, ermöglichen. Geeignete Klonierungsvekto- ren sind u.a. pBR332, pUC-Serien, Ml3mp-Serien und pACYC184. Besonders geeignet sind binäre Vektoren, die sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien replizieren können. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung einer erfindungsgemäßen Expressionskassette zur Transformation von Pflanzen, Pflanzenzellen, -geweben oder Pflanzenteilen. Vorzugsweise ist Ziel der Verwendung die Erhöhung der Resistenz durch Expression einer resistenzvermittelnden Protoporphyrinogen-IX- Oxidase mit der DNA-Sequenz SEQ-ID No . 1, SEQ-ID No . 3, SEQ-ID No. 5 oder SEQ-ID No . 7 in der Pflanze.
Alternativ zu einer veränderten, herbizidtoleranten Protoporphy- rinogen-IX-Oxidase I Sequenz wurde gezeigt, daß eine Überproduktion der unveränderten Protoporphyrinogen-IX-Oxidase I aus Arabidopsis thaliana in einer Pflanze ebenfalls zu einer erhöhten Toleranz gegenüber Herbiziden führt, siehe Beispiel 5. Dazu wurde die Arabidopsis Protoporphyrinogen-IX-Oxidase I in Tabak konsti- tutiv überexprimiert und die erhaltenen Pflanzen auf erhöhte Toleranz gegenüber Acifluorfen getestet. Photodynamische Schäden blieben in diesen Pflanzen aus. In in-vitro Assays wurde eine gegenüber Wildtyp-Pflanzen deutlich erhöhte Protoporphyrinogen-IX- Oxidase I Enzymaktivität gemessen.
Dabei kann je nach Wahl des Promotors die Expression spezifisch in den Blättern, in den Samen oder anderen Teilen der Pflanze erfolgen. Solche transgenen Pflanzen, deren Vermehrungsgut sowie deren Pflanzenzellen, -gewebe oder -teile sind ein weiterer Ge- genstand der vorliegenden Erfindung.
Die Expression der DNA-Sequenz SEQ-ID No. 1, SEQ-ID No. 3, SEQ-ID No. 5 oder SEQ-ID No . 7 bzw. der DNA-Sequenz mit der Accession No . D 83139 in Pflanzen vermittelt Resistenz gegen peroxidierende Hemmstoffe der Protoporphyrinogen-IX-Oxidase. Peroxidierend wirkende Hemmstoffe der Protoporphyrinogen-IX-Oxidase sind beispielsweise die folgenden Verbindungen:
Diphenylether, wie Acifluorfen, Acifluorfen-sodium, Acloni- fen, Bifenox, Chlornitrofen (CNP) , Ethoxyfen, Fluorodifen,
Fluoroglycofen-ethyl, Fomesafen, Furyloxyfen, Lactofen, Nitrofen, Nitrofluorfen oder Oxyfluorfen;
Oxadiazole, wie Oxadiargyl oder Oxadiazon; cyclische Imide, wie Azafenidin, Butafenacil, Carfentrazone- ethyl, Cinidon-ethyl, Flumiclorac-pentyl, Flumioxazin, Flumi— propyn, Flupropacil, Fluthiacet-methyl, Sulfentrazone oder
Thidiazimin; oder
Pyrazole, wie ET-751, JV 485 oder Nipyraclofen; Die herbizid wirksamen Verbindungen sind z.B. in "Herbizide", Hock, Fedtke, Schmidt, 1. Auflage, Thieme 1995 ( s. "Ethoxyfen" S. 30, "Flumiclorac-pentyl" , S. 35)
bzw. in "Agricultural Chemicals", Book II Herbicides, 1993 Revision, Thomson Publications ISBN-No. 0-913702-40-4, ( s . "Fomesafen" S. 248, "Flumioxazin" S. 43, "Flumipropyn" S. 267, "Sulfentra- zone" S. 261)
bzw. in "Agricultural Chemicals", Book II Herbicides, 13th Edition, 1997, Thomson Publications, ISBN-No. 0-913702-40-4, ("ET-751" S. 278, "Carfentrazone-ethyl" S. 267," Fluthiacet-me- thyl" S. 277) bzw. in "Short Review of Herbicides & PGRs 1991, Hodogaya Chemicals ( siehe "Furyloxyfen" S. 142, "Acifluorfen-so- dium" S. 142, "Aclonifen" S. 146, "Bifenox" S. 140, "Chlornitrofen" S. 138, "Fluorodifen" S. 138, "Fluoroglycofen"-ethyl" S. 146, "Lactofen" S. 144, "Nitrofen" S. 136, "Nitrofluorfen" S. 140, "Oxyfluorfen" S. 140, "Oxadiazon" S. 162 bzw. in "Global Herbicide Directory" First Edition, 1994 ( "Oxadiargyl" S. 96) bzw. "Cinidon-ethyl" in DE-A 36 03 789 beschrieben.
Inhibitoren der Protoporphyrinogen-IX-Oxidase können in trans- genen Kulturen, die eine DNA-Sequenz SEQ-ID No. 1, SEQ-ID No . 3, SEQ-ID No . 5 oder SEQ-ID No . 7 kodierend für eine gegen Hemm- Stoffe der Protoporphyrinogen-IX-Oxidase resistente Protoporphyrinogen-IX-Oxidase enthalten, wie Mais, Getreide, Reis und Soja, Unkräuter und Schadgräser sehr gut bekämpfen, ohne die Kulturpflanze zu schädigen; ein Effekt, der vor allem auch bei niedrigen Aufwandmengen auftritt .
