JP2001500008A

JP2001500008A - アデニロスクシナート・シンセターゼ

Info

Publication number: JP2001500008A
Application number: JP10512245A
Authority: JP
Inventors: レルヒル，イェンス; シュミット，ラルフ―ミヒャエル; シファー，ヘルムート; ゾネヴァルト，ウヴェ; バドゥル，ラルフ
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 1996-09-04
Filing date: 1997-09-04
Publication date: 2001-01-09
Also published as: BR9711658A; WO1998010074A2; EP0927246A2; AU4553097A; AU741624B2; CA2264677A1; IL128618A0; WO1998010074A3

Abstract

(57)【要約】植物、または植物の細胞、組織もしくは部分の植物アデニロスクシナート・シンセターゼ阻害物質に耐性を授与する発現カセットを、植物、または植物の細胞、組織もしくは部分の形質転換用の好ましいベクターに用いる。

Description

【発明の詳細な説明】アデニロスクシナート・シンセターゼ本発明は、植物に植物アデニロスクシナート（ＡＤＳＳ）阻害物質への耐性を授与する非植物アデニロスクシナート・シンセターゼをコードする発現カセット (expression cassettes)、この様な発現カセットを含有するベクターおよび微生物、これにより形質転換の行われた形質転換植物、対応の発現生成物および核酸配列、植物宿主の形質転換に使用される発現キットに関する。光独立栄養生物としての植物は、自らの細胞成分を二酸化炭素、水および無機塩から合成可能することができる。この方法は有機物質を合成するための生化学反応を用いてのみ実施可能である。特に、植物は更に、核酸の構成成分としてのヌクレオチドをデノボ合成により得ることが必要である。ヌクレオチドの効率的な生産、使用および分配により、植物の細胞分割および生長に大きな影響が与えられる。植物はヌクレオチドのデノボ生合成の機能に依存するため、この生合成経路が除草剤使用の適切な標的となり得る。ヌクレオチド生合成を確実に行う複雑な各反応がプリン生合成とピリミジン生合成に分割される。ホスホリボシルピロ燐酸（ＰＲＰＰ）から出発する、プリン生合成における酵素反応は、以下の各工程に分割される。ａ）ピリミジン環の合成ｂ）プリン環の合成ｃ）ＩＭＰからＡＭＰまたはＧＭＰへの分岐。工程ｃ）の反応順序を、添付の図１に模式的に叙述する。プリン生合成に関与する酵素の数種類は除草剤に潜在的な攻撃点を供するが、このうちＡＤＳＳは特別の位置を占める。この酵素は以下の反応を触媒する。ＩＭＰ＋Ｌ−アスパラギン酸(aspartate)＋ＧＴＰＡＤＳＳがＥ．ｃｏｌｉで均質性を有するまで精製され（Bass等著、1987、 Arch．Biochem．BioPhys．、256、335-342)、結晶構造が決定され(Poland等著、 1993、J．Biol．Chem.、268、25334-25342)、酵素の動的性質が特性づけられた( KangおよびFromm共著、1995、J．Biol．Chem.、270、15539-15544)。この酵素はディクティオステリウム・ディスコイデウム(Dictyostelium discoideum)(Jahng en、Rossomando共著、1984、Arch．Biochem．Biophys．、229、145-154)、およびウサギの筋肉(J．Biol．Chem．1974、249(2)、459-464)でも同様に精製されている。植物のアデニロスクシナート・シンセターゼは、コムギの苗(Hatch著、19 67、Phytochemistry、６、115-119)、およびトウモロコシ(Siehl等著、1996、Pl ant Physiol.、110、753-758)から、酵素作用測定用に単離されている。 E．Coliにおけるアデニロスクシナート・シンセターゼは、２個の４８ｋＤポリペプチドの二量体として存在する。植物のＡＤＳＳに関するデータは公開されていない。これまでに、ＡＤＳＳをコードする遺伝子は大腸菌（Escherichia coli）（EM BLアクセスＮｏ．J04199）、枯草菌(Bacillus subtilis)(J02732)、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)(L46263)、サッカロマイセス・ポンベ(コウボキン目：Saccharomyces pombe)(L22185)、シゾサッカロマイセス・ポンベ(コウボキン目：Schizosaccharomyces pombe)(M98805)、ディクチオステリウム・ディスコイデウム(タマホコリカビ：Dictyostelium discoideum)(M58471)、ホモ・サピエンス(現生人類:Homosa piens)(X65503)、およびモス・ムスクルス(ハツカネズミ：Mus musculus)(M74495)から単離されている。データを比較することにより、上記ＡＤＳＳと明確に類似するシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)(T42 64l)およびイネ(Oryza sativa)(D15352)から試験配列(test sequences)と呼ばれる発現配列タグ(expression sequence tag)を探すことが可能である。