EP0927246A2 - Adenylosuccinat synthetase - Google Patents

Adenylosuccinat synthetase

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Publication number
EP0927246A2
EP0927246A2 EP97943832A EP97943832A EP0927246A2 EP 0927246 A2 EP0927246 A2 EP 0927246A2 EP 97943832 A EP97943832 A EP 97943832A EP 97943832 A EP97943832 A EP 97943832A EP 0927246 A2 EP0927246 A2 EP 0927246A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
nucleic acid
expression
plant
plants
expression cassette
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP97943832A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Jens Lerchl
Ralf-Michael Schmidt
Helmut Schiffer
Uwe Sonnewald
Ralf Badur
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BASF SE
Original Assignee
BASF SE
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BASF SE filed Critical BASF SE
Publication of EP0927246A2 publication Critical patent/EP0927246A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance

Definitions

  • the present invention relates to expression cassettes, coding for non-vegetable adenylosuccinate synthetases (ADSS), which impart resistance to plant ADSS inhibitors to plants; Vectors and microorganisms containing such expression cassettes; transgenic plants transformed therewith; the corresponding expression products and nucleic acid sequences; and an expression kit for use in transforming a plant host.
  • ADSS non-vegetable adenylosuccinate synthetases
  • plants are able to synthesize their cell components from carbon dioxide, water and inorganic salts. This process is only possible by using biochemical reactions to build up organic substances. In particular, plants must also synthesize the nucleotides as components of the nucleic acids de novo.
  • the enzyme reactions of purine biosynthesis can start from
  • Pliosphoribosyl pyrophosphate can be divided into the following steps:
  • step c) The reaction sequence of step c) is shown schematically in the attached FIG. 1.
  • ADSS occupies a special position. The enzyme catalyzes the following reaction:
  • ADSS was purified from E. coli for homogeneity (Bass et al., 1987, Aren. Biochem. Biophys., 256, 335-342), the crystal structure was determined (Poland et al., 1993, J. Biol. Che. , 268, 25334-25342) and kinetic properties of the enzyme 5 were characterized (Kang and Fromm, 1995, J. Biol. Chem., 270,
  • the enzyme was also purified from Dictyostelium diseoideum (Jahngen and Rossomando, 1984, Arch. Biochem. Biophys., 229, 145-154) and rabbit muscle (J. Biol. Chem., 1974, 249 (2), 459-464). Vegetable adenylosuccinate synthetase 10 was obtained from wheat seedlings (Hatch, 1967, Phytochemistry, 6,
  • the adenylosuccinate synthetase is present in E. coli as a dimer of two 15 48 kD polypeptides. No data are available for herbal ADSS.
  • ADSS ADSS Genes coding for ADSS have so far been derived from Escherichia coli (EMB access number J04199), Bacillus subtilis (J02732),
  • ADSS activity No cofactors are required to measure ADSS activity.
  • the active substances hadacidin and alanosine (Stayton et al., 1983, Curr. Top. Cell. Regul., 22, 103-141) as well as hydantoine or its metabolite 5 '-phosphohydantocidine have been described (Siehl et al., 1996, Plant Physiol., 110, 753-758), which inhibit the enzyme activity of plant ADSS.
  • the phytotoxic active ingredient hydantocidin was isolated from Streptomyces 40 hygroscopicus (strain SANK 63584) (Nakajima et al., 1991, J. Antibiot., 44, 293-300). It has been shown that 5'-phosphohydantoeidine as the plant metabolite is the actual inhibitor of ADSS (Siehl et al., 1996, Plant Physiol., 110, 753-758). Hydantocidin exerts its toxic effect only in plants, has a low mammalian toxicity and does not act on various microorganisms investigated (Nakajima et al., 1991, J. Antibiot., 44, 293-300). It would be desirable, if ways could be found to specifically change the response of plants to ADSS inhibitors.
  • the invention is therefore based on the object of providing means by means of which the response of plants to ADSS inhibitors can be specifically modified.
  • this modification should be feasible by genetic engineering.
  • This object is achieved by providing an expression cassette containing regulatory under genetic control
  • Nucleic acid sequences the coding nucleic acid sequence for a protein which imparts resistance to inhibitors of plant adenylosuccinate synthetase to a plant host.
  • FIG. 1 shows the de novo purine biosynthesis in plants
  • FIG. 2 shows the nucleic acid sequence of the adenylosuccinate synthase from Escherichia coli, including the 5 'and 3' terminal Ba HI cleavage sites
  • FIG. 3 shows the amino acid sequence of the adenylosuccinate synthetase from Escherichia coli
  • FIG. 4 oligonucleotide sequences for isolating the nucleic acid sequence of the adenylosuccinate synthetase from Escherichia coli
  • FIG. 5 shows the nucleic acid sequence of the transit peptide of chloroplast plastid transketolase in three reading frames
  • FIG. 6 shows the structure of the expression cassettes and transformation vectors pTP09, pTPlO and pTPll;
  • FIG. 7 shows the structure of the expression cassettes and the transformation vector pTP09-ASS.
  • a first object of the present invention relates to expression cassettes which are suitable for transforming a plant host and which contain a coding sequence which give the host resistance to inhibitors of plant ADSS.
  • resistance means the artificially acquired resistance to the action of plant ADSS inhibitors. It includes the partial and, in particular, the complete insensitivity to these inhibitors for at least one generation of plants.
  • expression cassettes for a plant host are selected from whole plants, plant cells, plant tissues or plant parts, such as leaves, roots, fruits.
  • the plant host is selected from crop plants, cells, tissues or parts derived therefrom.
  • suitable crop plants can be mentioned: cereals, corn, soybeans, rice, cotton, sugar beet, canola, sunflower, flax, potato, tobacco, tomato, rapeseed, alfalfa, lettuce and the various tree, nut and Wine species.
  • the present invention offers the advantage that, after induction of a selective resistance of the crop plant to plant ADSS inhibitors, these inhibitors can be used as specific herbicides against non-resistant plants.
  • Non-limiting examples of inhibitors of this type include alanosine, hadacidin, hydantocidin and metabolites and functionally equivalent derivatives thereof.
  • Functionally equivalent derivatives of plant ADSS inhibitors have a comparable spectrum of action as the specifically named substances, with lower, equal or higher inhibitory activity (e.g. expressed in g inhibitor per hectare of cultivated area, required to completely suppress the growth of non-resistant plants).
  • the invention relates in particular to expression cassettes whose coding sequence contains a non-vegetable ADSS nucleic acid sequence which is tolerant to plant ADSS inhibitors or a functional equivalent thereof.
  • the ADSS nucleic acid sequence can e.g. be a DNA or a cDNA sequence.
  • Coding sequences suitable for insertion into an expression cassette according to the invention are, for example, those which essentially comprise a microbial DNA sequence which are suitable for an adenylosuccinate synthetase from microorganisms of the genera Escherichia, Bacillus, Haemophilus, Dictyostelium, Saccharomyces or Schizosaccharomyces and in particular from Escherichia coli subtilis, Haemophilus influenzae, Dictyostelium discoideum, Saccharomyces pombe or Schizosaccharomyces pombe.
  • Particularly suitable is an ADSS sequence which essentially corresponds to the DNA sequence from E. coli shown in FIG. 2 (SEQ ID N0: 1).
  • artificial DNA sequences are suitable as long as they induce the desired resistance as described above.
  • Such artificial DNA sequences can be determined, for example, by back-translation of proteins constructed by means of molecular modeling which have adenylosuccinate synthetase activity or by in vitro selection.
  • ADSS coding DNA sequences obtained by back-translating an ADSS polypeptide sequence according to the codon usage specific for the host plant.
  • the specific codon usage can easily be determined by a person skilled in plant genetic methods by computer evaluations of other, known genes of the plant to be transformed.
  • the invention also relates to the sequences which are functionally equivalent to the above nucleic acid sequences and to the amino acid sequences derived therefrom.
  • functional equivalents are sequences which essentially correspond to one another. This means in particular sequence variants which have arisen as a result of natural or artificial mutations in an ADSS sequence, provided that the desired ADSS activity, which is necessary to maintain plant metabolism, is retained.
  • the exogenous ADSS activity transformed in the plant host can therefore be higher, comparable or somewhat lower than that of the endogenous plant ADSS. Mutations include substitutions, deletions, exchanges or insertions of one or more nucleotide or amino acid residues.
  • Substitutions mean exchanges of nucleotides or amino acids. So-called silent or conservative exchanges are preferred. A silent nucleotide exchange does not change the amino acid sequence. A conservative exchange results in an amino acid substitution by an amino acid residue with comparable properties, e.g. Size, charge, polarity, solubility. Examples of amino acid pairs with similar properties are Glu and Asp, Val and Ile, Ser and Thr.
  • a deletion means the removal of at least one nucleotide or at least one amino acid residue.
  • Preferred positions for deletions are the DNA regions which code for the termini of the polypeptide and the links between the individual protein domains. According to the invention, particular preference is given to DNA sequences which code for ADSS proteins and which are reduced by N-terminal truncations by up to about 100, e.g. by 20 to 100 amino acids, from the sequence shown in FIG. 3 (SEQ ID N0: 2).
  • insertions comprise insertions of at least one nucleotide or amino acid residue into one of the sequences according to the invention.
  • Sequences which code for fusion proteins are to be mentioned as further functionally equivalent nucleic acid sequences according to the invention, part of the fusion protein being a non-vegetable ADSS polypeptide or a functionally equivalent part thereof.
  • the second part of the fusion protein can be, for example, another polypeptide with the same or different enzymatic activity. However, this is preferably a regulatory protein sequence, such as a signal or transit peptide, which directs ADSS to the desired site of action.
  • the invention thus also relates to expression cassettes whose coding sequence codes for an ADSS fusion protein, part of the fusion protein being a transit peptide which controls the translocation of the ADSS sequence.