In Betracht kommen weiterhin auch folgende transgene Kulturpflanzen exprimierend eine DNA-Sequenz kodierend für eine gegen Hemmm— Stoffe der Protoporphyrinogen-IX-Oxidase resistente Protoporphyrinogen-IX-Oxidase :
Allium cepa, Ananas comosus, Arachis hypogaea, Asparagus offici- nalis, Beta vulgaris spp. altissima, Beta vulgaris spp. rapa, Brassica napus var . napus , Brassica napus var . napobrassica, Brassica rapa var. silvestris, Camellia sinensis, Carthamus tinc— torius, Carya illinoinensis , Citrus limon, Citrus sinensis, Cof- fea arabica (Coffea canephora, Coffea liberica) , Cucumis sativus, Cynodon dactylon, Daucus carota, Elaeis guineensis , Fragaria ve- sca, Glycine max, Gossypium hirsutum, (Gossypium arboreum, Gossy— pium herbaceum, Gossypium vitifolium) , Helianthus annuus, Hevea brasiliensis, Hordeum vulgäre, Humulus lupulus, Ipomoea batatas, Juglans regia, Lens culinaris, Linum usitatissimum, Lycopersicon lycopersicum, Malus spp., Manihot esculenta, Medicago sativa, Musa spp., Nicotiana tabacum (N.rustica), Olea europaea, Oryza sativa, Phaseolus lunatus, Phaseolus vulgaris, Picea abies, Pinus spp., Pisum sativum, Prunus avium, Prunus persica, Pyrus commu- nis, Ribes sylvestre, Ricinus communis, Saccharum officinarum, Seeale cereale, Solanum tuberosum, Sorghum bicolor (s. vulgäre), Theobroma cacao, Trifolium pratense, Triticum aestivum, Triticum durum, Vicia faba, Vitis vinifera und Zea mays .
Darüber hinaus können die Hemmstoffe der Protoporphyrinogen-IX- Oxidase auch in transgenen Kulturen, die die DNA-Sequenz SEQ-ID No. 1, SEQ-ID No. 3, SEQ-ID No. 5 oder SEQ-ID No. 7 exprimieren eingesetzt werden, die zusätzlich durch Züchtung oder gentechnische Methoden gegen die Wirkung von anderen Herbiziden tolerant sind.
Des weiteren bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung des resistenzvermittelnden Protoporphyrinogen-IX-Oxidase Gens der SEQ-ID No . 1 , SEQ-ID No . 3 , SEQ-ID No . 5 oder SEQ-ID No . 7 zur Herstellung von gegen peroxidierende Hemmstof fe der Proto- porphyrinogen- IX-Oxidase toleranten Pflanzen, sowie die Verwendung der gegen peroxidierende Hemmstoffe der Protoporphyrinogen- IX-Oxidase resistenten Protoporphyrinogen-IX-Oxidase der Aminosäuresequenzen SEQ-ID No . 2 , SEQ-ID No . 4 , SEQ-ID No . 6 oder SEQ-ID No . 8 zum Aufbau eines enzymatischen Testsystems zur Iden— tifizierung neuartiger Hemmstoffe der Protoporphyrinogen-IX-Oxidase .
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung der DNA- Sequenz SEQ-ID No . 1 , SEQ-ID No . 3 , SEQ-ID No . 5 oder SEQ-ID No. 7 zur Herstellung eines Selektionssystems , dadurch gekenn∑ieich- net , daß die DNA-Sequenz in einen Trans formationsvektor eingebaut wird, mit diesem pflanzliche Zellen transformiert und anschließend die transformierten Pflanzenzellen bzw. Pflanzen auf peroxidierend wirkenden Hemmstoffen der Protoporphyrinogen-IX-Oxidase selektioniert werden .
Die Erfindung wird durch die nun folgenden Beispiele erläutert , ist aber nicht auf diese beschränkt :
Beispiele
Gentechnische Verfahren, die den Ausführungsbeispielen zugrunde liegen : Allgemeine Klonierungsverfahren
Klonierungsverfahren wie z.B. Restriktionsspaltungen, Agarose- Gelelektrophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nu— kleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylon Membranen, Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von Escherichia coli Zellen, Anzucht von Bakterien und Sequenzanalyse rekombinanter DNA wurden wie bei Sambrook et al . (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6) beschrieben durchgeführt.
Sequenzanalyse rekombinanter DNA
Die Sequenzierung rekombinanter DNA-Moleküle erfolgte mit einem Laserfluoreszenz-DNA-Sequenzierer der Firma ABI nach der Methode von Sanger (Sanger et al., Proc . Natl. Acad. Sei. USA 74(1977), 5463-5467) . Fragmente resultierend aus einer Polymerase Kettenreaktion wurden zur Vermeidung von Polymerasefehlern in zu expri- mierenden Konstrukten sequenziert und überprüft.
Analyse von Gesamt-RNA aus pflanzlichen Geweben
Die Extraktion der Gesamt-RNA erfolgte nach Chomczinsky, P. and Sacchi, N. (Anal. Biochem. 162(1987), 156-159). Für die Analyse wurden jeweils 20 μg RNA in einem Formaldehyd-haltigen l,5%igen Agarosegel aufgetrennt und auf Nylon Membranen (Hybond, Amersham) überführt . Der Nachweis spezifischer Transkripte wurde wie bei Amasino beschrieben durchgeführt ( Anal. Biochem. 152(1986), 304) . Die als Sonde eingesetzten DNA-Fragmente wurden mit einem Random Primed DNA Labeling Kit (Röche, Mannheim) radioaktiv mar- kiert und nach Standardmethoden hybridisiert (siehe Hybond-Benut— zerhinweise, Amersham) . Hyridisierungssignale wurden durch Auto- radiographie mithilfe von X-OMAT AR Filmen der Fa. Kodak sichtbare gemacht .
Die verwendeten Chemikalien wurden, sofern nicht anders erwähnt, in p.a. Qualität von den Firmen Fluka (Neu-Ulm) , Merck (Darmstadt) , Roth (Karlsruhe) , Serva (Heidelberg) sowie Sigma (Deisen— hofen) bezogen. Lösungen wurden mit aufbereitetem, pyrogenfreiem Wasser, im weiteren Text als H0 bezeichnet, aus einer Milli-Q Wa. - ter System Wasseraufbereitungsanlage (Millipore, Eschborn) angesetzt. Restriktionsendonucleasen, DNA-modifizierende Enzyme und molekularbiologische Kits wurden von den Firmen AGS (Heidelberg) , Amersham (Braunschweig), Biometra (Göttingen), Röche (Mannheim), Genomed (Bad Oeynnhausen) , New England Biolabs (Schwalbach/Tau- nus) , Novagen (Madison, Wisconsin, USA) , Perkin-Elmer (Weiterstadt) , Pharmacia (Freiburg) , Qiagen (Hilden) und Stratagene (Heidelberg) bezogen. Sie wurden, soweit nicht anders erwähnt, nach Herstellerangaben verwendet.