更に、シロイヌナズナおよびトウモロコシ（米国特許第５５１９１２５号明細書）、およびコムギ（国際特許第９６／１９５７６号）から得られた植物アデニロスクシナート・シンセターゼの完全なｃＤＮＡ配列が開示されている。ＡＤＳＳ活性測定には他の相互要因は全く必要ない。しかしながら植物のＡＤＳＳの酵素活性を阻害する薬剤が、ハダシジン(hadacidin)およびアラノシン(alanosine)の形状で（Stayton等著、1983、Curr．Top．Cell．Regul．、22、 103-141)およびヒダントシジン(hydantocidin)とそのメタボライト５’−ホスホヒダントシジン(metabolite 5'-phosphohydantocidin)(Siehl等著、1996、Plant Physiol.、110、753-758)の形状で記載されている。植物毒素薬剤であるヒダントシジンが、ストレプトミセス・ヒグロスコピクス (菌株SANK 63584)(ナカジマ等、1991、J．Antibiot.、44、293-300)から単離された。５’−ホスホヒダントシジン、つまり植物中で製造されるメタボライトがＡＤＳＳの実質的な阻害物質である(Siehl等著、1996、Plant Physiol.、110、7 53-758)。ヒダントシジンはその有毒作用を植物のみにおいて示し、ほ乳類に対する毒性は低く、種々の微生物に対しては作用しないことが調査により示されている(ナカジマ等著、1991、J．Antibiot．、44、293-300)。可能であれば、ＡＤＳＳ阻害物質に対する植物の応答を所望の形態に変更する方法を見つけられると望ましい。しかるに、ＡＤＳＳ阻害物質に対する植物の応答を所望の形態に修正する手段を提供することを本発明の目的とする。本発明においては、特にこの修飾を遺伝的操作により可能とすることを目的とする。本発明者等は、上記目的が、調節核酸配列を遺伝的に制御しつつ、植物宿主に植物アデニロスクシナート・シンセターゼの阻害物質に対する耐性を授与するタンパク質を得るためのコード核酸配列を含む発現カセットを提供することにより達成されることを見出した。以下に図面を参照しつつ、本発明を詳細に説明する。図１は、植物におけるデノボプリン生合成を示すものである。図２は、５’−末端および３’−末端のＢａｍＨＩ分割サイトを含む、大腸菌由来のアデニロスクシナート・シンセターゼの核酸配列を示すものである。図３は、大腸菌由来のアデニロスクシナート・シンセターゼのアミノ酸配列を示すものである。図４は、大腸菌からアデニロスクシナート・シンセターゼの核酸配列を単離するためのオリゴヌクレオチド配列を示すものである。図５は、３個の読み枠における色素体トランスケトラーゼの転移ペプチドの核酸配列を示すものである。図６は、発現カセットと、形質転換ベクターｐＴＰ０９、ｐＴＰ１０およびｐＴＰ１１の組立を示す図である。図７は、発現カセットと、形質転換ベクターｐＴＰ０９−ＡＳＳの組立を示す図である。第一に、本発明は植物宿主の形質転換用に適し、宿主に植物ＡＤＳＳ阻害物質に対する耐性を授与するコード配列を含む発現カセットに関する。本発明において、「耐性」と称するのは、植物ＡＤＳＳ阻害物質の作用に対抗するための人工的に得られた能力を意味するものとする。これによると、少なくとも一植物世代に亘り、これらの阻害物質に部分的、または特に完全な無感覚が示される。本発明の好ましい実施の形態において、発現カセットを植物全体、植物細胞、植物組織、および植物部分、例えば葉、根および果実から選択される植物宿主に付与する。この植物宿主は、特に農作物、および農作物の細胞、組織、または部分から選択される。適する農作物を以下に挙げるが、これらの例は本発明を限定するためのものではない。すなわち、穀物、トウモロコシ、大豆、イネ、綿花、テンサイ、キャノラ(canola)、ヒマワリ、アマ、ジャガイモ、タバコ、トマト、アブラナ、アルファルファ、レタス、および種々の木、ナッツ、蔓植物各種が宿主として好ましく使用される。本発明は、植物ＡＤＳＳ阻害物質に対する選択的耐性を農作物に誘導することにより、これらの阻害物質を非耐性植物用の特別な除草剤として使用可能であるという、特に農作物における利点を有する。これら阻害物質の非限定的例としてはアラノシン、ハダシジン、ヒダントシジンおよびメタボライト、並びにこれらの機能的に等価の誘導体を挙げることができる。植物ＡＤＳＳ阻害物質の機能的に等価の誘導体には、上述の物質に匹敵する範囲の作用があるが、その阻害作用は上記物質に比較して低い場合も、同様の場合も、高い場合もある（例えば非耐性植物の生長を完全に抑制するために必要な耕作面積ヘクタールあたりの阻害物質使用量（ｇ）で示される）。本発明は、特に、コード配列が、植物ＡＤＳＳ阻害物質に対して耐性を有する非植物ＡＤＳＳ核酸配列、またはその等価配列を有する発現カセットに関する。ＡＤＳＳ核酸配列は、例えばＤＮＡ配列であっても、ｃＤＮＡ配列であってもよい。本発明の発現カセットに挿入される好ましいコード配列の例は、大腸菌（Esch erichia）、枯草菌（Bacillus）、インフルエンザ菌(Haemophilus)、タマホコリカビ(Dictyostelium)、コウボキン(SaccharomycesまたはSchizosaccharomyces) の各属、特に大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌(Bacillus subtilis)、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、ディクチオステリウム・ディスコイデウム（タマホコリカビ：Dictyostelium discoideum）、サッカロマイセス・ポンベ(コウボキン目：Saccharomyces pombe)またはシゾサッカロマイセス・ポンベ(コウボキン目：Schizosaccharomyces pombe)である。