  • Chloroplast-specific transit peptides are particularly preferred which, after translocation of the ADSS sequence into the plant chloroplasts (main site of purine biosynthesis in plants), are enzymatically split off from the ADSS part.
  • the transit peptide is particularly preferably derived from plastid transketolase (TK) or a functional equivalent of this transit peptide.
  • TK plastid transketolase
  • An expression cassette which contains one of the transit peptide DNA sequences shown in FIG. 5 (SEQ ID NOs: 3,4,5) is particularly preferred.
  • an expression cassette according to the invention also comprise regulatory nucleic acid sequences which control the expression of the coding sequence in the host cell.
  • an expression cassette according to the invention comprises upstream, i.e. at the 5 'end, the coding sequence a promoter and downstream, i.e. at the 3 'end a polyadenylation signal, and optionally further regulatory elements which are operatively linked to the intervening coding sequence for ADSS and / or transit peptide.
  • An operative link is understood to mean the sequential arrangement of the said regulatory elements in such a way that each of the regulatory elements can fulfill its function in the expression of the coding sequence.
  • any promoter which can control the expression of foreign genes in plants is suitable as the promoter of the expression cassette according to the invention.
  • a plant promoter is preferably used in particular.
  • the 35S CaMV promoter from the Cauliflower mosaic virus (Franck et al. (1980) Cell 21, 285-294) is particularly preferred.
  • This promoter contains different recognition sequences for transcriptional effectors, which in their entirety lead to a constitutive expression of the introduced gene (Benfey et al. (1989) EMBO J. 8, 2195-2202).
  • Preferred polyadenylation signals are plant polyadenylation signals, preferably those which essentially correspond to T-DNA polyadenylation signals from Agrobacterium tumefaciens, in particular the polyadenylation signal of gene 3 of the T-DNA of the Ti plasmid pTiACH5.
  • An expression cassette according to the invention is produced by fusing a suitable promoter with a suitable ADSS-DNA and preferably a DNA coding for a chloroplast-specific transit peptide inserted between the promoter and ADSS-DNA, and a polyadenylation signal according to common recombination and cloning techniques, as described, for example, in T. Maniatis, EF Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory manual, Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) and in T.J. Silhavy, M.L. Berman and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) and in Ausubel, F.M. et al. , Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987).
  • ADSS-DNA or cDNA required for the production of expression cassettes according to the invention is preferably obtained with the aid of the
  • PCR Polymerase chain reaction
  • the invention also relates to an expression kit which comprises at least three expression cassettes, at least two of which contain a variable region or frame shift sequence which differ from one another by insertion or deletion, preferably insertion, of a number of nucleotides which cannot be divided by 3 and thus shift the reading frame for a sequence inserted downstream by one or two nucleotides.
  • the 5 'end of the frame shift sequence is linked to the transit peptide sequence.
  • the frame shift sequence includes a restriction site at the 3 'end into which, for example, the ADSS-DNA sequence is inserted.
  • the provision of at least three vectors, each containing an expression cassette of the kit with different reading frames for the inserted gene, ensures that the fusion constructs consist of any DNA sequence and a DNA sequence coding for a transit peptide. can be expressed in three different reading frames, with at least one of the constructs leading to the expression of functional gene product (such as ADSS).
  • the construction diagrams for an expression kit according to the invention containing three expression cassettes and which is particularly suitable for the transformation of plants are shown in the attached FIG. 6.
  • the invention also relates to the use of such kits for transforming a plant host.
  • the expression cassettes according to the invention can be cloned into suitable vectors which enable their multiplication, for example in E. coli.
  • suitable cloning vectors include pBR332, pUC series, M13mp series and pACYC184.
  • Another object of the invention therefore relates to recombinant vectors, such as e.g. Plasmids or viruses containing at least one expression cassette according to the invention.
  • a particularly preferred recombinant plasmid called pTP09-ASS contains the gene construct shown in FIG. 7 and gives the plant host transformed therewith resistance to plant ADSS inhibitors, such as e.g. Hydantocidin.
  • an expression cassette according to the invention is inserted as an insert in a recombinant vector, the vector DNA of which contains additional functional regulatory signals, for example sequences for replication or integration.
  • Suitable vectors are inter alia in "Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology” (CRC Press), Chap. 6/7, p.71-119.
  • the vectors according to the invention can be used to transform plants, plant cells, plant tissues or parts.
  • the DNA constructs fused according to the invention can also be transferred into plant genomes by various other known methods. Suitable methods are, for example, protoplast transformation by polyethylene glycol-induced DNA uptake, electroporation, sonication or microinjection, and the transformation of intact cells or tissue by micro or macro injection into tissue or embryos, tissue electroporation, incubation of dry embryos in DNA-containing solution, biolistic shear gene transfer and particularly preferably Agrobacterium transform ation. The methods mentioned are described, for example, in B. Jenes et al. , Techniques for Gene Transfer; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, edited by SD Kung and R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 128-143 and in Potrykus (1991) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42, 205-225).
  • the fused construct is preferably cloned into a vector, for example pBin19, which is suitable for transforming Agrobacterium tumefaciens.
  • Agrobacteria transformed with such a vector can then be used in a known manner to transform plants, in particular crop plants, such as e.g. of tobacco plants can be used, for example, by wounding leaves or leaf pieces in an agrobacterial solution and then cultivating them in suitable media.
  • the transformation of plants by agrobacteria is known, among other things, from F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, edited by S-d Kung and R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 15-38 and from S.B.
  • Transgenic plants which express ADSS-DNA integrated into the expression cassette according to the invention can be regenerated in a known manner from the transformed cells of the wounded leaves or leaf pieces.
  • ADSS transgenically expressed ADSS
  • an enzyme assay as described in Baugher et al. , Biochem. Res. Commun., 94: 123-129 (1980); Stayton et al., Curr. Top. Cell. Regul. , 22: 103-141 (1983); and Bass et al., Arch. Biochem. Biophys., 256: 335-342 (1987).
  • the invention also relates to microorganisms, such as Bacteria or fungi which contain a recombinant vector according to the invention.
  • the invention also relates to transgenic plants transformed with a vector or microorganism according to the invention, and to transgenic cells, tissues, parts and propagation material of such plants.
  • Transgenic crop plants such as e.g. Cereals, corn, soybeans, rice, cotton, sugar beet, canola, sunflower, flax, potato, tobacco, tomato, rapeseed, alfalfa, lettuce and the various tree, nut and wine species.
  • transgenic plants, plant cells, tissue or parts can be treated with an active ingredient which inhibits the plant ADSS, as a result of which those which have not been successfully transformed Plants, cells, tissues or parts of plants die.
  • suitable active substances are alanosine, hadacidin and in particular hydantocidin as well as metabolites and functional derivatives of these compounds.
  • the ADSS-DNA inserted into the expression cassette according to the invention can thus be used as a selection marker.
  • Another object of the invention thus relates to the use of vectors or microorganisms transformed therewith for the transformation of plants, plant cells, plant tissues or plant parts, in particular for the expression of exogenous proteins, glycoproteins or fusion proteins.
  • the aim of the use is preferably to impart resistance to inhibitors of plant ADSS.
  • the invention also relates to the expression products produced according to the invention, in particular the fusion proteins from transit peptide and protein part with non-plant ADSS activity.
  • Example 1 PCR amplification of Escherichia coli adenylosuccinate synthetase using synthetic oligonucleotides
  • the PCR amplification of the Escherichia coli ADSS was carried out in a DNA thermal cycler from Perkin Elmer.
  • the oligonucleotides used (SEQ ID NO: 6, 7) are shown in FIG. 4 and were taken from the published sequence.
  • the reaction mixtures contained 8ng / ⁇ l genomic DNA from Escherichia coli, 0.5 ⁇ M of the corresponding oligonucleotides, 200 ⁇ M nucleotides (Pharmacia), 50 mM KCl, 10 M Tris-HCl (pH 8.3 at 25 ° C.), 1 , 5 mM MgCl) and 0.02 U / ⁇ l Taq polymerase (Perkin Elmer).
  • the amplification conditions were set as follows:
  • Annealing temperature 45 ° C, 1 min
  • nucleotides 11749-11939 derived from the octopine synthase (OCS) gene, was isolated as a PvuII-Hindlll fragment and after addition of Sphl linkers to the PvuII interface between the Sphl-Hindlll- Interfaces of the vector were cloned, resulting in the plasmid pBinAR (Höfgen and Willmitzer (1990) Plant Science 66, 221-230).
  • the cDNA sequence of the transit peptide (TP) of the transketolase (TK) was taken from the plasmid pBluescript TK-26 (DE-A-19501906) and with the aid of synthetic oligonucleotides as a Kpnl-BamHI fragment via a polymerase chain reaction into the plasmid pBinAR - riert.
  • three vectors were obtained as plant expression cassettes (pTP09, pTPlO, pTPll, see FIGS. 5 and 6), which allow chimeric gene constructs with the cDNA transit sequence of the plastid transketolase in three different reading frames to create.
  • Example 3 Creation of a plant expression cassette for the adenylosuccinate synthetase
  • the DNA fragment coding for the adenylosuccinate synthetase was cloned into the vector pTP09 as a BamHI fragment.
  • the plasmid pTP09-ASS resulted (see FIG. 7). Fusion of the transit peptide (TP / TK) with the adenylosuccinate synthetase ensured the import of the protein into the chloroplasts.
  • the plasmid pTP09-ASS was in Agrobacterium tumefaciens
  • C58C1 pGV2260 transformed.
  • the transformation of Agrobacterium tumefaciens was carried out according to the method of Höfgen and Willmitzer (Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877).
  • the agrobacteria were grown in YEB medium (Vervliet et al., J. Gen. Virol. (1975) 26, 33).
  • YEB medium Vervliet et al., J. Gen. Virol. (1975) 26, 33.