Die im folgenden verwendeten Bakterienstämme (E. coli, XL-1 Blue) wurden von Stratagene bezogen. E. coli AT 2465 wurde bei dem coli genetic stock centre (Yale University, New Haven) bezogen. Der zur Pflanzentransformation verwendete Agrobakterienstamm (Agrobacterium tumefaciens, C58C1 mit dem Plasmid pGV2260 oder pGV3850kan) wurde von Deblaere et al . beschrieben (Nucl. Acids Res. 13 (1985), 4777) . Alternativ können auch der Agrobakterienstamm LBA4404 (Clontech) oder andere geeignete Stämme eingesetzt werden. Zur Klonierung können die Vektoren pUC19 (Yanish-Perron, Gene 33(1985), 103-119), pBluescript SK- (Stratagene), pGEM-T (Promega) , pZerO ( Invitrogen) , pBinl9 (Bevan et al . , Nucl. Acids Res. 12(1984), 8711-8720) und pBinAR (Höfgen und Willmitzer, Plant Science 66 (1990), 221-230) benutzt werden.
Die Transformation von Agrobacterium tumefaciens wurde entsprechend der Methode von Höfgen und Willmitzer (Nucl. Acid Res. 16 (1988), 9877) ausgeführt. Die Anzucht der Agrobakterien erfolgte in YEB Medium (Vervliet et al . , J. Gen. Virol. 26 (1975), 33). Die Analyse von Proteinen in der SDS-Polyacrylamidgelelektropho- rese, deren Transfer und Detektion (Western Analyse) wurden wie bei Sa brook et al . (1989) beschrieben durchgeführt.
Beispiel 1
Selektion von mutierten Protoporphyrinogen-IX-Oxidase I Genen, die für eine Hemmstoff-resistente Protoporphyrinogen-IX-Oxidase kodieren.
Aus einer Lambda ZAP II Tabak (SRl)-cDNA Bibliothek (Stratagene) wurden rekombinante Phagemids (pBluescript) herausgeschnitten. Nach Transformation der E. coli hemG-Mutante (Stamm R751; Nishi- mura et al . , DNA Res. 2(1995), 1-8), die über keine Protoporphy- rinogen-IX-Oxidationsaktivität verfügt, mit diesen Plasmiden und Anzucht der hemG-Mutante auf LB-Agar ohne Heminzusatz, wurden Plasmide identifiziert, die die vollständigen cDNA-Sequenzen für die plastidäre (Protoporphyrinogen-IX-Oxidase I) (AcNo: Y13465) und die mitochondriale (Protoporphyrinogen-IX-Oxidase II) (AcNo: Y13466) (Lermontova et al . , PNAS, 1997) enthalten.
Die cDNA, die für die plastidäre Protoporphyrinogen-IX-Oxidase I kodiert, besteht aus 1644 Nukleotiden, einschließlich 29 bzw. 21S Basen des 5' und 3' nicht translatierten Bereichs. Das offene Le— seraster kodiert für 548 Aminosäuren, die ein Molekulargewicht von 59138 Da ergeben. Diese Protoporphyrinogen-IX-Oxidase I Pro- teinsequenz aus Tabak weist Sequenzidentitäten von 71.2% zum homologen Protein aus Arabidopsis (Ward and Volrath, 1996), 28.1% zum Bacillus HemY (Hansson and Hedderstedt, 1992), 24.6% zum Protein aus der Maus (Dailey et al., Arch. Biochem. Biophys. 5 324(1995) , 379-384) oder 19.3% zum Protein aus Hefe (Camadro, J.-M. & Labbe, P. , J. Biol. Chem. 271(1996), 9120-9128) auf.
Die Protoporphyrinogen-IX-Oxidase I cDNA-Sequenz wurde in pBluescript KS zur Transformation von XL-Red E. coli Zellen (Strata- 0 gene) eingesetzt. Verschiedene Strategien wurden zur Mutagenese verwendet :
1. Die transformierten Zellen wurden nach Anzucht auf LB-Agar- platten (mit Ampicillin lOOμg/ml Medium) vom Agar geschwemmt 5 und entweder anschließend umgehend einer Plasmidpräparation unterzogen oder für 5 weitere Stunden in flüssigem LB bei 37°C inkubiert, bevor die Plasmid-DNA aus den Bakterienzellerα extrahiert wurde .
0 2. Alternativ wurden die transformierten E. coli XL-Red Zellen umgehend in flüssigem LB-Medium gezüchtet und anschließend im Midi- oder Maxi-Präparationsverfahren Plasmid-DNA isoliert.
Mit der gepoolten Plasmid-DNA wurden kompetente HemG-Mutantenzel — 5 len transformiert und die Bakterien auf einer LB-Platte mit Ampicillin (50μg / ml) für die Kontrolle und, alternativ, auf LB- Platten mit Ampicillin und 100 μM Acifluorfen (ohne Häminzugabe) ausplattiert. Aus den Bakterienkolonien, die in Anwesenheit von Acifluorfen innerhalb von 72 h Inkubation bei 37°C wuchsen, wurde 0 Plasmid-DNA isoliert und die Plasmide erneut in hemG-Zellen transformiert. Nach dieser Retransf ormation erwiesen sich noch ca. 20% der Bakterienklone als resistent gegenüber peroxidierend wirkenden Hemmstoffe der Protoporphyriogen-IX-Oxidase . Falls die Transformation allen Nachkommen das Wachstum auf Acifluorfen er- 5 möglicht, wurde die Plasmid-DNA erneut isoliert und die Sequenz der Protoporphyrinogen-IX-Oxidase I cDNA bestimmt. Es wurden ca. 250 Kolonien isoliert, die auf LB+lOOμM Acifluorfen wachsen können. Von 70 Klonen wurde die Protoporphyrinogen-IX-Oxidase I cIMΑ. Sequenz in den Plasmiden sequenziert. Unter diesen Klonen wurden 0 4 cDNA Sequenzen identifiziert, die eine Punktmutation in dem ko — dierenden Bereich im Vergleich zu der Wildtyp-Sequenz aufweisen, siehe Tabelle 1.
5 18
Tabelle 1
Beschreibung der Punktmutationen der Protoporphyrinogen-IX-Oxidase I cDNA-Sequenzen
Figure imgf000019_0001
Die Linien #36 und #38 weisen beide einen Basenunterschied in derr Position 1222 von A nach G auf. Dadurch verändert sich ein Tri- plett in der cDNA-Sequenz und die kodierte Aminosäure an der Position 408 von ACA (Thr) nach GCA (Ala) . Klon #51 besitzt einen Basenaustausch an der Position 1465 von T nach C mit dem Resultat, daß die Aminosäure Phe (TTT) in Leu (CTT) an der Position 489 umgewandelt wird. Der Klon #65 enthielt einen Basenaustausch von T nach C an der Position 1565, dadurch ändert sich in der Aminosäuresequenz an der Position 522 die Aminosäure Val (GTA) zi Ala (GCA) .