主に適するＡＤＳＳ配列は、図２に示されるＥ．ｃｏｌｉ由来のＤＮＡ配列に実質的に対応する(SEQ I D NO:1)。上述のような所望の耐性を有する人工ＤＮＡ配列も好適に用いられる。この人工ＤＮＡ配列は、分子のモデル化を行いアデニロスクシナート・シンセターゼ活性を得ることにより構成されるタンパク質から逆に翻訳することにより、または生体外での選択により得られる。ＡＤＳＳをコードし、宿主植物用の特別なコドンを使用したＡＤＳＳポリペプチド配列から逆方向に翻訳することにより得られるＤＮＡ配列は、特に好ましい。この特定コドンの使用は、形質転換の行われるべき植物のものとして知られる他の遺伝子のコンピュータ分析による、植物遺伝学的方法に詳しい当業者により簡単に行われる。本発明は、更に、上述の核酸配列ないしこれから誘導されるアミノ酸配列に機能的に等価な配列に関する。本発明によると、機能的等価物同士は相互に対応する配列を有する。これは、特に、植物の代謝維持に必要な所望のＡＤＳＳ作用が保持されている場合において、ＡＤＳＳ配列の天然または人工突然変異による配列変化を意味する。しかるに、植物宿主中に形質転換によりもたらされた外因性ＡＤＳＳ活性は、内因性植物ＡＤＳＳ活性に比較して、高い場合も、同様の場合も、いくらか低い場合もある。突然変異には、１個以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の置換、欠失、転座、挿入が含まれる。ここで、置換とはヌクレオチドまたはアミノ酸の交換を意味する。サイレントまたは保守的交換と呼ばれる交換が好ましい。サイレント・ヌクレオチド交換は、アミノ酸配列に変化を生じせしめない。保守的交換は、アミノ酸が、寸法、電荷、極性、溶解度等において同等の性質を有するアミノ酸残基により置換されるものである。同様の性質を有するアミノ酸対の例には、ＧｌｕとＡｓｐ、ＶａｌとＩｌｅ、ＳｅｒとＴｈｒがある。本発明において、欠失とは、１個以上のヌクレオチドまたは１個以上のアミノ酸残基の喪失を意味する。欠失されるに適する位置は、ポリペプチドの末端をコードするＤＮＡ領域、および個々のタンパク質ドメイン間を連結するＤＮＡ部分である。本発明において特に好ましいＤＮＡ頻度は、約１００、例えば２０−１００の、図３に示された配列によるとアミノ酸のＮ−末端短縮により得られたＡＤＳＳタンパク質をコードするものである。（SEQ ID NO:2）。本発明によると、挿入には、本発明の配列への１個以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の導入が含まれる。更に、本発明による機能的に等価の核酸配列には、融合タンパク質（ここでは、非植物ＡＤＳＳポリペプチド、またはその機能的等価部分が融合タンパク質部分を構成している）をコードする配列が含まれる。融合タンパク質の第二の部分は、例えば同様または異なる酵素活性を有する他のペプチドであってもよい。しかしながら、これはＡＤＳＳを所望の活性サイトにもたらすシグナルまたは転移 (transit)ペプチド等の、調節タンパク質配列であるのが好ましい。更に本発明は、ＡＤＳＳ融合タンパク質をコードするコード配列を有し、融合タンパク質の部分がＡＤＳＳ配列の転座を制御する転移ペプチドである発現カセットに関する。特に好ましい転移ペプチドはクロロプラストに特異的であり、ＡＤＳＳ配列の植物クロロプラスト（植物中のプリン生合成の主サイト）への転座後に、ＡＤＳＳ部分から酵素作用により分離する。この転移ペプチドはプラスチド・トランスケトラーゼ（ＴＫ）から得られると、あるいはこの転移ペプチドの機能的等価物であると特に好ましい。図５に記載の転移ペプチドＤＮＡ配列（SE Q ID NOs:３、４、５）を有する発現カセットが特に好ましく用いられる。本発明の発現カセットは、更に、宿主細胞中のコード配列の発現を制御する、調節核酸配列を有する。好ましい実施の形態における本発明の発現カセットは上流、例えば５’末端に、コード配列のプロモーターを、下流、例えば３’末端に、ポリアデニル化シグナルを有し、これらの間に存在するＡＤＳＳおよび／または転移ペプチド用にコード配列と最適に連結する他の調節エレメントを有してもよい。ここで、最適な結合とは、上記の調節エレメントがコード配列の発現において機能できるような調節エレメントの連続配列を意味する。本発明による発現カセットに用いられる適するプロモーターとしては、原則的に植物の異質遺伝子の発現を制御可能な全てのプロモーターが挙げられる。植物のプロモーターが特に好ましく用いられる。ハナヤサイモザイクウイルス由来の３５ＳCaMＶプロモーター(Franck等著、（1980）Cell 21、285-294)が特に好ましい。このプロモーターは転写エフェクター用の種々の認識配列を有し、その全体性において挿入された遺伝子の構成的な発現が得られる(Benfey等著、（1989 ）EMBO J．8、2195-2202)。好ましいポリアデニル化シグナルは、植物のポリアデニル化シグナルであり、主にアグロバクテリウム・ツメファシエンスから得られるＴ−ＤＮＡポリアデニル化シグナル、特にＴｉプラスミドのｐＴｉＡＣＨ５のＴ−ＤＮＡの遺伝子３のポリアデニル化シグナルに実質的に対応するものが好ましい。