  • For the transformation of tobacco plants (Nicotiana tabacum cv. Samsun NN) a 1:50 dilution of an overnight culture of a positively transformed agrobacterial colony in Murashige-Skoog Medium ((1962) Physiol. Plant. 15, 473) with 2% sucrose (2MS- Medium) is used.
  • Leaf disks of sterile plants (each about 1 cm 2 were incubated in a Petri dish with a 1:50 agrobacterial dilution for 5 to 10 minutes. This was followed by a 2-day incubation in the dark at 25 ° C. on 2MS medium with 0.
  • RNA total RNA of tobacco plants, as in Logemann et al. (Anal. Biochem. (1987) 163,21).
  • 20 ⁇ g RNA were separated in a 1.5% agarose gel containing formaldehyde. After electrophoretic separation of the RNA molecules, the RNA was transferred to a nylon membrane by capillary transfer. The detection of specific transcripts was carried out as described in Amasino (Anal. Biochem. (1986) 152, 304).
  • the cDNA fragments used as a probe were radioactively labeled with a random primed DNA labeling kit (Boehringer, Mannheim).
  • Example 7 Enzyme assay of adenylosuccinate synthetase isolated from transgenic tobacco plants
  • the test mixture contained 14 mM Tris-HCl pH 8.3; 6 mM MgCl 2 ; 0.4 mM IMP; 0.1 mM GTP; 0.5 mM phosphoenol pyruvate; 0.1 mM ATP; 2 U / ml pyruvate kinase; 3 mM aspartate and in a 1 ml test batch 10 to 100 ⁇ l enzyme preparation.
  • the recombinant ADSS showed no inhibition by hydantocidin.
  • Example 8 Testing of hydantocidine-resistant tobacco plants
  • Tobacco plants transformed with the plasmid pTP09-ASS were grown in tissue culture on 2MS medium with 0.8% Bacto agar, 250 mg / 1 claforan, 50 mg / 1 kanamycin, and axial shoots were transferred to corresponding medium with 220 mg / 1 hydantocidin. Untransformed plants died within a few weeks, while resistant plants continued to grow.
  • ORGANISM Escherichia coli

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Abstract

Die Erfindung betrifft Expressionskassetten, die in Pflanzen, Pflanzenzellen, -geweben oder -teilen Resistenz gegenüber Inhibitoren pflanzlicher Adenylosuccinat Synthetasen vermitteln sowie die Verwendung der Expressionskassetten in geeigneten Vektoren zur Transformation von Pflanzen, Pflanzenzellen, -geweben oder -teilen.

Description

Adenylosuccinat Synthetase
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft Expressionskassetten, kodierend für nicht-pflanzliche Adenylosuccinat Synthetasen (ADSS) , die Pflanzen Resistenz gegenüber Inhibitoren pflanzlicher ADSS vermitteln; Vektoren und Mikroorganismen, enthaltend solche Expressionskassetten; damit transformierte transgene Pflanzen; die entsprechenden Expressionsprodukte und Nukleinsäuresequenzen; sowie einen Expressions-Kit zur Verwendung bei der Transformation eines pflanzlichen Wirts.
Pflanzen sind als photoautotrophe Organismen in der Lage, aus Kohlendioxid, Wasser und anorganischen Salzen ihre Zellkomponenten zu synthetisieren. Dieser Prozeß ist nur möglich, indem biochemische Reaktionen zum Aufbau organischer Substanzen genutzt werden. Insbesondere müssen Pflanzen auch die Nukleotide als Bestandteile der Nukleinsäuren de novo synthetisieren.
Es ist anzunehmen, daß die effiziente Bildung, Nutzung und Verteilung der Nukleotide die Zellteilung und das Wachstum einer Pflanze stark beeinflussen. Da Pflanzen auf eine funktionierende de novo Nukleotidbiosynthese angewiesen sind, bietet sich dieser Biosyntheseweg als Ziel für den Einsatz von Herbiziden an. Die komplexen Reaktionen, die die Nukleotidbiosynthese gewährleisten, unterteilen sich in Purin- und Pyri idinbiosynthese .
Die Enzymreaktionen der Purinbiosynthese können ausgehend vom
Pliosphoribosylpyrophosphat (PRPP) in folgende Schritte unterteilt werden :
a) Synthese des Pyrimidinringes b) Synthese des Purinringes c) Verzweigung vom IMP zum AMP bzw. GMP
Die Reaktionssequenz von Schritt c) ist in beiliegender Figur 1 schematisch dargestellt.
Einige der an der Purinbiosynthese beteiligten Enzyme stellen potentielle Angriffspunkte für herbizide Wirkstoffe dar. Eine besondere Stellung nimmt die ADSS ein. Das Enzym katalysiert folgende Reaktion:
IMP + L-Aspartat + GTP ±+ Adenylosuccinat + GDP + Pi Die ADSS wurde aus E. coli zur Homogenität aufgereinigt (Bass et al., 1987, Aren. Biochem. Biophys . , 256, 335-342), die Kristallstruktur wurde bestimmt (Poland et al . , 1993, J. Biol . Che . , 268, 25334-25342) und kinetische Eigenschaften des Enzyms wurden 5 charakterisiert (Kang und Fromm, 1995, J. Biol. Chem., 270,
15539-15544). Das Enzym wurde zudem aus Dictyostelium diseoideum (Jahngen und Rossomando, 1984, Arch. Biochem. Biophys., 229, 145-154) und Kaninchenmuskel (J. Biol. Chem., 1974, 249(2), 459-464) aufgereinigt . Pflanzliche Adenylosuccinat Synthetase 10 wurde aus Weizenkeimlingen (Hatch, 1967, Phytochemistry, 6,
115-119) sowie aus Mais (Siehl et al., 1996, Plant Physiol., 110, 753-758) für eine Bestimmung der Enzymaktivität isoliert.
Die Adenylosuccinat Synthetase liegt in E. coli als Dimer zweier 15 48 kD Polypeptide vor. Für die pflanzliche ADSS liegen bisher keine Daten vor.
Gene, die für ADSS kodieren, wurden bisher aus Escherichia coli (EMB -Accessions-Nummer J04199), Bacillus subtilis (J02732),
20 Haemophilus influenzae ( 46263), Saccharomyces pombe (L22185) , Schizosaccharomyces pombe (M98805), Dictyostelium diseoidem (M58471), Homo sapiens (X65503) und Mus musculus (M74495) isoliert. Durch Datenvergleiche lassen sich "expressed-sequence- tags", sogenannte est-Se uenzen, aus Arabidopsis thaliana
25 (T42641) und Oryza sativa (D15352) mit deutlicher Ähnlichkeit zu den genannten ADSS finden.
Vollständige cDNA-Sequenzen pflanzlicher Adenylosuccinat Synthetasen sind zudem aus Arabidopsis thaliana und Mais (US-A-5519125) 30 sowie aus Weizen beschrieben worden (W096/19576) .
Zur ADSS-Aktivitätsmessung sind keine Cofaktoren notwendig. Jedoch wurden die Wirkstoffe Hadacidin und Alanosin (Stayton et al., 1983, Curr. Top. Cell . Regul . , 22, 103-141) sowie Hydanto- 35 eidin bzw. dessen Metabolit 5 ' -Phosphohydantocidin beschrieben (Siehl et al . , 1996, Plant Physiol., 110, 753-758), die die Enzymaktivität der pflanzlichen ADSS hemmen.
Der phytotoxische Wirkstoff Hydantocidin wurde aus Streptomyces 40 hygroscopicus (Stamm SANK 63584) isoliert (Nakajima et al . , 1991, J. Antibiot., 44, 293-300). Es wurde gezeigt, daß das 5'-Phospho- hydantoeidin als in der Pflanze entstehender Metabolit der eigentliche Inhibitor der ADSS ist (Siehl et al . , 1996, Plant Physiol., 110, 753-758). Hydantocidin entfaltet seine toxische Wir- 45 kung nur bei Pflanzen, hat eine geringe Säugertoxizität und wirkt nicht auf verschiedene untersuchte Mikroorganismen (Nakajima et al . , 1991, J. Antibiot., 44, 293-300). Es wäre wünschenswert, wenn Wege gefunden werden könnten, das Ansprechen von Pflanzen auf ADSS-Inhibitoren gezielt zu verändern.
Der Erfindung liegt folglich die Aufgabe zugrunde, Mittel bereit- zustellen, mit deren Hilfe gezielt das Ansprechen von Pflanzen auf ADSS-Inhibitoren modifiziert werden kann. Insbesondere sollte diese Modifikation auf gentechnischem Wege durchführbar sein.
Diese Aufgabe wird gelöst durch Bereitstellung einer Expressions- kassette, enthaltend unter genetischer Kontrolle regulativer
Nukleinsäuresequenzen die kodierende Nukleinsäuresequenz für ein Protein, welches einem pflanzlichen Wirt Resistenz gegenüber Inhibitoren pflanzlicher Adenylosuccinat Synthetase vermittelt.
Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden Figuren näher erläutert . Dabei zeigt
Figur 1 die de novo Purinbiosynthese in Pflanzen; Figur 2 die Nukleinsäuresäuresequenz der Adenylosuccinat Syn- thetase aus Escherichia coli, einschließlich der 5'- und 3 ' -terminalen Ba HI-Schnittstellen; Figur 3 die Aminosäuresäuresequenz der Adenylosuccinat Synthetase aus Escherichia coli; Figur 4 Oligonukleotidsequenzen zur Isolierung der Nukleinsäu- resequenz der Adenylosuccinat Synthetase aus Escherichia coli; Figur 5 die Nukleinsäuresequenz des Transitpeptides der chloro- plastidären Transketolase in drei Leserastern; Figur 6 den Aufbau der Expressionskassetten und Transforma- tionsvektoren pTP09, pTPlO und pTPll;
Figur 7 den Aufbau der Expressionskassetten und des Trans- formationsvektors pTP09-ASS.