Die mutierten cDNAs wurden isoliert, erneut in pBluescript inseriert und anschließend zur Transformation der hemG E.coli Mutante verwendet. Das Wachstum der hemG-Abkömmlinge mit Expression einear mutierten Protoporphyrinogen-IX-Oxidase I Sequenz wurde in Medium mit zwei Konzentrationen an Acifluorfen sowie ohne Herbizid gete — stet. Als Kontrolle diente die hemG Mutante, die das Wildtyp-Pro — toporphyrinogen-IX-Oxidase I Gen aus Tabak exprimiert. Die Zelldichte einer 20 ml Kultur, die mit 0,5 ml einer ÜberNacht-Kultur inokuliert wurde, wurde jeweils nach 24 h Inkubation bei 37°C in LB Medium bestimmt. Abbildung 1 zeigt die Zelldichten der 4 ver- schiedenen Bakterienkulturen ( Wildtyp, Klone #38, #51 und #65) ohne und unter Herbizideinwirkung und bestätigt in den Klonen #38, #51 und #65 die Synthese eines Acifluorfenresistenten, mutierten Enzyms.
Beispiel 2
Transformation von Arabidopsis thaliana und Regeneration intakte. _r Pflanzen
Für die Herstellung transgener Arabidopsis thaliana Pflanzen, di_ e die mutierten Protoporphyrinogen- IX-Oxidase I Sequenzen der Klone #38 , #51 und #65 überexpremieren und daher eine gegenüber nicht — transformierten Pflanzen erhöhte Resistenz gegen peroxidierend wirkenden Herbiziden aufweisen, wurden die mutierten Protoporphyrinogen-IX-Oxidase I DNA-Sequenzen mittels der Restriktionsenzyme Kpn I und Bam HI in der multiplen Klonierungsschnittstelle des pBluescript-Vektors aus dem Vektor herausgeschnitten und in Sense-Orientierung in den binären Vektor BinAr-TX (Höfgen und Willmitzer, Plant Science 66(1990), 221-230), einem pBIB Abkömmling (Becker, Nucleic Acid Res. 18(1990), 203), der mit denselben Re- striktionsendonukleasen verdaut wurde, hinter den Ca_MV-35S-Promo— tor hineinligiert , siehe Abbildung 2.
Anstelle des genannten binären Vektors kann jeder beliebige für die Pflanzentransformation geeignete Vektor für die Herstellung eines Chimären Gens, bestehend aus einer Fusion des CaMV 35S Pro— motors oder eines anderen Promotors, der die Transkription und Translation in Pflanzenzellen gewährleistet, und DNA—Sequenzen, die für die mutierten Protoporphyrinogen-IX-Oxidase I Proteine kodieren, verwendet werden. Die rekombinanten Vektoren pProtopor— phyrinogen-IX-Oxidase I#38, pProtoporphyrinogen-IX-Oxidase I#51 und pProtoporphyrinogen-IX-Oxidase I#65 wurden anschließend in Agrobakterium tumefaciens (Stamm GV2260) transformiert und zur Transformation von Arabidopsis thaliana eingesetzt.
Dazu wurde zunächst mit einer Kolonie der Agrobakterienkultur , die eines der Plasmide enthält, eine 4 ml ÜberNacht—Kultur inokuliert, mit der anschließend eine 400 ml Kultur angeimpft wurde (jeweils LB-Kultur mit 80 μg Kanamycin/ml, 25 μg/ml Rifampicin; ÜberNacht Inkubation, 30 °C , 220 rp ) . Die Kultur wurde im GSA- Rotor bei 8.000 rpm für 20 min abzentrifugiert . Das Bakterienpel — let wurde in Infiltrationsmedium aufgenommen (1/2 MS-Mediu ,
0,5g/l MES, pH 5,8, 50 g/1 Saccharose). Die Suspension wurde in eine Pflanzenbox (Duchefa) gegeben und das Silwett zugesetzt. Die Pflanzenbox wurde mit 8-12 Pflanzen in einen Exsikkator gestellt , dreimal für jeweils 5 Minuten ein Vakuum angelegt, und jeweils nach 5 Minuten schlagartig gelüftet . Die Pflanzen wurden anschließend in Pflanzenschalen in befeuchtete Erde gesetzt und unter Langtagbedingungen angezogen (22-24°C, nachts 19°C/ 65% relative Luftfeuchtigkeit) . Nach 6 Wochen wurde das Saatgut geerntet .
Alternativ können transgene Pflanzen von Arabidopsis thaliana mittels Wurzeltransformation erzeugt werden. Dazu -wurden weiße Wurzelsprosse nach maximal 8-wöchigem Wachstum verwendet. Die Pflanzen aus der Sterilkultur wurden aus dem Keimungsmedium (1 MS-Medium, 1 % Saccharose, 100mg/l Inositol, 1,0 mg/1 Thiamin, 0,5 mg/1 Pyridoxin, 0,5 mg/1 Nicotinsäure, 0,5 g MES, pH 5,7, 0, 8 % Agar) herausgezogen und die Wurzeln vom Rest der Pflanze getrennt. Die Wurzeln wurden dann auf einem Kallus-induzierenden Medium (Ix Gambourg's B5 Medium, 2% Glucose, 0,5 g/1 MES, 0,8% Agar, 0,5 mg/1 2,4-D, 0,05 mg/1 Kinetin) für 3 Tage inkubiert. 0,5 cm lange Wurzelstücke wurden in 10-20 ml flüssigem Kallus-in— duzierendem Medium (s.o. ohne Agar) überführt, mit 1 ml einer ÜberNacht-Agrobakterienkultur (bei 28°C, 200rpm in LB) versetzt und dann für 2 Minuten geschüttelt. Die Wurzelexplantate wurden auf Filterpapier von überschüssigem Medium befreit, dann auf das Kallus-induzierende Medium+Agar gelegt. Abschließend wurden die Explantate in flüssigem Medium mit Betabactyl geschüttelt und auf: sproßinduzierendem Medium (mit 5 mg/1 2-Isopentenyl—Adenine Phosphat und 0,15 mg/1 Indol-3-Essigsäure, 50 mg/1 Kanamycin, 500 mg/1 Betabactyl) ausgelegt. Nach ca. 5 Wochen und 1-2-maligem Austausch des Mediums, wurden kleine grüne Sprosse auf das Keimungsmedium übergesetzt (s.o.) und zu ganzen Pflanzen regene- riert.