本発明による発現カセットの製造は、適するプロモーターと、適するＡＤＳＳＤＮＡ、特に好ましくはプロモーターとＡＤＳＳＤＮＡの間に挿入され、クロロプラスト特有の転移ペプチドをコードするＤＮＡとの、並びにポリアデニル化シグナルとの融合により、例えば慣用の組み換えまたはクローニング技術（例えば T．Maniatis、E．F．FritschおよびJ．Sambrook共著、「Molecular Cloning:A L aboratory manua」、 Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、N Y（1989）、およびT．J．Silhavy、M．L．Berman、L．W．Enquist共著、「Exper iments with Gene Fusion」、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Ha rbor、NY（1984）、およびAusubel、F．M．等著、「Current Protocols in Mole cular Biology」、Greene Publishing Assoc.、Wiley-Interscience(1987)）を用いて行われる。本発明の発現カセットを得るために必要なＡＤＳＳＤＮＡまたはｃＤＮＡがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅させられるのが好ましい。ＰＣＲによるＤＮＡ増幅方法は、例えばInnis等著、「PCR Protocols、A Guide to Methods and Applications」、Academic Press（1990）により開示されている。ＰＣＲ発生によるＤＮＡフラグメントを、配列分析により調査し、発現に用いられる構造中のボリメラーゼ・エラーを回避することが可能であり、これを行うのが好ましい。更に、本発明は、３個以上の発現カセットを有する発現キットに関する。このキットでは２個以上のカセットが変更可能な領域またはフレームシフト配列を有するが、これらのカセットは３で割り切れない数のヌクレオチドの挿入または欠失、好ましくは挿入により相互に異なり、従って１個或いは２個のヌクレオチドにより下流に挿入された配列の読み枠のシフトが起こる。フレームシフト配列の５’末端を転移ペプチド配列に連結する。フレームシフト配列は、３’末端に制限分離サイトを有し、ここに例えばＡＤＳＳＤＮＡ配列が挿入される。挿入された遺伝子により異なる読み枠を有するキットの発現カセットをそれぞれ有する３個以上のベクターを有することにより、いずれかのＤＮＡ配列により得られた融合構造と転移ペプチドをコードするＤＮA配列により得られた融合構造が、３種の異なる読み枠中で発現され得ることになり、この構造の１種以上が機能的遺伝子生成物を発現する（例えばＡＤＳＳ）。３種の発現カセットを含み、植物の形質転換に好ましく使用される本発明の発現キットを示す構成図を添付の図６に示す。本発明は、更に上記キットの、植物宿主形質転換を行うための使用法に関する。上記の組み換えおよびクローニング技術を用いることにより、本発明による発現カセットをクローンして、例えばＥ．ｃｏｌｉについての複製を可能とする適当なベクターを得ることが可能である。適するクローンベクターは、特にｐＢＲ３３２、ｐＵＣシリーズ、Ｍ１３ｍｐシリーズ、およびｐＡＣＹＣ１８４である。Ｅ．ｃｏｌｉとアグロバクテリア（agrobacteria）、例えばｐＢｉｎ１９の双方で複製可能な二元的ベクター（Bevan等著、（1980）Nucl． Acids Res．12、8711）が特に好ましく用いられる。しかるに本発明は、更に、本発明による１個以上の発現カセットを含むプラスミドまたはウイルス等の組み換えベクター関する。ｐＴＰ０９−ＡＳＳと称される特に好ましい組み換えプラスミドは、図７に示す遺伝子構造を有し、植物ＡＤＳＳ抑制物質、例えばこれにより形質転換された植物宿主におけるヒダントシジンに耐性を与える。ＡＤＳＳＤＮＡによる宿主植物のトランスフェクションを行うため、本発明の発現カセットを、ベクターＤＮＡが付加的に機能的特定シグナル、例えば複製または組み込みのための配列、を有する組み換えベクターに挿入により組み込む。適するベクターは、特に「Methods inPlant Mo1ecular Biology and Biotechnol ogy」(CRC Press)、第６／７章、７１−１１９頁に記載されている。本発明で使用されるベクターは、植物、または植物の細胞、組織および部分の形質転換に用いられる。本発明の融合ＤＮＡ構造は、種々の他の公知方法により、植物ゲノム中に導入可能である。適する方法の例は、ポリエチレングリコール誘発ＤＮＡの取り込み、電気穿孔法、超音波処理、顕微注射、および完全な細胞または組織の、組織または胚への顕微注射または巨視的注射による形質転換、組織電気穿孔法、ＤＮＡ含有溶液中での乾燥胚の培養、生体分解的遺伝子転移、および特に好ましくはアグロバクテリウム形質転換によるプロトプラストの形質転換である。上記方法は、例えばB．Jenes等著、Techniques for Gene Transfer;in Transgenic Plants 、第１巻、Engineering and Utilization、S.D.Kung、R．Wu編、Academic Press 、1993、128-143頁、およびPotrykus（1991）Annu．Rev．Plant Physiol．Plant Molec．Biol．42、205-225に記載されている。この融合構造を、アグロバクテリウム・ツメファシエンスの形質転換に好適に用いられるベクター、例えばｐＢｉｎ１９にクローンするのが好ましい。