Ein erster Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft Expres- sionskassetten, welche zur Transformation eines pflanzlichen Wirts geeignet sind und eine kodierende Sequenz enthalten, die dem Wirt Resistenz gegen Inhibitoren pflanzlicher ADSS verleihen.
Resistenz bedeutet im Rahmen der vorliegenden Erfindung die künstlich erworbene Widerstandsfähigkeit gegen die Wirkung pflanzlicher ADSS-Inhibitoren. Sie umfaßt die partielle und, insbesondere, die vollständige Unempfindlichkeit gegenüber diesen Inhibitoren für die Dauer mindestens einer Pflanzengeneration.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Ex- pressionskassetten für einen pflanzlichen Wirt, ausgewählt unter ganzen Pflanzen, Pflanzenzellen, Pflanzengeweben oder Pflanzen- teilen, wie z.B. Blättern, Wurzeln, Früchten, bereitgestellt. Insbesondere ist der pflanzliche Wirt ausgewählt unter Kulturpflanzen, davon abgeleiteten Zellen, Geweben, oder Teilen. Als nicht-limitierende Beispiele für geeignete Kulturpflanzen können genannt werden: Getreide, Mais, Soja, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Canola, Sonnenblume, Flachs, Kartoffel, Tabak, Tomate, Raps, Alfalfa, Salat und die verschiedenen Baum-, Nuß- und Wein- species .
Insbesondere bei Kulturpflanzen bietet die vorliegende Erfindung den Vorteil, daß nach Induktion einer selektiven Resistenz der Kulturpflanze gegenüber pflanzlichen ADSS-Inhibitoren diese Inhibitoren als spezifische Herbizide gegen nichtresistente Pflanzen eingesetzt werden können. Als nicht-limitierende Beispiele für derartige Inhibitoren können genannt werden Alanosin, Hadacidin, Hydantocidin sowie Metabolite und funktionell äquivalente Derivate davon. Funktioneil äquivalente Derivate pflanzlicher ADSS- Inhibitoren besitzen ein vergleichbares Wirkungsspektrum wie die konkret genannten Substanzen, bei niedrigerer, gleicher oder höherer inhibitorischer Aktivität (z.B. ausgedrückt in g Inhibitor pro Hektar Anbaufläche, erforderlich zur vollständigen Unterdrückung des Wachstums nicht-resistenter Pflanzen) .
Gegenstand der Erfindung sind insbesondere Expressionskassetten, deren kodierende Sequenz eine gegen pflanzliche ADSS-Inhibitoren tolerante, nicht-pflanzliche ADSS-Nukleinsäuresequenz oder ein funktionelles Äquivalent davon enthält. Die ADSS-Nukleinsäuresequenz kann dabei z.B. eine DNA- oder eine cDNA-Sequenz sein.
Zur Insertion in eine erfindungsgemäße Expressionskassette geeignete kodierende Sequenzen sind beispielsweise solche, welche im wesentlichen eine mikrobielle DNA-Sequenz umfassen, die für eine Adenylosuccinat Synthetase aus Mikroorganismen der Genera Escherichia, Bacillus, Haemophilus, Dictyostelium, Saccharomyces oder Schizosaccharomyces und inbesondere aus Escherichia coli, Bacillus subtilis, Haemophilus influenzae, Dictyostelium discoideum, Saccharomyces pombe oder Schizosaccharomyces pombe kodiert. Insbesondere geeignet ist eine ADSS-Se uenz , die im wesentlichen der in Figur 2 (SEQ ID N0:1) dargestellten DNA-Sequenz aus E. coli entspricht.
Außerdem sind artifizielle DNA-Sequenzen geeignet, solange sie, wie oben beschrieben, die gewünschte Resistenz induzieren. Solche artifiziellen DNA-Sequenzen können beispielsweise durch Rücküber- setzung mittels Molecular Modelling konstruierter Proteine, die Adenylosuccinat Synthetase-Aktivität aufweisen oder durch in vi- tro-Selektion ermittelt werden. Besonders geeignet sind für ADSS kodierende DNA-Sequenzen, die durch Rückübersetzung einer ADSS- Polypeptidsequenz gemäß der für die Wirtspflanze spezifischen Codon-Nutzung erhalten wurden. Die spezifische Codon-Nutzung kann ein mit pflanzengenetischen Methoden vertrauter Fachmann durch Computerauswertungen anderer, bekannter Gene der zu transformierenden Pflanze leicht ermitteln.
Gegenstand der Erfindung sind auch die zu obigen Nukleinsäure- sequenzen und zu den davon abgeleiteten Aminosäuresequenzen funk- tionell äquivalenten Sequenzen. Funktionelle Äquivalente sind erfindungsgemäß solche Sequenzen, die einander im wesentlichen entsprechen. Darunter versteht man insbesondere Sequenzvarianten, die durch natürliche oder künstliche Mutationen einer ADSS-Se- quenz entstanden sind, sofern die gewünschte, zur Aufrechterhai- tung des pflanzlichen Metabolismus notwendige, ADSS-Aktivität dabei erhalten bleibt. Die in den pflanzlichen Wirt transformierte exogene ADSS-Aktivität kann also höher, vergleichbar oder etwas geringer sein als diejenige der endogenen pflanzlichen ADSS. Mutationen umfassen Substitutionen, Deletionen, Vertauschungen oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotid- oder Aminosäurereste.
Als Substitutionen werden Austausche von Nukleotiden oder Aminosäuren verstanden. Bevorzugt sind sogenannte stumme oder konser- vative Austausche. Ein stummer Nukleotidaustausch bewirkt keine Veränderung in der Aminosäuresequenz. Ein konservativer Austausch bewirkt eine Aminosäuresubstitution durch einen Aminosäurerest mit vergleichbaren Eigenschaften, wie z.B. Größe, Ladung, Polarität, Löslichkeit. Beispiele für Aminosäurenpaare mit ähnlichen Eigenschaften sind Glu und Asp, Val und Ile, Ser und Thr.
Unter einer Deletion versteht man erfindungsgemäß das Entfernen wenigstens eines Nukleotids oder wenigstens eines Aminosäurerests. Bevorzugte Positionen für Deletionen sind die DNA-Regio- nen, die für die Termini des Polypeptids und die Verknüpfungen zwischen den einzelnen Proteindomänen kodieren. Besonders bevorzugt sind erfindungsgemäß DNA-Sequenzen, die für ADSS-Proteine kodieren, die durch N-terminale Verkürzungen um bis zu etwa 100, wie z.B. um 20 bis 100 Aminosäuren, aus der in Figur 3 (SEQ ID N0:2) dargestellten Sequenz entstehen.
Insertionen umfassen erfindungsgemäß Einfügungen von wenigstens einem Nukleotid oder Aminosäurerest in eine der erfindungsgemäßen Sequenzen. Als weitere erfindungsgemäße funktionell äquivalente Nukleinsäu- re-Sequenzen sind zu nennen Sequenzen, welche für Fusionsproteine kodieren, wobei Bestandteil des Fusionsproteins ein nicht-pflanzliches ADSS-Polypeptid oder ein funktioneil äquivalenter Teil da- von ist. Der zweite Teil des Fusionsproteins kann z.B. ein weiteres Polypeptid mit gleicher oder verschiedener enzymatischer Aktivität sein. Bevorzugt handelt es sich dabei jedoch um eine regulative Proteinsequenz, wie z.B. ein Signal- oder Transitpep- tid, das ADSS an den gewünschten Wirkort leitet.
Gegenstand der Erfindung sind somit auch Expressionskassetten, deren kodierende Sequenz für ein ADSS-Fusionsprotein kodiert, wobei Teil des Fusionsproteins ein Transitpeptid ist, das die Translokation der ADSS-Sequenz steuert. Besonders bevorzugt sind Chloroplasten-spezifische Transitpeptide, welche nach Translokation der ADSS-Sequenz in die Pflanzenchloroplasten (Hauptort der Purinbiosynthese in Pflanzen) vom ADSS-Teil enzymatisch abgespalten werden. Insbesondere bevorzugt ist das Transitpeptid abgeleitet von plastidärer Transketolase (TK) oder einem funktioneilen Äquivalent dieses Transitpeptids . Besonders bevorzugt ist eine Expressionskassette, welche eine der in Figur 5 (SEQ ID N0s:3,4,5) dargestellte Transitpeptid-DNA-Sequenz enthält.
Die erfindungsgemäßen Expressionskassetten umfassen außerdem re- gulative Nukleinsäuresequenzen, welche die Expression der kodierenden Sequenz in der Wirtszelle steuern. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt eine erfindungsgemäße Expressionskassette stromaufwärts, d.h. am 5 '-Ende, der kodierenden Sequenz einen Promotor und stromabwärts, d.h. am 3 ' -Ende ein Polyadenylierungs- signal, und gegebenenfalls weitere regulatorische Elemente, welche mit der dazwischenliegenden kodierenden Sequenz für ADSS und/ oder Transitpeptid operativ verknüpft sind. Unter einer operativen Verknüpfung versteht man die sequenzielle Anordnung der genannten regulativen Elemente derart, daß jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz erfüllen kann.
Als Promotor der erfindungsgemäßen Expressionskassette ist grundsätzlich jeder Promotor geeignet, der die Expression von Fremd- genen in Pflanzen steuern kann. Vorzugsweise verwendet man insbesondere einen pflanzlichen Promotor. Insbesondere bevorzugt ist der 35S CaMV-Promotor aus dem Cauliflower-Mosaik-Virus (Franck et al . (1980) Cell 21, 285-294). Dieser Promotor enthält unterschiedliche ErkennungsSequenzen für transkriptionale Effektoren, die in ihrer Gesamtheit zu einer konstitutiven Expression des eingeführten Gens führen (Benfey et al . (1989) EMBO J. 8, 2195-2202) .