Beispiel 3
Analyse und Selektion transgener Arabidopsis thaliana Pflanzen mit Resistenz gegen Hemmstoffe der Protoporphyrinogen-IX-Oxidase
Transgene Pflanzen wurden - wie in Beispiel 2 beschrieben - transformiert und die regenerierten Sprosse auf MS—Medium mit 30O nM Acifluorfen (+ 50 mg/ml Kanamycin) angezogen, um Acifluorfen- tolerante Linien zu selektieren. Alternativ wurden Tl-Samen in Sterilkultur auf MS-Medium bei 21°C im Kurztag (8 Std. Licht/16 Std. Dunkelheit) auf 50nM und lOOnM Acifluorfen ausgekeimt. Einige der Transformanden zeigten gegenüber Kontrollanzuchten des Wildtyps ein normales Wachstum in Anwesenheit des Hemmstoffs, siehe Tabelle 2. Die Transformanden mit Acifluorfen-Resistenz zeigten weder hinsichtlich ihres Phänotyps ein verändertes Aussehen noch eine im Vergleich zu Kontrollpflanzen auf MS Medium oh e Acifluorfen veränderte Wachstumsrate .
Tabelle 2
Keimungsverhalten von Samen von Acifluorfen-toleranten Arabidopsis Pflanzen (transformiert mit mutierten Protoporphyrinogen-IX- Oxidase I Sequenzen) auf Acifluorfen
Legende :
++++ normales Wachstum
++— leicht reduziertes Wachstum,
+ reduziertes Wachstum - kein Wachstum 10
15
Figure imgf000022_0001
2^ Es erfolgten verschiedene biochemische und molekularbiologische Analysen der transgenen Pflanzen mit der neuerworbenen Eigenschaft. Die transgenen Pflanzen wurden unabhängig von ihrer Eigenschaft auf Kanamycin-haltigern und Acifluorfen-haltigem Medium zu wachsen im Southern-Blot-Verfahren analysiert. Hierbei ergaben sich nach Hybridisierung mit einem markierten cDNA Fragment für die Protoporphyrinogen-IX-Oxidase I aus Tabak zusätzliche radioaktiv-markierte Banden der mit Restriktionsenzymen verdauten genomischen DNA der Transformanden im Vergleich zu den Kontrollpflanzen. Eine Northern-Blot-Analyse ergab im Vergleich zu den
30 Wildtyppflanzen eine sichtbar markierte Bande innerhalb der elek— trophoretisch aufgetrennten Gesamt-RNA der Transformanden nach Hybridisierung mit der Tabak-cDNA Sonde. Dies ist auch ein Beweis dafür, daß unter den gewählten Hybridisierungs- und Waschbedingungen keine Kreuzhybridisierung mit der Arabidopsis-eigenen Pro —
■" toporphyrinogen-IX-Oxidase I RNA erfolgt.
Abbildung 3 zeigt die Northern-Blot Analyse transgener Pflanzen und der Wildtyp-Pflanze. Mit einer radioaktiv-markierten DNA Sonde für die Tabak Protoporphyrinogen-IX-Oxidase I cDNA wurde ^ der transgene RNA-Gehalt in verschiedenen transgenen Acifluorfen — resistenten Arabidopsis-Linien bestimmt.
Eine Hybridisierung desselben Northern-Blot-Filters mit der Arabidopsis cDNA für Protoporphyrinogen-IX-Oxidase I resultierte in. 45 einer RNA-Bande der Gesamt-RNA in allen transgenen Linien und der Kontrollpflanze. Die Intensität für die endogene Protoporphyrin - gen-IX-Oxidase I RNA war in den transgenen Linien gegenüber der Kontrolle gleich oder schwächer .
Eine repräsentative Anzahl von transgenen Arabidopsis -Linien, die mit dem Gen #51 , das für eine Acif luorf en-resistente Protoporphyrinogen-IX-Oxidase I kodiert , wurde einer Northern-Blot-Analyse mit der Arabidopsis-Sonde für Protoporphyrinogen-IX-Oxidase II-cDNA unterzogen . Wildtyp-und transgene Linien enthalten vergleichsweise ähnliche Mengen an Protoporphyrinogen-IX-Oxidase II— RNA, siehe Abbildung 4 . Abbildung 4 zeigt Protoporphyrinogen-IX- Oxidase II RNA Gehalte in Tl-Linien der Arabidopsis Protoporphyrinogen-IX-Oxidase I Mutante # 51 und der Kontrolle . Nach Extraktion von Proteinen aus Blättern gleichaltriger transgener Pflanzen und Kontrollpflanzen und einer Western-Blot-Ana- lyse mit einem Antiserum gegen Protoporphyrinogen-IX-Oxidase I konnte nachgewiesen werden , daß Trans formanden ähnliche Mengen an Protoporphyrinogen-IX-Oxidase I enthielten wie die Kontrollpf lan — zen, siehe Abbildung 5 . Dies zeigt , daß die Resistenz gegenüber Acifluorfen nicht auf einer Überproduktion des mutierten Proteins zurückzuführen ist , sondern auf die Punktmutation des Proteins . Für die Gelelektrophorese wurden 100 mg Blattmaterial in flüssigem Stickstoff gemörsert und in 1 ml Probenpuffer ( 56 mM Na2C03 , 56 mM DTT , 2%SDS , 12% Saccharose , 2mM EDTA) aufgenommen. Nach 15 inütiger Denaturierung bei 70°C wurde kurz zentrif giert und Al d.- quots ( j eweils 10 μg Protein) des Überstandes für die Protein-Po - lyacrylamidgelelektrophorese und anschließender Western-Blot-Ana - lyse verwendet . Abbildung 5 zeigt eine Western-Blot Analyse in verschiedenen transgenen, Acif luorf en-resistenten Arabidopsis-Li nien, in denen das mutierte Tabak-Protoporphyrinogen-IX-Oxidase I-Gen #51 exprimiert wird und der Wildtyppflanze und deren Proto porphyrinogen Oxidase I-Gehalt .