この様なベクターにより形質転換されるアグロバクテリアを、公知方法により、植物、特にタバコ植物等の農作物を、例えば損傷した葉部または葉片をアグロバクテリウム溶液に浸し、次いで適する媒体中で栽培することにより形質転換に用いる。アグロバクテリアによる植物の形質転換は、特に、F．F．White著、Vectors for Gene Transfer in Higher Plants;in Transgenic Plants、第１巻、Engineerin g and Utilization、S．D．KungおよびR．Wu編、Academic Press)1993、15-38頁、およびS．B．Gelvin著、Molecular Genetics of T-DNA Transfer from Agroba cterium to Plants、およびTransgenic Plants、49-78頁に開示されている。本発明の発現カセットに統合されたＡＤＳＳＤＮＡを発現する形質転換植物は、損傷を受けた葉部または葉片の形質転換後の細胞から、公知方法により再生可能である。形質転換により発現されるＡＤＳＳの活性は、例えば、Baugher等著、Biochem ．Res．Commun94(1980):123-129、Stayton等著、Curr．Top．Cell．Regul．、22 (1983):103-141、およびBass等著、Arch．Biochem．Biophys．256(1987):335-34 2に記載の酵素分析により、例えば試験管内で分析される。本発明は、更に本発明による組み換えベクターを含むバクテリアまたは細菌等の微生物に関する。更に本発明は、本発明によるベクターまたは微生物により形質転換された、形質転換植物、およびこの様な植物の形質転換細胞、組織、部分および増殖材料に関する。これに関して特に好ましくは、形質転換農作物、例えば穀物類、トウモロコシ、大豆、イネ、綿花、テンサイ、キャノラ、ヒマワリ、アマ、ジャガイモ、タバコ、トマト、アブラナ、アルファルファ、レタス、および種々の木、ナッツ、蔓植物各種が挙げられる。形質転換植物、または植物の細胞、組織または部分を、植物ＡＤＳＳを阻害する薬剤で処理することが可能であり、これにより形質転換がうまく行われなかった植物、もしくはこの様な植物の細胞、組織または部分が破壊される。このために用いられる適する薬剤の例には、アラノシン、ハダシジン、および特にヒダントシジンおよびメタボライト、およびこれら化合物の機能的誘導体がある。本発明の発現カセットに挿入されているＡＤＳＳＤＮＡを、選択マーカーとして使用することが可能である。更に、本発明は、ベクターまたはこれにより形質転換された微生物の、植物、または植物細胞、組織または部分の形質転換を行うための、特に外因性タンパク質、糖タンパク質または融合タンパク質の発現を行うための使用法に関する。この使用法の目的は、好ましくは、植物ＡＤＳＳの抑制物質に対する耐性を授与することである。また本発明は、本発明により製造された発現生成物、特に非植物ＡＤＳＳ活性を有する転移ペプチドとタンパク質部分から成る融合タンパク質に関する。以下に記載の実施例により、本発明を更に説明するが、これら実施例により本発明が限定されるものではない。［実施例１］合成オリゴヌクレオチドを用いた大腸菌アデニロスクシナート・シンセターゼのＰＣＲ増幅大腸菌ＡＤＳＳのＰＣＲ増幅を、Perkin Elmer DNAサーマル・サイクラー中で行った。使用されたオリゴヌクレオチド(SEQ ID NO:6、7)を図４に示すが、これは既に発表されている配列から得たものである。反応混合物は、８ｎｇ／μｌの、大腸菌に由来するゲノムＤＮＡ、０．５μＭの適当なオリゴヌクレオチド、２００μＭのヌクレオチド（Pharmacia）、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃にてｐＨ８．３）、１．５ｍＭのＭｇＣｌ₂および０．０２Ｕ／μｌのｔａｑポリメラーゼ（Perkin Elmer）を含むものである。増幅条件を以下の様に設定した。アニーリング温度：４５℃、１分変性温度：９２℃、１分伸長温度：７２℃、１．５分サイクル数：４０１３００塩基対のフラグメントが得られ、これをベクターｐＧＥＭ−Ｔ(Prome ga)に結紮した。結紮混合物を、形質転換Ｅ．ｃｏｌｉＸＬ−ＩＢｌｕｅに対して用い、これによりプラスミドｐＧＥＭ−ＡＳＳを得た。［実施例２］植物発現カセットの製造３５ＳＣａＭＶプロモーターを、ＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩフラグメント（ハナヤサイモザイクウイルスのヌクレオチド６９０９−７４３７に対応（Frank等著(１９８０）Cell 21、285）としてプラスミドｐＢｉｎｌ９（Bevan等著、（１９８０）Nucl．Acids Res．12、8711)(Clontech、Palo Alto、CA、USAにより市販）に挿入した。ＴｉプラスミドｐＴｉＡＣＨ５のＴ−ＤＮＡの遺伝子３のポリアデニル化シグナル（Gielen等著、（1984）EMBO J．3、835)、オクトピン・シンセターゼ（ＯＣＳ）遺伝子から得られたヌクレオチド１１７４９−１１９３９が、ＰｖｕＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとして単離され、ＰｕｖＩＩ分離サイトにＳｐｈＩリンカーを添加した後、ベクターのＳｐｈＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ分離サイトの間でクローンし、プラスミドｐＢｉｎＡＲを得た(Hoefg en、Willmitzer共著（１９９０）Plant Science 66、221-230)。