Bevorzugte Polyadenylierungssignale sind pflanzliche Polyadeny- lierungssignale, vorzugsweise solche, die im wesentlichen T-DNA- Polyadenylierungssignalen aus Agrobacterium tumefaciens, insbesondere dem Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5 entsprechen.
Die Herstellung einer erfindungsgemäßen Expressionskassette erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einer geeigneten ADSS-DNA und vorzugsweise einer zwischen Promotor und ADSS- DNA insertierten für ein Chloroplasten-spezifisches Transitpeptid kodierenden DNA sowie einem Polyadenylierungssignal nach gängigen Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory manual, Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T.J. Silhavy, M.L. Berman und L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Labo- ratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel , F.M. et al . , Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987) beschrieben sind.
Die zur Herstellung erfindungsgemäßer Expressionskassetten erfor- derliche ADSS-DNA oder -cDNA wird vorzugsweise mit Hilfe der
Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert . Verfahren zur DNA- Amplifikation mittels PCR sind bekannt, beispielsweise aus Innis et al . , PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Aca- demic Press (1990). Zweckmäßigerweise können die PCR-erzeugten DNA-Fragmente durch Sequenzanalyse zur Vermeidung von Polymerase- fehlern in zu exprimierenden Konstrukten überprüft werden.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Expressions-Kit, das mindestens drei Expressionskassetten umfaßt, wobei mindestens zwei eine variable Region oder Frame-Shift-Sequenz enthalten, die sich durch Insertion oder Deletion, vorzugsweise Insertion, einer nicht durch 3 teilbaren Zahl von Nukleotiden voneinander unterscheiden und somit eine Verschiebung des Leserahmens für eine stromabwärts insertierte Sequenz um ein bzw. zwei Nukleotide be- wirken. Das 5 '-Ende der Frame-Shift-Sequenz ist mit der Transit- peptidsequenz verknüpft. Die Frame-Shift-Sequenz umfaßt am 3 ' -Ende eine Restriktionsschnittstelle, in welche z.B. die ADSS- DNA-Sequenz insertiert wird. Durch Bereitstellung von mindestens drei Vektoren, die je eine Expressionskassette des Kits mit unterschiedlichen Leserahmen für das insertierte Gen enthalten, ist gewährleistet, daß die Fusionskonstrukte aus einer beliebigen DNA-Sequenz und einer für ein Transitpeptid kodierenden DNA-Se- quenz in drei verschiedenen Leserastern exprimiert werden können, wobei wenigstens eines der Konstrukte zur Expression von funktio- nellem Genprodukt (wie z.B. ADSS) führt. Die Konstruktionssche- mata für einen drei Expressionskassetten enthaltenden erfindungε- gemäßen Expressions-Kits der zur Transformation von Pflanzen besonders geeignet ist, werden in beiliegender Figur 6 gezeigt.
Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung solcher Kits zur Transformation eines pflanzlichen Wirts.
Unter Verwendung der oben zitierten Rekombinations- und Klonierungstechniken können die erfindungsgemäßen Expressionskassetten in geeignete Vektoren kloniert werden, die ihre Vermehrung, beispielsweise in E. coli, ermöglichen. Geeignete Klonierungsvekto- ren sind u.a. pBR332, pUC-Serien, M13mp-Serien und pACYC184. Besonders geeignet sind binäre Vektoren, die sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien replizieren können, wie z.B. pBinl9 (Bevan et al. (1980) Nucl. Acids Res . 12, 8711).
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft daher rekombinante Vektoren, wie z.B. Plasmide oder Viren, enthaltend wenigstens eine erfindungsgemäße Expressionskassette. Ein besonders bevorzugtes rekombinantes Plasmid mit der Bezeichnung pTP09-ASS enthält das in Figur 7 abgebildete Gen-Konstrukt und verleiht dem damit transformierten pflanzlichen Wirt Resistenz gegen pflanzliche ADSS-Inhibitoren, wie z.B. Hydantocidin.
Zur Transfektion einer Wirtspflanze mit einer ADSS-DNA wird eine erfindungsgemäße Expressionskassette als Insert in einen rekombi- nanten Vektor eingebaut, dessen Vektor-DNA zusätzliche funktioneile Regulationssignale, beispielsweise Sequenzen für Replika- tion oder Integration enthält. Geeignete Vektoren sind unter anderem in "Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology" (CRC Press), Kap. 6/7, S.71-119 beschrieben.
Die erfindungsgemäßen Vektoren können zur Transformation von Pflanzen, Pflanzenzellen, -geweben oder -teilen verwendet werden.
Die erfindungsgemäß fusionierten DNA-Konstrukte können auch durch verschiedene andere bekannte Verfahren in pflanzliche Genome transferiert werden. Geeignete Verfahren sind beispielsweise Protoplasten-Transformation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA- Aufnahme, Elektroporation, Beschallung oder Mikroinjektion sowie die Transformation intakter Zellen oder Gewebe durch Mikro- oder Makroinjektion in Gewebe oder Embryonen, Gewebeelektroporation, Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung, biolisti- scher Gentransfer und besonders bevorzugt Agrobacterium-Transfor- ation. Die genannten Verfahren sind beispielsweise in B. Jenes et al . , Techniques for Gene Transfer; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S.D. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 128-143 sowie in Potrykus (1991) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42, 205-225) beschrieben.
Vorzugsweise wird das fusionierte Konstrukt in einen Vektor, beispielsweise pBinl9, kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium tumefaciens zu transformieren. Mit einem solchen Vektor transformierte Agrobakterien können dann in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen, insbesondere von Kulturpflanzen, wie z.B. von Tabakpflanzen, verwendet werden, indem beispielsweise verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung geba- det und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden. Die Transformation von Pflanzen durch Agrobakterien ist unter anderem bekannt aus F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S-d Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15-38 und aus S.B. Gelvin, Molecular Genetics of T-DNA Transfer from Agrobacterium to Plants, gleichfalls in Transgenic Plants, S. 49-78. Aus den transformierten Zellen der verwundeten Blätter bzw. Blattstücke können in bekannter Weise transgene Pflanzen regeneriert werden, die in die erfindungsgemäße Expres- sionskassette integrierte ADSS-DNA exprimieren.
Die Wirksamkeit der transgen exprimierten ADSS kann beispielsweise in vitro durch einen Enzymassay getestet werden, wie in Baugher et al . , Biochem. Res . Commun., 94:123-129 (1980); Stayton et al., Curr. Top. Cell. Regul . , 22:103-141 (1983); und Bass et al., Arch. Biochem. Biophys., 256:335-342 (1987) beschrieben.
Gegenstand der Erfindung sind außerdem Mikroorganismen, wie z.B. Bakterien oder Pilze, welche einen erfindungsgemäßen rekombinan- ten Vektor enthalten.
Gegenstand der Erfindung sind außerdem transgene Pflanzen, transformiert mit einem erfindungsgemäßen Vektor oder Mikroorganismus, sowie transgene Zellen, Gewebe, Teile und Vermehrungsgut solcher Pflanzen. Besonders bevorzugt sind dabei transgene Kulturpflanzen, wie z.B. Getreide, Mais, Soja, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Canola, Sonnenblume, Flachs, Kartoffel, Tabak, Tomate, Raps, Alfalfa, Salat und die verschiedenen Baum-, Nuß- und Weinspecies .
Die transgenen Pflanzen, Pflanzenzellen, -gewebe oder -teile können mit einem Wirkstoff, der die pflanzliche ADSS inhibiert, behandelt werden, wodurch die nicht erfolgreich transformierten Pflanzen, -zellen, -gewebe oder Pflanzenteile absterben. Beispiele für geeignete Wirkstoffe sind Alanosin, Hadacidin und insbesondere Hydantocidin sowie Metabolite und funktioneile Derivate dieser Verbindungen. Die in die erfindungsgemäßen Expressionskas- setten insertierte ADSS-DNA kann somit als Selektionsmarker verwendet werden .
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft somit die Verwendung von Vektoren oder damit transformierten Mikroorganismen zur Transformation von Pflanzen, Pflanzenzellen, -geweben oder Pflanzenteilen insbesondere zur Expression exogener Proteine, Glyco- proteine oder Fusionsproteine. Vorzugsweise ist Ziel der Verwendung die Vermittlung von Resistenz gegen Inhibitoren pflanzlicher ADSS.
Gegenstand der Erfindung sind aber auch die erfindungsgemäß erzeugten Expressionsprodukte, insbesondere die Fusionsproteine aus Transitpeptid und Proteinteil mit nicht-pflanzlicher ADSS-Aktivität.
Die Erfindung wird durch die nun folgenden Beispiele erläutert, ist aber nicht auf diese beschränkt:
Beispiel 1: PCR-Amplifikation der Escherichia coli Adenylosucci- nat Synthetase mit Hilfe synthetischer Oligonukleotide
Die PCR-Amplifikation der Escherichia coli ADSS wurde in einem DNA-Thermal Cycler der Firma Perkin Eimer durchgeführt. Die ver- wendeten Oligonukleotide (SEQ ID NO: 6, 7) sind in Figur 4 dargestellt und wurden der publizierten Sequenz entnommen. Die Reak- tionsgemische enthielten 8ng/μl genomische DNA aus Escherichia coli, 0,5 μM der entsprechenden Oligonukleotide, 200 μM Nukleotide (Pharmacia), 50 mM KCl, 10 M Tris-HCl (pH 8,3 bei 25°C) , 1,5 mM MgCl ) und 0,02 U/μl Taq Polymerase (Perkin Eimer). Die Amplifika- tionsbedingungen wurden wie folgt eingestellt:
Anlagerungstemperatur : 45°C, 1 min
Denaturierungstemperatur : 92°C, 1 min E1ongationstemperatur : 72°C, 1,5 min
Anzahl der Zyklen: 40
Es resultierte ein Fragment von 1300 Basenpaaren, das in den Vektor pGEM-T (Promega) ligiert wurde. Mit dem Ligationsansatz wurde E. coli XL-I Blue transformiert und das Plasmid pGEM-ASS erhalten. Beispiel 2 : Erzeugung pflanzlicher Expressionskassetten
In das Plasmid pBinl9 (Bevan et al . (1980) Nucl . Acids Res . 12, 8711) (kommerziell erhältlich von der Firma Clontech, Palo Alto, CA, USA) wurde ein 35S CaMV Promotor als EcoRI-Kpnl-Frag ent (entsprechend den Nukleotiden 6909-7437 des Cauliflower-Mosaik- Virus (Franck et al . (1980) Cell 21, 285) inseriert. Das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmides pTiACH5 (Gielen et al . , (1984) EMBO J. 3, 835), Nukleotide 11749-11939, abgeleitet vom Octopin Synthase (OCS)-Gen, wurde als PvuII-Hin- dlll-Fragment isoliert und nach Addition von Sphl-Linkern an die PvuII-Schnittstelle zwischen die Sphl-Hindlll-Schnittstellen des Vektors kloniert. Es entstand das Plasmid pBinAR (Höfgen und Willmitzer (1990) Plant Science 66, 221-230) .