Beispiel 4
Überexpression mutierter Tabak-Protoporphyrinogen- IX-Oxidase I ±n E. coli und Nachweis der Herbizidresistenz .
Mittels eines Sense Primers 5 ' GACCCATGGTTGCCAAAGATTACAGTTC und eines Antisense-Primers 5 ' GACGGATCCTCATTTGTATGCATACCGAGAC wurde die Tabak cDNA-Sequenz der Protoporphyrinogen-IX-Oxidase I Mutanten #38 , #51 und #65 in einer PCR amplifiziert (Bedingungen : 1 Min 94°C , 2 Min 60°C , 3 Min 72°C für 25 Zyklen) . Es wurde j eweil s eine Gensequenz amplifiziert , die für das putative prozessierte Protein kodiert (ab Position 53 mit einem Valin) . Das DNA-Frag — ment wurde mit Nco I/BamH I geschnitten und in de Expressions — vektor pQE 60 (Quiagen) , der mit denselben Restriktionsenzymen geschnitten wurde , eingesetzt . Die Insertion erf olgte im Leser a.h- men beginnend mit dem Initiationscodon, das in der Nco I Erkennungssequenz enthalten ist. Als E. coli Expressionss a m diente SG 13009. Das rekombinante Protein wurde nach Isopropyl-ß-D-Thio— galactopyranosid-Induktion (IPTG, ImM Endkonzentration) während des exponentiellen Wachstums der Bakterien bei 37°C für einen Zeitraum von 4 Stunden erzeugt. Der bakterielle Gesarntextrakt oder die pelletierbaren Proteine nach Zellaufschluß wurden für den Nachweis der Enzymaktivität und der Herbizidresistenz verwendet.
Der Enzy assay wurde gemäß Smith und Griffiths (1993 ) , Methods in Plant Biochemistry, eds . Dey, PM und Harborne, JB (Academic Press, London), 299-344 durchgeführt. Aliquots der Bakterienextrakte wurden im Assay-Puffer (50 mM Tris/HCl, pH 7, 5; ImM EDTA; 5 MM DTT; 0,03% Tween 80) nach Zellzertrümmerung durch Ultraschall für 5 und 10 Min. bei 30°C mit 2 μM Protoporphyrinogen im Dunkeln inkubiert. Das gebildete Protoporphyrin IX wurde fluori- metrisch bei λ 405 nmex und λ 632 nmem am LS 50B Fluoreszenzspektralphotometer (Perkin-Elmer) gemessen. Die Autooxidation des Protoporphyrinogens wurde durch die Inkubation des Substrats mit hitzedenaturiertem Proteinextrakt bestimmt. Die Acifluorfen-Wir- kungen auf Wildtyp- und Mutantenprotein wurden unter den selben Assay-Bedingungen bestimmt.
Beispiel 5
Erzeugung herbizidresistenter Tabakpflanzen durch Überproduktion der plastidären Protoporphyrinogen-IX-Oxidase I aus Arabidopsis
Alternativ zu einer veränderten, herbizidtoleranten Protoporphyrinogen-IX-Oxidase I Sequenz wurde gezeigt, daß eine Überproduktion der unveränderten Protoporphyrinogen-IX-Oxidase I in einer Pflanze bereits zu einer erhöhten Toleranz gegenüber Herbiziden führt. Dazu wurde die Arabidopsis Protoporphyrinogen-IX-Oxidase I in Tabak konstitutiv überexprimiert und die erhaltenen Pflanzen auf erhöhte Toleranz gegenüber Acifluorfen getestet. Photodynami — sehe Schäden blieben in diesen Pflanzen aus. In in—vitro Assays wurde eine gegenüber Wildtyp-Pflanzen deutlich erhöhte Protoporphyrinogen-IX-Oxidase I Enzymaktivität gemessen.
Wildtyp und transgene Tabakpflanzen (Nicotiana tabacum var. Sam- sun NN) wurden in Wachstumskammern bei Intervallen von 12h Licht und 12h Dunkelheit (lOOμmol Photonen m-2 s_1) bei 25 SC angezogen. Blätter wurden von 4-6 Wochen alten Pflanzen geerntet und bei -80SC in flüssigem Stickstoff gelagert. Alle Experimente wurden mit Primärtransformanden durchgeführt, individuelle Pri ärtrans- formanden wurden durch vegetative Vermehrung erhalten.
Ein etwa 1600 Bp langes Fragment der Arabidopsis Protoporphyrino— gen-IX-Oxidase I (D83139; Narita et al . , Gene 182(1996), 169-175) wurde via PCR mit folgenden Primern amplifiziert: 5 AAGGATCCATG— GAGTTATCTCTTCTCC 3 x und 5 l AAGTCGACTTACTTGTAAGCGTACCG 3 * . Das Produkt wurde über Ba HI und Sal I in den Vektor pBIN AR (Höfgen und Willmitzer, 1992) eingefügt, in dem es unter der Kontrolle des CaMV35S Promoters exprimiert wird, siehe Abbildung 2.
Das Plasmid wurde in Agrobakterien (Stamm GV 2260) transformiert und mit diesen wiederum Tabak transformiert (Blattscheibentrans- formation; Horsch et al . , Science 228(1985), 1229-1231). Die An- Wesenheit der Transgene wurde per Southern Blot (wie bei Sambrook et al., 1989 beschrieben) und PCR festgestellt.
Zum Nachweis der steady-state Gehalte an Protoporphyrin IX in transgenen und Wildtyp-Pflanzen unter Acifluorfeneinwirkung wurde jeweils 100 mg Blattmaterial in 1 ml Methanol/Aceton/0.1 N NaOH (9:10:1 v/v) aufgearbeitet und das Homogenat für 10 min bei 10.000g zentrifugiert . Protoporphyrinogen IX wurde durch Zugabe von 25μl IM Essigsäure und 25μl 2-Butan-Peroxid pro 1 ml Probe ziα Protoporphyrin IX oxidiert . Porphyrine wurden mit einer Flußrate von lml/min per HPLC getrennt (RP 18 Säule, Novapak C18, 4μm Par— tikelgröße, 4.6X250 mm; Waters Chromatography, Millipore Corp.). Porphyrine wurden eluiert durch einen linearen Gradienten von Solvent B (90% Methanol, 0. IM Ammoniumacetat , pH 5.2 ) zu Solvent A (10% Methanol, 0. IM Ammoniumacetat, pH 5.2) . Das Eluat wurde durch einen Fluoreszenzdetektor bei λex405nm und λem625nm detek- tiert . Protoporphyrin IX wurde mit Standards identifiziert und quantifiziert (Kruse et al . , EMBO J. 14(1995), 3712-3720).