トランスケトラーゼ（ＴＫ）の転移ペプチド（ＴＰ）のｃＤＮＡ配列をプラスミドpBluescript TK-26（ドイツ特許出願公開第１９５０１９０６号公報）から取り除き、これをＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとしての合成オリゴヌクレオチドを用い、ポリメラーゼ連鎖反応により、プラスミドｐＢｉｎＡＲに挿入した。使用した３’−特異的オリゴヌクレオチドを変化させて、３種のベクターを植物発現カセット（ｐＴＰ０９、ｐＴＰ１０、ｐＴＰ１１、図５および６参照）として得、これらの３種類の異なる読み枠におけるプラスミド・トランスケトラーゼのｃＤＮＡ転移配列により、キメラ遺伝子構造体が製造された。［実施例３］アデニロスクシナート・シンセターゼに用いられる植物発現カセットの製造アデニロスクシナート・シンセターゼをコードするＤＮＡフラグメントをＢａｍＨＩフラグメントとしてベクターｐＴＰ０９にクローンし、プラスミドｐＴＰ０９−ＡＳＳを得た（図７参照）。転移ペプチド（ＴＰ／ＴＫ）をアデニロスクシナート・シンセターゼに融合することにより、クロロプラスト中へのタンパク質の移送が確実とされた。［実施例４］組み換えＤＮＡの配列分析組み換えＤＮＡ分子を、サンガーの方法により（Sanger等著、（1977）Proc． Natl．Acad．Sci．USA 74、5463-5467）、Pharmaciaレーザー蛍光ＤＮＡセキュエンサーを用いて配列した。ポリメラーゼ連鎖反応により得られたフラグメントを配列し、発現される構造体におけるポリメラーゼ・エラーを回避するように検査した。［実施例５］クロロプラスト中に微生物アデニロスクシナート・シンセターゼを有する形質転換タバコ植物の製造プラスミドｐＴＰ０９−ＡＳＳを形質転換し、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＣ５８Ｃｌ：ｐＧＶ２２６０を得た。アグロバクテリウム・ツメファシエンスの形質転換は、HoefgenおよびWillmitzerの方法（Nucl．Acid Res．(1988 )16、9877）により行われた。アグロバクテリアの培養は、ＹＥＢ媒体中で行った(Vervliet等著、J．Gen．Virol．（1975）26、33）。タバコ植物(Nicotina ta bacum cv．Samsun NN)を、２％の蔗糖を含むムラシゲースクーグ(Murashige-Sko og)媒体（２ＭＳ媒体）((1962)Physiol．Plant．15、473)中で、明確に形質転換の行われたアグロバクテリウム群生を一晩培した１：５０希釈液を用いて形質転換した。無菌植物から得られた葉ディスク（それぞれ約１ｃｍ²）をペトリ皿中で１：５０のアグロバクテリア希釈液により、５−１０分培養した。この後、バクテリアを２ＭＳ媒体で、０．８％バクト・アガー(Bacto agar)を用い、２５℃ の暗所にて、２日間培養した。２日後、１６時間光にあて、８時間を暗所に保管し、一週間周期的に培養を継続した。この時、５００ｍｇ／リットルのクラフォラン(Claforan:セフォタキシム・ナトリウム（Sefotaxime sodium）、５０ｍｇ／リットルのカナマイシン(Kanamycin)、１ｍｇ／リットルのベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、０．２ｍｇ／リットルのナフチル酢酸および１．６ｇ／リットルのグルコースを含むＭＳ媒体を用いた。成長段階の苗条を、２％の蔗糖、２５０ｍｇ／リットルのクラフォラン、および０．８％のバクト・アガーを含むＭＳ媒体上に移植した。２２０ｍｇ／リットルのヒダントシジンを抗生物質として添加した以外は同様の操作を第２の形質転換操作として行った。［実施例６］植物組織からの完全なＲＮＡの分析発現を詳細に調査するために、Logemann等による論考に記載のあるように完全なＲＮＡをタバコ植物から単離した（Anal．Biochem．（1987）163、21）。この分析を行うにあたり、各場合において２０μｇのＲＮＡをホルムアルデヒド含有１．５％アガロースゲル中で分割した。ＲＮＡ分子を電気泳動により分割した後、ＲＮＡをナイロン膜に毛管転移させた。Amashinoの論考に記載の方法(Anal．B iochem．（1986）152、304)で特異な転写を検出した。試料として使用したｃＤＮＡフラグメントを、ランダムプライマーＤＮＡラベリングキットにより放射線標識した（Boehringer、Mannheim）。［実施例７］形質転換タバコ植物から単離されたアデニロスクシナート・シンセターゼの酵素分析分析混合物として、１ｍｌの分析用混合物に対して１４ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．３）、６ｍＭのＭｇＣｌ₂、０．４ｍＭのＩＭＰ、０．１ｍＭのＧＴＰ、０．５ｍＭのホスホエノールピルビン酸、０．１ｍＭのＡＴＰ、２Ｕ／ｍｌピルビン酸キナーゼ、３ｍＭのアスパラギン酸、および１０−１００μｌの酵素調製液を用いた。阻害物質のヒダントシジンの存在下または非存在下に２５℃ にて５−２０分間潜伏させた後、標準としての、アスパラギン酸を含まない混合物を用いた、２８０ｎｍ（アデニロスクシナートの吸収）の二光束分光光度計による測定を行った。組み換えＡＤＳＳにおいてはヒダントシジンによる阻害は観察されなかった。［実施例８］ヒダントシジンに耐性を有するタバコ植物の実験プラスミドｐＴＰ０９−ＡＳＳにより形質転換を受けたタバコ植物を、０．