Die cDNA-Sequenz des Transitpeptides (TP) der Transketolase (TK) wurde dem Plasmid pBluescript TK-26 (DE-A-19501906) entnommen und mit Hilfe synthetischer Oligonukleotide als Kpnl-BamHI-Fragment über eine Polymerase-Kettenreaktion in das Plasmid pBinAR inse- riert. Durch Variation des verwendeten 3 '-spezifischen Oligonu- kleotides wurden drei Vektoren als pflanzliche Expressionskassetten erhalten (pTP09, pTPlO, pTPll, siehe Figuren 5 und 6), die es erlauben, chimäre Genkonstrukte mit der cDNA-Transitsequenz der plastidären Transketolase in drei verschiedenen Leserastern zu erzeugen.
Beispiel 3 : Erstellung einer pflanzlichen Expressionskassette für die Adenylosuccinat Synthetase
Das DNA-Fragment kodierend für die Adenylosuccinat Synthetase wurde als BamHI-Fragment in den Vektor pTP09 kloniert. Es resultierte das Plasmid pTP09-ASS (siehe Figur 7) . Durch Fusion des Transitpeptides (TP/TK) mit der Adenylosuccinat Synthetase wurde der Import des Proteins in den Chloroplasten gewährleistet.
Beispiel 4 : Sequenzanalyse rekombinanter DNA
Die Sequenzierung rekombinanter DNA-Moleküle erfolgte mit einem Laserfluoreszenz-DNA-Sequenzierer der Firma Pharmacia nach der Methode von Sanger (Sanger et al . (1977) Proc . Natl . Acad. Sei. USA 74, 5463-5467). Fragmente resultierend aus einer Polymerase- Kettenreaktion wurden zur Vermeidung von Polymerasefehlern in zu exprimierenden Konstrukten sequenziert und überprüft. Beispiel 5: Herstellung transgener Tabakpflanzen, die eine mikro- bielle Adenylosuccinat Synthetase im Chloroplasten enthalten
Das Plasmid pTP09-ASS wurde in Agrobacterium tumefaciens
C58C1 :pGV2260 transformiert. Die Transformation von Agrobacterium tumefaciens wurde entsprechend der Methode von Höfgen und Will- mitzer (Nucl. Acid Res . (1988) 16, 9877) ausgeführt. Die Anzucht der Agrobakterien erfolgte in YEB-Medium (Vervliet et al . , J. Gen. Virol. (1975) 26, 33). Zur Transformation von Tabakpflanzen (Nicotiana tabacum cv. Samsun NN) wurde eine 1:50 Verdünnung einer Übernachtkultur einer positiv transformierten Agrobakterien- kolonie in Murashige-Skoog Medium ((1962) Physiol. Plant. 15, 473) mit 2% Saccharose (2MS-Medium) benutzt. Blattscheiben steri- 1er Pflanzen (zu je ca. 1 cm2 wurden in einer Petrischale mit einer 1:50 Agrobakterienverdünnung für 5 bis 10 Minuten inkubiert. Es folgte eine 2-tägige Inkubation in Dunkelheit bei 25°C auf 2MS-Medium mit 0,8% Bacto-Agar. Die Kultivierung wurde nach 2 Tagen mit 16 Stunden Licht/ 8 Stunden Dunkelheit weitergeführt und in wöchentlichem Rhythmus auf MS-Medium mit 500 mg/1 Claforan (Cefotaxime-Natrium) , 50 mg/1 Kanamycin, 1 mg/1 Benzylaminopurin (BAP) , 0,2 mg/1 Naphthylessigsäure und 1,6 g/1 Glukose weitergeführt. Wachsende Sprosse wurden auf MS-Medium mit 2% Saccharose, 250 mg/1 Claforan und 0,8% Bacto-Agar überführt.
Bei einer zweiten Transformation wurde entsprechend vorgegangen, jedoch wurde als Antibiotikum 220 mg/1 Hydantocidin zugegeben.
Beispiel 6: Analyse vom Gesamt-RNA aus pflanzlichen Geweben
Zur genaueren Untersuchung der Expression wurde die Gesamt-RNA von Tabakpflanzen, wie bei Logemann et al . (Anal. Biochem. (1987) 163,21) beschrieben, isoliert. Für die Analyse wurden jeweils 20 μg RNA in einem Formaldehyd-haltigen l,5%igen Agarosegel aufge- trennt. Nach elektrophoretischer Auftrennung der RNA-Moleküle wurde die RNA mittels Kapillartransfer auf eine Nylonmembran übertragen. Der Nachweis spezifischer Transkripte wurde, wie bei Amasino (Anal. Biochem. (1986) 152, 304) beschrieben, durchgeführt. Die als Sonde eingesetzten cDNA-Fragmente wurden mit einem Random Primed DNA Labeling Kit (Boehringer, Mannheim) radioaktiv markiert . Beispiel 7: Enzymassay von aus transgenen Tabakpflanzen isolierter Adenylosuccinat Synthetase
Der Testansatz beinhaltete 14 mM Tris-HCl pH 8,3; 6 mM MgCl2; 0,4 mM IMP; 0 , 1 mM GTP; 0 , 5 mM Phosphoenolpyruvat ; 0 , 1 mM ATP; 2 U/ml Pyruvatkinase; 3 mM Aspartat sowie in einem 1 ml Testansatz 10 bis 100 μl Enzympräparat. Es erfolgte eine Inkubation von 5 bis 20 min bei 25°C in Anwesenheit oder Abwesenheit des Inhibitors Hydantocidin und anschließende Messung bei 280 nm (Absorp- tion von Adenylosuccinat) am Zweistrahlphotometer gegen einen Ansatz ohne Aspartat als Leerwert. Die rekombinante ADSS zeigte keine Inhibierung durch Hydantocidin.
Beispiel 8 : Testung Hydantocidin-resistenter Tabakpflanzen
Mit dem Plasmid pTP09-ASS transformierte Tabakpflanzen wurden in Gewebekultur auf 2MS-Medium mit 0,8% Bacto Agar, 250 mg/1 Claforan, 50 mg/1 Kanamycin angezogen und axiale Sprosse auf entsprechendes Medium mit 220 mg/1 Hydantocidin überführt. Nichttrans- formierte Pflanzen starben innerhalb weniger Wochen ab, während resistente Pflanzen weiterwuchsen.
SEQUENZPROTOKOLL
(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER!