Eine erhöhte Toleranz der transgenen Tabakpflanzen gegenüber Aci— fluorfen wurde mittels Anreicherung von Protoporphyrin IX in
Blattscheiben als Indikator für die vorhandene Menge an Protopor— phyrinogen-IX-Oxidase nachgewiesen ( Lee et al . , Plant Physiologe 102(1993), 881-889). Vier Tabakblattscheiben mit 9 mm Durchmesser wurden aus Blätter 5 und 6 (von der Sproßspitze der Pflanze ge- zählt) von 4 Wochen alten Wildtyp und Protoporphyrinogen-IX-Oxidase I überexprimierenden Pflanzen isoliert und bei 25 aC entwederr bei Dunkelheit für 20 h (A) oder für 20 h in Dunkelheit und 6 h in Licht (B, C) in 5ml 1% Sucrose und ImM 2-(N-Morpho- lino-) -Ethansulfonsäure (pH 6.5) mit verschiedenen Konzentrationen an Acifluorfen inkubiert, siehe Abbildung 6. Porphyrine wurden extrahiert und ihre Gehalte wie beschrieben gemessen. Als Indika— tor für die Schädigung der Zellen wurde der Gehalt an Elektroly- ten infolge der Zellzerstörung mit einem Leitfähigkeitsmessgerät nach Orr und Hess , Pestic. Biochem. Physiol. 16(1981), 171-178 bestimmt. Abbildung 6 zeigt die Protoporphyrin IX Mengen in her- bizid-behandelten Wildtyp- und Protoporphyrinogen-IX-Oxidase I überexpri ierenden Pflanzen (A, B) . In Abbildung C dargestellt ist der Effekt der akkumulierenden Porphyrine auf die Zellmembranen. Der peroxidative Abbau von Porphyrinen im Cytoplasma beein- flusst die Integrität von Membranen. Das Ausmaß des Ionenaus- stroms wird zur Quantifizierung der Phytotoxizität eines Herbi- zids benutzt. Die Kontrollpflanzen zeigen bei jeder Acifluorfen- Konzentration einen mindestens dreimal höheren Protoporphyrin IX- Gehalt als transgene Pflanzen. Die Membranpermeabilität (C) änderte sich durch Herbizidbeigabe in transgenen Pflanzen nicht wesentlich, wohingegen Wildtyp-Pflanzen bereits ab einer Herbizid- konzentration von 1 μM einen starken Anstieg des Leckstroms zeigten.
Eine 5-Wochen alte transgene Pflanze mit Protoporphyrinogen-IX- Oxidase I Überproduktion (Linie S7) und eine Wildtyp-Pflanze wur- den mit 20 ml einer 10 μM Acifluorfenlösung vollständig besprüht. Die Porphyringehalte in beiden Pflanzen wurden 18 h, 3, 5 und 7 Tage nach der Behandlung bestimmt. Am ersten Meßtag waren die Protoporphyringehalte in der transgenen Pflanze um 20-40% niedriger als in der Wildtyppflanze. Die Mengen an Protoporphyrin IX nahmen von Tag 1 bis 7 nach der Behandlung kontinuierlich in beiden Pflanzen ab. Die Abbildung 7 zeigt links die transgene Pflanze und rechts die Wildtyppflanze 3 Tage nach der Besprühung mit Acifluorfenlösung. Die ausgewählte transgene Pflanze zeigte keine Nekrosen nach der Behandlung, während die Wildtyp-Pflanze starke Blattnekrosen aufwies.
Beispiel 6
Selektion von Acifluorfen-resistenten Arabidopsis-Pflanzen
Auf Platten mit Standardmedien (MS-Medium; Duschefa; NL) ausgelegte Arabidopsissamen werden mit einer 3%igen EMS-Lösung (Ethyl- methansulfonat; Sigma) für 16 Stunden inkubiert.
Anschließend werden die Samen auf Erde ausgekeimt und aus den resultierenden Pflanzen (M( 0 ) -Generation) werden Samen erhalten. Diese Samen werden entweder auf lOOnM Acifluorfen haltigem sterilem Nährmedium (MS-Medium) angezogen oder erneut in Erde ausgekeimt. Aus der Sterilkultur werden Keimlinge nach 10 Tagen selek- tiert, die in Anwesenheit des Herbizids Wachstum zeigen. Die
Keimlinge in Erdkultur werden 4 Wochen nach Auskeimung einmal mit einer 10μM Acifluorfen-Lösung besprüht. Herbizid-resistente Pflanzen werden anschließend auf Sequenzveränderungen im PPXI Gen über eine Sequenzierung analysiert . SEQ-ID No . 7 zeigt die DNA- Sequenz der Acifluorfen-resistenten Arabidopsis thaliana Mutante Aci8 . Die Mutante zeigt bei Position 1360 gegenüber der Wildtyp- Pflanze einen A zu G Austausch. Dies ergibt auf Aminosäureebene einen Methionin zu Valin Austausch bei Aminosäure 458 , siehe SEQ-ID No . 8 .
Beispiel 7
Porphyrin-Analytik
Pflanzenmaterial (z.B. Blätter, 100 mg) wird in 1 ml Methanol/ Aceton/0.1 N NaOH (9:10:1 v/v) gemörsert und das Homogenat bei 10,000g für 10 min zentrifugiert um Zellbruchteile und Proteine zu entfernen.
Protoporphyrinogen IX wird zu Protoporphyrin IX oxidiert durch die Zugabe von 25 μl I M Essigsäure und 25 μl 2-Butanon Peroxid pro ml gereinigtes Homogenat. Porphyrine werden über HPLC in einer RP-18 Säule (Novapak C18, 4 μm Porengröße, 4.6X250 mm; Waters Chromatography, Millipore Corp.) bei einer Flussrate von 1 ml/min getrennt. Porphyrine werden in einem linearen Gradienten von Lösungsmittel B (90 % Methanol, 0.1 M Ammoniumacetat, pH 5.2) zu Lösungsmittel A (10 % Methanol, 0.1 M Ammoniumacetat pH, 5.2) eluiert. Das Säuleneluat wird durch einen Fluoreszenzdetector (Model 474, Waters) bei einer Extinktion von 405nm und einer Emission von 625nm gemessen. Protoporphyrin IX wird identifiziert und quantifiziert durch Porphyrin-Standards wie beschrieben (Kruse et al . , 1995, EMBO J. 14: 3712-3720).