８％のバクト・アガー、２５０ｍｇ／リットルのクラフォラン、５０ｍｇ／リットルのカナマイシンを含む２ＭＳ媒体上で組織培養により育成し、軸苗条を２００ｍｇ／リットルのヒダントシジンを含む対応の媒体に移植した。形質転換の行われていない植物は数週間で枯死したが、耐性を有する植物は生長を続けた。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年１２月７日（１９９８．１２．７）【補正内容】請求の範囲１．調節核酸配列の遺伝的制御下に、非植物アデニロスクシナート・シンセターゼ（ＡＤＳＳ）またはその機能的等価物のコード核酸配列、およびＡＤＳＳを所望の作用サイトにもたらす調節タンパク質配列のコード核酸配列を有することを特徴とする、植物宿主の形質転換に用いられる発現カセット。２．非植物アデニロスクシナート・シンセターゼを、微生物のアデニロスクシナート・シンセターゼから得ることを特徴とする、請求項１に記載の発現カセット。３．微生物アデニロスクシナート・シンセターゼを、大腸菌、枯草菌、インフルエンザ菌、ディクチオステリウム・ディスコイデウム、サッカロマイセス・ポンベ、またはシゾサッカロマイセス・ポンベから得ることを特徴とする、請求項２に記載の発現カセット。４．コード核酸配列がSEQ ID NO:2により特定されるアミノ酸配列もしくはこれと等価のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするか、またはSEQ ID NO:1により特定される残渣＋７から＋１３０５の核酸配列もしくはこれと等価の核酸配列を有することを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の発現カセット。５．調節タンパク質配列が、クロロプラスト−特異的転移ペプチドであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の発現カセット。６．転移ペプチドがプラスチド・トランスケトラーゼまたはその機能的等価物であることを特徴とする、請求項５に記載の発現カセット。７．請求項１〜６に記載のいずれかの発現カセットを含むことを特徴とする、組み換えベクター。８．ベクターｐＴＰ０９−ＡＳＳに実質的に対応することを特徴とする、請求項７に記載のベクター。９．請求項７または８に記載の組み換えベクターを含む微生物。１０．アグロバクテリウム属、特にアグロバクテリウム・ツメファシエンス種から選択される、請求項９に記載の微生物。１１．植物、または植物の細胞、組織もしくは部分の形質転換を行うための、請求項７もしくは８に記載のベクターの、または請求項９もしくは１０に記載の微生物の使用法。１２．植物アデニロスクシナート・シンセターゼの阻害物質に対する耐性を、植物、または植物の細胞、組織もしくは部分に授与することを特徴とする、請求項１１に記載の使用法。１３．植物、または植物の細胞、組織もしくは部分の選択または標識遺伝子としての、請求項１〜４のいずれかに記載のコード核酸配列の使用法。１４．請求項７もしくは８に記載のベクター、または請求項９もしくは１０に記載の微生物で形質転換された、形質転換植物、または形質転換細胞、組織、部分もしくはその形質転換増殖材料。１５．穀物、トウモロコシ、大豆、イネ、綿花、テンサイ、キャノラ、ヒマワリ、アマ、ジャガイモ、タバコ、トマト、アブラナ、アルファルファ、レタス、および種々の木、ナッツ、蔓植物各種から選択されることを特徴とする、請求項１４に記載の形質転換植物。１６．植物の細胞、組織もしくは部分、またはプロトプラストを、請求項７もしくは８に記載のベクター、または請求項９もしくは１０に記載の微生物で形質転換し、この形質転換された植物の細胞、組織もしくは部分、またはプロトプラストを、育成媒体中で培養し、更に必要に応じて植物を再生させることを特徴とする、請求項１４または１５に記載の形質転換植物の製造法。１７．請求項１−６のいずれかに定義された発現カセットの発現生成物。１８．SEQ ID NO:2に定義されたアミノ酸＋１〜＋４３２から得られたアミノ酸配列、またはこれと機能的に等価のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１７に記載の発現生成物。１９．３個以上の発現カセットを有し、これらの発現カセットの２個以上が、調節核酸配列の遺伝的制御下に、それぞれフレーム・シフト配列を有し、これらは、３で割り切れない数のヌクレオチドの挿入または欠失により、相互に異なり、これにより下流に位置するコード核酸配列の読み枠がそれぞれ１個および２個のヌクレオチドによりシフトしていることを特徴とする植物宿主の異質遺伝子発現のための発現キット。２０．各発現カセットが、クロロプラスト−特異的転移ペプチドのコード配列を有し、存在するフレーム・シフト配列が、必要に応じてその３’末端に連なることを特徴とする、請求項１９に記載の発現キット。２１．それぞれが、以下のヌクレオチド配列のいずれか、すなわち SEQ ID NO:3核酸残渣＋７〜＋２５２、 SEQ ID NO:4核酸残渣＋７〜＋２５４、 SEQ ID NO:5核酸残渣＋７〜＋２５３、またはこれらの機能的等価物を含むことを特徴とする、請求項２０に記載の発現キット。２２．植物宿主の形質転換を行うための、請求項１９〜２１のいずれかに記載の発現キットの使用法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:85） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:19） (72)発明者シファー，ヘルムートドイツ国、Ｄ―67112、ムターシュタット、テーオドール―ホイス―シュトラーセ、31 (72)発明者ゾネヴァルト，ウヴェドイツ国、Ｄ―06467、ホイム、マルタ― ブラウチュ―シュトラーセ、７アー (72)発明者バドゥル，ラルフドイツ国、Ｄ―31137、ヒルデスハイム、ブレヒェンシュテター、シュトラーセ、７