(A) NAME: BASF Aktiengesellschaft
(B) STRASSE: -- -<C) ORT: Ludwigshafen
(E) LAND: Germany
<F) POSTLEITZAHL: D-67056
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Adenylosuccinat Synthetase
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 7
(iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM ?C compatible
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version tfl.30 (EPA)
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1: (i) SEQUSNZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 1311 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Eir.zelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENSE: NEIN
(vi) URSPRÜNLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Escherichia coli
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(B) LAGE:!..6
(D) SONSTIGE ANGABE :/function= "BamHI Schnittstelle"
(ix) MERKMAI:
(A) NAME/SCHLÖSSEL: CDS (ß) LAGE:7..1302
(D) SONSTIGE ANGABEN :/product» "Adenylosυccinate Synthetase"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_fea ure
(B) LAGE:1303..1305 (D) SONSTIGE ANGABEN: /function- "Stop codon"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_f ea ure
(3) LAGE:1306..1311
(D) SONSTIGE ANGABEN -./function- "BamHI Schnittstelle"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1: GGATCC ATG GGT AAC AAC GTC GTC GTA CTG GGC ACC CAA TGG GGT GAC 48
Met Oly Asn Asn Val Val Val Leu Gly Thr Gin Trp Gly Asp
I S 10
GAA GGT AAA GGT AAG ATC GTC GAT CTT CTG ACT GAA CGG GCT AAA TAT 96
Glu Gly Lys Gly Lys Ilβ Val Asp Leu Leu Thr Glu Arg Ala Lys Tyr 15 20 25 30
GTT GTA CGC TAC CAG GGC GGT CAC AAC GCA GGC CAT ACT CTC GTA ATC 144
Val Val Arg Tyr Gin Gly Gly His Asn Ala Gly His Thr Leu Val Ile 35 40 45
AAC GGT GAA AAA ACC GTT CTC CAT CTT ATT CCA TCA GGT ATT CTC CGC 192
Asn Gly Glu Lys Thr Val Leu His Leu Ile Pro Ser Gly Ile Leu Arg 50 55 60
GAG AAT GTA ACC AGC ATC ATC GGT AAC GGT GTT GTG CTG TCT CCG GCC 240 Glu Asn Val Thr Ser Ile Ile Gly Asn Gly Val Val Leu Ser Pro Ala 65 70 75
GCG CTG ATG AAA GAG ATG AAA GAA CTG GAA GAC CGT GGC ATC CCC GTT 288
Ala Leu Met Lys Glu Met Lys Glu Leu Glu Asp Arg Gly Ile Pro Val
80 85 90
CGT GAG CGT CTG CTG CTG TCT GAA GCA TGT CCG CTG ATC CTT GAT TAT 36 Arg Glu Arg Leu Leu Leu Ser Glu Ala Cys Pro Leu Ile Leu Asp Tyr 9S 100 105 110
CAC GTT GCG CTG GAT AAC GCG CGT GAG AAA GCG CGT GGC GCG AAA GCG 384 His Val Ala Leu Asp Asn Ala Arg Glu Lys Ala Arg Gly Ala Lys Ala 115 120 125
ATC GGC ACC ACC GGT CGT GGT ATC GGG CCT GCT TAT GAA GAT AAA GTA 32 Ile Gly Thr Thr Gly Arg Gly Ile Gly Pro Ala Tyr Glu Asp Lys Val 130 135 140
GCA CGT CGC GGT CTG CGT GTT GGC GAC CTT TTC GAC AAA GAA ACC TTC 480 Ala Arg Arg Gly Leu Arg Val Gly Asp Leu Phe Asp Lys Glu Thr Phe 145 150 155
GCT GAA AAA CTG AAA GAA CTG ATG GAA TAT CAC AAC TTC CAG TTG GTT 528 Ala Glu Lys Leu Lyε Glu Val Met Glu Tyr His Asn Fhe Glr. Leu Val 160 165 170
AAC TAC TAC AAA GCT GAA GCG GTT GAT TAC CAG AAA GTT CTG CAT GAT 576 Asn Tyr Tyr Lys Ala Glu Ala Val Asp Tyr Gin Lys Val Leu Asp Asp 175 180 185 190
ACG ATG GCT GTT GCC GAC ATC CTG ACT TCT ATG GTG GTT GAC GTT TCT 624 Thr Met Ala Val Ala Asp Ile Leu Thr Ser Met Val Val Asp Val Ser 195 200 205
GAC CTG CTC GAC CAG GCG CGT CAG CGT GGC GAT TTC GTC ATG TTT GAA 672 Asp Leu Leu Asp Gin Ala Arg Gin Arg Gly Asp Phe Val Met Fhe Glu 210 215 220
GGT GCG CAG GGT ACG CTG CTG GAT ATC GAC CAC GGT ACT TAT CCG TAC 720 Gly Ala Gin Gly Thr Leu Leu Asp Ile Asp Hie Gly Thr Tyr Pro Tyr 225 230 235 GTA ACT TCT TCC AAC ACC ACT GCT GGT GGC GTG GCG ACC GGT TCC GGC 76θ Val Thr Ser Ser Asn Thr Thr Ala Gly Gly Val Ala Thr Gly Ser Gly 240 245 250 CTG GGC CCG CGT TAT GTT GAT TAC GTT CTG GGT ATC CTC AAA GCT TAC 816
Leu Gly Pro Arg Tyr Val Asp Tyr Val Leu Gly Ile Leu Lys Ala Tyr
255 260 265 270
TCC ACT CGT GTA GGT GCA GGT CCG TTC CCG ACC GAA CTG TTT GAT GAA 864
Ser Thr Arg Val Gly Ala Gly Pro Phe Pro Thr Glu Leu Phe Asp Glu 275 280 285
ACT GGC GAG TTC CTC TGC AAG CAG GGT AAC GAA TTC GGC GCA ACT ACO 912
Thr Gly Glu P~he Leu' Cys Lys Gin Gly Asn Glu Phe Gly Ala Thr Thr 290 295 300
GGG CGT CGT CGT CGT ACC GGC TGG CTG GAC ACC GTT GCC GTT CGT CGT 960
Gly Arg Arg Arg Arg Thr Gly Trp Leu Asp Thr Val Ala Val Arg Arg 305 310 315
GCG GTA CAG CTG AAC TCC CTG TCT GGC TTC TGC CTG ACT AAA CTG GAC 1008
Ala Val Gin Leu Asn Ser Leu Ser Gly Phe Cys Leu Thr Lys Leu Asp 320 325 330
GTT CTG GAT GGC CTG AAA GAG GTT AAA CTC TGC GTG GCT TAC CGT ATG 1056
Val Leu Asp Gly Leu Lys Glu Val Lys Leu Cys Val Ala Tyr Arg Met
335 340 345 350
CCG GAT GGT CGC GAA GTG ACT ACC ACT CCG CTG GCA GCT GAC GAC TGG 1104 Pro Asp Gly Arg Glu Val Thr Thr Thr Pro Leu Ala Ala Aso Asp Trp
355 360 365
AAA GGT GTA GAG CCG ATT TAC GAA ACC ATG CCG GGC TGG TCT GAA TCC 1152
Lys Gly Val Glu Pro Ile Tyr Glu Thr Met Pro Gly Trp Ser Glu Ser 370 375 380
ACC TTC GGC GTG AAA GAT CGT AGC GGC CTG CCG CAG GCG GCG CTG AAC 1200 Thr Phe Gly Val Lys Asp Arg Ser Gly Leu Pro Gin Ala Ala Leu Asn 385 390 395
TAT ATC AAG CGT ATT GAA GAG CTG ACT GGT GTG CCG ATC GAT ATC ATC 1248
Tyr Ile Lys Arg Ile Glu Glu Leu Thr Gly Val Pro Ile Asp Ile Ile 400 405 41C TCT ACC GAT CCG GAT CGT ACT GAA ACC ATG ATT CTG CGC GAC CCG TTC 1296
Ser Thr Asp Pro Asp Arg Thr Glu Thr Met Ile Leu Arg Asp Pro Phe
415 420 425 430
GAC GCG TAAGGATCC 1 11
Asp Ala
(2 ) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 2 ;
( i ) S EQUENZXENNZ E I CHEN :
(A) LANGE : 432 Aminosäuren
( B) ART : Aminosäure <D> TOPOLOGIE : l inea r
( i i ) ART DES MOLEKÜLS ; Prote in
(xi ) SEQUENZBESCHREIBUNG : SEQ ID NO : 2
Met Gly Asn Asn Val Val Val Leu Gly Thr Gin Trσ Gly Aso Glu Gly 1 5 10 ' ' 15
Lys Gly Lys Ile Val Asp Leu Leu Thr Glu Arg Ala Lys Tyr Val Val 20 25 30
Lys Leu Lyε Glu Val Met Glu Tyr His Asn Phe Gin Leu Val Asn Tyr
165 170 175
Tyr Lys Ala Glu Ala Val Asp Tyr Gin Lys Val Leu Asp Asp Thr Met
180 185 190
Ala Val Ala Asp Ile Leu Thr Ser Met Val Val Asp Val Ser Asp Leu 195 200 205
Leu Asp Gin Ala Arg Gin Arg Gly Asp Phe Val Met Phe Glu Gly Ala 210 215 * 220
Gin Gly Thr Leu Leu Asp Ile Asp His Gly Thr Tyr Pro Tyr Val Thr
225 230 " 235 240
Ser Ser Asr. Thr Thr Ala Gly Gly Val Ala Thr Gly Ser Gly Leu Gly 245 250 255
Pro Arg Tyr Val Asp Tyr Val Leu Gly Ile Leu Lys Ala Tyr Ser Thr 260 265 270
Arg Val Gly Ala Gly Pro Phe Pro Thr Glu Leu Phe Asp Glu Thr Gly 275 280 285
Glu Phe Leu Cys Lys Gin Gly Asn Glu Phe Gly Ala Thr Thr Gly Ära 290 295 300
Arg Arg Arg Thr Gly Trp Leu Asp Thr Val Ala Val Arg Arg Ala Val 305 310 315 320 Gin Leu Asr. Ser Leu Ser Gly Phe Cys Leu Thr Lys Leu Asp Val Leu
325 330 335
Asp Gly Leu Lys Glu Val Lys Leu Cys Val Ala Tyr Arg Met Pro Asp 340 345 350
Gly Arg Glu Val Thr Thr Thr Pro Leu Ala Ala Asp Aso Tro Lys Gly 355 360 36*5 Val Glu Pro Ile Tyr Glu Thr Met Pro Gly Trp Ser Glu Ser Thr Phe 370 375 380
Gly Val Lys Asp Arg Ser Gly Leu Pro Gin Ala Ala Leu Asn Tyr Ile
385 390 395 400
Ly3 Arg Ile Glu Glu Leu Thr Gly Val Pro Ile Asp Ile Ile Ser Thr 405 410 415
Asp Pro Asp Arg Thr Glu Thr Met Ile Leu Arg Asp Pro Phe Asp Ala 420 425 430
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENZKEN ZEICKEN:
(A) LÄNGE: 258 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid (C) STRAX3F0RM : Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN (iv) ANTISENSE: NEIN
(vi) URSPRÜNLICHE HERKUNFT:
(I) CRGANELLE: Chloroplast
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(B) LAGE:1..S (D) SONSTIGE ANGABEN:/function= "Knpl Schnittstelle»
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: transit_peptide
(B) LAGE: 7..252
(ix) MERKMAL: (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_fea:ure
(B) LAGE:253..253
(D) SONSTIGE ANGABEN: /function- "BamHI Schnittstelle"
(xi) SEQUENZBΞSTHREIBUNG: SEQ ID MO: 3: GGTACCATGG CGTCTTCTTC TTCTCTCACT CTCTCTCAAG CTATCCTCTC ICGTTCTGTC 60
CCTCGCCATG GCTCTGCCTC TTCTTCTCAA CTTTCCCCTT CTTCTCTCAC TTTTTCCGGC 120
CTTAAATCCA ATCCCAATAT CACCACCTCC CGCCGCCGTA CTCCTTCCTC CGCCGCCGCC 180
GCCGCCGTCG TAAGGTCACC GGCGATTCCT GCCTCAGCTG CAACCGAAAC CATAGAGAAA 240
ACTGAGACTG CGGGATCC 258
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:
( i ) SEQUENZKSNIZ EICHEN :
(A) LÄNGE: 260 Baseπpaare (B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM; Einzelstrang (0) TOPOLOGIE: lir.ear (ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENSE: NEIN
(vi) URSPRÜNLICHE HERKUNFT:
(I) ORGANELLE: Chloroplast