Beispiel 8
Porphyrin Gehalt in Wildtyp bzw. Acifluorfen-resistenten Arabi- dopsis Pflanzen
In Arabidopsis thaliana Wildtyppflanzen und transformierten, Aci— fluorfen-resistenten Arabidopsis Pflanzen ( Klone 51-3, 51-4, 51-8, 65-3, 65-4 und 65-5, siehe Beispiele 1 - 3) wurde die Bil- dung von Porphyrin in Gegenwart unterschiedlicher Acifluorfenkon— zentrationen ( 500 nM, 1 iM bzw. 5 iM Acifluorfen) untersucht. Hierzu wurden Blatter von 3 Wochen alten Pflanzen geerntet und in Gegenwart von Acifluorfen im Dunkeln inkubiert. Die Porphyrine wurden anschließend wie in Beispiel 7 beschrieben extrahiert und analysiert. Die akkumulierte Protoporphyrinogen IX Menge des
Wildtyps war gegenüber der in transformierten, Acifluorfen-resistenten Blättern erhöht, siehe Abbildungen 8 und 9. Da die er- höhte Porphyrin Akkumulation in Wildtyppflanzen eng mit der Primärwirkung von Protoxinhibitoren verknüpft ist, belegt die verringerte Porphyrinmenge in transformierten, Acifluorfen-resistenten Arabidopsis Mutanten den Zusammenhang zwischen Punktmutation und Ausbildung der Resistenz gegenüber Acifluorfen.

Claims

Patentansprüche
1. DNA-Sequenz, enthaltend die Kodierregion einer pflanzlichen ^ Protoporphyrinogen-IX-Oxidase, dadurch gekennzeichnet, daß diese DNA-Sequenz die Nukleotidabf olge SEQ-ID No . 1, SEQ-ID No. 3, SEQ-ID No. 5 oder SEQ-ID No . 7 aufweist.
2. DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1, die für ein Protein kodiert, 10 d s die biologische Aktivität einer gegen peroxidierende
Hemmstoffe der Protoporphyrinogen-IX-Oxidase resistenten Protoporphyrinogen-IX-Oxidase besitzt .
3. DNA-Sequenz, die mit der DNA-Sequenz SEQ-ID No. 1, SEQ-ID No - 15 3, SEQ-ID No. 5 oder SEQ-ID No . 7 gemäß Anspruch 1 oder Teilen davon oder Derivaten, die durch Insertion, Deletion oder Substitution von diesen Sequenzen abgeleitet ist , hybridisiert und für ein Protein kodiert, das die biologische Aktivität einer gegen peroxidierende Hemmstoffe der Protoporphy-
2° rinogen-IX-Oxidase resistenten Protoporphyrinogen-IX-Oxidase besitzt .
4. Protein mit Protoporphyrinogen-IX-Oxidase Aktivität, dadurch gekennzeichnet, daß es als Aminosäuresequenz die in SEQ-ID
25 No. 2, SEQ-ID No. 4, SEQ-ID No . 6 oder SEQ-ID No . 8 dargestellte Sequenz enthält.
5. Protein nach Anspruch 4 , dadurch gekennzeichnet , daß es als Aminosäuresequenz die Teilsequenz 370-440 aus SEQ-ID No. 2, 30 die Teilsequenz 460-530 aus SEQ-ID No . 4, die Teilsequenz
490-560 aus SEQ-ID No . 6 oder die Teilsequenz 420-490 aus SEQ-ID No. 8 enthält.
6. Verwendung einer DNA-Sequenz nach Anspruch 1, 2 oder 3 zur 3^ Einführung in pflanzliche Zellen, wobei diese Sequenz mit
Steuerelementen, die die Transkription und Translation in den Zellen gewährleisten, verknüpft ist und die Expression einer translatierbaren mRNA, kodierend für die Synthese einer pflanzlichen Protoporphyrinogen-IX-Oxidase, die resistent ist *0 gegen peroxidierende Hemmstoffe der Protoporphyrinogen-IX-
Oxidase, bewirkt.
7. Gegen peroxidierende Hemmstoffe der Protoporphyrinogen-IX- Oxidase resistente Pflanze, dadurch gekennzeichnet, daß in
45 der Pflanze eine DNA-Sequenz SEQ-ID No . 1, SEQ-ID No. 3, SEQ-ID No . 5 oder SEQ-ID No . 7 nach Anspruch 1 , 2 oder 3 ex— primiert wird .
8 . Verfahren zur Herstellung einer gegen peroxidierende Hemm- Stof fe der Protoporphyrinogen-IX-Oxidase resistenten Pflanze , dadurch gekennzeichnet , daß in der Pflanze eine DNA-Sequenz SEQ-ID No . 1 , SEQ-ID No . 3 , SEQ-ID No . 5 oder SEQ-ID No . 7 nach Anspruch 1 , 2 oder 3 exprimiert wird .
9 . Testsystem basierend auf der Expression einer DNA-Sequenz SEQ- ID No . 1 , SEQ-ID No . 3 , SEQ-ID No . 5 oder SEQ-ID No . 7 nach Anspruch 1 , 2 oder 3 zur Identifizierung von neuartigen Inhibitoren der pf lanzlichen Protoporphyrinogen-IX-Oxidase mit herbizider Wirkung .
10. Verwendung einer DNA-Sequenz nach Anspruch 1, 2 oder 3 zur Herstellung eines Selektionssystems, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz nach Anspruch 1, 2 oder 3 in einen Trans - formationsvektor eingebaut wird, mit diesem pflanzliche Zel — len transformiert und anschließend die transformierten Pflanzenzellen bzw. Pflanzen auf peroxidierend wirkenden Hemmstoffen der Protoporphyrinogen-IX-Oxidase selektioniert werden.
11. Verwendung der DNA-Sequenz Accession No . D 83139 kodierend für eine Protoporphyrinogen-IX-Oxidase I aus Arabidopsis tha.- liana, dadurch gekennzeichnet, daß diese DNA-Sequenz in einer Pflanze zur Überexpression gebracht wird und die Pflanze durch diese Überexpression resistent gegenüber peroxidieren— den Hemmstoffen der Protoporphyrinogen-IX-Oxidase wird.
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