Claims

【特許請求の範囲】１．調節核酸配列の遺伝的制御下に、植物宿主に植物アデニロスクシナート・シンセターゼの阻害物質に対する耐性を授与するタンパク質のコード核酸配列を有することを特徴とする、発現カセット。２．阻害物質がアラノシン、ハダシジン、ヒダントシジン、メタボライト、およびこれらの機能的に等価の誘導体であることを特徴とする、請求項１に記載の発現カセット。３．コード核酸配列が非植物アデニロスクシナート・シンセターゼまたはこの機能的等価物を含むタンパク質をコードすることを特徴とする、請求項１または２に記載の発現カセット。４．非植物アデニロスクシナート・シンセターゼを、微生物のアデニロスクシナート・シンセターゼから得ることを特徴とする、請求項３に記載の発現カセット。５．微生物アデニロスクシナート・シンセターゼを、大腸菌、枯草菌、インフルエンザ菌、ディクチオステリウム・ディスコイデウム、サッカロマイセス・ポンベ、またはシゾサッカロマイセス・ポンベから得ることを特徴とする、請求項４に記載の発現カセット。６．コード核酸配列がSEQ ID NO:2により特定されるアミノ酸配列もしくはこれと等価のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするか、またはSEQ ID NO:1により特定される残渣＋７から＋１３０５の核酸配列もしくはこれと等価の核酸配列を有することを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の発現カセット。７．コード核酸配列が、更にクロロプラスト−特異的転移ペプチドをコードすることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の発現カセット。８．コード核酸配列が、プラスチド・トランスケトラーゼの転移ペプチドまたはその機能的等価物をコードすることを特徴とする、請求項７に記載の発現カセット。９．請求項１〜８に記載のいずれかの発現カセットを含むことを特徴とする、組み換えベクター。１０．ベクターｐＴＰ０９−ＡＳＳに実質的に対応することを特徴とする、請求項９に記載のベクター。１１．請求項９または１０に記載の組み換えベクターを含む微生物。１２．アグロバクテリウム属、特にアグロバクテリウム・ツメファシエンス種から選択される、請求項１１に記載の微生物。１３．植物、または植物の細胞、組織もしくは部分の形質転換を行うための、請求項９もしくは１０に記載のベクターの、または請求項１１もしくは１２に記載の微生物の使用法。１４．植物アデニロスクシナート・シンセターゼの阻害物質に対する耐性を、植物、または植物の細胞、組織もしくは部分に授与することを特徴とする、請求項１３に記載の使用法。１５．植物、または植物の細胞、組織もしくは部分の選択または標識遺伝子としての、請求項１〜６のいずれかに記載のコード核酸配列の使用法。１６．請求項９もしくは１０に記載のベクター、または請求項１１もしくは１２に記載の微生物で形質転換された、形質転換植物、または形質転換細胞、組織、部分もしくはその形質転換増殖材料。１７．穀物、トウモロコシ、大豆、イネ、綿花、テンサイ、キャノラ、ヒマワリ、アマ、ジャガイモ、タバコ、トマト、アブラナ、アルファルファ、レタス、および種々の木、ナッツ、蔓植物各種から選択されることを特徴とする、請求項１６に記載の形質転換植物。１８．植物の細胞、組織もしくは部分、またはプロトプラストを、請求項９もしくは１０に記載のベクター、または請求項１１もしくは１２に記載の微生物で形質転換し、この形質転換された植物の細胞、組織もしくは部分、またはプロトプラストを、育成媒体中で培養し、更に必要に応じて植物を再生させることを特徴とする、請求項１６または１７に記載の形質転換植物の製造法。１９．請求項１−８のいずれかに定義された発現カセットの発現生成物。２０．SEQ ID NO:2に定義されたアミノ酸＋１〜＋４３２から得られたアミノ酸配列、またはこれと機能的に等価のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１９に記載の発現生成物。２１．３個以上の発現カセットを有し、これらの発現カセットの２個以上が、調節核酸配列の遺伝的制御下に、それぞれフレーム・シフト配列を有し、これらは、３で割り切れない数のヌクレオチドの挿入または欠失により、相互に異なり、これにより下流に位置するコード核酸配列の読み枠がそれぞれ１個および２個のヌクレオチドによりシフトしていることを特徴とする植物宿主の異質遺伝子発現のための発現キット。２２．各発現カセットが、クロロプラスト−特異的転移ペプチドのコード配列を有し、存在するフレーム・シフト配列が、必要に応じてその３’末端に連なることを特徴とする、請求項２１に記載の発現キット。２３．それぞれが、以下のヌクレオチド配列のいずれか、すなわち SEQ ID NO:3核酸残渣＋７〜＋２５２、 SEQ ID NO:4核酸残渣＋７〜＋２５４、 SEQ ID NO:5核酸残渣＋７〜＋２５３、またはこれらの機能的等価物を含むことを特徴とする、請求項２２に記載の発現キット。２４．植物宿主の形質転換を行うための、請求項２１〜２３のいずれかに記載の発現キットの使用法。