(ix) MERKMAL: (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(B) LAGE:1..6 (D) SONSTIGE ANGABEN :/function= *KpnI Schnittstelle"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: transi _peptide
(B) LAGE:7..2S2 (ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc feature
(B) LAGE:2S3..254
(D) SONSTIGE ANGABEN :/function= "frame shifr. insert"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature (B) LAGE:255..260
(D) SONSTIGE ANGABE :/function- "BamHI Schnittstelle"
(xi) SEQUENZBE≤CHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
GGTACCATGG CGTCTTCTTC TTCTCTCACT CTCTCTCAAG CTATCCTCTC TCGTTCTGTC 60
CCTCGCCATG GCTCTGCCTC TTCTTCTCAA CTTTCCCCTT CTTCTCTCAC TTTTTCCGGC 120
CTTAAATCCA ATCCCAATAT CACCACCTCC CGCCGCCGTA CTCCTTCCTC CGCCGCCGCC 180
GCCGCCGTCG TAAGGTCACC GGCGATTCGT GCCTCAGCTG CAACCGAAAC CATAGAGAAA 240 ACTGAGACTG CGCTGGATCC 260
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5:
(i) SEQUENZKENNZEICKΞN:
(A) LÄNGE: 259 Basenpaare
(B) AST: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
<ii) ART DES MOLEKÜLS: cDMA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISΞNSΞ: NEIN
(vi) URSPRÜNLICHE HERKUNFT:
(I) ORGANΞLLE: Chloroolast
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(B) LAGE:1..6 ( D) SONST IGE ANGABEN : / fur.ct ion= " Koni Schni t t s te l l e ' (ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: transit peptide
(B) LAGE: 7..252
(ix) MERKMAL: (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc feature
(B) LAGE:253 (D) SONSTIGE ANGABEN :/product- "Fraπe shift insert"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc feature
(B) LAGE -.254..259 (D) SONSTIGE ANGABEN :/function- "BanHI Schnittstelle"
(xi) SEQUENZ3ESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 5:
GGTACCATGG CGTCTTCTTC TTCTCTCACT CTCTCTCAAG CTATCCTCTC TCGTTCTGTC 60
CCTCGCCATG GCTCTGCCTC TTCTTCTCAA CTTTCCCCTT CTTCTCTCAC TTTTTCCGGC 120
CTTAAATCCA ATCCCAATAT CACCACCTCC CGCCGCCGTA CTCCTTCCTC CGCCGCCGCC 180
GCCGCCGTCG TAAGGTCACC GGCGATTCGT GCCTCAGCTG CAACCGAAAC CATAGAGAAA 240
ACTGAGACTG CGGGGATCC 259 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 33 Baseπpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure (A) BESCHREIBUNG: /desc « "syr.the ic"
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENSE: NEIN
(xi) SEQUENZ3ES HREIBUNG: SEQ ID NO: 6 : AAGGATCCAT GGGTAACAAC GTCGTCGTAC TGG 33
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7:
( i) SEQUENZKΞN ZEICHEN :
(A) LÄNGE: 23 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Ξiπzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure (A) BESCHREIBUNG: /desc « "synthetic"
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENSE: NEIN (Xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7: AAGGATCCCG TACCAGAATT ACG 23

Claims

Patentansprüche
1. Expressionskassette, enthaltend unter genetischer Kontrolle regulativer Nukleinsäuresequenzen die kodierende Nukleinsäuresequenz für ein Protein, welches einem pflanzlichen Wirt Resistenz gegenüber Inhibitoren pflanzlicher Adenylosuccinat Synthetase vermittelt.
2. Expressionskassette nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Inhibitor ausgewählt ist unter Alanosin, Hadacidin, Hydantocidin sowie Metaboliten und funktioneil äquivalenten Derivaten davon .
3. Expressionskassette nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die kodierende Nukleinsäuresequenz für ein Protein kodiert, das nicht-pflanzliche Adenylosuccinat Synthetase oder ein funktionelles Äquivalent davon umfaßt.
4. Expressionskassette nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die nicht-pflanzliche Adenylosuccinat Synthetase von einer mikrobiellen Adenylosuccinat Synthetase abgeleitet ist.
5. Expressionskassette nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die mikrobielle Adenylosuccinat Synthetase aus Escherichia coli, Bacillus subtilis, Haemophilus influencae, Dictyostelium discoideum, Saccharomyces pombe oder Schizosaccharomyces pombe abgeleitet ist.
6. Expressionskassette nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die kodierende Nukleinsäuresequenz für ein Protein enthaltend eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder ein funktionelles Äquivalent davon kodiert oder eine Nukleinsäuresequenz von Rest + 7 bis + 1305 gemäß SEQ ID NO-.l oder ein funktionelles Äquivalent davon umfaßt.
7. Expressionskassette nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die kodierende Nukleinsäuresequenz außerdem für ein Chloroplasten-spezifisches Transit- peptid kodiert.
8. Expressionskassette nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die kodierende Nukleinsäuresequenz für das Transitpeptid plastidärer Transketolase oder ein funktionelles Äquivalent davon kodiert.
9. Rekombinanter Vektor, umfassend eine Expressionskassette nach einem der Ansprüche 1 bis 8.
10. Vektor nach Anspruch 9, der im wesentlichen dem Vektor 5 pTP09-ASS entspricht.
11. Mikroorganismus, enthaltend einen rekombinanten Vektor nach Anspruch 9 oder 10.
10 12. Mikroorganismus nach Anspruch 11 aus der Gattung Agrobacterium und insbesondere der Art Agrobacterium tumefaciens.
13. Verwendung eines Vektors nach einem der Ansprüche 9 und 10 oder eines Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 11 und 12
15 zur Transformation von Pflanzen, Pflanzenzellen, -geweben oder -teilen.
14. Verwendung nach Anspruch 13, wobei den Pflanzen, Pflanzenzellen, -geweben oder -teilen Resistenz gegenüber Inhibitoren
20 pflanzlicher Adenylosuccinat Synthetase vermittelt wird.
15. Verwendung einer kodierenden Nukleinsäuresequenz gemäß der Definition in einem der Ansprüche 1 bis 6 als Selektionsoder Markergen in Pflanzen, Pflanzenzellen, -geweben oder
25 -teilen.
16. Transgene Pflanze, transformiert mit einem Vektor gemäß einem der Ansprüche 9 und 10 oder mit einem Mikroorganismus gemäß einem der Ansprüche 11 und 12, oder transgene Zellen, Gewebe,
30 Teile oder transgenes Vermehrungsgut davon.
17. Transgene Pflanze nach Anspruch 16, ausgewählt unter Kulturpflanzen, wie Getreide, Mais, Soja, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Canola, Sonnenblume, Flachs, Kartoffel, Tabak, Tomate,
35 Raps, Alfalfa, Salat und den verschiedenen Baum-, Nuß- und Weinspecies .
18. Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen nach einem der Ansprüche 16 und 17, dadurch gekennzeichnet, daß man
40 Pflanzenzellen, -gewebe oder -teile oder Protoplasten mit einem Vektor gemäß einem der Ansprüche 9 und 10 oder mit einem Mikroorganismus gemäß einem der Ansprüche 11 und 12 transformiert, die transformierten Zellen, Gewebe, Pflanzenteile oder Protoplasten in einem Wachstumsmedium kultiviert
45 und gegebenenfalls aus der Kultur Pflanzen regeneriert.
19. Expressionsprodukt einer in den Ansprüchen 1 bis 8 definierten Expressionskassette.
20. Expressionsprodukt nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, 5 daß es im wesentlichen eine Aminosäuresequenz von Aminosäure
+ 1 bis + 432 gemäß SEQ ID NO: 2 oder ein funktionelles Äquivalent davon umfaßt.
21. Expressions-Kit für die Expression eines Fremdgens in einem 10 pflanzlichen Wirt, das mindestens drei Expressionskassetten umfaßt, wobei mindestens zwei Expressionskassetten davon unter der genetischen Kontrolle regulativer Nukleinsäuresequenzen jeweils eine Frame-Shift-Sequenz enthalten, die sich voneinander durch Insertion oder Deletion einer nicht durch 3 15 teilbaren Anzahl von Nukleotiden unterscheiden und den Leserahmen für eine stromabwärts liegende kodierende Nukleinsäuresequenz um ein bzw. zwei Nukleotide verschieben.
22. Expressions-Kit nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß 20 jede Expressionskassette eine kodierende Sequenz für ein
Chloroplasten-spezifisches Transitpeptid enthält und die gegebenenfalls enthaltene Frame-Shift-Sequenz auf deren 3 ' -Ende folgt.
25 23. Expressions-Kit nach Anspruch 22, enthaltend Expressionskassetten, die je eine der folgenden Nukleotidsequenzen: SEQ ID NO: 3 von Nukleinsäurerest +7 bis +252 SEQ ID NO: 4 von Nukleinsäurerest +7 bis +254 SEQ ID NO: 5 von Nukleinsäurerest +7 bis +253
30 oder ein funktionelles Äquivalent davon, enthalten.
24. Verwendung eines Expressions-Kits nach einem der Ansprüche 21 bis 23 zur Transformation eines pflanzlichen Wirts.
35
40
45
EP97943832A 1996-09-04 1997-09-04 Adenylosuccinat synthetase Withdrawn EP0927246A2 (de)

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